JPH066057B2 - デキストリンデキストラナーゼ及びその生産方法 - Google Patents
デキストリンデキストラナーゼ及びその生産方法Info
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- JPH066057B2 JPH066057B2 JP6959091A JP6959091A JPH066057B2 JP H066057 B2 JPH066057 B2 JP H066057B2 JP 6959091 A JP6959091 A JP 6959091A JP 6959091 A JP6959091 A JP 6959091A JP H066057 B2 JPH066057 B2 JP H066057B2
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医療あるいは生化学な
どの分野で利用されているデキストラン（α１，６グル
カン）を、マルトオリゴ糖，澱粉及びその分解物より生
成する能力を有するデキストリンデキストラナーゼ（以
下、ＤＤａｓｅという。）及びその生産方法に関するも
のである。
どの分野で利用されているデキストラン（α１，６グル
カン）を、マルトオリゴ糖，澱粉及びその分解物より生
成する能力を有するデキストリンデキストラナーゼ（以
下、ＤＤａｓｅという。）及びその生産方法に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】ＤＤａｓｅについては約４０年前に報告
（Ｈｅｈｒｅ，Ｅ．Ｊ．＆ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｄ．
Ｍ．（１９５１）：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５，１６１ １７
４．）が行われているが、それ以降全く研究がされてい
ない。同報告による精製手法とは、菌体を除去しないま
まの状態の菌体培養液に適量の硫酸アンモニウムを加え
ることによって生じる沈澱を集めた後、これを適量の蒸
留水に溶かし、溶けない細胞などを除去することによっ
て酵素を取得する方法である。また、現在における菌体
内酵素を精製する通常の方法は、細胞破壊により無細胞
抽出液を調製した後、有機溶媒を含まない緩衝液を用い
る各種クロマトグラフィーによる。
（Ｈｅｈｒｅ，Ｅ．Ｊ．＆ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｄ．
Ｍ．（１９５１）：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５，１６１ １７
４．）が行われているが、それ以降全く研究がされてい
ない。同報告による精製手法とは、菌体を除去しないま
まの状態の菌体培養液に適量の硫酸アンモニウムを加え
ることによって生じる沈澱を集めた後、これを適量の蒸
留水に溶かし、溶けない細胞などを除去することによっ
て酵素を取得する方法である。また、現在における菌体
内酵素を精製する通常の方法は、細胞破壊により無細胞
抽出液を調製した後、有機溶媒を含まない緩衝液を用い
る各種クロマトグラフィーによる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】発明者は、前述の報告
に基ずき実験によりＤＤａｓｅの生産と精製を行ったと
ころ、同精製方法では菌体中に存在する酵素量のわずか
数％の粗製酵素が得られただけで、従来の技術を使用し
てはこれ以上の精製はできなかった。また、細胞破壊に
よる精製では、超音波を用いた通常の菌体破壊処理によ
ってもなおＤＤａｓｅは菌体内にとどまったままであっ
た。この時得られるＤＤａｓｅを含む液を常法通り有機
溶媒を含まない緩衝液を用いた各種クロマトグラフィー
によって精製することを試みたが、ほとんど吸着せず精
製はできなかった。
に基ずき実験によりＤＤａｓｅの生産と精製を行ったと
ころ、同精製方法では菌体中に存在する酵素量のわずか
数％の粗製酵素が得られただけで、従来の技術を使用し
てはこれ以上の精製はできなかった。また、細胞破壊に
よる精製では、超音波を用いた通常の菌体破壊処理によ
ってもなおＤＤａｓｅは菌体内にとどまったままであっ
た。この時得られるＤＤａｓｅを含む液を常法通り有機
溶媒を含まない緩衝液を用いた各種クロマトグラフィー
によって精製することを試みたが、ほとんど吸着せず精
製はできなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本グルコノバクター属に
属するデキストリンデキストラナーゼ生産菌とは、グル
コノバクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９４株（Ｇｌ
ｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｓｔｒａｉｎ Ｎｏ．１１８９４），グルコノバク
ターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９５株（Ｇｌｕｃｏｎ
ｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｓ
ｔｒａｉｎ Ｎｏ．１１８９５）又はグルコノバクター
に属するその他のＤＤａｓｅ生産菌をいう。その培養
は、常法によればよい。
属するデキストリンデキストラナーゼ生産菌とは、グル
コノバクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９４株（Ｇｌ
ｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｓｔｒａｉｎ Ｎｏ．１１８９４），グルコノバク
ターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９５株（Ｇｌｕｃｏｎ
ｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｓ
ｔｒａｉｎ Ｎｏ．１１８９５）又はグルコノバクター
に属するその他のＤＤａｓｅ生産菌をいう。その培養
は、常法によればよい。
【０００５】本発明において有機溶媒とは、ｎ−ブタノ
ール，エチレングリコール，エタノール，プロパノー
ル，ジエチレングリコール等のアルコール類やアセトン
等をいう。特に菌体から酵素を抽出する際にはｎ−ブタ
ノール，クロロホルム等の水に溶けにくいあるいは水に
ほとんど溶けない、つまり極性の低い有機溶媒が好適に
用いられる。この極性の低い有機溶媒とはヘキサンを
０，水を９とした分類（以下、有機溶媒の極性とい
う。）により表すと５より低いものをいう。またクロマ
トグラフィーに吸着した酵素を溶出する際には、たとえ
ばエチレングリコールのように有機溶媒の極性が５以上
のものが好適に用いられる。有機溶媒を用いて採取する
には次のとおりに行う。培養後採取した菌体をそのまま
あるいは細胞破壊した後、緩衝液に懸濁する。緩衝液に
は酢酸緩衝液などＤＤａｓｅが安定に存在できるＰＨの
水溶液を用いることが望ましい。この懸濁液にたとえば
ｎ−ブタノールなどの極性の低い有機溶媒を同容量程度
加え分散させる。分散は手で軽く振とうする程度で容易
に行うことができる。この分散液を適時放置した後、遠
心分離すると有機溶媒を主とする層，水を主とする層及
び菌体あるいは菌体破砕沈澱物に分かれる。このうち水
を主とする層を集め、透析した後、疎水クロマトグラフ
ィーに供し、吸着したタンパク質を、たとえばエチレン
グリコール等の水で容易に溶かすことのできるアルコー
ル類などを含む緩衝液で溶出した後、これを濃縮し、同
じく緩衝液で平衡化したゲルろ過カラムに供し回収す
る。
ール，エチレングリコール，エタノール，プロパノー
ル，ジエチレングリコール等のアルコール類やアセトン
等をいう。特に菌体から酵素を抽出する際にはｎ−ブタ
ノール，クロロホルム等の水に溶けにくいあるいは水に
ほとんど溶けない、つまり極性の低い有機溶媒が好適に
用いられる。この極性の低い有機溶媒とはヘキサンを
０，水を９とした分類（以下、有機溶媒の極性とい
う。）により表すと５より低いものをいう。またクロマ
トグラフィーに吸着した酵素を溶出する際には、たとえ
ばエチレングリコールのように有機溶媒の極性が５以上
のものが好適に用いられる。有機溶媒を用いて採取する
には次のとおりに行う。培養後採取した菌体をそのまま
あるいは細胞破壊した後、緩衝液に懸濁する。緩衝液に
は酢酸緩衝液などＤＤａｓｅが安定に存在できるＰＨの
水溶液を用いることが望ましい。この懸濁液にたとえば
ｎ−ブタノールなどの極性の低い有機溶媒を同容量程度
加え分散させる。分散は手で軽く振とうする程度で容易
に行うことができる。この分散液を適時放置した後、遠
心分離すると有機溶媒を主とする層，水を主とする層及
び菌体あるいは菌体破砕沈澱物に分かれる。このうち水
を主とする層を集め、透析した後、疎水クロマトグラフ
ィーに供し、吸着したタンパク質を、たとえばエチレン
グリコール等の水で容易に溶かすことのできるアルコー
ル類などを含む緩衝液で溶出した後、これを濃縮し、同
じく緩衝液で平衡化したゲルろ過カラムに供し回収す
る。
【０００６】本発明のＤＤａｓｅは以下の特徴を有す
る。 １）作用 本酵素はアミロースなどを含めて重合度３以上のマルト
オリゴ糖に作用し、それら基質の非還元末端側のグルコ
ース残基を転移することによってデキストランを生産す
る。この作用は、反応に用いた物質がマルトースなどの
重合度が２つとなるマルトオリゴ糖となるまで進行す
る。このＤＤａｓｅの作用はマルトオリゴ糖の還元末端
に位置するグルコースが水素添加などの修飾を受けてい
ても同様である。 ２）最適ＰＨ及び安定ＰＨ ＤＤａｓｅの最適作用ＰＨは４．０〜４．５であり、各
種ＰＨ下で３０分置いた時にＰＨは２．５〜６．０で安
定であった。 ３）最適温度及び安定温度 ＤＤａｓｅの最適作用温度は３７〜４５℃であり各種温
度下で３０分置いた時に温度は４５℃以下で安定であっ
た。また、本酵素は５５℃まで活性を示した。 ４）分子量 電気泳動によるＤＤａｓｅの分子量は約３０万であっ
た。５）力価測定法 酵素反応基質には還元低加水分解澱粉を用い、常法によ
り測定した。力価は１分間に１μｍｏｌのグルコース単
位がデキストランとなる時の酵素量を１Ｕとした。
る。 １）作用 本酵素はアミロースなどを含めて重合度３以上のマルト
オリゴ糖に作用し、それら基質の非還元末端側のグルコ
ース残基を転移することによってデキストランを生産す
る。この作用は、反応に用いた物質がマルトースなどの
重合度が２つとなるマルトオリゴ糖となるまで進行す
る。このＤＤａｓｅの作用はマルトオリゴ糖の還元末端
に位置するグルコースが水素添加などの修飾を受けてい
ても同様である。 ２）最適ＰＨ及び安定ＰＨ ＤＤａｓｅの最適作用ＰＨは４．０〜４．５であり、各
種ＰＨ下で３０分置いた時にＰＨは２．５〜６．０で安
定であった。 ３）最適温度及び安定温度 ＤＤａｓｅの最適作用温度は３７〜４５℃であり各種温
度下で３０分置いた時に温度は４５℃以下で安定であっ
た。また、本酵素は５５℃まで活性を示した。 ４）分子量 電気泳動によるＤＤａｓｅの分子量は約３０万であっ
た。５）力価測定法 酵素反応基質には還元低加水分解澱粉を用い、常法によ
り測定した。力価は１分間に１μｍｏｌのグルコース単
位がデキストランとなる時の酵素量を１Ｕとした。
【０００７】
【作用】ＤＤａｓｅには有機溶媒に対する親和性が強く
且つ菌の細胞膜の近辺に存在するという特異性がある。
また有機溶媒は細胞膜の成分である脂質を溶かすことが
できる。したがって細胞を破壊しなくても有機溶媒によ
り直接作用させることにより、ＤＤａｓｅが抽出でき
る。一般的に、酵素は有機触媒の存在下ですみやかに活
性を失うが、ＤＤａｓｅは有機溶媒下で失活しない。
且つ菌の細胞膜の近辺に存在するという特異性がある。
また有機溶媒は細胞膜の成分である脂質を溶かすことが
できる。したがって細胞を破壊しなくても有機溶媒によ
り直接作用させることにより、ＤＤａｓｅが抽出でき
る。一般的に、酵素は有機触媒の存在下ですみやかに活
性を失うが、ＤＤａｓｅは有機溶媒下で失活しない。
【０００８】
【実施例】（実施例１） ０．５％酵母エキス，０．３％ポリペプトン，０．５％
グルコース，１％エタノールを含む培地４リットルを殺
菌後、グルコノバクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９
４株を接種し、３０℃で１６時間振とう培養した。得ら
れた菌体を１０ｍＭ酢酸緩衝液に懸濁し、等容積のｎ−
ブタノールを加えてよく混和した後、遠心分離すること
によって水層画分にＤＤａｓｅ活性を得た。この時の酵
素活性は０．５４Ｕ／ｍリットルであった。次にこの時
得られたＤＤａｓｅ画分を透析してｎ−ブタノールを除
去した後、４０％エチレングリコールを用いてフェニル
トヨパール，トヨパールＨＷ−６５Ｓクロマトグラフィ
ーを行い、ＤＤａｓｅを精製した。得られた精製酵素は
ゲル電気泳動によって単一のバンドを示し、この時の酵
素回収率は４９．７％であった。
グルコース，１％エタノールを含む培地４リットルを殺
菌後、グルコノバクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９
４株を接種し、３０℃で１６時間振とう培養した。得ら
れた菌体を１０ｍＭ酢酸緩衝液に懸濁し、等容積のｎ−
ブタノールを加えてよく混和した後、遠心分離すること
によって水層画分にＤＤａｓｅ活性を得た。この時の酵
素活性は０．５４Ｕ／ｍリットルであった。次にこの時
得られたＤＤａｓｅ画分を透析してｎ−ブタノールを除
去した後、４０％エチレングリコールを用いてフェニル
トヨパール，トヨパールＨＷ−６５Ｓクロマトグラフィ
ーを行い、ＤＤａｓｅを精製した。得られた精製酵素は
ゲル電気泳動によって単一のバンドを示し、この時の酵
素回収率は４９．７％であった。
【０００９】（実施例２） ０．５％酵母エキス，０．３％ポリペプトン，０．５％
グルコース，２％グリセリンを含む培地１リッ卜ルを殺
菌後、グルコノバクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９
４株を接種し、３０℃で１６時間振とう培養した。培養
後、遠心分離により得た菌体２．０ｇを２５ｍリット
ル，１０ｍＭ酢酸緩衝液に懸濁し、等容積のｎ−ブタノ
ールを加えてよく混和した後、遠心分離することによっ
て水層画分にＤＤａｓｅ活性を得た。この時の酵素活性
は０．３９Ｕ／ｍリットルであった。次にこの時得られ
たＤＤａｓｅ画分を透析してｎ−ブタノールを除去した
後、４０％エチレングリコールを用いてフェニルトヨパ
ール，トヨパールＨＷ−６５Ｓクロマトグラフィーを行
い、ＤＤａｓｅを精製した。得られた精製酵素はゲル電
気泳動によって単一のバンドを示した。その酵素活性か
ら算出された酵素回収率は２１．８％であった。
グルコース，２％グリセリンを含む培地１リッ卜ルを殺
菌後、グルコノバクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９
４株を接種し、３０℃で１６時間振とう培養した。培養
後、遠心分離により得た菌体２．０ｇを２５ｍリット
ル，１０ｍＭ酢酸緩衝液に懸濁し、等容積のｎ−ブタノ
ールを加えてよく混和した後、遠心分離することによっ
て水層画分にＤＤａｓｅ活性を得た。この時の酵素活性
は０．３９Ｕ／ｍリットルであった。次にこの時得られ
たＤＤａｓｅ画分を透析してｎ−ブタノールを除去した
後、４０％エチレングリコールを用いてフェニルトヨパ
ール，トヨパールＨＷ−６５Ｓクロマトグラフィーを行
い、ＤＤａｓｅを精製した。得られた精製酵素はゲル電
気泳動によって単一のバンドを示した。その酵素活性か
ら算出された酵素回収率は２１．８％であった。
【００１０】（実施例３） ０．５％酵母エキス，０．３％ポリペプトン，０．２％
グルコース，１％グリセリンを含む培地２リッ卜ルを殺
菌後、グルコノバクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９
５株を接種し、３０℃で４０時間振とう培養した。培養
後、遠心分離により得た菌体３．９ｇを４５ｍリット
ル，１０ｍＭ酢酸緩衝液に懸濁し、等容積のｎ−ブタノ
ールを加えてよく混和した後、遠心分離することによっ
て水層画分にＤＤａｓｅ活性を得た。この時の酵素活性
は０．２４Ｕ／ｍリットルであった。次にこの時得られ
たＤＤａｓｅ画分を透析してｎ−ブタノールを除去した
後、４０％ｎ−プロパノールを用いてフェニルトヨパー
ル，トヨパールＨＷ−６５Ｓクロマトグラフィーを行
い、ＤＤａｓｅを精製した。得られた精製酵素はゲル電
気泳動によって単一のバンドを示た。その酵素活性から
算出された酵素回収率は２３．４％であった。
グルコース，１％グリセリンを含む培地２リッ卜ルを殺
菌後、グルコノバクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９
５株を接種し、３０℃で４０時間振とう培養した。培養
後、遠心分離により得た菌体３．９ｇを４５ｍリット
ル，１０ｍＭ酢酸緩衝液に懸濁し、等容積のｎ−ブタノ
ールを加えてよく混和した後、遠心分離することによっ
て水層画分にＤＤａｓｅ活性を得た。この時の酵素活性
は０．２４Ｕ／ｍリットルであった。次にこの時得られ
たＤＤａｓｅ画分を透析してｎ−ブタノールを除去した
後、４０％ｎ−プロパノールを用いてフェニルトヨパー
ル，トヨパールＨＷ−６５Ｓクロマトグラフィーを行
い、ＤＤａｓｅを精製した。得られた精製酵素はゲル電
気泳動によって単一のバンドを示た。その酵素活性から
算出された酵素回収率は２３．４％であった。
【００１１】
【効果】本発明によりＤＤａｓｅが採取できた。また細
胞破壊を行わない容易な方法で且つ高い回収率でＤＤａ
ｓｅが精製できた。ＤＤａｓｅを精製することによっ
て、例えばマルトオリゴ糖等からデキストランを生産す
る際に従来法によって得られている粗製酵素中に含まれ
ているＤＤａｓｅ以外の酵素やその他の成分による影響
等を受けることがなくなる。また目的のデキストラン中
に不純物の混入が少なく、その精製は極めて容易にな
る。特に生成物であるデキストランは高分子物質である
ので、混入している異物の除去は困難であることから、
精製酵素を使用した方が良い。
胞破壊を行わない容易な方法で且つ高い回収率でＤＤａ
ｓｅが精製できた。ＤＤａｓｅを精製することによっ
て、例えばマルトオリゴ糖等からデキストランを生産す
る際に従来法によって得られている粗製酵素中に含まれ
ているＤＤａｓｅ以外の酵素やその他の成分による影響
等を受けることがなくなる。また目的のデキストラン中
に不純物の混入が少なく、その精製は極めて容易にな
る。特に生成物であるデキストランは高分子物質である
ので、混入している異物の除去は困難であることから、
精製酵素を使用した方が良い。
Claims (2)
- 【請求項１】 グルコノバクター属に属するデキストリ
ンデキストラナーゼ生産菌を培養し、これから有機溶媒
を用いて採取したものであることを特徴とするデキスト
リンデキストラナーゼ。 - 【請求項２】 グルコノバクター属に属するデキストリ
ンデキストラナーゼ生産菌を培養し、これから有機溶媒
を用いて採取することを特徴とするデキストリンデキス
トラナーゼの生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6959091A JPH066057B2 (ja) | 1991-01-10 | 1991-01-10 | デキストリンデキストラナーゼ及びその生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6959091A JPH066057B2 (ja) | 1991-01-10 | 1991-01-10 | デキストリンデキストラナーゼ及びその生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04234983A JPH04234983A (ja) | 1992-08-24 |
| JPH066057B2 true JPH066057B2 (ja) | 1994-01-26 |
Family
ID=13407195
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6959091A Expired - Fee Related JPH066057B2 (ja) | 1991-01-10 | 1991-01-10 | デキストリンデキストラナーゼ及びその生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH066057B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5224572B2 (ja) * | 2005-12-06 | 2013-07-03 | 国立大学法人北海道大学 | デキストラン生成酵素遺伝子、デキストラン生成酵素およびその製造方法、デキストランの製造方法 |
-
1991
- 1991-01-10 JP JP6959091A patent/JPH066057B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04234983A (ja) | 1992-08-24 |
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| JPH0144721B2 (ja) | ||
| JPH027631B2 (ja) |
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