JPH0667958B2 - 蛋白質とポリアミンとの反応生成物及びその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ポリヌクレオチド配列に結合する能力のあ
る、蛋白質とポリアミンとの反応生成物を提供する。こ
の蛋白質は西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリ
性ホスファターゼのような酵素が好ましく、ポリアミン
はポリエチレンイミンが好ましい。

本発明はまた、ベンゾキノン分子を蛋白質に共有結合さ
せ、得られた中間体をポリアミンと反応させることから
なる上記反応生成物の製造方法をも提供する。

ハイブリダイゼーションは２本の異なるポリヌクレオチ
ド鎖についての塩基配列の同一性の確認のための手段で
ある。２本のDNA鎖は相補性塩基配列とともに溶液状態
で冷却すると互いに２重らせん構造を形成し、一本のDN
A鎖及び一本のRNA鎖は相補性構造とぴったり合体してDN
A-RNAハイブリッドを形成する。それ故ハイブリダイゼ
ーションによりヌクレオチド化学の多くの問題、たとえ
ば特定の遺伝子または遺伝子断片の発見と単離、遺伝子
配列の図をかくこと等が解決される。特に遺伝子工学の
分野で特定の必要な遺伝子の位置決定は最終的で決定的
な役割を演じ、ハイブリダイゼーションはこのような位
置決定を可能にする。

ハイブリダイゼーションを実施するためには、必要とさ
れる核酸に対する相補性構造を有する核酸鎖がこの目的
に使用されるが、その際再び見出すための適当な方法で
核酸構造を標識しておく。通常この標識は、放射性同位
元素を有するヌクレオチドトリホスフェートを同定に使
用する相補性核酸中に予め酵素的に導入することにより
行われた。この方法の重大な不利な点は、放射性物質に
よって研究する必要があり、広大な安全対策と高価な装
置を設置する必要がある点である。

それ故、放射性同位元素による標識を他の標識に変換す
る試みがすでになされてきた。

最近、ビオチンをピリミジンまたはプリン環に共有結合
させたヌクレオチド同族体が合成された。これらのヌク
レオチド誘導体はRNA-およびDNA-ポリメラーゼの基質で
あって、これらの酵素の作用の下で形成されたポリヌク
レオチドはそれらの相補性配列と特異的にハイブリッド
を形成する。これらのプローブは、親和性物質（たとえ
ばアビジン−ペルオキシダーゼ）あるいは免疫学的（た
とえばもう１つのペルオキシダーゼ担持抗体と結合して
いるビオチン−抗体）検出系と結合させて放射性標識核
酸の代替物として、使用される。同様にビオチン残基は
チトクロームＣを介してRNAと結合し、ハイブリダイゼ
ーションは電子顕微鏡的によってアビジン−検出系を使
用してその存在を確認される（Chromosoma/Berl.53、10
7-117(1975))。

さらに多くの合成工程を必要とするのでこの方法はいま
だに比較的複雑である。従って相変らず、プローブとし
て適し、簡単につくれてハイブリダイゼーションの技術
の感受性を高めるより簡単なハイブリダイゼーションの
方法、及びハイブリダイゼイションの試薬の必要性が存
在する。

よって、本発明の目的はそのような方法及び試薬を提供
することである。

この目的はポリヌクレオチドと検出物質との複合体を形
成し、このようにして形成された複合体をハイブリダイ
ゼーション反応のために使用することによるハイブリダ
イゼーションに反応を実施する方法であって、その方法
が一本鎖ポリヌクレオチド及び正に荷電した、核酸と結
合し、検出し得る蛋白質またはポリアミンを溶液中で反
応させ、生成した複合体を架橋結合剤で共有結合させ、
得られたポリヌクレオチド化合物を未知のポリヌクレオ
チドの相補性配列の探索の際のハイブリダイゼーション
実験において標識として使用することを特徴とする本発
明によって達成される。

本発明の観点において正に荷電した蛋白質またはポリア
ミンとは、本来そのような特性を有しているものかある
いは、もしそれが負に荷電または中性であったならば対
応する正に荷電した蛋白質またはポリアミンによって修
飾されるものを意味する。また驚くべきことは、正に荷
電したタンパク質またはポリアミンで修飾することによ
り任意のタンパク質がDNA-結合性タンパク質に転換でき
ることであった。

従って本発明は、反応生成物を使用することによって大
きな蛋白質分子をも標識として導入できる簡単なハイブ
リダイゼーション用プローブの簡単な製造方法を提供す
る。上記プローブの製造方法は正に荷電した蛋白質また
はポリアミンが静電気的相互作用によってより低いイオ
ン強度の核酸と結合し、それ故核酸と蛋白質またはポリ
アミンとの間の架橋結合を促進するという事実にもとづ
いている。このことは２つの要求を充す：すなわち 1.核酸に対する非常に緊密な結合が得られ、それ故に短
い反応時間内で低濃度の架橋剤たとえばグルタルアルデ
ヒドのようなものによって非常に強力な架橋結合を可能
とする。そのようにして生成した蛋白質−核酸−化合物
（プローブ）は蛋白質で標識された一本鎖DNAではない
が、蛋白質：DNA-質量比約１の共有結合した一本鎖−DN
A−蛋白質−単位を生成する。ハイブリダイゼーション
後、蛋白質を調べることによって（たとえば抗体によっ
て）相補性配列を検出することができる。2.蛋白質また
はポリアミンは化学的に容易に修飾され得る。その際、
標識基または標識化合物は直接またはたとえば環状Ｎ−
サクシンイミドエステルのような架橋形成化合物によっ
てアミノ基に固定化され得る。分子（今や標識されてい
る）を一本鎖−DNAで架橋結合し、多数の標識部位を有
する標識物を得ることができる。これはハイブリダイゼ
ーション後に親和力検出系または免疫学的検出系によっ
て容易に検出される。ブロットハイブリダイゼーション
実験において、同一の反応条件下に標識をつけられたこ
の方法のプローブは、高い特異性を以ってそれらの相補
性配列と反応し、ニック翻訳された又は末端標識された
プローブと相違しないことが示される。

本発明で使用されるポリアミンとしてはスペルミジン、
スペルミン、プトレシン等の天然で生成したいわゆる
“ポリアミン”であり、これらは場合により実際にはオ
リゴアミンが好ましい。しかし合成ポリアミンもまた適
する。

一本鎖ポリヌクレオチドも天然のものまたは合成したも
のでよいが、DNAまたはRNAが好ましい。ハイブリダイゼ
ーション反応の相手としてDANおよびRNAを使用でき、結
果として、DNAとDNA、DNAとRNAおよびRNAとRNAのハイブ
リダイゼーションを行うことができる。

一本鎖ポリヌクレオチドおよび正の荷電を有するポリア
ミンから形成した複合体の架橋結合は通常の架橋結合剤
によって生じる。該結合剤は蛋白質の官能基をポリ核酸
の官能基と結合させることができる。特に適しているの
は、ジアルデヒド、たとえばグルタールアルデヒド、ジ
エポキシドのような二官能試薬および、一般的に水溶液
中でアルキル化するに適した２つの官能基を有する化合
物である。従来からの適当な典型的基は、酸クロリド、
酸ブロミド、無水酸、隣接する二重結合によって活性化
されたハロゲン原子等の活性化カルボキシル基である。

ハイブリダイゼーションによる生成物を可視化するため
に、ここに包含される蛋白質はたとえば標識等によって
検出されなければならない。

蛋白質またはポリアミンの標識は予め複合体形成反応前
に行うか、またはすでに形成された時に行うか必要なら
すでに架橋結合された複合体にも行うことができる。こ
の目的のために標識をつけることは蛋白質化学の従来か
らの公知の方法であって、当業者に周知であって今さら
ここで明示する必要はない。放射性同位元素による標識
および色素、色素成分または生物活性蛋白質（たとえば
酵素）による標識が標識系としては適当である。

複合体形成のために使用される正の荷電を有する核酸形
成蛋白質またはポリアミンによる標識の代わりに蛋白質
およびポリアミンを免疫反応によって検出することも可
能であり、この場合免疫反応の相手側が標識されるか又
は第２抗体によって検出されなければならない。そのよ
うなものとして定義し得る基は、放射性同位元素または
色素によって標識され直接検出されるかあるいは間接的
に、たとえば酵素−免疫検定法によって知られる如くそ
れらの酵素活性によって検出される。

蛋白質またはポリアミンと一本鎖ポリヌクレオチドとの
間の複合体形成反応の実施のための溶液は低いイオンの
活量を示さなければならない。好ましくはイオン強度は
50mMより低くなければならない。

ハイブリダイゼーション反応自体は、従来公知の方法に
従って、一本鎖ポリヌクレオチド及びポリアミンから本
発明に従い得られた共有結合した架橋結合複合体を単
に、所望の相補性核酸を含有する溶液に加え、好ましく
はいく分高い温度でインキュベートすることによって行
う。形成したハイブリッドの可視化および単離は同じく
当業者に公知の方法により行う。

本発明のさらなる目的であるハイブリダイゼーション反
応の実施のための試薬は、一本鎖ポリヌクレオチドと正
の電荷を有する核酸に結合する検出可能な蛋白質または
ポリアミンとの架橋共有結合複合体からなるあるいはそ
れを含むものである。同様に蛋白質対核酸の重量比約1:
1が好ましい。

本発明はハイブリダイゼーション反応を行うための方法
および試薬を提供し、その方法はプローブとして化学合
成された化合物を使用し、核酸化合物は高収率で得られ
（90％以上）、何らポリメラーゼを使用して製造する必
要がなく、先駆体および余分な最終生成物とを分離する
ことも必要ない。所要時間は非常に短く、プローブ製造
のためのポリヌクレオチドは高純度状態になくてもよ
い。ブロット−ハイブリダイゼーションのために当業者
に公知の標準的方法がそのまま使用される。

下記例は、本発明を説明する。

例1. 20mg（５×10³単位）の西洋ワサビのペルオキシダーゼ
（ベーリンガーマンハイム、１級）を220μの90mMリ
ン酸ナトリウム(pH6.0)に溶解させ、次いで1mのエタ
ノール中の30mgのｐ−ベンゾキノンを含有する溶液60μ
を加えた。この混合物を１時間37℃で暗中反応させ
た。共有結合したベンゾキノン分子を有するペルオキシ
ダーゼを、緩衝液なしに0.15M NaCl中セファデックスG1
00カラム6mを使用したゲル濾過により未反応ベンゾキ
ノンから分離した。褐色になったフラクション（約1.8
ｍ）をいっしょにし、180μの１M NaHCO₃及び2.7μ
（133μｇ）のポリエチレンイミン溶液（ポリミンG35
BASF）の添加によってpH値を上昇させることによってカ
ップリング反応を進めた。反応混合物を14時間37℃で暗
中に置き、次いで5mMリン酸ナトリウム（pH6.8）に対し
て透析し、３℃で保存した（溶液Ａ）。溶液Ａの蛋白質
濃度は約７μｇ／μであった。３ケ月間の貯蔵の間に
何ら活性低下は見られなかった。

ペルオキシダーゼ混合物の大きさ及び組成を、¹²⁵I−ポ
リエチレンイミン（ボルトン−ハンター試薬で標識）を
使用したSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および
コオマシー（Coomassie）−青染色ゲルを相当するオー
トラジオグラムと比較することによって測定した。その
結果すべてのベルオキシダーゼ分子はすでに修飾されて
いた。該結合物は下記の大きさを有した：50KDa 10％；
100KDa 60％；150KDa 20％；200KDa 5％；250KDa 2％。
すべての結合物はペルオキシダーゼ対ポリエチレイミン
のモル比が１であった。

参考例１ プローブの製造 環状二本鎖DNA分子を制限エンドヌクレアーゼで線状化
し、さらに精製することなしに使用した。20μの５mM
リン酸ナトリウム(pH6.8)中１μｇDNAを加熱変成（100
℃、３分）し、氷上で３分間冷却した。まず20μの溶
液Ａを加え、その後６μの５％グルタールジアルデヒ
ド溶液を加えた。プローブを37℃で10分間インキュベー
トし、次いで直接にニトロセルロース紙およびハイブリ
ダイゼーションの溶液を含むハイブリザイゼーション反
応物に加えるか、あるいは40％のポリエチレングリコー
ル8000（シグマ社製）を含有する溶液28μを添加する
ことによって沈殿させる。この混合物を６分間遠心分離
し、沈殿を５mMリン酸ナトリウム（pH6.8）中1.5ML−リ
ジン10μに溶かし、ハイブリダイゼーションに使用し
た。ゲル濾過のカラム（Sepharose CL-6B）によるDNA−
結合の研究によって、約25％のペルオキシダーゼ活性が
DNAに共有結合していることがわかった。これは蛋白
質：DNAの重量比約30に相当する。

プローグのハイブリダイゼーションと可視化 固定化されたDNAを有するニトロセルロース紙（シュラ
イヘル＆シル（Schleicher&Schiill）製）を１時間38℃
で10×デンハーツ（Denhardts）溶液、４×SET（１×SE
Tは0.15M NaCl,0.03Mトリス−Hcl、pH８、１mM EDTA）お
よび0.1％SDSに浸透し、２〜20ｍのブランクハイブリ
ダイゼーション混合物（50％ホルムアミド、２×デンハ
ーツ溶液、４×SET、0.1％SDSおよび30μg/m酵母tRN
A）を含有するプラスチック容器に移し、振とうしなが
ら１時間38℃でインキュベートし、プローブを添加後２
〜16時間38℃でさらにインキュベートした。

ニワトリおよびヒト単−複写−遺伝子配列の分析のため
に、ハイブリダイゼーションはポリエチレングリコール
8000の存在下に行った。ハイブリダイゼーション混合物
は、ホルムアミドのみの代わりにホルムアミド中12％
（重量／容量）ポリエチレングリコール溶液を使用する
ことによって修飾された。このニトロセルロース紙を、
60分38℃で50％ホルムアミド、0.4％SDS及び0.5×SSC
（１×SSCは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）を
含有する溶液を２回交換して、および20分20℃で２×SS
Cを含有する溶液を２回交換して洗った。次いでこのフ
ィルターを20℃で暗中色素溶液とインキュベートした。
ペルオキシダーゼは、10mMイミダゾール、2mのエタノ
ールを含有する100mMトリス−HCl(pH7.4)の溶液（6mgの
3,3′−ジアニジンを溶解）および10μの30％H₂O₂に
よって可視化された。発色後フィルターを洗いトリス−
HCl−イミダゾール緩衝液中で保存した。

第１図中、面ａは別々の制限エンドヌクレアーゼによっ
て切断されたpHBV14.1DNAの寒天ゲル−電気泳動図（エ
チジウムプロミドで発色）を示し、すなわち左から右へ
BamHl、Bg1II、Aval、HpaII、PstIによる切断を示す。
各々の横線は100ngのDNAを含む。最右端のカラムは、下
記の長さ(Kb)の標準物を含んでいた： 23.1、9.4、6.6、4.4、2.3、2.2、2.0、1.1、0.75、0.56、0.38
（参考例１−１）。

面ｂは、面ａ中に示されるDNAを転写しEcoRIで切断した
pBR 322DNAとハイブリダイゼーションを行った後でペル
オキシダーゼ（10μの溶液Ａ）と結合しアニシジン−
H₂O₂で染色したニトロセルロース紙を示す（参考例１−
２）。

面ｃはペルオキシダーゼで標識されたHBVDAN配列とハイ
ブリダイズしたコピーフィルターを示す。pHBV14.1の挿
入部（32Kb長）をPst Iで切断した後寒天ゲル−電気泳
動に供し、溶出した。そのようにして得られた0.5μｇ
の挿入部DNAをペルオキシダーゼで標識した（10μの
溶液Ａ）（参考例１−３）。

面ｄは、HBVDNA（ペルオキシダーゼで標識）およびpBR3
22DNA（アルカリ性ホスファターゼで標識）とハイブリ
ダイゼーションしたコピーフィルターを示す。挿入物HB
VDNA0.5μｇをペルオキシダーゼと結合し（10μの溶
液Ａ）、線状化pBR322DNA0.5μｇをアルカリ性ホスファ
ターゼで標識した（例２による溶液Ｂ 10μ）。

ハイブリダイゼーション後濾紙をまずホスファターゼの
ための基質溶液とインキュベートしたところ青く呈色
し、次いでアニシジンでペルオキシダーゼとインキュベ
ートしてペルオキシダーゼを可視化した（茶色の帯）。
ハイブリダイゼーションの容量および時間は各々15m
ないし３時間であった（参考例１−４）。

第２図においては、面ａは下記試験の結果を示す：pDv
l、すなわちディー・ビリリス(D.virilis)の挿入物を含
むpBR322プラスミドをEcoRIおよびPvuIIで切断したとこ
ろ４つの断片が形成した:2ディー・ビリリス(D.virili
s)断片（2.8Kbと2.4Kbの大きさ）および2pBR322断片
（2.3Kbおよび2.06Kbの大きさ）。連続希釈物（各々50
0、100および20pg/１トラック当り）を電気泳動にかけ、
ブロットしペルオキシダーゼ（10μの溶液Ａ）とハイ
ブリッド形成させた線状化pBR322を0.5μｇのEcoRIで線
状化しハイブリッドを16時間、2.0ｍの容量で形成さ
せた。中央の列の２本の帯は24ないし21pgDNAを含む。
両方の帯の中の断片は2.3ないし2.06Kbの長さである
（参考例１−５）。

面b)は、EcoRIで切断された電気泳動で分離された0.75
μｇDNA（ディー(D.)黒色胃Kc細胞由来）を転写し、5m
の容量でPstIで線状化した4.8Kbの挿入物を含むpBR32
2クローン0.5μｇと３時間ハイブリダイゼーションを行
った後のニトロセルロース紙を示す。ここでは該挿入物
はアルコール脱水素酵素遺伝子を有し、ペルオキシダー
ゼ（溶液Ａ10μ）と結合させてある。帯中のDNA断片
は4.8Kbの長さであった（参考１−６）。

面c)はa)と同様に滴定実験の結果を示しているが、ここ
ではハイブリダイゼーションは６％ポリエチレングリコ
ールの存在下に行われた。右端の列の２つの帯は4.7な
いし4.1pgDNAを含む（参考例１−７）。

面d)は、10μｇのニワトリ胎児-DNAをSaclで切断し、こ
れを寒天ゲル−電気泳動に付して、次いでニトロセルロ
ース濾紙上に転写した試験の結果を示す。ハイブリダイ
ゼーションは、EcoRIで線状化された2.5μｇのpBR322プ
ラスミドであって、ペルオキシダーゼ（溶液Ａ50μ）
と結合させてあるひな赤芽球症ウィルスのerbAおよびer
bBをコードする2.5Kbの配列で行われた。ハイブリダイ
ゼーションの時間は14時間で、容量は5mであった。こ
のハイブリダイゼションの混合物は６％ポリエチレング
リコールを含有していた。帯は下記Kbの大きさに一致し
た：8.1、7.5、5.0、3.0、2.5（参考１−８）。

面e)は下記試験の結果を示す。すなわち、ヒーラ(HeLa)
細胞からのヒトDNA15μｇをHindIIIで切断し、寒天ゲル
−電気泳動により大きさで分離し、ニトロセルロース濾
紙上に転写し、15時間（5mの容量）でEcoRIで線状化
されたpKT218−プラスミドであってペルオキシダーゼ
（溶液Ａ50μ）と結合させてあるアルブミン遺伝子(2
Kb)の同調領域を含むもの2.5μｇを使用してハイブリッ
ト形成させた。このハイブリット混合物は６％ポリエチ
レングリコールを含有していた。得られた帯は下記Kbの
大きさに一致した：6.2、4.2、1.8（参考１−９）。

例２ 例１に記載の如く、アルカリ性ホスファターゼとポリエ
チレンイミンの結合物を製造した。この目的のために子
牛の腸からのアルカリ性ホスファターゼ３mg（350μ
）（１級、ベーリンガーマンハイム製）を0.1Mリン酸
ナトリウム（pH6.0）に対して透析した。90μのｐ−
ベンゾキノン溶液（例１の如く）を添加し、その混合物
を暗中で１時間37℃でインキュベートした。ゲルクロマ
トグラフィー（6mのカラムセファデックスG25）後、
ホスファターゼ含有フラクションをいっしょにし（約90
0μ）、100μの1M NaHCO₃および20μｇのポリエチ
レンイミンを加えた。この混合物を18時間37℃で暗中イ
ンキュベートし、5mMリン酸ナトリウム（pH6.8）に対し
て透析し３℃で保存した（溶液Ｂ）。

プローブの製造は参考例１に記載の如く、しかし溶液Ａ
の代りに溶液Ｂを使用して行った。同じくハイブリダイ
ゼーションも参考例１に記載の如く行った。

アルカリ性ホスタファーゼは、ニトロブルーテトラゾリ
ン（NBT）および５−ブロム−４−クロル−３−インド
キシル−ホスフェート−４−トルイジン塩(BCIP)を含有
し次のようにして製造された溶液15ｍを添加すること
により可視化された:5mの0.1Mトリス−HCl(pH9.5)、
0.1M NaCl、5mMMgCl₂（緩衝液Ａ）に５mgNBTを懸濁し、
１分間激しく動かし、短時間遠心分離した。上清をあら
かじめ37℃に加温した10ｍの緩衝液Ａに傾瀉した。次
いで2.5mgBCIPを50μのジメチルホルムアミドに溶解
させ、動かしながら上記NBT溶液に滴下した。発色後、
フィルターを洗い、5mM EDTA含有100mMトリス−HCl(pH
7.4）中で保存した。

【図面の簡単な説明】

添付図面中、第１図は本発明の反応生成物を含む標識プ
ローブを使用したブロットハイブリダイゼーションの結
果を示す電気泳動図であり、第２図は滴定−およびゲノ
ム−プロット−実験の結果を示す電気泳動図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ポリヌクレオチド配列に結合する能力を有
   する、蛋白質とポリアミンとの反応生成物。
2. 【請求項２】蛋白質が酵素である特許請求の範囲第１項
   記載の反応生成物。
3. 【請求項３】酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼまたは
   アルカリ性ホスファターゼである、特許請求の範囲第２
   項記載の反応生成物。
4. 【請求項４】ポリアミンがポリエチレンイミンである特
   許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載
   の反応生成物。
5. 【請求項５】ポリエチレンイミンは約1400の分子量を有
   し且つ実質的に等量の第一、第二および第三アミノ基を
   含む、特許請求の範囲第４項記載の反応生成物。
6. 【請求項６】ベンゾキノン分子をタンパク質に共有結合
   により結合させ、得られる中間体をポリアミンと反応さ
   せることから成る、ポリヌクレオチド配列に結合する能
   力を有する、蛋白質とポリアミンとの反応生成物の製造
   方法。