JPH0670621B2 - 水性液体中の被分析物を決定する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、電気的に、例えば、電気泳動によって分離さ
れている被分析物の決定方法に関する。

〔従来の技術〕

試料中に存在する別々の分子種を分離および同定する各
種の分析方法が開発されてきた。分離は、水含有固体媒
質に試料を加え、そしてその媒質内で種の分子分離を引
起こすことによって一般に行なう。特に、クロマトグラ
フィーおよび電気泳動が使用されており、両者によれば
異なる分子種は分離される。分離媒質は一般にクロマト
グラフィー媒質または電気泳動プレートと称されてい
る。このような方法では、分離工程の前、最中または後
に、試料中の１種以上の分子種と相互作用を示す各種の
試薬を媒質中に加え、被分析物の分離または同定の補助
とする。

一般に、水が存在するために媒質中で水溶性試薬は著し
く拡散するので分離度が低く、通常の電気泳動媒質中で
は分離された材料の同定は妨害される。タンパク質を酸
または溶媒で媒質に固定した場合、染色すると非常に鮮
明な（シャープな）信号を得ることができる。しかしな
がら、固定工程は通常、変質によって酵素活性を破壊す
る。更に、着色剤は一般には、決定すべきすべてのタン
パク質に対して同じ親和性を示さない。

電気泳動媒質中には多数の方法によって試薬の導入が行
なわれてきた。例えば、水溶性バインダー中に分散させ
た水溶性試薬からなる転写（transfer）装置を使用して
電気泳動プレートに試薬を転写することが知られてい
る。その転写装置を電気泳動プレート表面上に置くとバ
インダーが溶解し、水溶性試薬がプレート中に拡散し
て、分離されている被分析物と反応する。この技術には
多数の欠点がある。電気泳動プレートは一回しか使用す
ることができない。なぜなら、試薬が水中に分散し、そ
して得られる検出可能信号をプレート中で観察するから
である。更に、試薬転写が高度の水性環境中で行なわれ
るので、得られる被分析物−試薬信号の分離度は劣って
いるからである。反応生成物（例えば、色素）は毛細管
作用のために媒質中に拡がる傾向がある。更に、操作の
実施が困難なことがある。

微孔質ナイロン膜を使用して被分析物例えば核酸を電気
吸取法（electroblotting）によって電気泳動プレート
から膜へ転写することも知られている。その膜の選択性
は限られているのですべての被分析物が転写される。次
に、その膜を処理して、被分析物の存在下で検出可能な
信号を提供する。それは、検出手段を提供する試薬を含
有していない。更に、転写工程は水性環境下で実施され
る。

水溶性の螢光性物質を含浸させたセルロース系膜を、電
気泳動プレート中のアイソエンザイムの同定に使用する
ことがR.E.Smith,J.Histochem.Cytochem.,32（12）,126
5−1274頁（1984）に記載されている。この文献は、前
記膜のオーバーレイ（overlayer;被覆層）によって、高
度に分離された同定バンドが提供されるものと主張して
いる。しかしながら、この膜には多数の重大な欠点があ
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

前記文献による膜のオーバーレイは、それを使用する際
に湿潤状態であることが必要である。結果として、検出
可能な信号を提供する基質が水溶性であるので、同定バ
ンドがかなり拡散してしまう。更に、基質がオーバーレ
イからプレート中へ拡散するので、同じ電気泳動プレー
トを用いて複数の試験を行なう手段は、前記のオーバー
レイによっては提供されない。本質的には、前記文献の
オーバーレイは一回かぎりの試験に使用することができ
るだけである。

〔問題点を解決するための手段〕

前記の公知の検出方法における問題点は、水性液体中の
被分析物を決定する方法であって、下記の工程： A.電気泳動プレートに前記液体の試料を接触させる工
程； B.前記プレート中で、複数の被分析物を互いに電気的に
分離する工程； C.前記プレートを乾燥した透明なシート状分析要素で覆
って一時的ラミネート体を形成する工程、ここで、前記
分析要素は、水不溶性バインダー材料と、該バインダー
中に予め分散せしめられた、前記被分析物の少なくとも
１つと反応して非拡散性の検出可能な種を前記要素中で
のみ形成するような反応性成分とを含有する；及び D.前記要素を前記プレートから分離し、そして前記要素
中の前記検出可能な種を検出する工程； を含んでなることを特徴とする、水性液体中の被分析物
を決定する方法により解決される。

本発明は、各種の分野の研究例えば医学、免疫学、遺伝
学、微生物学、生化学、臨床化学および法廷科学（一部
分を例示したに過ぎない）において有利に使用すること
できる。分子荷電に基づいて、電気的に誘発されて水性
媒質を通って移動することができ、そして他の物質から
分離させることのできる任意の物質を、本発明を使用し
て同定することができる。このような物質を本明細書に
おいては被分析物と称する。例えば、生物学的流体例え
ば血液中の特定の酵素、抗原または抗体を検出する診断
の目的に本発明を使用することができる。法廷科学にお
いては、身元確認または個人確認の目的に、酵素および
他のタンパク質の遺伝的変異の表現型化（phenotypin
g）に使用することができる。核酸、ペプチドおよび他
の細胞成分の分析も可能である。好ましい態様におい
て、本発明は各種タンパク質例えば酵素（例えば、クレ
アチンキナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、アルカ
リホスファターゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、アデニレートキナーゼ、γ−グルタミル
トランスフェラーゼ等）の決定に有用である。個別のバ
ンドに分離されているアイソエンザイムの存在を本発明
によって有利に決定することができる。この存在には、
クレアチンキナーゼ、アルカリホスファターゼおよびラ
クテートデヒドロゲナーゼのアイソエンザイムの存在が
含まれる。

水溶液体例えばヒトまたは動物の生物学的液体中には複
数の被分析物が一般に存在する。被分析物は電気的に誘
発される移動によって固体媒質中で分離することができ
る。前記液体の適当な試料を、電気的に誘発した分子移
動操作または親和分離操作に使用される適当な媒質に加
える。前記の媒質には、電気泳動プレートおよび等電点
電気泳動（エレクトロフォーカシング）プレートが含ま
れる。本発明方法で使用することのできる多数の市販プ
レートが存在し、それらには例えば米国特許第3,975,16
2号明細書に記載のもの、および後記の実施例に記載の
ものが含まれる。一般に、前記のプレートは水和ゲルま
たは膜の薄層中に１以上のコンパートメントをもってい
る。水和ゲル、例えばアガロース、寒天、ポリアクリル
アミド、アクリルアミドおよび当業界に公知の他の物質
から調製したプレートが特に有用である。本発明の実施
には、アガロースおよびポリアクリルアミドプレートが
好ましい。

液体試料をプレート上に加えた後に、プレートに適当な
電流を印加して、被分析物の分子移動および相互間の分
離を行なわせる。公知の分離方法を使用するとができ
る。例えば、電気泳動を使用することができ、この場合
には被分析物には一定のpHおよびイオン強度の電場がか
けられる。他の分離技術は等電点電気泳動であり、この
場合には分子個々の等電点に基づいて分子をpH勾配にか
けて分離する。

分子分離を適当な程度まで進行させた後、電気泳動プレ
ート表面と分析要素（後述する）とを接触させ、この際
に界面の気泡数を確実に最小にする。一般に、プレート
と要素とのラミネート体は、プレートを要素で被覆（ov
erlay）することによって行なう。しかしながら、要素
をプレートで被覆することもできる。本発明で使用する
いずれの接触技術においても、接触するプレート表面と
要素表面とが界面を形成し、その界面で被分析物と反応
性成分（後述する）との反応が可能になる。このラミネ
ート中には相対的にほとんど水分が存在しないので、被
分析物または非拡散性検出可能種による界面を横切る拡
散は実質的に存在しない。換言すれば、本発明の実施に
おいては、被分析物はプレートから実質的に離れず、そ
して検出可能種は分析用要素から実質的に離れない。こ
れは、プレートと要素とのラミネート体の各成分に有意
量の水が存在しないこと、および検出可能種の水不溶性
によってもたらされる。標準的な電気泳動プレート中に
は若干の水分が存在するが、その量は要素中で水不溶性
試薬の移動を起こすのには充分ではない。

要素とプレートを十分な時間ラミネート体の状態に保っ
て、被分析物と反応性成分との反応をおこさせ、検出可
能種を要素中でのみ形成させた。反応時間は、被分析
物、使用する相互作用組成物および被分析物と前記組成
物の濃度に依存して変動する。僅かな実験で最適反応時
間を見出すことができる。反応は37℃のインキュベーシ
ョン工程で実施することができるが、45℃までの任意の
温度を使用することができる。

反応の結果として生成する検出可能種は、要素中で使用
する反応性成分の型に依存する。一般に、種の検出は分
光光度法手段によって行なうことができる。すなわち、
適当な検出装置および方法で検出可能な比色、螢光、化
学ルミネッセンスまたはリン光の濃度の増減によって種
を測定することができる。好ましくは要素を透明にし、
検出可能な色原体（chromogen）を透過分光学によって
測定する。

検出可能な種を決定するために、プレートから分析要素
を引き離し、適当な検出方法にかける。必要な場合に
は、要素に追加の試薬を加えるかまたはインキュベーシ
ョンにより、種から得られる信号を強化することができ
る。

本発明を実施する際に使用する分析要素は一般に１種以
上の水不溶性バインダー材料からなる。バインダー材料
およびその中に分散せしめた反応性成分を、自己支持性
塗布層または非多孔質支持体上の塗布層に分散させる。
特に興味のある要素はEastman Kodak社（米国ニューヨ
ーク州ロチェスター）からEktachem Clinical Chemistn
y分析用スライドとして最近市販されたものである。最
外の多孔質拡散層を除去することによってこのような要
素を、改良することができる。代表的な要素例を後記の
実施例で説明する。他の有用な分析要素は、拡散層を含
んでいるものまたは含まないもので、米国特許第3,992,
158号、第4,042,335号、第4,144,306号、第4,259,011号
および第4,430,436号明細書に記載されている。

要素は、一般に、水不溶性バインダー材料１種以上から
なる１以上の領域または層を含んでなる。電気泳動プレ
ートと接触する要素の少なくとも最外の領域または層は
水不溶性バインダー材料から構成されており、従って最
小量の水を含有することのあるプレートに対してその要
素が粘着性でないことが必須である。前記のバインダー
材料の20℃における水溶性は、１重量％未満の程度であ
る。有用なバインダー材料としては、繊維材料例えば
紙、織物、繊維フリースまたはマットが含まれる。好ま
しい態様において、非繊維材料例えば硬化によって高水
不溶性にすることのできる天然または合成コロイド（例
えばゼラチン、多糖等）、アクリルアミドポリマー、ビ
ニルピロリドンポリマー、セルロースエステル、セルロ
ースエーテル、ポリビニルエステル、ビニルアセタール
等を使用する。硬化ゼラチンは好ましいバイダー材料で
ある。

前記の要素は１層以上の試薬層を有することができ、そ
れらの試薬層は反応性成分を１種以上または反応性成分
全部を含有することができる。所望により、他の層を存
在させることができ、これらの層としては下塗り層、輻
射線遮断層、反射層、位置合せ層、障壁層、拡散層およ
び当業者に公知のもの等が挙げられる。１層で複数の機
能を果すことができる。例えば試薬層でもある拡散層で
ある。通常はポリマー材料例えばセルロースアセテー
ト、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリカーボネー
トまたはポリビニル化合物例えばポリスチレンである適
当な非孔質支持体上に前記の層を担持させるのが好まし
い。支持体の選択は意図する検出モードに適合させる。
好ましい支持体は、波長範囲200〜900nmの電磁輻射線お
よび放射能による放射線を透過する輻射線透過性のもの
である。電気泳動プレート上へ被覆するのに適当な可撓
性を付与するためには、好ましい支持体は比較的薄いも
の、例えば0.2mm未満の厚さのものである。

要素中に包含される反応性成分は、目的の被分析物次第
で各種のものが挙げられる。本発明は、被分析物と反応
して非拡散性で検出可能な種を提供する反応１種以上に
関与する有用な組成物の範囲に限定することを意図する
ものではない。臨床化学の当業者は特定の被分析物に適
した組成物を決定することができるものと考える。

反応性成分は要素中で何らかの方法によって検出するこ
とのできる非拡散性種を提供することが必須である。本
明細書において「非拡散性」とは、種が認識できる程度
には要素の外側に拡散することができないこと、そして
要素内において横方向へ移動することができないことを
意味する。しかしながら、他の成分は要素内の領域間ま
たは層間を移動することができてもよい。水不溶性種が
非拡散性を獲得することが好ましい。これらの水不溶性
種は、塗布または不動化の目的で種を可溶化する有機溶
媒を用いて塗布することができる。有用な非拡散性種の
例は、水不溶性ロイコ染料例えば米国特許第4,089,747
号明細書記載のトリアリールイミダゾールから形成され
る染料である。他の有用な非拡散性種またはその前駆体
は当業者には公知のものである。

あるいは、検出可能な種は水溶性であってもよいが、適
当な方法例えば媒染剤または不動性バインダーによって
要素中で非拡散性にすることができる。前記の水溶性種
および不動性材料は多数あり、当業者に公知である。

本発明の好ましい態様においては、クレアチンキナーゼ
（CK）決定用に設計した分析要素を使用してCKアイソエ
ンザイムを分離しそして同定する。このような分析要素
の１つを後記の実施例１に記載する。その要素中の反応
性成分としてはペルオキシダーゼ、α−グリセロホスフ
ェートオキシダーゼ、アイソエンザイムの反応に応答し
て水不溶性検出可能染料を提供することのできる水不溶
性トリアリールイミダゾールロイコ染料、アデノシンジ
ホスフェート、グリセロールおよびグリセロールキナー
ゼが含まれる。これらの試薬は要素中の同じ層中または
別異の層中に位置させることができる。他のクレアチン
キナーゼ相互活性組成物は当業界において公知である。

本発明方法の重要な長所は、本発明方法を使用すること
により、単一の電気泳動プレートと液体試料と多様な乾
式分析要素とを連続的に使用して複数個（本明細書では
Ｎと称する）の被分析物を決定することができる点であ
る。この方法は、 A.電気泳動プレートに前記液体の試料を接触させる工
程； B.前記プレート中で、複数の被分析物を互いに電気的に
分離する工程； C.前記プレートを乾燥した透明なシート状分析要素で覆
って一時的ラミネート体を形成する工程、ここで、前記
分析要素は、水不溶性バインダー材料と、該バインダー
中に予め分散せしめられた、前記被分析物の少なくとも
１つと反応して非拡散性の検出可能な種を前記要素中で
のみ形成するような反応性成分とを含有する；及び D.前記要素を前記プレートから分離し、そして前記要素
中の前記検出可能な種を検出する工程； を含んでなることを特徴とする、水性液体中の被分析物
を決定する方法。

E.前記工程（Ａ）〜（Ｄ）をＮ−１回繰返すが、その工
程（Ａ）〜（Ｄ）の各繰返しにおいて、各々の被分析物
と反応して検出可能な各々の種を各々別異の要素中だけ
に形成する各々の反応性成分をその中に分散せしめた水
不溶性バインダー材料を含有する各々別異の乾式分析要
素と前記プレートとを使用する。

（ここで少なくとも最初の（Ｎ−１）決定用の反応性成
分は各々の被分析物と反応して各々の要素中に各々の非
拡散性検出可能種を提供するものとする） 各工程を含んでなる。

前記の態様において各要素に生成した検出可能な種は、
分析要素をプレートから引き離した直後に測定すること
もでき、またはその要素を後の測定用に適当な環境に保
存することもできる。この態様による複数の被分析物の
測定は後記の実施例３で説明する。

あるいは、一連の決定において、先行する決定の各々を
非拡散性種を用いて実施している限り、最後の決定を拡
散性検出可能種で実施することができる。この最後の試
験で製造される検出可能種は拡散性であるので、それが
プレート中へ移動し、そのためにそれ以後の試験用には
プレートを汚染することがある。

更に別の態様においては、一連の決定の最後の２つの決
定を別異の拡散性反応成分で連続的に実施することがで
きる。これは、それによって生成される検出可能種が別
異のものであり、別別に測定することができるものであ
る場合である。例えば、１つの試験が螢光定量信号を生
成することができ、一方、第２の試験が比色定量信号を
生成することができる場合である。しかしながら、これ
らの決定は、非拡散性反応性成分を生成して測定する１
以上の試験の後であることが必要である。

分析要素と、被分析物の電気誘発性移動に適合させたプ
レート（電気泳動または等電点電気泳動）とを、個々に
得ることも、または診断キットとして一緒に得ることも
可能である。同一の被分析物用または別異の被分析物用
のキット中に１種より多くの分析要素を包含させること
ができる。

〔実施例〕

以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する。

本明細書においてI.U.とは酵素活性の国際単位であり、
1I.U.は酵素の標準pHおよび温度条件下で１分間当りに
基質１μモルの変換を触媒するのに必要な酵素活性量で
あるものと定義される。

実施例で使用する方法 （Ａ）従来の電気泳動法を、使用する装置の製造業者が
推奨する方法に従って行った。試料をＮ−アセチル−Ｌ
−システイン20mモルでスパイクしてクレアチンキナー
ゼ（CK）性能を強化した。Ｎ−アセチル−Ｌ−システイ
ンは分析要素中には存在しなかった。これらの方法の重
要な部分は以下のとおりである。

（１）CK電気泳動法、Helena Laboratories,Procedure
No.20（日付８／80） トリス−バルビタール緩衝液中でセルロースアセテート
電気泳動プレート上でそれらの電気泳動移動性に従って
CKのアイソエンザイムを分離した。分離後、Helena CK
Isoenzmye Reagent用基質オーバーレイにセルロースア
セテートプレートをラミネートし、37〜40℃でインキュ
ベーションした。

インキュベーション期間（25〜30分間）の終了時に、ラ
ミネート体状の両材料を分離し、着色セルロースアセテ
ートプレートをインキュベーター中で完全に乾燥した。

着色セルロースアセテートプレート上に得られるCKバン
ドは、UVランプを使用して肉眼で見えるようにするか、
あるいは可視光線または紫外線および螢光消光を使用し
てデンシトメーター中で定量した。

（２）ポリアクリルアミドゲル（PAG）中での分析用等
電点電気泳動 （３）アガロース中での分析用等電点電気泳動（EF） （Ｂ）等電点電気泳動は以下の方法で実施する。

（１）標準Multiphor電気泳動装置の冷却プレートにケ
ロシンを塗布した。

（２）冷却プレート上に鋳型を置き、気泡を除去した。

（３）鋳型にケロシンを塗布した。

（４）鋳型の頂上にアガロースゲルを載せ、この際プラ
スチック側を下にして気泡がトラップされないようにし
た。

（５）適当な電極溶液で電極ストリップを均質に飽和し
た。ストリップを適切に湿らせると湿気のかすかな跡が
ホイル上に残留した。過剰の溶液はいずれも吸取（blot
ting）によって除去した。

（６）鋳型によって示される正しい位置に、できる限り
まっすぐに芯（wick）を置いた。

（７）ゲルの縁を除いて芯を鋭く切断した。

（８）ゲルの縁部を避けて、試料の所望のとおりに加え
た。試料の体積は15〜20μｌであった。少容量（例えば
２μｌ）をゲル表面上に直接ピペットで添加した。大部
分のタンパク質にとって、最良の添加位置はカソードス
トリップから２〜4cmのところである。高分子量タンパ
ク質はそれらの予想されるpI位置の近くに添加した。

（９）ゲルを横切るフォーカシング用の等電点電気泳動
フタをして、電極線を電極ストリップに沿って整列さ
せ、そして赤および黒の線を接続させた。

（10）圧力棒（pH3.5〜9.5の範囲の両性電解質をもつゲ
ルには不要である）を安全フタ中に挿入し、フタを正し
い位置に置いた。

（11）電源をオンにした。

（12）フォーカシングの20〜30分間後、電源をオフに
し、試料投与片を除去した。フタをもとの場所に置き、
同じ電力セットの下でフォーカシングを続けた。

実施例1:クレアチンキナーゼ（CK）アイソエンザイムの
決定−本発明と公知方法との比較 pH範囲3.5〜9.5の両性電解質を含有するポリアクリルア
ミドゲルプレートに、一連の血清試料を加えた。その試
料の等電点電気泳動を前記の方法に従って90分間実施し
た。その後に、このプレートを半分に切断し、過剰の水
分を除去した。一方の半分部分にはCKアイソエンザイム
検出（可視化）用の修正Ektachem乾式分析要素（後述す
る）を本発明に従って被覆した。別の半分部分には、基
質−染料・アガロース温溶液を被覆し、冷却するにまか
せて対照用の電気泳動プレートとオーバーレイとからな
るラミネート体を形成した。両方の半分部分をインキュ
ベーター中に置き、同じ期間に亘って37℃で反応させ
た。

各々のPAGプレートから両オーバーレイを取り去った。
観察すると、本発明で使用した乾式分析要素上のバンド
は輪郭を明瞭に示すのに対し、アガロースオーバレイ
（対照）上のバンドは拡散しており輪郭も明瞭ではなか
った。更に、対照用の電気泳動プレート上にバンドがは
っきりと表われていた。これはオーバーレイからプレー
トへの拡散が起こったことを示すものである。本発明で
は使用したプレート上にはバンドは表われなかった。

電気泳動的に分離した前記のクレアチンキナーゼアイソ
エンザイムの決定に使用した前記の本発明分析要素は以
下の構成をもつものであった。

実施例2:クレアチンキナーゼアイソエンザイムの決定−
本発明方法とHelena Laboratoriesのセルロースアセテ
ート電気泳動プレート法との比較本発明方法およびHele
na LaboratoriesのCK電気泳動法を使用して実施例１を
繰返した。

セルロースアセテート媒質含有の２枚のプレートを電極
緩衝液中に浸漬し、吸取そして各々に同じ血清試料を加
えた。両方のプレートを、製造業者を指示どおりに調製
した標準Helenaチャンバー中に置いた。電気泳動の後、
プレートを取り出し、以下のように処理した。

（１）一方のプレートは前記実施例１に記載の乾式分析
要素とラミネート体にした。界面の気泡を除き、ラミネ
ート体を37℃でインキュベーションした。

（２）他方のプレートは以下の方法で調製した第２のセ
ルロースアセテートプレートとラミネート体にした。す
なわち、 （ａ）電極緩衝液に浸漬してから吸取り、 （ｂ）CK剤をセルロースアセテートに塗布しそれを吸収
させることによって基質−染料溶液を充填する 方法で前記プレートを調製した。

得られたラミネート体を37℃でインキュベーター内に置
いて発現させた。一定時間が終了した後に、両ラミネー
ト体をインキュベーターから取出し、オーバーレイをプ
レートから剥した。

両方のセルロースアセテートオーバーレイ（対照）およ
びその相当する電気泳動プレート上のバンドは、通常の
室内光線下では肉眼で見えなかった。乾燥させ、紫外線
下に置くと、オーバーレイおよび電気泳動プレートのど
ちらもバンドを示した。オーバーレイ上のバンドはプレ
ート上のバンドと比較して非常に弱かった。オーバーレ
イ上のバンドは拡散もしていた。これは、電気泳動およ
びそれに続く乾燥工程の際に、染料が毛細管作用によっ
てセルロースアセテートを通って運ばれ、バンドを不鮮
明にするからである。

これに対して、乾式分析要素を使用する本発明による試
験では通常の室内光線中でバンドが認められた。相当す
る電気泳動プレートはバンドが認められなかった。前記
要素および相当するセルロースアセテート電気泳動プレ
ートを紫外線下に置くと、要素は螢光バックグランドに
対して消光したバンドを示した。セルロースアセテート
電気泳動プレート上にはバンドが見られなかった。これ
は、試薬および反応生成物が要素から電気泳動プレート
へ拡散しなかったからである。要素上に存在するバンド
は等電点フォーカシング後に観察されるバンドよりも広
かった。これは、pH勾配における電気泳動のフォーカシ
ング効果がないと、CKアイソエンザイムが電場中での分
離の際に拡散する傾向があるからである。これに対し
て、乾式要素はセルロースアセテートオーバーレイを使
用するプレートよりも非常に鮮明であった。

実施例3:単一の電気泳動プレートを使用する複数分析 使用したCK要素は実施例１に記載したものであった。

本分析で使用したアルカリホスファターゼ（ALP）分析
要素を以下に示す。二酸化チタンをゲル層中に装入し
て、アイソエンザイムバンドの発現の際に発生する黄色
染料に対する白色バックグランドとした。

血清試料を２枚のポリアクリルアミドゲルプレート上に
加え、電気泳動分離を前記のとおりに実施した。

プレート（Ｉ）に対してはALP要素を被せて、３〜５分
間、前記の方法でインキュベーションした。この要素の
オーバーレイでは、この基質のALP反応の特徴である黄
色バンドが現われた。ゲルプレート中に現われたバンド
は無かった。なぜなら、短かい反応時間の間には、認識
可能な染料の拡散が起きなかったからである。

第２のプレート（II）は、実施例１に記載の修正CK要素
で被覆（オーバーレイ）した。実施例１と同様に、オー
バーレイ中に明瞭なバンドが表われた。ゲルプレート中
にはバンドは現われなかった。

新しい一組の要素を、同じポリアクリルアミドゲルプレ
ート上に再び被せた。しかしながら、この場合にはオー
バーレイの順序を逆にした。プレート（Ｉ）にはCK要素
を、そしてプレート（II）にはALP要素を被せた。前記
と同様に、得られたラミネート体をインキュベーション
し、乾燥させた。

両要素とも、検出しようとした被分析物の色および外観
に特徴的なバンドが現われた。電気泳動ゲルはどちらの
場合にもバンド形成を示さなかった。

この実施例は本発明による複数分析の能力を示すもので
ある。単一の電気泳動プレートに乾式分析要素を連続的
に被覆して、各要素が検出しようとする被分析物を決定
することができる。

実施例4:本発明と従来技術の方法との比較 本例は、R.E.SmithがJ.Histochem.Cytochem.,32（12）,
1265〜1274頁（1984）に記載したEnzyme Uverlay Membr
aneを使用する被分析物の決定と本発明方法とを比較す
るものである。

トリプシンアイソエンザイム検出用の基質含浸セルロー
スアセテートからなる酵素用オーバーレイ膜（EOM:enzy
me overlay membrane）を、Enzyme Systems Products
（米国カリホルニア州リバーモアー）から購入した。こ
れらの膜は、アガロースおよびポリアクリルアミド電気
泳動プレート上でアイソエンザイム活性パターンを検出
するために螢光トリプシン基質を含有している。

pH範囲3.5〜9.5においてLKB水平電気泳動系を使用し
て、0.5mm厚のポリアクリルアミドゲルプレート上で等
電点フォーカシングを実施した。等電点電気泳動の温度
は５℃に維持した。電源は、電圧＝1800、電力＝20ワッ
トおよび電流＝200ミリアンペアにセットした。フォー
カシングは約2.5時間実施した。

高いトリプシン活性をもつことが予想される患者の血清
試料を以下のとおりに調製した。すなわち、（１）生の
状態のままのもの、（２）1000I.U.／１過剰の計算値活
性をもつ重炭酸塩緩衝化トリプシン（pH6.6）でスパイ
クしたもの、（３）トリプシン・スパイク化試料を緩衝
剤で1:1に希釈したもの、（４）トリプシン・スパイク
化試料を緩衝液で3:1に希釈したものである。

各血清試料を前記のとおり電気泳動にかけた。EOMを蒸
留水浴中に浸して湿潤化、そして気泡を取り込まないよ
うに注意して各ゲルプレート上に載せた。得られたラミ
ネート体を10〜30分間37℃でインキュベーションした。
紫外線（長波長）ランプを使用して各ラミネート中の反
応を監視した。最適の螢光が得られたら、オーバーレイ
を剥がした。一方、ゲルプレートは湿らしたままにし
た。膜を放置して乾かした。膜およびプレートを観察し
たところ、以下のことが分かった。

最初の血清試料は、プレートの両適用領域すなわちpH8.
5およびpH4.0においてわずかな活性を示した。拡散螢光
の非常に薄い筋が主要活性の領域を連結していた。

トリプシン・スパイク化試料は同じ領域に主要活性を示
した。しかしながら、主要バンド間の領域の活性は、拡
散螢光によって囲まれた、更に良好に輪郭を示すバンド
に分解した。スパイク化試料の希釈体は、予想される低
下活性とほぼ相関した低下螢光を示した。螢光は、評価
するトリプシン検査における等電点フォーカシングルゲ
ルのpH勾配によって影響を受けないように見える。

ゲルプレート中へのまたはゲルプレート上への螢光基質
の拡散を検査するために、予めEOMで上張りしたゲルプ
レートに、湿潤・未処理セルロースアセテートシートを
与えた。乾燥したセルロースアセテートを観察したとこ
ろ、EOM−ゲル反応の領域中に拡散螢光があった。

市販のEOMを使用する欠点は以下のとおり明白である。
（１）基質を活性化するためにEOMは湿潤状態であるこ
とが必要であり、このために溶解性基質による望ましく
ない拡散が起きる。（２）複数（回）試験において、後
のオーバーレイは連続的に明瞭性の劣ったバンドを示
す。（３）血清成分の日常的臨床分析に有用な基質は利
用できない。（４）EOMは透明ではないので、直接また
は透過分光測光に使用することができない。そして
（５）それらは比較的高価である。

前記の検査を、実施例１に記載の本発明によって実施し
た検査と比較した。本発明は乾式要素中に非常に明瞭な
バンドを提供し、一方で電気泳動プレートは観察可能な
バンドをもたずに再使用が可能であった。

〔発明の効果〕

本発明は、同一の電気泳動プレートを使用して、電気的
に分離した１個又はそれ以上の被分析物を同定する手段
を提供する。換言すれば、本発明は複数試験検出法を提
供する。本発明方法は使用が容易で、比較的安価で、感
度が高い。好ましい態様においては、比色的にまたは螢
光的に検出可能な種に使用することができる。

前記の長所は、目的の被分析物と反応して非拡散性検出
可能種を提供する試薬をその中に分散せしめた水溶性バ
インダー材料を含有する分析要素をオーバーレイとして
使用することによって構成される。被分析物の反応はプ
レートとオーバーレイとの界面で起り、非常に輪郭の明
瞭なバンドが与えられる。検出可能種は水中で非拡散性
であるので、オーバーレイからプレートへ移動しない。
従って、１種以上の分析物を決定する無制限の回数の連
続的試験において同じプレートを繰返し使用することが
できる。

更に、検査は実質的に乾式条件下で実施され、そのため
に、オーバーレイ中でのバンドの拡散が最少化されかつ
感度を低下させるような公知方法にみられる状況に最小
にすることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 タイ−ウィング ウー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，アンディロン レーン 72

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】水性液体中の被分析物を決定する方法であ
   って、下記の工程： A.電気泳動プレートに前記液体の試料を接触させる工
   程； B.前記プレート中で、複数の被分析物を互いに電気的に
   分離する工程； C.前記プレートを乾燥した透明なシート状分析要素で覆
   って一時的ラミネート体を形成する工程、ここで、前記
   分析要素は、水不溶性バインダー材料と、該バインダー
   中に予め分散せしめられた、前記被分析物の少なくとも
   １つと反応して非拡散性の検出可能な種を前記要素中で
   のみ形成するような反応性成分とを含有する；及び D.前記要素を前記プレートから分離し、そして前記要素
   中の前記検出可能な種を検出する工程； を含んでなることを特徴とする、水性液体中の被分析物
   を決定する方法。