JPH0666806A

JPH0666806A - 発熱性物質吸着体とそれを用いた発熱性物質の定量方法

Info

Publication number: JPH0666806A
Application number: JP3169479A
Authority: JP
Inventors: Kazuyoshi Chiba; 主喜千葉; Masashi Funayama; 政志船山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-01-26
Filing date: 1991-01-26
Publication date: 1994-03-11
Anticipated expiration: 2012-12-10
Also published as: JP2690415B2

Abstract

(57)【要約】【目的】発熱性物質（エンドトキシン）を定量する為の
担体、および発熱性物質（エンドトキシン）定量キット
を提供する。【構成】発熱性物質（エンドトキシン）と親和性のある
リガンド（主に抗生物質）を共有結合させた担体および
発色試薬からなる。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、医療領域で極めて重要
な問題と考えられる、発熱性物質の定量方法に関する。［従来技術］臨床医学の領域では注射剤に混入する不純
物により、静脈注射後に悪寒戦りつを伴う発熱があるこ
とは、好ましいことではない。それ故に注射剤の製造工
程では、これらの悪寒戦りつを伴う発熱性物質の混入を
防止することは、極めて重要である。また、製造された
注射剤が発熱性物質を含有しないことを確認することも
極めて重要なことである。ウサギを用いてｉｎｖｉｔ
ｒｏで発熱性物質の有無を検出する試験を発熱性物質
試験という。近年、ウサギを用いた発熱性物質試験に代
わり、カブトガニの血球成分を用いたｉｎｖｉｔｒｏ
のＬｉｍｕｌｕｓ試験が汎用される様になっている。日
本ではＬｉｍｕｌｕｓ試験に用いられるカブトガニの血
球成分に標準規格が定められておらず、また、抽出成分
の純度や、反応試薬中に存在する反応阻害物質の問題
等、克服すべき問題が多い。［発明が解決しようとする問題点］本発明の目的は従
来、血液及び蛋白製剤を検査対象としたＬｉｍｕｌｕｓ
試験に求められた前処理、後処理の問題、Ｌｉｍｕｌｕ
ｓ試験の特異性の欠如の問題（（１→３）−β−Ｄ−Ｇ
ｌｕｃａｎに対する非特異反応の問題）を一挙に克服し
ようとするものである。即ち、被検検体が血液または蛋
白製剤である場合、従来のＬｉｍｕｌｕｓ試験では、検
体中の非特異的なアミダーゼ活性及びＬｉｍｕｌｕｓ反
応阻害物質（α_２−プラスミンインヒビター、アンチト
ロンビンＩＩＩ、α_１−アンチトリプシン）を除去する
為、クロロホルム法、エーテル法、酸処理法、アルカリ
処理法等の前処理が必須であった。また従来のＬｉｍｕ
ｌｕｓ試験では、被検検体がビリルビン等により黄褐色
に呈色していた場合、エンドトキシンの作用により、合
成基質から最終的に遊離されるｐ−ニトロアニリンの吸
収波長（４０５ｎｍ）と検体の黄褐色の吸収波長（４０
０ｎｍ付近）が重なり合い、正確な値が得られなかっ
た。この為ｐ−ニトロアニリンを更にジアゾ化し、黄褐
色系色素の影響を除く必要があった。更に、従来のＬｉ
ｍｕｌｕｓ試験では、カブトガニ血球抽出液全体を用い
ている為、凝固因子の一つであるＦａｃｔｏｒＧを
介してエンドトキシン以外の物質（（１→３）−β−Ｄ
−Ｇｌｕｃａｎ、真菌多糖、クレスチン、レンチナン、
ザイモサン、セルロース系血液透析膜の洗浄液等）に対
しても反応するという問題があった。この問題を解決す
る為には、カブトガニ血球抽出液からＦａｃｔｏｒＧ
を除去する操作が必要であった。［問題点を解決するための手段］本発明の考案者らは発
熱性物質の定量方法について鋭意検討した結果、（１）発熱性物質吸着体（ゲル）を固相化した容器、試
験管、球（ビーズ、ボール）、磁性粒子、チップ、薄
板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタープレート、ス
トリップ、ろ紙ディスク等の器具。（２）−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）ｎ−ＣＨ＝Ｎ−，−ＣＯ
ＮＨ− 等の反応性官能器を固相化し、その官能基に発
熱性物質と結合するリガンドを共有結合させた容器、試
験管、球（ビーズ、ボール）、磁性粒子、チップ、薄
板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタープレート、ス
トリップ、ろ紙ディスク等の器具。を用いて発熱性物質を吸着した後、従来のＬｉｍｕｌｕ
ｓ試験で発熱性物質の定量を行なう方法が、従来の難問
を一挙に解決することを発見した。即ち、本発明に関わ
る器具を使用し、発熱性物質を特異的に吸着した後、Ｌ
ｉｍｕｌｕｓ試験、或いは、放射イムノアッセイ法、非
放射イムノアッセイ法等により、発熱性物質を定量する
ことにより、従来技術で不可欠であった検体の前処理、
後処理の必要が全く無くなるという利点が生ずる。ま
た、本発明に関わる器具が発熱性物質（エンドトキシ
ン）のみを特異的に吸着する為、カブトガニ血球抽出液
全体を用いてＬｉｍｕｌｕｓ試験を行なっても（１→
３）−β―Ｄ−Ｇｌｕｃａｎ等に対する非特異反応に配
慮する必要はない。以下に実施例を挙げて、本発明を更
に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例には、何ら
限定されるものではない。実施例１．反応性官能基−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ
Ｈ＝Ｎ−を固相化し、その官能基に発熱性物質と結合す
るリガンドであるヒスチジンを共有結合させたマイクロ
タイタープレートを調製した。その発熱性物質吸着マイ
クロタイタープレート（ブロック済）に、エンドトキシ
ン溶液（緩衝液に溶解したエンドトキシンまたは、血清
に溶解したエンドトキシン：濃度は何れも２．５００
ＥＵ／ｍｌ）２００ｕｌを秤量し、室温で３０分ｉｎｃ
ｕｂａｔｅした。次に、マイクロタイタープレートの各
穴をリン酸緩衝液２００ｕｌで３回洗浄した。最後に、
発熱性物質定量用試薬エンドスペシー（（１→３）−β
−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎは検出しない）及びトキシカラー
（（１→３）−β−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎも検出する）を用
いて、発熱性物質の定量を行ない、その結果を以下に示
した。尚、以上の操作に用いた器具、緩衝液等はすべて
エンドトキシンフリー及び（１→３）−β−Ｄ−Ｇｌｕ
ｃａｎフリーのものを用いた。表に示した様に、本発明に関わる発熱性物質吸着マイク
ロタイタープレートは、発熱性物質の良好な吸着性能を
示した。また、エンドスペー及びトキシカラーによるエ
ンドトキシンの定量結果も良好であった。実施例２反応性官能基−Ｎ＝ＣＨ―（ＣＨ_２）_３−ＣＨ＝Ｎ―
を固相化し、その官能基に発熱性物質と結合するリガン
ドであるヒスタミンを共有結合させたマイクロタイター
プレートを調製した。その発熱性物質吸着マイクロタイ
タープレート（ブロック済）に、リン酸緩衝液に溶解し
た（１→３）−β―Ｄ−Ｇｌｕｃａｎ溶液（１ｕｇ／
ｍｌ）１００ｕｌを秤量し、室温で３０分ｉｎｃｕｂａ
ｔｅした。次に、マイクロタイタープレートの各穴をリ
ン酸緩衝液２００ｕｌで３回洗浄した。最後に、発熱性
物質定量用試薬エンドスペシー（（１→３）−β―Ｄ−
Ｇｌｕｃａｎは検出しない）及びトキシカラー（（１→
３）−β―Ｄ−Ｇｌｕｃａｎも検出する）を用いて、発
熱性物質の定量を行ない、その結果を以下に示した。
尚、以上の操作に用いた器具、緩衝液等はすべてエンド
トキシンフリー及び（１→３）−β−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎ
フリーのものを用いた。表に示した様に、本発明に関わる発熱性物質吸着マイク
ロタイタープレートは、発熱性物質の特異な吸着性能を
示した。即ち、（１→３）−β―Ｄ−Ｇｌｕｃａｎは上
記マイクロタイタープレートには吸着されず、従って、
エンドスペー及びトキシカラーの両者によって（１→
３）−β−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎは検出されなかった。実施例３．反応性官能基−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ
Ｈ＝Ｎ−を固相化し、更にその官能基にリガンドとし
て、ポリミキシンＢを共有結合させたビーズを調製
した。小試験管にリン酸緩衝液に２ｍｌ、発熱性物質吸
着ビーズ（ブロック済）、非溶血血清に溶解したエンド
トキシンまたは、溶血血清に溶解した標準エンドトキシ
ン（濃度は何れも５．０００ＥＵ／ｍｌ）２００ｕｌを
秤量し、室温で３０分ｉｎｃｕｂａｔｅした。次に、前
記ビーズをリン酸緩衝液２ｍｌで３回洗浄した。次に、
発熱性物質定量用試薬トキシカラー（（１→３）−β−
Ｄ−Ｇｌｕｃａｎも検出する）を用いて、発熱性物質の
定量を行ない、その結果を以下に示した。尚、以上の操
作に用いた器具、緩衝液等はすべてエンドトキシンフリ
ー及び（１→３）−β−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎフリーのもの
を用いた。表に示した様に、本発明に関わる発熱性物質吸着ビーズ
は、発熱性物質の良好な吸着性能を示した。また、トキ
シカラーによるエンドトキシンの定量結果も良好であっ
た。即ち、溶血（ヘモグロビン）による４１５ｎｍの吸
収がｐ―ニトロアニリンの４０５ｎｍの吸収を妨害する
ことはなかった。実施例４．反応性官能基−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ
Ｈ＝Ｎ― を固相化し、更にその官能基にリガンドとし
て、コリスチンを共有結合させたビーズを調製した。小
試験管に緩衝液２ｍｌ、発熱性物質吸着ビーズ（ブロッ
ク済）、Ａ液（非溶血血清にエンドトキシン１．０００
ＥＵ／ｍｌを溶解したもの）、またはＢ液（非溶血血清
にエンドトキシン１．０００ＥＵ／ｍｌとレンチナ
ン１００ｎｇ／ｍｌを溶解したもの）２００ｕｌを秤量
し、室温で３０分ｉｎｃｕｂａｔｅした。次に、前記ビ
ーズをリン酸緩衝液２ｍｌで３回洗浄した。次に、発熱
性物質定量用試試薬エンドスペシー（（１→３）−β−
Ｄ−Ｇｌｕｃａｎは検出しない）を用いて、発熱性物質
の定量を行ない、その結果を以下に示した。尚、以上の
操作に用いた器具、緩衝液等はすべてエンドトキシンフ
リー及び（１→３）−β−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎフリーのも
のを用いた。表に示した様に、本発明に関わる発熱性物質吸着ビーズ
は、発熱性物質の良好な吸着性能を示した。また、エン
ドスペーによるエンドトキシンの定量結果も良好であっ
た。即ち、レンチナンによる非特異反応は認められなか
った。実施例５．反応性官能基−Ｎ−ＣＨ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ
Ｈ＝Ｎ−を固相化し、更にその官能基にリガンドとし
て、カナマイシンンを共有結合させたビーズを調製し
た。小試験管に緩衝液２ｍｌ、発熱性物質吸着ビーズ
（ブロック済）、エンドトキシンＡ液（プール血清にエ
ンドトキシン５．０００ＥＵ／ｍｌを溶解）または、
エンドトキシＢ液（プール血清にエンドトキシン５．０
００ＥＵ／ｍｌ及びレンチナン１ｕｇ／ｍｌを溶解）
２００ｕｌを秤量し、室温で３０分ｉｎｃｕｂａｔｅし
た。次に、前記ビーズをリン酸緩衝液２ｍｌで３回洗浄
した。次に、発熱性物質定量用試薬エンドスペシー
（（１→３）−β―Ｄ―Ｇｌｕｃａｎは検出しない）及
びトキシカラー（（１→３）−β−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎも
検出する）を用いて、発熱性物質の定量を行ない、その
結果を以下に示した。尚、以上の操作に用いた器具、緩
衝液等はすべてエンドトキシンフリー及び（１→３）−
β―Ｄ−Ｇｌｕｃａｎフリーのものを用いた。表に示した様に、本発明に関わる発熱性物質吸着ビーズ
は、発熱性物質の良好な吸着性能を示した。また、エン
ドスペー及びトキシカラーによるエンドトキシンの定量
結果も良好であった。即ち、レンチナンによる影響は認
められなかった。実施例６．反応性官能基―Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ
Ｈ＝Ｎ―を固相化し、更にその官能基にリガンドとし
て、ヒスチジンを共有結合させたポリスチレン製小試験
管を調製した。小試験管（ブロック済）に緩衝液２ｍ
ｌ、エンドトキシンＡ液（リン緩衝液にエンドトキシン
１．５００ＥＵ／ｍｌを溶解）または、エンドトキシン
Ｂ液（リン酸緩衝液にしエンドトキシン１．５００ＥＵ
／ｍｌ及びメシル酸ガベキサート８０ｕｇ／ｍｌを溶
解）２００ｕｌを秤量し、室温で３０分ｉｎｃｕｂａｔ
ｅした。次に、前記小試験管をリン酸緩衝液２ｍｌで３
回洗浄した。次に、発熱性物質定量用試薬エンドスペシ
ー（（１→３）−β−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎは検出しない）
及びトキシカラー（（１→３）−β−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎ
も検出する）を用いて、発熱性物質の定量を行ない、そ
の結果を以下に示した。尚、以上の操作に用いた器具、
緩衝液等はすべてエンドトキシンフリー及び（１→３）
−β―Ｄ−Ｇｌｕｃａｎフリーのものを用いた。表に示した様に、本発明に関わる発熱性物質吸着小試験
管は、発熱性物質の良好な吸着性能を示した。また、エ
ンドスペー及びトキシカラーによるエンドトキシンの定
量結果も良好であった。即ち、メシル酸ガベキサートの
影響は認められなかった。実施例７．反応性官能基−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）_３−Ｃ
Ｈ＝Ｎ−を固相化し、更にその官能基にリガンドとし
て、ヒスチジンを共有結合させたポリスチレン製小試験
管を調製した。小試験管（ブロック済）に緩衝液２ｍ
ｌ、エンドトキシンＡ液（リン緩衝液にエンドトキシン
０．５００ＥＵ／ｍｌを溶解）または、エンドトキシン
Ｂ液（リン酸緩衝液にエンドトキシン０．５００ＥＵ／
ｍｌ及びアプロチニン１０ｕ／ｍｌを溶解）２００ｕｌ
を秤量し、室温で３０分ｉｎｃｕｂａｔｅした。次に、
前記小試験管をリン酸緩衝液２ｍｌで３回洗浄した。次
に、発熱性物質定量用試薬エンドスペシー（（１→３）
−β−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎは検出しない）及びトキシカラ
ー（（１→３）−β−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎも検出する）を
用いて、発熱性物質の定量を行ない、その結果を以下に
示した。尚、以上の操作に用いた器具、緩衝液等はすべ
てエンドトキシンフリー及び（１→３）−β−Ｄ−Ｇｌ
ｕｃａｎフリーのものを用いた。表に示した様に、本発明に関わる発熱性物質吸着小試験
管は、発熱性物質の良好な吸着性能を示した。また、エ
ンドスペー及びトキシカラーによるエンドトキシンの定
量結果も良好であった。即ち、アプロチニンの影響は認
められなかった。実施例１〜実施例７に用いたエンドス
ペシー及びトキシカラーは、何れも（株）生化学工業
（東京）の製品である。

Claims

【特許請求の範囲】（１）発熱性物質吸着体（ゲル）を固相化した容器、試
験管、球（ビーズ、ボール）、磁性粒子、チップ、薄
板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタープレート、ス
トリップ、ろ紙ディスク等の器具。（２）発熱性物質吸着体がポリペプチド系抗生物質（ポ
リミキシン類（ＰｏｌｙｍｙｘｉｎＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，
Ｅ，Ｆ，Ｋ，Ｍ，Ｐ，Ｓ，Ｔ）、コリスチン類（Ｃｏｌ
ｉｓｔｉｎＡ，Ｂ，Ｃ）、グラミシジンＳ類、タイロ
シジン類等）またはアミノグリコシド系抗生物質（カス
ガマイシン、エデイン、ストレプトマイシン、カナマイ
シン、ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシ
ン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、ゲンタマイシ
ン等）またはヒスタミン、またはヒスチジンをまたは、
β−（１−４）−２−ａｍｉｎｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ
−ｇｌｕｃａｎ（キトサン）を固定化したアフィニティ
ークロマトグラフィー担体である請求項（１）記載の器
具。（３）−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）ｎ−ＣＨ＝Ｎ−，−ＣＯ
ＮＨ− 等の反応性官能器を固相化し、その官能基に発
熱性物質と結合するリガンドを共有結合させた容器、試
験管、球（ビーズ、ボール）、磁性粒子、チップ、薄
板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタープレート、ス
トリップ等の器具。（４）リガンドがポリペプチド系抗性物質（ポリミキシ
ン類、コリスチン類、グラミシジンＳ類、タイロシジン
類等）またはアミノグリコシド系抗生物質、またはヒス
タミン、またはヒスチジン、またはキトサンである請求
項（３）記載の器具。（５）請求項（１）及び請求項（３）に記載された実験
器具を用いて、発熱性物質を吸着した後、既知の方法
（放射イムノアッセイ法、非放射イムノアッセイ法、Ｌ
ｉｍｕｌｕｓ試験等）により定量する方法。（６）請求項（５）の実施の為に構成された発熱性物質
定量キット。