JPH0712816A - 特異結合反応を利用した生体物質の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】短時間かつ高感度で被測定物質を定量できる特
異結合反応を利用した生体物質の測定方法を提供する。 【構成】担体に抗体を固層化した後、抗原を含むサンプ
ルを接触させる。サンプル中の抗原は抗体に結合する。
洗浄後、アルカリフォスファターゼで標識された抗体を
接触させて抗原に結合させる。ＡＭＰＤＤをアルカリフ
ォスファターゼに反応させる。反応開始後に所定時間経
過した後、発光を１秒間ごとにフォトンカウントし、こ
れを所定時間連続して行う。得られた測定結果から、発
光強度の経時変化量を求め、濃度既知のサンプルから得
られた検量線に基づいてサンプル中の抗原を定量する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫反応のような生体
の特異結合反応を利用した測定反応に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、抗原または抗体を定量するため
に、酵素活性を標識として抗体または抗原と被測定物質
の間で抗原抗体反応を追跡し、その結果に基づいて抗原
または抗体を定量する酵素免疫測定法が主に医療または
バイオテクノロジーの分野で行われている。この酵素免
疫測定法の一つとして、生物発光、化学発光または蛍光
を利用するものがある。これは、酵素標識抗原または抗
体と基質とを反応させ、この酵素反応により生じる発光
または蛍光を受光器で検出し、その強度を測定すること
により行われる。

【０００３】上述の酵素および基質の反応により生じる
発光または蛍光の強度の測定は、例えば、光子計数（フ
ォトンカウント）法により行っている。この場合、ある
時点での発光または蛍光の強度、あるいは、特定の時間
範囲での発光または蛍光の強度を測定している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述の酵素免疫測定法
において、発光または蛍光を生じる基質として、ルミノ
ールやアクリジニウム・エステルのように極めて短時間
で発光を起こす物質を用いる場合には、測定も極めて短
時間で終了する。しかしながら、短時間で発光または蛍
光のピークが現れる場合には、応答性の速い測定装置を
構成しない限り、操作が困難であり、自動化する上でも
障害となる。そこで、一般に用いられる基質の中には、
例えばジオキセタン誘導体やルミノール・ｐ−ヨードフ
ェノール系のように、発光または蛍光反応が緩慢に進行
する場合がある。例えば、ジオキセタン誘導体は、図９
に示すように、酵素基質反応開始後約２０分まで発光強
度がゆっくり増加し続ける。なお、図９ではアルカリフ
ォスファターゼの濃度は１０^-4unit/ mlとなっている。

【０００５】このような発光または蛍光反応が遅い基質
を用いた場合、発光または蛍光のピーク値を逃す問題は
解消される反面、測定は短時間で行うことが極めて難し
い。なぜならば、酵素基質反応が開始した後短時間で
は、発光または蛍光の強度が十分でなく測定が難しく、
測定に十分な強度が得られるまでには長時間を要するか
らである。また、被測定物質が低濃度になる程、発光ま
たは蛍光のピークが不明瞭になるので、ピーク部分の発
見が遅れてしまう可能性すらある。

【０００６】また、従来の光子計数方式では、測定装置
での迷光等によりバックグランド・ノイズが発生する
と、計数結果にバックグランド・ノイズが含まれてベー
スが上昇し、高感度測定が難しくなる。

【０００７】なお、以上の説明では、酵素免疫測定法に
おける問題について説明したが、同様の問題は、相補的
ＤＮＡ鎖による反応やＤＮＡ結合鎖とＤＮＡとの間の反
応のような生体の特異結合反応においても認められてい
る。本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、
短時間かつ高感度で被測定物質を定量できる特異結合反
応を利用した生体物質の測定方法を提供する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、被測定物質と
前記被測定物質に特異的に結合しかつ酵素で標識された
特異反応物質とを反応させた後、前記被測定物質および
前記特異反応物質に前記酵素と反応して発光または蛍光
を示す基質を反応させて生じた発光または蛍光を検出す
ることにより被測定物質を定量する生体物質の測定方法
であって、発光または蛍光の検出強度の経時変化量に基
づいて前記被測定物質を定量することを特徴とする特異
結合反応を利用した生体物質の測定方法を提供する。

【０００９】以下、本発明の生体物質の測定方法をさら
に詳細に説明する。ここで、特異結合反応とは、例え
ば、抗原抗体反応、相補的ＤＮＡ鎖による反応（ＤＮＡ
−ＲＮＡ結合も含む）を包含する。

【００１０】また、被測定物質は、特異結合反応が抗原
抗体反応である場合には抗原または抗体であり、固相酵
素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）におけるサンドイッチア
ッセイのように、担体に結合された抗原に結合した抗体
であっても良い。かかる被測定物質の例としては、各種
病原菌、ウイルス、ホルモン、アレルゲン、血液型抗
原、組織型抗原、アミノ酸等の抗原またはその抗体が挙
げられる。

【００１１】標識に用いる酵素としては、通常標識酵素
として用いられるものであれば特に限定されないが、例
えば、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼを好ましく用いること
ができる。

【００１２】酵素と反応して発光または蛍光を生じる基
質は、標識に用いられる酵素に応じて選択される。例え
ば、標識酵素としてアルカリフォスファターゼやβ−ガ
ラクトシダーゼを用いた場合には基質としてはジオキセ
タン誘導体が好ましく用いられる。

【００１３】本発明の生体物質の測定方法において、生
体物質の定量は、発光または蛍光の検出強度の経時変化
量に基づいて行う。すなわち、酵素基質反応を開始して
所定の時間経過した後、所定時間の間、発光または蛍光
の検出強度を連続して測定する。この測定結果から検出
強度の経時変化量を求める。

【００１４】例えば、濃度既知のサンプルを用意し、こ
のサンプルにおける特異結合反応を酵素基質反応で捕捉
し、酵素基質反応により生じる発光または蛍光の検出強
度を上述のように連続して測定する。得られた測定結果
に基づいて、測定時間および検出強度の関係（以下、時
間特性ともいう）を示す特性線を作成し、この特性線に
対して最小自乗法を施し、この特性線を直線に近似させ
る。この直線の傾きが、検出強度の経時変化量を示し、
試料溶液中の特異結合反応の状態、すなわち、試料溶液
中の生体物質の量に依存する。従って、複数の濃度既知
のサンプルを用いて、上記の時間特性の傾きと被測定物
質の濃度との関係からなる検量線を作成し、未知量の被
測定物質を含有するサンプルの時間特性の傾きを測定し
て、検量線からサンプル中の被測定物質の定量を行うこ
とができる。

【００１５】また、検量線は、被測定物質の濃度と検出
強度の経時変化量との関係からなるものではなく、異な
る濃度で酵素を含有するサンプルを用いて検量線を作成
し、酵素濃度と検出強度の経時変化量との関係からなる
ものであっても良い。酵素の量は、その酵素で標識され
た特異反応物質が結合する被測定物質の量と常に一定の
相関を持っているので、酵素量から被測定物質の量を決
定できる。

【００１６】

【作用】本発明の特異結合反応を利用した生体物質の測
定方法によれば、発光または蛍光の検出強度の経時変化
量を求めている。この経時変化量は被測定物質の量に依
存し、既知の被測定物質の量と経時変化量との関係に基
づいて、未知量の被測定物質を決定する。これにより、
酵素基質反応による発光または蛍光の検出強度が飽和に
達するのを待つことなく被測定物質の定量を行うことが
できる。また、発光または蛍光の検出強度の経時変化量
は、検出強度が含むベースを含んでいないので、光子計
数方式の測定装置での迷光等によって発生するバックグ
ランド・ノイズによる影響が少ない。

【００１７】

【実施例】以下、本発明の生体物質の測定方法を詳細に
説明する。図１は、本実施例の生体物質の測定方法に用
いる化学発光測定装置の一例を示すブロック図である。
図中１１は、内部に試料溶液が収容され、発光または蛍
光反応により生じた生物発光、化学発光または蛍光を外
部に透過し得るようになっている。反応容器１１として
は、例えば、ガラスチューブ、ポリスチレン等のプラス
チック製チューブやマイクロタイタープレートを用いる
ことができる。

【００１８】反応容器１１からの発光または蛍光は受光
素子１２で受光する。受光素子１２で得られた信号は増
幅器１３で増幅された後、光子計数管１４でフォトンカ
ウントされ、計数結果はデ−タ処理装置１５で処理され
る。デ−タ処理装置１５としては、コンピュ−タなどの
計算機を用いて演算処理することができる装置を用いる
ことができる。

【００１９】本実施例では、発光基質としては、ジオキ
セタン誘導体（ＡＭＰＰＤ；３−（４−メトキシスピロ
［１，２−ジオキシエタン−３，２´−トリシクロ
［３，３，１，１^3,7 ］デカン］−４−イル）フェニル
リン酸二ナトリウム；Ｔｒｏｐｉｘ社製“Ｅｌｉｓａ
Ｌｉｇｈｔ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ”）を用いた。

【００２０】本実施例で使用した試薬は、アッセイ・バ
ッファー (Assay Buffer) としては、０．１Ｍジエタノ
−ルアミン，１ｍＭ塩化マグネシウム，０．０２％アジ
化ナトリウム；ＰＨ９．５を用意した。基質液として
は、１０％エメラルド (Emerald)，０．４ｍＭ ＡＭＰ
ＰＤを用いた。また、洗浄用緩衝液としては、０．００
５％のトウィーン２０を含むトリス塩酸緩衝生理食塩水
（ＰＨ７．６）を用いた。

【００２１】本実施例の生体物質の測定方法では、固相
法による２ステップ・サンドイッチサッセイを行った。
まず、図２（Ａ）に示すように、反応容器１１（Ｎｕｎ
ｃ社製マイクロプレート）のウエルの内壁に被測定物質
であるＨＢｓ抗原２２に対して特異的に反応する抗ヒト
ＨＢｓ抗体２１（日本特殊免疫）を２μｇ／ｍｌ、１０
０μｌ用いてオーバーナイトすることで固相化した。固
相化終了後、抗原の非特異的結合を防ぐ目的で反応容器
１１の固相化表面を３％牛アルブミンでブロッキングし
た。

【００２２】次に、反応容器１１に、図２（Ｂ）に示す
ように、サンプル１００μｌを添加して室温で３０分間
一次反応を行った。ここで、サンプルとしては、上記洗
浄用緩衝液中に所定濃度のＨＢｓ抗原（明治乳業）を溶
解させたものを用いた。これにより、図２（Ｃ）に示す
ように、サンプル中のＨＢｓ抗原２２が、抗ヒトＨＢｓ
抗体２１に結合した。

【００２３】一次反応終了後、反応液を除去し、反応容
器１１を洗浄用緩衝液を用いて洗浄した。洗浄後、反応
容器１１に酵素標識抗ＨＢｓ抗体液（オリンパス光学工
業社製）を添加して３０分間二次反応（抗原抗体反応）
を遂行した。これにより、図２（Ｄ）に示すように、抗
ヒトＨＢｓ抗体２１に結合したＨＢｓ抗原２２に、酵素
２３で標識された二次抗体２４が結合した。酵素２３
は、アルカリフォスファターゼである。

【００２４】二次反応終了後、反応液を除去し、反応容
器１１を洗浄用緩衝液を用いて再び洗浄した。図２
（Ｅ）に示すように、洗浄後、濃度が１７ｍｇ／ｍｌの
ＡＭＰＰＤ液および濃度０．１％のエメラルド液を添加
した後、室温で酵素基質反応を行った。

【００２５】酵素基質反応開始後、所定時間が経過した
後、上述の化学発光測定装置を使用して発光強度を測定
した。発光強度の計測は１秒単位で行ない、１秒間で計
数されたフォトンの数を測定値とし、所定時間連続して
計測した。

【００２６】図３に、抗原濃度１０ｎｇ／ｍｌのＨＢｓ
抗原を含有するサンプルについて、上述の通りに発光強
度を測定した場合の抗原抗体反応による発光強度と時間
との関係を示す。図３の横軸は、発光強度の測定を開始
してからの時間を示し、縦軸は、発光強度（単位；１秒
あたりのカウント数）を示す。ここで、発光強度の測定
は、酵素基質反応を開始して１７分間経過してから開始
し、１秒単位で６０秒間行った。

【００２７】図３から明らかなように、抗原抗体反応が
起こると、上記標識抗体に標識された酵素に対する酵素
基質反応により化学発光が生じる。この発光強度は時間
と共に増大していく。また、発光強度が増大していく傾
向は抗原濃度依存性を示し、抗原濃度の増加に伴って大
きくなる。

【００２８】次に、異なる濃度のアルカリフォスファタ
ーゼ（東洋紡）を上記洗浄用緩衝液中に溶解させたもの
をサンプルとして用意し、上述の手順に従って、酵素基
質反応を開始して１７分が経過した後から、６０ポイン
トのデ−タを得る。夫々の酵素濃度における発光強度と
時間との関係（時間特性）をグラフに表した場合の特性
線の傾きを最小自乗法で求めた。

【００２９】これらの各サンプルから得られた時間特性
の傾きを縦軸にとり、アルカリフォスファタ−ゼの濃度
（単位；単位／ｍｌ）を横軸にとって、図４に示すよう
な検量線が得られた。

【００３０】図４に示す検量線に基づいて、サンプル中
のＨＢｓ抗原の濃度を定量できる。すなわち、検量線を
作成した場合と同じ条件で、未知量のＨＢｓ抗原を含有
するサンプルについて発光強度の測定を測定し、対応す
る検量線から測定値に対応するアルカリフォスファタ−
ゼの濃度を求め、これに対応するＨＢｓ抗原の濃度を決
定することができる。

【００３１】本実施例の生体物質の測定方法によれば、
アルカリフォスファターゼの濃度と発光強度の時間特性
の傾きに基づいて検量線を作成し、サンプル中のＨＢｓ
抗原の濃度を求めている。発光強度の経時変化量は、発
光強度に含まれるベースを含んでいないので、迷光等に
よるバックグランド・ノイズによりベースが上昇して
も、その影響をほとんど受けず、Ｓ／Ｎ比の低下を防ぐ
ことができる。

【００３２】図５に、上述と同様にして、各種濃度のＨ
Ｂｓ抗原を含むサンプルについて、酵素基質反応を開始
して３０秒後から６０秒後までの３０秒間測定を連続し
て行ない、得られたデ−タに基づいて時間特性の傾きを
最小自乗法で近似して求めた結果を示す。この場合の測
定点数は１秒毎に計３０点とし、抗原濃度毎に各２つの
サンプルによる結果をプロットした。なお、比較データ
として、同様に３０秒後〜６０秒後の間の発光強度を平
均した値を抗原濃度毎にプロットしたものを図６に示し
た。図５および図６を比較して明らかなように、発光強
度を縦軸にプロットしただけでは、抗原濃度が低いほど
定量測定が困難なため測定感度が１ｎｇ／ｍｌ程度にす
ぎない（図６参照）。これに対して、最小自乗法に基づ
く時間特性の傾きによれば、抗原濃度に応じた結果が得
られるので、酵素基質反応が始まって極めて早い時期に
も拘らず既に定量測定が可能な状態になっている（図５
参照）。

【００３３】図７は、上述と同様にサンドイッチアッセ
イを行ない、酵素基質反応を開始して６０秒後から１２
０秒後までの６０秒間測定を連続して行ない、得られた
デ−タに基づいて時間特性の傾きを最小自乗法で近似し
て求めた結果であり、測定点数は６０点である。また、
比較データとして、同様に１分後〜２分後の間の１秒毎
の発光強度を平均した値を抗原濃度毎にプロットして図
８を得た。図７および図８を比較して明らかなように、
発光強度を縦軸にプロットしただけでは、図６と同様に
抗原濃度が低いほど定量測定が困難になっている（図８
参照）。これに対して、最小自乗法に基づく時間特性の
傾きによれば、抗原濃度に応じた結果がより相関性良く
得られており、測定感度についても１０^-2〜１０^-1ｎｇ
／ｍｌという超高感度な定量測定が可能であることを示
唆している（図７参照）。

【００３４】なお、以上説明した本実施例において、発
光強度の測定は、１ポイント毎秒単位で行なっている
が、これに限ることなく、１ポイント毎０．１秒でも良
いし、１ポイント毎２秒でも良い。即ち、測定を開始し
て１０秒〜２分間、好ましくは３０秒〜６０秒間に、１
０〜１００点、好ましくは３０〜６０点に亘って得た測
定値を用いると良い。測定可能な範囲は発光または蛍光
反応が進行し初めてから反応が飽和するまでの間、本実
施例では反応開始後３０秒〜１７分間、であれば構わな
いが、実用的には最小自乗法による各プロットがより直
線に近い有効範囲を設けて、その中からなるべく迅速に
測定できる測定開始時機を選択すればよい。

【００３５】また、本実施例では抗体を反応容器の内壁
に固相化したが、抗原を固相化して抗体を測定すること
もできる。また、抗原または抗体は、反応容器の内壁に
固相化するに限ることなく、磁性ビーズ、ガラスビ−ズ
若しくはポリスチレンビーズなどの微粒子に抗原または
抗体を固相化して、上述と同様にサンドイッチアッセイ
を行なうこともできる。また、反応容器として、スライ
ド、カラム、フィルター、チューブ等の種々の形態のも
のを使用しても良い。さらに、使用する発光または蛍光
用基質、酵素、洗浄用緩衝液、反応温度、ｐＨ、希釈濃
度等は、測定原理等に応じて種々の公知技術（例えば、
生物発光と化学発光、今井、１９８９年）の測定範囲内
で変更しても本発明と同様の作用効果を奏する。さら
に、発光基質として、ルミノールとｐ−ヨードフェノー
ルを用いて同様の原理により迅速かつ高感度に測定可能
であることも確認できた。

【００３６】

【発明の効果】本発明の特異結合反応を利用した生体物
質の測定方法によれば、発光または蛍光の検出強度の経
時変化量に基づいて被測定物質の量を決定するので、酵
素と基質との反応による発光または蛍光の検出強度が飽
和に達するのをまつことなく、被測定物質の定量を行う
ことができる。また、発光または蛍光の検出強度の経時
変化量は、検出強度に含まれるベースが取り除かれてい
るので、バックグランド・ノイズによる影響が少ない。
この結果、高感度かつ短時間で被測定物質の定量を行う
ことができる。さらに、発光または蛍光のピークを発見
する必要がないので、測定を簡単かつ確実に実施でき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本実施例の生体物質の測定方法に用いる化学発
光測定装置の一例を示すブロック図。

【図２】（Ａ）〜（Ｅ）は、本実施例における生体物質
の測定方法におけるサンドイッチアッセイの各工程を夫
々示す工程図。

【図３】本実施例の生体物質の測定方法におけるサンプ
ルの発光強度と時間との関係を示す特性図。

【図４】本実施例の生体物質の測定方法におけるアルカ
リフォスファターゼの濃度と時間特性の傾きとの関係に
基づく検量線を示す特性図。

【図５】本実施例の生体物質の測定方法に従って、各種
濃度のＨＢｓ抗原を含むサンプルについて酵素基質反応
開始後３０秒ないし６０秒間の間に測定した時間特性を
測定した結果を示す図。

【図６】図５と同様の方法に従って、各種濃度のＨＢｓ
抗原を含むサンプルについて酵素基質反応開始後３０秒
ないし６０秒間の間に測定した発光強度を平均した値を
抗原濃度毎にプロットした図。

【図７】本実施例の生体物質の測定方法に従って、各種
濃度のＨＢｓ抗原を含むサンプルについて酵素基質反応
開始後６０秒ないし１２０秒間の間に測定した時間特性
を測定した結果を示す図。

【図８】図７と同様の方法に従って、各種濃度のＨＢｓ
抗原を含むサンプルについて酵素基質反応開始後１分後
ないし２分後の間の１秒毎の発光強度を平均した値を抗
原濃度毎にプロットした図。

【図９】特異結合反応を利用した生体物質の測定方法に
おける発光強度と測定時間との関係を示す特性図。

【符号の説明】

１１…反応容器、１２…受光素子、１３…増幅器、１４
…光子計数管、１５…デ−タ処理装置。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被測定物質と前記被測定物質に特異的に
   結合しかつ酵素で標識された特異反応物質とを反応させ
   た後、前記被測定物質および前記特異反応物質に前記酵
   素と反応して発光または蛍光を示す基質を反応させて生
   じた発光または蛍光を検出することにより被測定物質を
   定量する生体物質の測定方法であって、発光または蛍光
   の検出強度の経時変化量に基づいて前記被測定物質を定
   量することを特徴とする特異結合反応を利用した生体物
   質の測定方法。