JPH0662669B2 - グルタチオンの精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はグルタチオンとともにグルタミン酸等のアミノ
酸を含有する、例えば酵母菌体抽出液、植物細胞抽出
液、合成法により取得されるグルタチオン含有液等か
ら、グルタチオンを分離する方法に関するものである。

［従来技術］ グルタチオンは、酵母および動物の肝臓等に広く分布し
ており、生体内の酸化還元系に関与し、諸酵素の賦活作
用および解毒作用等の重要な役割を果たす生理活性トリ
ペプチドで、医薬上きわめて重要な物質である。

酵母抽出液等、不純物を含むグルタチオン含有液からグ
ルタチオンを単離する場合、一般的に晶析操作等によっ
て回収されているが、グルタミン酸等のアミノ酸はグル
タチオンの結晶純度および収率を大きく低下させる要因
となっている。従って、最終的な晶析操作以前にグルタ
ミン酸等のアミノ酸を除去しておくことがグルタチオン
の高純度製品を得るためには不可欠であるが、グルタチ
オンはグルタミン酸等のアミノ酸と同じく分子内にアミ
ノ基並びにカルボキシル基を有し、その物理化学的性質
が類似しているという点から、グルタチオンとアミノ酸
との相互分離は極めて困難である。

従来、グルタチオン含有液からグルタチオンを単離精製
する方法としては銅塩法が広く知られているが、銅塩法
の一般的なプロセスは銅塩生成反応、銅塩洗浄、銅塩分
解反応の３段階からなり、操作が繁雑であり、しかも、
グルタチオンの回収率も低いという欠点を有している。

また、イオン交換樹脂を用いて、酵母菌体抽出液から高
濃度グルタチオン含有液を得る方法が、特公昭４４−２
３９、同４６−４７５５、同４６−２８３８等に開示さ
れているが、これらの方法では高濃度の塩類、酸、水酸
化アルカリ水溶液を用いてグルタチオンとグルタミン酸
等のアミノ酸を同時に脱離させるため、グルタチオンと
アミノ酸との分離は不完全で、高純度のグルタチオン水
溶液を得ることは不可能となり、さらに他の工程を要す
る。しかも、これらの方法では、溶出液中に脱離に用い
た塩類、酸、水酸化アルカリが混入するため、晶析操作
以前にこれらを除去する必要がある。また、低濃度の
酸、塩類、アルカリ水溶液を脱離液として用いれば精製
液の純度は向上するが、精製液の濃度が極端に低下する
ため実用には適していないとされていた。従って、高純
度かつ高濃度のグルタチオン精製液が容易に得られるプ
ロセスの開発が工業化を企てる上で強く望まれていた。

［発明の構成］ 本発明者らは、グルタミン酸等の不純物の共存するグル
タチオン含有液から高純度、高濃度のグルタチオンを高
収率で単離する方法について種々研究を重ねた結果、擬
似移動床を用いれば、多孔型強酸性イオン交換樹脂を吸
着剤として、水を脱離液として用いることにより、グル
タチオンと不純物質の分離が可能であり、かつ高濃度の
グルタチオン水溶液が得られることを見出し本発明の完
成に至った。

即ち、本発明では、内部に多孔型強酸性イオン交換樹脂
が収容されており、かつ前端と後端とが液体通路で結合
されて無端状になっていて液体が一方向に循環している
充填床に、アミノ酸の共存するグルタチオン含有液およ
び脱離液として水を導入し、同時に充填床からグルタチ
オン水溶液およびアミノ酸溶液を抜出すことからなり、
充填床には、アミノ酸を含むグルタチオン含有液導入
口、グルタチオン水溶液抜出し口、水導入口およびアミ
ノ酸水溶液抜出し口を流体の流れの方向に沿ってこの順
序で配置し、かつこれらを床内の流体の流れの方向にそ
れらの位置を間欠的に逐次移動させることよりなる擬似
移動床を用いることを特徴とするグルタチオン精製方法
を内容とするものである。

即ち、本発明は酵母菌体抽出液、植物細胞抽出液、合成
法により得られるグルタチオン含有液から、多孔型強酸
性イオン交換樹脂を吸着剤とし、水を脱離液として用い
る擬似移動床により、高純度かつ高濃度のグルタチオン
含有液を取得する方法に関するものである。

固体吸着剤が収容されており、かつ前端と後端の間が流
体通路で結合されていて、床内を流体が循環し得るよう
になっている充填床に、床内の流体の流れに沿って脱離
液流体導入口、吸着質流体抜出し口、原料流体導入口、
非吸着質流体抜出し口を設け、各導入口および抜出し口
からそれぞれの流体を連続的に導入または抜出し、一定
時間毎に各導入口および抜出し口を順次下流のそれと切
り替えることにより、原料流体を固定吸着剤に相対的に
吸着されやすい成分（吸着質成分）および相対的に吸着
されがたい成分（非吸着質成分）に分離する、いわゆる
擬似移動床は公知であり（特公昭４２−１５６８１）、
このような技術を利用した例としては、果糖の製造法
（特開昭５３−８８３３５）やマルトースの分離法（特
開昭６０−６７０００）等が挙げられる。しかしなが
ら、擬似移動床を用いてグルタチオンやアミノ酸類を含
む系から高純度でグルタチオンを分離する方法に関する
応用例は未だ全く報告されておらず、適用が困難とされ
ていた。

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。

本発明において使用される多孔型イオン交換樹脂には、
SO₃基を交換基としてもちスチレンとジビニルベンゼン
の共重合体を骨格とする、例えばローム＆ハース（株）
製アンバーライトＩＲ２００Ｃ、三菱化成（株）製ダイ
ヤイオンpk２２８等の他、各種の製品があるが、これら
に限定されない。中でも、Ｈ^＋型の多孔性イオン交換樹
脂が、好ましい。イオン交換樹脂の粒径は特に限定され
ないが、床内の偏流を防止するためには３００〜６００
μｍのものが望ましい。さらにイオン交換樹脂の細孔径
についても５０〜１５０Åのものが選択性の点で望まし
いが、特にこれに限定されない。

通液時の温度は高いほど高い分離能が得られるが、５０
℃以上ではグルタチオンの分解が顕著になるので１０〜
４０℃が望ましい。又、本発明で脱離液として用いられ
る水には、一般の水道水、工業用水、イオン交換水、蒸
留水等が適用できるが、カルシウム等のイオンが含まれ
るとイオン交換樹脂の能力低下の原因となるので、イオ
ン交換水或いは蒸留水を用いるのが望ましい。

以下、図面に基づいて、本発明の方法をより詳細に説明
する。

第１図は本発明で使用する擬似移動床の一例の模式図で
ある。第１図においては、擬似移動床の主要部である充
填床の内部は１６個の単位充填床に区分されているが、
その数は、グルタチオン含有液の組成、濃度および装置
の大きさ等の要因に従って適切に決定できる。第１図に
おいて、各単位充填床には、多孔型強酸性イオン交換樹
脂が充填されており、各単位充填床間には空間部が設け
られている。各空間部には充填床へのグルタミン酸等の
アミノ酸を含むグルタチオン含有液の導入口および水の
導入口並びに充填床からのグルタチオン精製液抜出し口
およびグルタミン酸等のアミノ酸含有液抜出し口の４種
類が開口している（ただし、第１図ではその大部分は省
略されている。）。この空間部の設置は不可欠ではない
が、充填床に導入されるグルタミン酸等のアミノ酸を含
むグルタチオン含有液および脱離液をこの空間部に導入
すると、床内を流下循環している流体中に速やかに拡散
混合させることができるので好ましい。

第１図では空間部１９にグルタミン酸等のアミノ酸を含
むグルタチオン含有液が導入され、空間部１１に脱離液
として水が導入されている。また、空間部１５からグル
タミン酸等のアミノ酸含有液が抜出され、空間部２３か
らグルタチオン精製液が抜出されている。従って、充填
床は１０９〜１１２の４個の単位充填床からなる吸着帯
域、１１３〜１１６の４個の単位充填床からなる一次精
製帯域、１０１〜１０４の４個の単位充填床からなる脱
離帯域および１０５〜１０８の４個の単位充填床からな
る二次精製帯域の４個の帯域よりなっている。各帯域の
作用は、グルタミン酸等のアミノ酸を吸着質成分とし、
グルタチオンを非吸着質成分とした場合の公知の擬似移
動床のそれに等しい。

充填床内の液中には、グルタチオンおよびグルタミン酸
等のアミノ酸の濃度分布が形成されており、この濃度分
布はその形状を保持しつつ下流方向に移動する。この移
動に追随するように充填床へのグルタミン酸等のアミノ
酸を含むグルタチオン含有液あるいは水の導入口並びに
充填床からのグルタチオン精製液およびグルタミン酸等
のアミノ酸含有液の抜出し口が順次下方のそれに切り替
えられる。切替えは４種類の開口について同時に行って
も良く、また各開口毎に時間的にずらして行ってもよ
い。同一の開口からの液の導入または抜出しを継続する
時間は、単位充填床の大きさ、床内を流下する流速等に
より異なるが、通常、数分ないし数十分である。この切
替えにより、上述の４個の帯域は逐次その充填床に占め
る位置を移動する。しかし、各帯域の長さは常にほぼ一
定であり、その大きさおよび相対的位置を保持したまま
充填床を循環する。

多孔型強酸性イオン交換樹脂を吸着剤とする擬似移動床
におけるグルタチオンとグルタミン酸等のアミノ酸の分
離の程度は、種々の要因により影響されるが、特に大き
な要因は床内の液の流下速度、同一の開口からの液の導
入または抜出しを継続する時間である。このことは、液
の導入口および抜出し口の下流の開口への切替えは、見
方を替えれば導入口および抜出し口の位置を一定にして
多孔型強酸性樹脂を上流方向に移動させることに等しい
ものであり、床内の各成分の濃度分布は、この上流方向
に移動する液との相互作用により形成されることからも
推測される。また、この移動速度は各単位充填床の長さ
（ｌ）を同一の開口から液の導入または抜出しを継続す
る時間(T)で除したもの（ｌ／T)に相当する。周知のよ
うに２成分以上の成分を擬似移動床により分離するに
は、非吸着質成分の充填床内の移動速度v₁を吸着帯域に
おいてはv₁＞ｌ／Ｔ、１次精製帯域においてはv₁＜ｌ／
Ｔ、脱離帯域においてはv₁＞ｌ／Ｔ、２次精製帯域にお
いてはv₁＞ｌ／Ｔとし、吸着質成分の充填床内の移動速
度v₂を吸着帯域においてはv₂＜ｌ／Ｔ、１次精製帯域に
おいてはv₂＜ｌ／Ｔ、脱離帯域においてはv₂＞ｌ／Ｔ、
２次精製帯域においてはv₂＜ｌ／Ｔとすればよい。従っ
て、液の流下および同一の開口から液の導入または抜出
しを継続する時間は、これらの関係から必然的に求めら
れる。一方、非吸着質成分の移動速度v₁および吸着質成
分の充填床内の移動速度v₂は、充填床内の液流速により
決定されるが、これらは回分式の充填床を用いて容易に
実測できるのはいうまでもない。

次に、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらに限定されない。

［実施例］ 内径１cm、長さ２０cmのカラム１６本からなる擬似移動
床を用いてグルタミンを含むグルタチオン含有液からの
グルタチオンの単離を行った。

原料液中のグルタチオンおよびグルタミン酸濃度はそれ
ぞれ10g／ｌ、5g／ｌであった。吸着剤としてはＨ^＋型
の多孔型強酸性イオン交換樹脂（ローム・アンド・ハー
ス（株）製ＩＲ２００Ｃ）を用い、脱離液としては水を
使用した。

原料液供給速度は2.83ml／分、脱離液供給速度は12.25m
l／分、さらにグルタチオン精製液の抜出しは3.30ml／
分、グルタミン酸含有液の抜出しは11.78ml／分の流量
で行い、原料液および脱離液供給口ならびにグルタチオ
ン精製液およびグルタミン酸含有液抜出し口の移動は６
０分毎に行った。

第２図にグルタチオン精製液中に含まれるグルタチオン
ならびにグルタミン酸の濃度の時間的変化を示す。第２
図に示されるように、グルタチオン精製液中にはグルタ
ミン酸は全く含まれず、約３００分で定常状態となり、
定常状態では原料液中ら含まれるグルタチオンの９９％
が回収された。

［発明の効果］ 本発明によれば、グルタチオンの濃度を低下させること
なく高純度のグルタチオン精製液が得られ、しかも脱離
液が水であるのでそのまま晶析操作を行いグルタチオン
結晶を得ることができる。又、本発明の方法は連続操作
であるので、自動化を容易に行うことが可能である。さ
らに、擬似移動床の利点として吸着剤及び脱離液である
水の量を節約できることが本発明の効果として挙げられ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法で使用する擬似移動床の一例の模
式図、および 第２図は、実施例における、グルタチオン精製液中に含
まれるグルタチオン並びにグルタミン酸の濃度の時間的
変化を示すグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】内部に多孔型強酸性イオン交換樹脂が収容
   されており、かつ前端と後端とが液体通路で結合されて
   無端状になっていて液体が一方向に循環している充填床
   に、アミノ酸の共存するグルタチオン含有液および脱離
   液として水を導入し、同時に充填床からグルタチオン水
   溶液およびアミノ酸水溶液を抜出すことからなり、充填
   床には、アミノ酸を含むグルタチオン含有液導入口、グ
   ルタチオン水溶液抜出し口、水導入口およびアミノ酸水
   溶液抜出し口を流体の流れの方向に沿ってこの順序で配
   置し、かつこれらを床内の流体の流れの方向にそれらの
   位置を間欠的に逐次移動させることによりなる擬似移動
   床を用いることを特徴とするグルタチオンの精製方法。
2. 【請求項２】イオン交換樹脂としてＨ^＋型の多孔型強酸
   性イオン交換樹脂を用いる特許請求の範囲第１項記載の
   方法。