JPH0660B2

JPH0660B2 - キチンを分解し得る新規な微生物

Info

Publication number: JPH0660B2
Application number: JP63308344A
Authority: JP
Inventors: 英幸松田; 洋司小村
Original assignee: SANIN KENSETSU KOGYO KK
Current assignee: SANIN KENSETSU KOGYO KK
Priority date: 1988-12-06
Filing date: 1988-12-06
Publication date: 1994-01-05
Anticipated expiration: 2009-01-05
Also published as: JPH0648904A; JPH02152904A

Description

【発明の詳細な説明】（技術分野）本発明はキチンを分解し得る新規な微生物に係り、特に
カニガラ等の甲殻類の殻にて与えられるキチンを微生物
培養処理することにより得られるキトサンを有効成分と
した、或いはそのような微生物を培養して得られる培養
体を含む抗菌性組成物乃至は抗線虫剤を与える微生物に
関するものである。

（背景技術）近年、カニガラ等の甲殻類の殻を化学処理して有用物質
としてのキトサンを採取することが行なわれている。な
お、この化学処理法では、先ず、カニガラ等の甲殻類の
殻を脱カルシウム処理して得られる脱カルシウム殻を１
％アルカリ若しくはプロテアーゼ処理して、除蛋白する
ことにより、キチン質を取り出し、次いでそれを４０％
アルカリ水溶液処理して、脱アセチル化を行なうことに
より、目的とするキトサンが得られている。そして、こ
のようにして得られるキトサンは数少ない天然の塩基性
多糖類の一つであり、主として排水処理用凝集剤等とし
て用いられており、また手術用糸、人工皮膚、肥料等と
しても有用であることが認められている。

かかる状況下、本発明者らは、キチンをよく分解し、特
に甲殻類の殻に存在するキチンの分解能力に優れ、しか
もキトサンや各種キチン分解酵素類の生産能力の高い微
生物を広く自然界から検索しているうち、エンテロバク
ター属のＧ−１株を用いて、キチンを分解して得られる
キトサンが、優れた抗菌作用や抗線虫作用を有すること
を見い出し、またそのような微生物をキチン培地にて培
養して得られる培養体（液）も、同様に、抗菌作用や抗
線虫作用を有することを見い出したものである。

（解決課題）ここにおいて、本発明は、かかる知見に基づいて完成さ
れたものであって、その解決課題とするところは、微生
物形成キトサン成分を有効成分とする抗菌性組成物乃至
は抗線虫剤を与える新規な微生物を提供しようとするこ
とにある。

（解決手段）そして、本発明は、かかる課題解決のために、キチン
を分解する能力を有し、微工研条寄第３１４０号として
寄託されたエンテロバクター・Ｇ−１からなる菌株（微
生物）を、その特徴とするものである。

（発明の効果）このような本発明に従う特定の菌株（エンテロバクター
・Ｇ−１）は、カニガラ等の甲殻類の殻に存在するキチ
ンを分解して、有効な抗菌作用乃至は抗線虫作用を有す
るトキサンを与える微生物として単離されたものであっ
て、そのような微生物を用いて、キチンを分解して得ら
れるキトサンを、有効成分として、抗菌性組成物乃至は
抗線虫剤に調製することによって、各種の病原菌、例え
ばブドウ根頭ガン腫、バラ根頭ガン腫、稲のモンガレ
病、ワサビの墨入れ病等に対して優れた抗菌作用を示
し、またマツノザイセンチュウ等の線虫に対する有効な
殺虫乃至は抗線虫効果を示すものである。

（具体的構成）ところで、かかる本発明に係る微生物は、エンテロバク
ター属に属する菌株であって、エンテロバクター・Ｇ−
１と称されるものである。この菌株は、島根県松江市の
月照寺において採取された水より得られ、脱カルシウム
カニガラ粉末及び０．２％Ｋ_２ＨＰＯ_４のみを含む培地
で、キチン分解活性を誘導させるために、約５カ月間１
０回の連続培層を行なったものから単離されたものであ
って、工業技術院微生物工業技術研究所に昭和６３年１
１月１４日に「微工研条寄第３１４０号（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−３１４０）」として受託されており、その菌学的性
質は、以下の通りである。

（Ｉ）形態学的性質本菌株は、グラム陰性の単桿菌（0.7〜1.2μｍ×1.0〜
1.5μｍ）で、胞子は形成しない。

（II）各種培地上の性質 (1)ブイヨン培地コロニーの色はクリーム色で、コロニーは大きく広が
る。コロニーの表面は円滑で、周辺の状態は円である。
また、コロニーはほんの少し隆起している。

(2)コロイダルキチン寒天培地コロニーの色は白色で、３０℃で１日間培養後には、コ
ロニーの周辺に透明なクリアゾーンができる。コロニー
の表面には小さな凹凸がある。コロニーの表面は波打っ
ている。また、寒天の下層の方にもコロニーが広がって
いる。

（III）生理的性質 (1)生育温度範囲液体振とう培養１５〜３３℃（最適生育温度２６℃）コロイダルキチン寒天培地１６〜５０℃（最適生育温度３０℃）クリアゾーンを作るまでの日数１６℃・・・２日後３０℃・・・１日後３７℃・・・１日後４２℃・・・４日後 (2)生育pH範囲・・・４〜９ (3)硝酸塩の還元・・・陽性 (4)硫化水素の発生・・・陽性 (5)インドールの生成・・・陰性 (6)Ｖ−Ｐテスト・・・陽性 (7)Ｏ−Ｆテスト・・・醗酵 (8)メチルレツドテスト・・・陰性 (9)カタラーゼ・・・陽性 (10)オキシダーゼ・・・陰性 (11)ウレアーゼ・・・陰性 (12)糖からの酸及びガスの生成試験酸の生成とガスの発生：Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンノース、グルコース、サツ
カロース酸を生成し、ガスは発生しない：マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−ソルビトール、マ
ニトール酸を生成せず、ガスも発生しない：アラビノース、ラクトース、Ｄ−キシロース、ラムノー
ス（IV）同定「バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・
バイオテクロノージ（Bergey's manual of systematic
biotechnology）」，Vol.１及び「微生物の分類と同定
＜下＞」（長谷川武治編著、学会出版センター）から検
索すると、エンテロバクター属に属するものと考えられ
る。しかし、バージーズ・マニュアルに記載の既知菌株
虫から検索すると、糖から酸の生成試験で完全に一致す
るものがない。また、硫化水素の発生に関しても、本菌
株は陽性であるが、既知菌株中には陽性のものがなく、
本菌株は新菌株であると認められ、この菌株をエンテロ
バクター（Enterobacter）Ｇ−１と命名した。

（Ｖ）微生物の培養この菌株の培養には、通常の放射菌の培養方法が用いら
れる。培養基の炭素源としては、菌に誘導されたキチン
分解活性を喪失させないためにも、コロイダルキチン等
のキチンを主体とし、これに必要に応じて公知の適当な
炭素源を組み合わせて用いられることとなる。また、窒
素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩、酵母エキス、
ペプトン等が単独でまたは組み合わせて用いられ、更に
Ｐ源として、リン酸塩等が用いられることとなる。更
に、その他、必要に応じて、無機塩、例えばアルカリ金
属塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛、塩化マン
ガン等が適宜に添加されることとなる。

なお、培養方法としては、固体培地上での培養も可能で
あるが、一般の酵母生産の方法と同様に、液体培養を採
用することが好ましく、その際には、例えば次の如き組
成の液体培地が用いられる。

コロイダルキチン：４ｇＫ_２ＨＰＯ_４：０．７ｇＫＨ_２ＨＰＯ_４：０．３ｇＭｇＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ：０．５ｇＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．０１ｇＺｎＳＯ_４：０．００１ｇＭｎＣｌ_２：０．００１ｇ酵母エキス：０．２５ｇペプトン：０．２５ｇ寒天：１５ｇ蒸溜水：１０００ｍｌｐＨ：７．０また、かかる培養は、一般に２０〜４０℃程度の培養温
度において行なわれる。

そして、本発明において、上記のエンテロバクター・Ｇ
−１を用いて、カニガラ等の甲殻類の殻の存在するキチ
ンを分解処理することにより、有効なキトサンが提供さ
れるものであるが、この微生物処理には、有利には甲殻
類の殻を塩酸等の適当な酸にて処理することにより、脱
カルシウム化された、換言すれば殻中のＣａＣＯ_３が酸
で溶出、除去されたものが、粉末状態において供される
こととなる。特に、このような脱カルシウム処理を行な
うことにより、殻全体の容積を減じることが出来、以て
その取扱いが容易になると共に、微生物処理タンク中の
カルシウム処理が不要となる利点があり、また黒変微生
物の殺菌が同時に行なわれ得る利点があるところから、
カニガラ処理に有利に採用されることとなる。

また、かかる甲殻類の殻は、水等の適当な分散媒体中に
分散せしめられて分散液とされ、次いで適当な反応容器
（バイオリアクター）に収容されて、本発明に従う前記
特定の微生物を用いて微生物処理が行なわれるのであ
る。なお、この微生物処理に際して、前記培養液構成と
同様な成分が適宜に添加され、そして２０〜４０℃の温
度に保持されて、攪拌下に１０〜１５日程度培養するこ
とにより、目的とする甲殻類の殻の処理が行なわれるの
である。

なお、かかる反応容器内に収容される分散液中の甲殻類
の殻の割合や微生物の添加量、更には培養温度、培養期
間等は、目的とするキトサンの培養液中の生産量が最大
となるように適宜に決定されることとなる。

また、このような微生物処理によって、次のように反応
が進行する。即ち、甲殻類の殻、特に脱カルシウム殻
は、その微生物処理によって除蛋白されてキチンとな
り、そしてこのキチンの微生物処理により、キチナー
ゼ、キチンデアセチラーゼ及びキトサナーゼ等が生成し
て、キトサンの生成、その低分子化及びキチンの低分子
化を行なわしめるのである。そして、このような微生物
処理による反応によって、生成する培養物は、目的とす
る生成物の生産量が最大に達した時点において、その培
養が停止されて、目的とする生成物が単離精製されるこ
ととなるが、その一つの手法としては、遠心分画による
方法がある。即ち、この遠心分画により、培養物を上澄
み液（培養濾液）と沈澱物に分画せしめ、その沈澱物か
らキトサン粉末を採取するようにするのである。なお、
上澄み液からは、限外濾過膜分画・キチンアフィニティ
クロマトグラフィ・等電点電気泳動等によって、キチナ
ーゼやキトサナーゼ等の有用な分解酵素類を採取するこ
とが出来る。

さらに、本発明にあっては、培養タンク内において連続
的に微生物処理を行ないつつ、培養物を取り出し、それ
より順次生成物を分離する方式も採用可能である。即
ち、所定期間の間、微生物処理された培養タンクから培
養物を取り出し、例えば分子量が２０万以上のものをカ
ットするフィルタ（膜）を用いて分離することにより、
微生物菌体、キチン、キトサンを取り出し、その中から
キトサンを分離する一方、微生物菌体やキチンを再び培
養タンク内に戻し、また必要な脱カルシウムカニガラ等
の原料を培養タンク内に供給して、かかる培養タンクに
て微生物処理を続行せしめるようにすることが出来るの
である。

このようにして得られたキトサンは、優れた抗菌作用乃
至は抗線中（殺虫）作用を有するものであって、それ故
それを有効成分として、公知の処方に従って、抗菌性組
成物乃至は抗線中剤として調製乃至は利用することが出
来るのである。また、このような微生物処理によって形
成されるキトサンは、本発明に従う微生物（エンテロバ
クター・Ｇ−１）を培養するために、栄養培地として、
キチン培地、例えばコロイダルキチン寒天培地を用いる
ものであることから、それを培養して得られる培養液
（培養体）にも、同様な抗菌作用乃至は抗線中作用が存
し、それ故そのような培養液を用いて抗菌性組成物乃至
は抗線中剤を調製することも出来るのである。

なお、かかる本発明に従う微生物を用いた処理によって
得られたキトサンが、病原微生物の増殖を阻害し、同時
に植物細胞を活性化する機構は、未だ充分に解明されて
いないが、現時点では、そのメカニズムは、次のように
考えると、実験結果をよく説明し得ると考えられる。即
ち、汚染土壌においては、植物細胞は、病原生物の感
染、線中の侵入或いは昆虫の食害等を受け、生理機能定
価、栄養障害、生育不良となり、ついには枯死する。他
方、キトサンを加えた活性土壌においては、次の４つの
働きが惹起される。第一は、添加キトサンは、共存する
微生物によって加水分解され、低分子で水に可溶なキト
サンオリゴ糖となり、これは植物細胞の中に入って、Ｄ
ＮＡからＲＮＡの転写を促進する。第二は、その結果、
植物細胞は蛋白合成が盛んになり、その中でキチナー
ゼ、キトサナーゼ糖の酵素類及びファイトアレキシンの
ような抗菌性物質の生合成が促進される。第三は、これ
らの酵素が病原生微生物の細胞壁を分解し、細胞の中に
ファイトアレキシン、キトサンオリゴ糖等が入り、ＲＮ
Ａ転写を抑えて、増殖を阻害する。第四は、この細胞壁
分解で生成した新たなキトサンオリゴ等は、植物細胞の
活性化を促進させる。また、このようにして生成するキ
トサンオリゴ糖や各種酵素は、線中を攻撃し、生育を阻
害するものと考えられる。そして、これらの一連の反応
は、キトサンによって刺激されてスタートするが、その
主役は、キトサンをキトサンオリゴ糖に分解する土壌中
の微生物群と言える。そして、このことは、微生物の機
能を利用して生産されたキトサンの優れた点を示してい
ると言うことが出来る。

（実施例）以下に、本発明の幾つかの実施例を示し、本発明を更に
具体的に明らかにすることとするが、本発明が、そのよ
うな実施例の記載によって、何等の制約をも受けるもの
でないことは、言うまでもないところである。

また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記
の具体的記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱しない限り
において、当業者の知識に基づいて種々なる変更、修
正、改良等を加え得るものであることが、理解されるべ
きである。

なお、以下の実施例中の百分率は、特に断わりのない限
り、重量技術によって示されるものである。

微生物処理キトサンの調製先ず、１％のＨＣｌの水溶液にて脱水カルシウム処理さ
れた脱Ｃａカニガラ粉末：４００ｇ、０．０２５％ペプ
トン及び０．２％Ｋ_２ＨＰＯ_４を含み、更にエンテロバ
クター・Ｇ−１の種培養菌７００ｍｌを含むｐＨ7.0の
培養液３０：３０を準備し、これを３０℃の温度に保
持しつつ、１４日間振盪培養を行なつた。そして、かか
る培養の後、その培養液から遠心分離して得られた沈澱
物は、乾燥重量で約２００ｇであり、赤外線吸収スペク
トル分析の結果、最大約５０〜６０％脱アセチル化され
た粗キチン、キトサン等の混合物であることが認められ
た。また、これを酢酸で処理すると、４８％の約９０ｇ
が酢酸不溶性粗キトサンとして得られ、残り５２％の約
１０５ｇが酢酸可溶性成分として得られた。この酢酸可
溶性成分は、キトサン及びカニガラ結合蛋白質から得ら
れる酢酸可溶性蛋白質を含むものである。

一方、前記の遠心分離により得られた培養濾液中には、
脱Ｃａカニガラの２００ｇ分が可溶化して存在し、これ
はキチン、キトサンの可溶性低分子成分等、即ち粗Ｎ−
アセチルグルコサミンオリゴ糖、グルコサミンオリゴ糖
及び部分的にアセチル化されているグルコサミンオリゴ
糖等が生成しているものと考えられる。

また、上記の培養処理によつて生成した各酵素の活性測
定は、キチナーゼについては、0.5％コロイダルキチン
水溶液0.5ｍｌ、0.1Ｍクエン酸−0.2Ｍリン酸水素二ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ7.0）１ｍｌ及び上記の培養濾液
（粗酵素液）0.5ｍｌの計２ｍｌを、３０℃×３０分間
インキュベーションし、更に１００℃で５分間沸騰し
て、酵素を失活させ、生じた還元末端をスカーレス（SC
HALES）の変法で定量して求めた。なお、１μmolのＮ−
アセチルグルコサミン相当の還元糖を生成する酵素量を
１単位（unit）とした。そしてまた、キトサナーゼ活性
の測定は、１％コロイダルキトサン水溶液（ｐＨ6.0）
0.5ｍｌに、上記の培養濾液の0.5ｍｌを加えて、３０℃
の温度で３０分間インキュベーションし、その後、１０
０℃の温度で５分間沸騰して酵素反応を失活させた後、
遊離した還元糖をスカーレスの変法で定量して求めた。
なお、１分間に１μmolのグルコサミンを生成する酵素
量を１単位とする。更に、キチンデアセチラーゼ活性
は、0.5％コロイダルキチン水溶液0.5ｍｌ、0.1Ｍクエ
ン酸−0.2Ｍリン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0）
１ｍｌ及び上記の培養濾液0.5ｍｌの計２ｍｌを、３０
℃の温度下で３０分間インキュベーションし、その後、
酵素を１００℃の温度で５分間加熱することによって失
活せしめ、そして生じたＮＨ_２基をコロイド滴定法によ
って測定して求めた。

以上の結果、最高で約２１０ｇのキトサンを含む酢酸可
溶性成分が生産され、また数ｇのＮ−アセチルグルコサ
ミン及びグルコサミンが得られることが分かつた。キチ
ンからキトサンを含む酢酸可溶性成分の生成率は、約５
２％となる。この時、キチナーゼ及びキトサナーゼ酵素
は、酵素蛋白質として１８０〜３００ｍｇ生産される。
１μmolのβ−１，４−グルコシド結合を１分間に切断
する酵素量を１単位とすると、３６０〜６００単位とな
る。同様に、キチンデアセチラーゼは、酵素蛋白質とし
て１２０〜１８０ｍｇ生産され、酵素量としては２１０
〜３００単位となることが分かった。

微生物処理キトサン及び微生物培養液の抗菌性試験上記のようにして得た微生物処理キトサンを用い、その
0.1％、0.5％または１％等の各濃度で添加した寒天培地
及び無添加のコントロールの寒天培地、更には比較のた
めに化学処理によって得られたコロイダルキトサン、粉
末キトサン、そしてコロイダルキチンの各種の濃度の寒
天培地を調製した。一方、ブドウ根頭ガン腫、イネのモ
ンガレ病、ワサビの墨入れ病の羅病植物または病原微生
物を入手し、上記の微生物処理キトサン添加寒天培地や
化学処理キトサン添加寒天培地等に植え継ぎ、その抗菌
性を調べた。

より具体的には、先ずブドウ根頭ガン腫病原菌（Agroba
cterium tumefaciens）に対する抗菌性については、先
ず培地として、普通寒天培地（肉エキス５ｇ、塩化ナト
リウム５ｇ、ペプトン１０ｇ、寒天１５ｇ／水１００ｍ
ｌ、ｐＨ7.0）をコントロールとして、これにコロイダ
ルキトサン、粉末キトサン、微生物処理キトサン、コロ
イダルキトチンを、各種の濃度において加えて調製した
ものを用い、そして予め液体培地で生育させておいた病
原菌を、かかる培地に塗抹し、３日間３０℃で培養の
後、菌数を測定した。その結果は、下記第１表に示す通
りである。

なお、バラ根頭ガン腫についても、上記と同様な抗菌性
テストを実施したところ、同様な結果が得られた。

また、ワサビの墨入れ病の病原菌（Phoma wasabiae Yok
ogi）に対する抗菌性については、上記と同様な普通寒
天培地をコントロールとして、それにコロイダルキトサ
ン、粉末キトサン、微生物処理キトサン、コロイダルキ
チンを、各種濃度に加えてなる培地に病原菌を９ヶ所植
え付け、３０℃で８日間培養した後、コロニーの直径の
平均値でそれぞれの抗菌性を調べた。その結果を、下記
第２表に示す。

さらに、イネのモンガレ病の病原菌に対する抗菌性につ
いては、上記と同様な普通寒天培地をコントロールし
て、それにコロイダルキトサン、粉末キトサン、微生物
処理キトサン、コロイダルキチンを各種濃度で加えた培
地に対し、予め液体培地で生育させておいた病原菌を塗
抹し、３０℃で１日間培養した後、コロニーの生育状況
を観察した。その結果、コントロール、粉末キトサンの
0.5％、１％添加培地、コロイダルキチンの0.5％、１％
添加培地、コロイダルキトサンの0.5％、１％添加培地
は、何れも、全面に生えていることが認められた。これ
に対して、微生物処理キトサンを添加した培地（0.5
％，１％，５％）にあっては、病原菌の生育が著しく抑
制されていることが認められ、特に微生物処理キトサン
の５％添加培地にあっては、病原菌の生育が全く認めら
れなかった。

以上の抗菌性テストの結果から明らかなように、何れの
場合も、微生物処理キトサンの効果が優れていることが
認められた。これは、化学処理キトサンに比べて、微生
物処理キトサンが比較的低分子で水に分散、可溶化し易
く、その抗菌性が速やかに発揮されるからであると考え
られる。また、微生物処理キトサンは、４０〜５０％の
アセチル基を有していると考えられるので、その低分子
キトサン化が徐々に進行することにより、速やかな効力
と共に、遅効性も期待されるのである。

一方、マツクイムシによるマツの枯死の主要な原因と考
えられているマツのザイセンチュウに対する効果を調べ
たところ、第１図に示されるように、５％微生物処理キ
トサンの適用例にあっては、５時間２５℃で９０％の線
虫を殺すことが認められた。他方、化学処理キトサンを
適用した場合には、同一条件で殆ど効果のないことが分
かった。これは、両キトサンの水に対する分散、可溶性
の差に依存しているためと思われる。また、エンテロバ
クター・Ｇ−１菌の２週間培養した培養液は、２５％の
濃度で、２５℃５時間で９５％の線虫を殺すことが分か
った。微生物の培養液中に低分子キトサン及び各種キチ
ナーゼが共存しているため、効果が現れたものと考えら
れる。また、これらの効果は、微生物処理キトサン及び
エンテロバクター・Ｇ−１菌の培養液が天然の抗菌剤及
び抗線虫剤として、実用上、農業においても、利用出来
る可能性を示しているのである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例において得られたマツのザイセンチュ
ウに対する微生物処理キトサンの殺虫性を示すグラフで
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】キチンを分解する能力を有し、微工研条寄
第３１４０号として寄託されたエンテロバクター・Ｇ−
１。