JPH0660901B2 - 酵素免疫測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、生体物質の微量を検出測定するために適用さ
れる酵素免疫測定法（エンザイムノアツセイ）に関する
ものである。

〔発明の背景〕

生体物質の微量を検出測定するために用いられる免疫学
的手法の一つとしてラジオイムノアツセイのように取扱
上の注意を要する放射性同位元素を使用する方式でな
く、酵素を抗原抗体反応複合物の標識として用いるよう
にした酵素免疫測定法が近時注目され、研究開発が盛ん
になつている。

この酵素免疫測定法は、例えばClinical Chemistry,vol
22 No.81243−1255（1976）に示されるような種々の方
法があるが、一般的には、反応室であるセルの内壁面又
はセル内に填加されたビーズの表面に抗原あるいは抗体
を固定した状態で、抗原あるいは抗体に標識として酵素
を結合したコンジユケートと抗原抗体反応により複合物
を生成させ更に、この酵素の活性作用を受けて、光学的
に検知可能な変化（螢光強度、吸光度、発光強度等の変
化）を生ずる基質を、前記セル内に填加し、この基質の
変化を螢光測定器、吸光光度計等の光学手段で測定し、
この測定結果に基づいて酵素を含む複合物の量ひいては
抗原又は抗体の量を定量するようにしたことを内容とす
る。

ところで、一般に１０^-13以下というような微量な生体
物質の定量を目的とする酵素免疫測定法にあつては、測
定誤差の影響度合が大きく、したがつて測定機器の高性
能化と共に、誤差の発生要因の除去が強く求められると
いつてよい。

かかる観点から本発明者は従来一般の酵素免疫測定の手
法を種々検討したところ次の問題点が明らかとなつた。
すなわち、一般にこの種の測定は、セル（反応室）を提
供するカツプ等の内壁面、カツプに填加されたビーズ、
あるいはその他の不溶性担体に固定した状態で抗原−抗
体−酵素の複合物を生成させ、これに基質溶液を接触さ
せて基質に対する酵素反応を開始させ、次いで一定時間
後に停止液を用いて酵素反応を停止させ、その時の基質
螢光強度を測定するか、あるいは停止液を用いずに一定
時間後の基質螢光強度を測定するかして酵素免疫測定が
行なわれているが、かかる方法では、酵素反応開始から
測定時点までの時間の厳密管理が要求されること、酵素
反応開始時点での基質の螢光強度は必ずしも零でなくあ
る程度のバラツキをもつた値を示すため、所謂零点補正
が必要になること、また基質に現われる螢光強度の増大
変化を示す特性線は、酵素反応の開始後増加率が漸次低
下する曲線を示し、しかも酵素の量によつて相違する二
以上の特性曲線の相互はリニヤな相関関係になく、した
がつて測定時間のバラツキで現われる誤差の程度も、各
特性曲線毎に夫々異ること等々の問題点が指摘されるの
である。

〔発明の目的〕

本発明は以上のような種々の点に鑑みてなされたもので
あり、その目的は酵素免疫測定における測定精度の向上
を図るところにある。

また本発明の別の目的は、高精度な測定を、測定操作上
の時間管理等の負担を大きくすることなく実現するとこ
ろにある。

また本発明の更に別の目的は、測定操作を迅速かつ能率
よく行なうことを可能とし、多数の試料の測定処理効率
を向上させることを目的とする。

〔発明の概要〕 而して以上の目的を実現するためになされた本発明より
なる免疫測定法の特徴は、酵素で標識された抗原又は抗
体を含む抗原抗体反応複合物を、上方に開口した有底筒
状の反応室であるセル内に充填された 1.4〜5mm の不溶
性磁性ビーズの表面に固定した状態で有し、前記酵素の
活性ｐＨ範囲と該酵素に反応する基質の蛍光測定時のｐ
Ｈとが重複する組み合わせを用い、前記重複ｐＨ範囲に
調整された基質溶液中において該基質とこの溶液中に不
均一に存在する前記複合物中の酵素とを接触させた際に
現れる基質蛍光強度の変化度合を測定する酵素免疫測定
法であって、前記基質溶液中で基質と酵素を接触させる
初期から前記ビーズにセル底面上で10〜180 回／分の直
線運動又は円運動を生ずるように振動磁界をセル外から
与え、これと並行して現れるセル内溶液の基質蛍光強度
の経時的変化をセル上方から光学的に測定し、測定され
た蛍光強度の変化特性線の実質的に直線をなす部分の少
なくとも２点間の傾きから、抗原又は抗体の濃度を検出
するようにしたところにある。

酵素反応によつて基質に現われる螢光強度の程度は、溶
液中の基質濃度および酵素の量（すなわち抗原−抗体−
酵素の複合物の量）によつて異り、前者の基質濃度を一
定とすれば、螢光強度は酵素の量に依存する。そして前
記ビーズの表面に固定した状態で抗原−抗体−酵素の複
合物を生成させ、この複合物に基質を接触させる不均一
系溶液において、酵素反応の現われ方を螢光強度の変化
として詳しく観察すると、酵素反応の開始初期には螢光
強度が実質上直線的に増大する領域のあることが認めら
れた。この領域は変化特性線の２点間の傾きを測定上有
意な値（誤差が十分小さい値）として検出するに十分で
あり、また前記２点間の傾き（増大率）は、一定濃度の
基質を用いれば溶液中の酵素の量にリニヤに依存すると
言つて差支えないから、かかる点を測定する本発明方法
が有効なものとして採用されるのである。

本発明方法においては、抗原−抗体−酵素複合物が不溶
性担体であるビーズの表面に固定されて、これを例えば
反応容器（テストカップ）に填加して用いられる。

また前記した螢光強度の増大が、初期の直線的領域から
漸次増大率の低下する領域に移行するのは、溶液中で不
均一に存在する複合物の酵素反応が、経時時に溶液中で
の基質の拡散に律速されるためと解される。拡散の影響
を低減するには高濃度の基質を用いることも考えられる
が、高濃度液では液中の物質による蛍光の吸収の問題が
ある。したがって本発明においては、前記傾きを検出す
るための測定２点間の間隔を拡げて、一層の精度向上を
図るために、ビーズを溶液中で低周波振動させるように
した。振動は、セル内に填加した磁性ビーズを振動磁界
により振動されることで与えられる。振動の程度は、通
常１０〜１８０回／min、好ましくは７０〜１２０回／m
inがよく、ビーズの振動の場合、ビーズが直線往復動又
は円運動をセル内の全域に渡るようにすることが好まし
い。このようなビーズ振動のための装置としては、透磁
性カツプ、例えばフエライト等磁性粉（好ましくは常磁
体粉）をポリスチレン、ＥＶＡ等の樹脂バインダーで結
着した磁性ビーズ、および例えば永久磁石を往復動させ
るようにして設けられた振動磁界を及ぼす磁石装置等か
ら構成されたものを挙げることができる。ビーズ表面へ
の抗原又は抗体の固定は既知の方法によればよい。

本発明における酵素免疫測定法で対象とされる抗原、抗
体は特に限定されるものではない。また標識される酵素
おび基質は、酵素の活性pＨ範囲と、基質螢光測定のた
めのpＨ範囲とが重複する組合せのものであればよく、
他は格別限定されるものではない。

螢光測定は適宜の光学装置を使用して行ない測定結果か
ら検出した螢光強度変化特性線の実質的直線部分の傾き
を予め求められている検量線と対比することで、酵素の
量ひいては抗原量又は抗体量を得ることができる。

〔発明の実施例〕

以下本発明の実施態様を図面に基づいて説明する。

第１図は本発明方法を適用する装置一例の一部構成概要
を示したものであり、１はテストカツプ、２はテストカ
ツプ１内に填加されたビーズ（ビーズの大きさは限定さ
れないが測定セルの口径の1/2以下程度以下が好まし
い。）であり、このビーズ表面に固定した状態で抗原−
抗体−酵素の複合体が常法により生成される。

３は基質溶液であり、その螢光測定のためのpＨは、前
記酵素の活性pＨと一致したものが選択される。

テストカップ１に、ビーズ２および基質溶液３が共に填
加された直後から蛍光検出装置による蛍光測定が開始さ
れる。

本例の螢光検出装置は、光源４、励起側フイルタ５、ダ
イクロイツクミラー６、集光レンズ７、受光側フイルタ
８、受光センサ９とからなり、受光センサ９で検出され
た信号は適宜増幅器等を介した後マイクロコンピユータ
等の演算回路（図示せず）に入力され、螢光強度変化特
性線を経時的に算出する。第２図のａ，ｂ，ｃはこのよ
うにして算出された螢光強度変化特性線の例を示したも
のであり、測定される各試料中の抗原（又は抗体）の量
は、螢光強度の大きい順にａ＞ｂ＞ｃである。そして、
これら各特性線ａ，ｂ，ｃの酵素反応開始の初期には、
第２図中t₁〜t₂で示した領域で拡散に殆んど影響されな
い実質的な直線部分が現われる。したがつてこの領域内
での２点間より、各試料についての螢光強度増大率（傾
き）を検出し、これを検量線と比較することで高精度な
抗原量又は抗体量の測定が実現される。

このような方法によれば、前記特性線の零点補正は不要
であり、しかも増大率（傾き）を算出するための２点間
の時間間隔を正確に管理すれば、反応開始（例えばテス
トカツプへの基質溶液の注入）の操作の時間管理は特に
要求されることもなく、測定操作処理上の容易化、簡易
化が大幅に実現される利点がある。特に多数の試料の測
定を連続的に行なうような装置の構成にあたつては、テ
ストカツプへの基質溶液注入の時点を厳しく制約されな
いことは装置設計上の自由度を拡大し、その実際上の利
益は極めて大きいものとなる。

本発明は前記例の装置において更に、ビーズが磁性体を
含有する磁性ビーズ２′とし、また例えば第３図に示す
ようにテストカップ１の下方近傍において、適宜の間隔
で永久磁石１１を固着した棒体１０を水平方向に往復動
させる機構を設けて、これによりテストカップ内の磁性
ビーズを所定の周波数で振動させながら、同時に前記蛍
光測定を行なうようにしたことを特徴としている。

このような本発明によれば、テストカツプ１内のビーズ
は、往復動する永久磁石片１１，１１によつて該テスト
カツプ１内を往復振動し、この結果得られる螢光強度変
化特性線は、第４図ａ′，ｂ′，ｃ′のように、実質的
な直線部分が経時的に長く現われるものとなる。したが
つて検出される増大率（傾き）の精度は第１図の例に比
べて一層良好となり、微量生体物質の定量測定において
の効果は極めて大となる。

実施例 第１図に示した装置を用い、酵素としてアルカリフォス
ファターゼを標識した複合体を１．４ｍｍのビーズ１０
個の表面に生成した後、４−メチルウンベリフエロンを
基質として含む基質溶液（濃度１m mol/ pH 9.5）を
テストカップ１内に注入し、第３図の例に従い、９０回
／min の周波数で振動させながら蛍光の測定を行なっ
た。

この場合螢光強度変化特性線の実質的直線部分は、基質
溶液注入後から６０秒までの間で現われ、この領域内の
任意の２点間の傾きは、同一試料を対象とした複数回の
試験において誤差０．１％以下のものであつた。

〔発明の効果〕

以上述べたように、セル内に磁性ビーズと基質を填加
し、該磁性ビーズを振動させながら同時に蛍光測定を行
なうようにした本発明の方法によれば、微量生体物質の
定量を高精度に行なうことができ、しかも誤差の要因で
ある零点のオフセツト、測定処理のための時間管理の厳
密さの要求が軽減ないし無関係となり、また、高濃度の
基質を使用した場合の溶液中の未反応の基質による影
響、すなわち測定すべき励起された蛍光が未反応基質で
吸収されて減少する、励起光が未反応基質に吸収され
る、測定対象外の蛍光が未反応基質から生ずる等の影響
が、未反応基質が高濃度に存在する場合に大きいが、本
発明では低濃度の基質を使用できるのでこれらの影響を
小さくできるなどその効果は極めて大なるものである。
また更に、多数の試料を連続的に処理するための装置を
構成する場合に、本発明方法によれば装置設計の自由度
が大きく得られこの点の効果も極めて大なるものであ
る。

【図面の簡単な説明】 図面第１図は本発明方法を実施するために用いられ装置
の構成の一部を示す概要図、第２図は同装置を用いて、
ビーズを振動させずに試験を行なった場合に得られる蛍
光強度変化特性線の状態を説明する図。第３図は、本発
明方法によるビーズを振動させるために用いられる装置
の一例を説明するための概要図、第４図は同第３図の装
置を用いてビーズを振動させながら試験を行なった場合
に得られる蛍光強度変化特性線の状態を説明する図であ
る。 １……テストカツプ、２……ビーズ ３……基質溶液、１１……磁石片。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵素で標識された抗原又は抗体を含む抗原
   抗体反応複合物を、上方に開口した有底筒状の反応室で
   あるセル内に充填された 1.4〜5mm の不溶性磁性ビーズ
   の表面に固定した状態で有し、前記酵素の活性ｐＨ範囲
   と該酵素に反応する基質の蛍光測定時のｐＨとが重複す
   る組み合わせを用い、前記重複ｐＨ範囲に調整された基
   質溶液中において該基質とこの溶液中に不均一に存在す
   る前記複合物中の酵素とを接触させた際に現れる基質蛍
   光強度の変化度合を測定する酵素免疫測定法であって、 前記基質溶液中で基質と酵素を接触させる初期から前記
   ビーズにセル底面上で10〜180 回／分の直線運動又は円
   運動を生ずるように振動磁界をセル外から与え、これと
   並行して現れるセル内溶液の基質蛍光強度の経時的変化
   をセル上方から光学的に測定し、測定された蛍光強度の
   変化特性線の実質的に直線をなす部分の少なくとも２点
   間の傾きから、抗原又は抗体の濃度を検出することを特
   徴とする酵素免疫測定法。