JPH0660882B2 - バイオセンサ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、生体試料中の特定成分を検知するバイオセン
サに関するものであり、医療分野や食品工学などに幅広
く応用できる。

従来の技術 医療技術の進歩とともに、血液や尿中の特定成分を測定
することにより健康のチェック、病気の状態、治療の効
果などがわかるようになった。しかし、従来は病院の臨
床検査室で大型の機械や複雑な手法で調べているため、
時間や費用がかかるという問題があった。そこで、もっ
とも簡易にその場で測定できるセンサが望まれている。
その１つの試みとして第５図のような多層式の分析担体
が提案されている。透明な支持体１１の上に試薬層12、
展開層１３、防水層１４、濾過層１５が順に積層した構
造になっている。血液サンプルを上部から滴下すると、
まず、濾過層１５により血液中の赤血球，血小板などの
固形成分が除去され、防水層１４にある小孔から展開層
１３へ均一に浸透し、試薬層１２において反応が進行す
る。反応終了後、透明な支持体１１を通して矢印の方向
から光を当て分光分析により基質濃度を測定する方式で
ある。この方式は、微量の血液を滴下することにより簡
易に測定できるというメリットがある。

発明が解決しようとする問題点 しかし上記の方式では、血液の浸透および反応に時間が
かかるため、サンプルの乾燥を防ぐ防水層１４が必要と
なったり、反応を速めるために高温でインキュベートす
る必要があり、装置および担体が複雑化するという問題
がある。

本発明は、上記の問題点である装置や担体の複雑化をさ
け、簡易な装置および担体で迅速に精度よく基質が測定
できるようにすることを目的とする。

問題点を解決するための手段 本発明は、絶縁性の基体に測定極、対極および参照極を
有する電極層を設け、前記電極層の上に、親水性の保液
層と、多孔体膜からなる濾過層と、酸化還元酵素と前記
酸素と共役する酸化型色素を含んだ反応層を順次積層
し、前記保液層は前記濾過層より形状が小さくしたバイ
オセンサである。

また、本発明は保液層の周辺部に突起を、電極部と前記
保液層の間に中空枠体を設け、前記保液層の突起を前記
枠体の周辺部に係止させたバイオセンサである。

さらに、具体的には周辺部に突起を設けた保液層と、前
記保液層の上に配した濾過層と、前記濾過層の上に配し
た反応層を、開口部のある底部を有する中空枠体に収納
し、前記保液層の突起を前記中空枠体の底部の縁部に係
止させ、前記底部の開口部に空間部を介して前記電極層
を設けたことを特徴とする。

作用 本発明のバイオセンサに血液を滴下すると、反応層で酸
化還元酵素およびこの酵素と共役する酸化型色素がすみ
やかに反応する。次に濾過層において赤血球および血小
板が濾過される。この濾過された反応液は下層の保液層
に達する。保液層は外周部を切り欠いて空間部としてい
るので、反応液は保液層の全面にひろがり、電極の露出
している空間部に満たされる。すなわち、本発明のよう
に保液層の形状を濾過層の外形に比べ小さくすると、保
液層の体積も小さくなり、保液層での単位体積当たりの
被検液の量は大きくなる。また本発明では保液層の一部
もしくは突起部のみが中空枠体の底部の開口部周辺の縁
部と上部に配された枠体間で加圧されるが中空枠体の底
部の開口部に面している部分は加圧されないことにな
る。したがって、保液層の周辺全体が加圧される場合濾
過層からの被検液が保液層周辺に溜まってしまうが、本
発明では保液層の周辺全体が加圧されることがないので
保液層周辺に液溜まりが生じることがない。したがっ
て、濾過層からの被検液は保液層の突起部を介してその
保液層全体に供給され、保液層の中央部が希薄になると
いうこともなく、保液層は濾過層から吸収した液を速や
かに電極表面に供給できる。このようにして、保液層が
濾過された反応液をすみやかに電極部に誘導し、そこで
電極反応により反応量を検知する。このように短時間
で、血液サンプルが反応し濾過されるため、簡易な装置
および担体で精度よく基質の測定が可能となった。

実施例 バイオセンサの１つとして、グルコースセンサを例に説
明する。酸化還元酵素としてグルコースオキシダーゼ
を、酸化還元酵素と共役する酸化型色素としてフェリシ
アン化カリウムを用いた。第１図にグルコースセンサの
一実施例の構成を示す。塩化ビニル樹脂からなる円柱状
の絶縁性基体１の上端面に深さ０．１mmの溝２を形成
し、この溝２に露出するように白金を埋め込んで測定極
３，対極４，および参照極５からなる電極系を構成して
いる。前記電極系を覆うように枠体９と１０で反応層
８，濾過層７，保液層６をはさんだ測定チップを設置す
る。

反応層８はパルプの不織布からなり、グルコースオキシ
ダーゼ２００mgとフェリシアン化カリウム４００mgをＰ
Ｈ５．６のリン酸緩衝液１ccに溶かした高濃度の溶液を
含浸し、エタノールのような水に対する溶解度の大きい
有機溶媒中に浸漬後真空乾燥してグルコースオキシダー
ゼおよびフェリシアン化カリウムの細かい結晶を高密度
に担持している。濾過層７は孔径１μｍのポリカーボネ
ート多孔体膜で、血液中の赤血球などの固形成分を除去
するものである。保液層６は、例えばレーヨン紙を用
い、第２図に示すように濾過層７より径の小さい円板状
であるが、端部に突出部６ａを設け、枠体には突出部の
み固定されるようにしている。第３図に、測定チップを
保液層６側から見た図を示した。保液層の周辺部に空間
ができるような形状というのは、第３図において濾過層
７の下に保液層がない部分ができるような保液層の形状
を意味している。上記の反応層８，濾過層７，保液層を
枠体９，１０において圧着またはエポキシ樹脂により固
定している。

反応層８上に、試料液として血液を３０μ添加し充分
浸透させた後、参照極５を基準に測定極３の電圧を０〜
＋０．１Ｖの間で鋸歯状に０．１Ｖ／秒で変化させた。
この場合、白金からなる参照極５の電位は試料液に溶解
しているフェリシアン化カリウムとフェロシアン化カリ
ウムの濃度比で決定される。添加された血液中のグルコ
ースが反応層８に担持されているグルコースオキシダー
ゼにより酸化される際、酵素−色素共役反応によりフェ
リシアン化カリウムが還元されフェロシアン化カリウム
が生成する。続いて反応した血液がポリカーボネート多
孔体膜７を通過する際、赤血球などの大きな固体成分が
濾過される。血液のように高粘度で微量のサンプルの場
合、濾過が困難であるが、下にはレーヨン紙のように親
水性の薄膜を保液層として設置することにより、すみや
かに濾過でき、電極部に反応した血漿（濾過液）が達
し、保液層６により電極部の全面に均一に反応液が保持
される。反応液中のフェロシアン化カリウムを測定極３
の電圧を掃引することにより酸化し、その時酸化電流が
流れる。この酸化電流は色素の変化量に比例し、色素が
充分に存在すれば色素の変化量は基質濃度に対応するた
め、電流値を測定すると基質であるグルコースの濃度が
検知できる。このグルコースセンサを用いると、400mg
／dlという高濃度のグルコースが２分という短時間で測
定できた。これは従来例のように濾過して反応を行なわ
せるのでなく、まず反応を行わせる構成であり、高濃度
の基質に充分対応できる酵素と色素がとけやすい状態で
担持されているため短時間で反応が終了したと考えられ
る。さらに、濾過層の下に親水性の薄い保液層６を置く
ことによりわずか３０μという微量の血液の濾過をす
みやかにおこなわせ電極上に均一に展開して安定した応
答電流がとれるようになった。しかし、保液層６が濾過
層７と同じ形状のまま枠体９，１０に組みこむと、濾過
された血液は、保液層６の外周部で枠体９，１０により
固定された所が早く濾過されてその部分に血漿がたまる
ため、電極部の溝２に液が満たされない場合が生じる。
そのため、保液層６の形状を第１図のようにして液のた
まりやすい外周部に空間を設けると、濾過された血液は
すばやく保液層６の全面にひろがり溝２にも液が満たさ
れた。この溝２を設けることで直接電極表面に測定チッ
プが接触することが防げるため測定極３の反応面積を常
に一定に保ち再現性のよい応答が得られた。又、保液層
６の面積が空間部を作ることで小さくなり、血液の添加
量も２０μとさらに少なくすることができた。保液層
６を除去すると血漿の濾過がすみやかにできなくなり、
電極上に不十分な量の反応した血漿（反応液）が浸透す
るのに時間がかかった。さらに、反応液の電極上へのひ
ろがりが不均一なため応答電流のばらつきが大きくなり
精度よく測定できなかった。

この例では、保液層として厚み５０μｍという薄膜のレ
ーヨン紙を用いたが、厚みを増すと液の保持量が増加し
十分な量の反応液を電極に浸透させるのに時間がかか
り、血液量も多くを必要とした。又、レーヨン紙に酵素
や色素を担持したところ、濾過層７との接触面が酵素や
色素の結晶により接点が減少し濾過に時間がかかった。
以上より保液層６としては、親水性の薄膜であり、何も
担持されていない多孔体が望ましい。又、保液層の形状
は第２図に示すような形状以外でも第４図に示すような
形状が使用でき、さらに基体１の形状や枠体９，１０の
形状に合わせいろいろ変化させることが可能である。

本発明のバイオセンサは、試料液以外の希釈液などは必
要としないため、血液の添加量を３０〜１００μに変
化させたところ、同一の血液では添加量に関係なく一定
の値を示した。このため、添加量を正確にする必要がな
く、微量の血液を添加するだけで簡易に測定が可能とな
った。さらに、高濃度の酵素および酸化型色素を用いる
ことにより２分という短時間で反応が終了しているた
め、高温でインキュベートするための装置や蒸発を防ぐ
防水層が不要で、簡易な装置および担体で精度よく測定
できた。

保液層としてレーヨン紙を用いたが、濾過層から微量の
液をすみやかに電極上に展開するには、親水性でかつ薄
い多孔性の膜であることが望ましい。レーヨン紙の他に
瀘紙やナイロンの不織布なども使用できた。

色素としては、上記実施例に用いたフェリシアン化カリ
ウムが安定に反応するので適しているがＰ−ベンゾキノ
ンを使えば反応速度が早いので高速化に適している。
又、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メ
チレンブルー、フェナジンメトサルフェート、β−ナフ
トキノン−４−スルホン酸カリウムなども使用できる。

なお、上記実施例におけるセンサはグルコースに限ら
ず、アルコールセンサやコレステロールセンサなど、酸
化還元酵素の関与する系に用いることができる。酸化還
元酵素としてはグルコースオキシダーゼを用いたが、他
の酵素、たとえばアルコールオキシダーゼ、キサンチン
オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等も用いら
れる。

発明の効果 本発明のセンサによれば、直接微量なサンプルを滴下す
るだけで、特定成分を短時間に精度よく測定することが
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例のグルコースセンサの縦断面
図、第２図はその分解斜視図、第３図は第１図III−II
I′線断面図、第４図は保液層の変形例を示す平面図、
第５図は従来のバイオセンサの縦断面図である。 １……基体、２……溝、３……測定極、４……対極、５
……参照極、６……保液層、７……濾過層、８……反応
層、９と１０……枠体、１１……支持体、１２……試薬
層、１３……展開層、１４……濾過層、１５……防水
層。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】絶縁性の基体に測定極、対極および参照極
   を有する電極層を設け、前記電極層の上に、親水性の保
   液層と、多孔体膜からなる濾過層と、酸化還元酵素と前
   記酵素と共役する酸化型色素を含んだ反応層を順次積層
   したものであり、前記保液層の形状を前記濾過層の形状
   より小さくしたことを特徴とするバイオセンサ。
2. 【請求項２】周辺部に突起を設けた保液層と、前記保液
   層の上に配した濾過層と、前記濾過層の上に配した反応
   層を、開口部のある底部を有する中空枠体に収納し、前
   記保液層の突起を前記中空枠体の底部の縁部に係止さ
   せ、前記底部の開口部に空間部を介して前記電極層を設
   けたことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のバイ
   オセンサ。