JPS62156552A - 水性液体中の被分析物を決定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、電気的に（例えば電気泳動によって）分離さ
れている被分析物の決定方法に関する。

〔従来の技術〕

試料中に存在する別々の分子種を分離および同定する各
釉°の分析方法が開発されてきた。分離は、水含有固体
媒質に試料を与え、そしてその媒質内で種の分子分離を
引起こすことによって一般に行なう。特に、クロマトグ
ラフィーおよび電気泳動が使用されておシ、両者とも異
なる分子種の分離を提供する。分離媒質は一般にクロマ
トグラフィー媒質または電気泳動プレートと称されてい
る。

このような方法では、分離工程の前、最中または後で、
試料中の１１以上の分子種と相互作用を示す各棟の試薬
を媒質中に与え、被分析物の分前または同定の補助とす
る。

一般に、水の存在による媒質中での水溶性試薬の著しい
拡散により、通常の電気泳動媒質中では分離された材料
の同定が、乏しい分離度のために妨害される。タンパク
質を酸または溶媒で媒質に固定し、染色すると非常に鮮
明な（シャープな）信号を得ることができる。しかしな
がら、固定工程は通常、変質によって酵素活性を破壊す
る。更に、着色剤は一般には、決定すべきすべてのタン
パク質に対して同じ親和性を示さない。

電気泳動媒質中には多数の方法によって試薬の導入が行
なわれてきた。例えば、水溶性バインダー中に分散させ
た水溶性試薬からなる転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ　）装置
を使用して電気泳動プレートに試薬を転写することが知
られている。その転写裂開を電気泳動グレート表面上に
置くとバインダーが溶解し、水浴性試薬がプレート中に
拡散して、分離されている被分析物と反応する。この技
術には多数の欠点がある。電気泳動プレートは一回しか
使用することができない。なぜなら、試薬が水中に分散
し、そして得られる検出可能信号をプレート中で観察す
るからである。災に、試薬転写が高度の水性環境中で行
なわれるので、得られる被分析物−試薬信号の分離度は
劣っている。反応生成物（すなわち色素）は毛細管作用
のために媒質中に拡がる傾向がある。更に、操作の実施
が困難なことがある。

微孔質ナイロン膜を使用して被分析物例えば核酸ラミ気
吸取％　（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｔｎｇ　）によっ
て電気泳動プレートから膜へ転写することも知られてい
る。その膜では選択性が制限されるのですべての被分析
物が転写される。次に、その膜を処理して、被分析物の
存在下で検出可能な信号を提供する。それは、検出手段
を提供する試薬を含弔していない。更に、転写工程は水
性環境下で実施される。

水浴性の螢光性物質を含浸させたセルロース系模を、電
気泳動グレート中のアイソエンザイムの同定に使用する
ことがＲ，Ｅ、　Ｓｍ１ｔｈ　、　Ｊ、　Ｈｉｇｔｏｃ
ｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　、　３２　（１２）　、　１２６
５−１２７４貞（１９８４）に記載されている。この文
献は、前記暎の上張りによって、高度に分離された同定
バンドが提供されるものと主張している。しかしながら
、この膜には多数の重大な欠点がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

前記文献による膜の上張りは、それを使用する際に湿潤
状態であることが必侠である。結果として、検出可能な
信号を提供する基質が水溶性であるので、同定バンドが
かなシ拡散してしまう。更に、基質が上張シからプレー
ト中へ拡散するので、同じ電気泳動プレートに対して複
数の試験を行なう手段は、前記の上張りによっては提供
されない。

本Ｔ↓的には、前記文献の上張りは単独の試験に使用す
ることができるだけである。

〔問題点を解決するだめの手段〕

前記の公知の検出方法における問題点は、（Ａ）　　を
気的に誘発される移動（マイグレーシラン）に適応させ
てあり、そして電気的に相互に分離されている複数の被
分析物を含むグレートと、被分析物少なくとも１種と反
応して非拡散性で検出可能な種（５ｐｅｃｉｅｓ）を要
素中だけに！是供する相互作用組成物を自身の中に分散
させてもつ水不溶性バインダー材料を含有する分析用要
素と全接触させることによってラミネート体を形成し、
そして （Ｂ）　　前記プレートから前記要素を取り去り、そし
てその安索中の検出可能棟を決定する各工程を含んでな
る、被分析物の決定方法によって解決される。

本発明は、各種の分野の研究例えば医学、免疫学、遺伝
学、微生物学、生化学、臨床化学および法廷科学（一部
分を例示したに過ぎない）において有利に使用すること
ができる。分子荷電に基づいて、電気的に誘発されて水
性媒質を通って移動することができ、そして他の物質か
ら分離させることのできる任意の物質を、本発明を使用
１−で同定することができる。このような物質を本明細
書においては被分析物と称する。例えば、生物学的流体
例えば血液中の特定の酵素、抗原または抗体を検出する
診断の目的に本発明を使用することができる。法廷科学
においては、身元確認または個人確認の目的に、酵素お
よび他のタン・卆り質の遺伝的変異の表現型化（ｐｈｓ
ｎｏｔｙｐｉｎｇ　）に使用することができる。核酸、
イプチドおよび他の細胞成分の分析も可能である。好ま
しい態様において、本発明は各種タンパク質例えば酵素
（例えば、りレアチンキナーゼ、ラクテートｒヒドロｒ
ナーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−ホ
スフニートデヒドロダナーゼ、アデニレートキナーゼ、
γ−グルタミルトランスフェラーゼ等）の決定に有用で
ある。個別のバンドに分離されているアイソエンザイム
の存在を本発明によって有利に決定することができる。

この存在には、クレアチンキナーゼ、アルカリホスファ
ターゼおよびラクテートデヒト０口ｒナーゼのアイソエ
ンザイムの存在が含まれる。

水性液体例えばヒトまたは動物の生物学的液体中には多
くの被分析物が一般に存在する。被分析物は電気的に誘
発される移動によって固体媒質中に分離することができ
る。前記液体の適当な試料を、電気的に誘発した分子移
動操作または親和分離操作に使用される適当な媒質に与
える。前記の媒質には、電気泳動プレートおよび等電点
電気泳動（エレクトロフォーカシング）グレートが含マ
れる。本発明方法で使用することのできる多数の市販プ
レートが存在し、それらには例えば米国特許第３，９７
５，１６２号明細書に記載のもの、および後記の実施例
に記載のものが含１れる。一般に、前記のプレートは水
和グルまたは嘆の薄層中に１以上のコン・２−トメント
をもっている。水和デル、例えばアガロース、寒天、ポ
リアクリルアミド。

アクリルアミドおよび当業界に公知の他の物質から調製
したプレートが特に二汀用である。本発明の１ｉＫＨ、
アがロースおよびポリアクリルアミドプレートが好まし
い。

酸体試料をグレート上に与えた鰻で、プレートに適当な
電流を与え、被分析物の分子移動および相互間の分離を
行なわせる。公知の分ｔ４方法を使用することができる
。例えば、電気泳動を使用することができ、この場合に
は被分析物には一定の−およびイオン強度の電場が与え
られる。他の９雅技術は等′「１点電気泳動であり、こ
の場合には分子個々の等電点に基づいて分子を一勾配に
かけて分離する。

分子分離を適当な程度まで進行させた後、電気泳動プレ
ート表面と分析用要素（後述する）とを接触させ、この
際に界面の気泡を最小数に保証するようにする。一般に
、グレートと要素とのラミネートは、グレートの上に要
素を重ねるととＫよって行なう。しかしながら、要素の
上にグレートを重ねることができる。本発明で使用する
いずれの接触技術においても、接触するプレート表面と
要素表面とが界面を形成し、その場所で被分析物と相互
作用組成物（後述する）との反応が可能になる。このラ
ミネート中には相対的にほとんど水分が存在しないので
、被分析物または非拡散性検出可能種による界面を横切
る拡散は実質的に存在しない。換言すれば、本発明の実
施においては、被分析物はプレートから実質的に離れず
、そして検出可能種は分析用要素から実質的に離れない
。

これは、プレート・要素ラミネートの各成分に有意量の
水が存在しないこと、および検出可能種の水不溶性によ
ってもたらされる。標準的な電気泳動プレート中には若
干の水分が存在するが、その量は要素中で水不溶性試薬
の移動を起こすのには充分ではない。

被分析物と相互作用組成物との反応を可能にして検出可
能釉を要素中にのみ提供するのに充分な時間に亘って、
要素とプレートとを一緒に保つ。

反応時間は、被分析物、使用する相互作用組成物および
被分析物と前記組成物の濃度に依存して変化する。最小
量の慣用的実験によって最適反応時間を見出すことがで
きる。反応は３７℃においてインキーペーション工程で
実施することができるが、４５℃までの任意の温度を使
用することができる。

反応の結果として生成する検出可能種は、要素中で使用
する相互作用組成物の型に依存する。一般に、種の検出
は分光光変法手段によって行なうことができる。すなわ
ち、適当な検出装着および方法で検出可能な比色、螢光
、化学ルミネッセンスまたはリン光の密度の増減によっ
て種を測定することができる。好ましくは要素を透明に
し、検出可能な色原体（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ　）を透過
分光学によって測定する。

検出可能な種を決定するために、プレートから要素を取
シ除き、適当な検出方法を行なう。必要によシ、要素に
追加の試薬を加えるかまたはインキュペーシッンにより
、種から得られる信号を強化することができる。

本発明を実施する際に使用する分析用要素は一般に１抛
以上の水不溶性・ぐインダー材料からなる。

バインダー材料およびその中に分散した相互活性組成物
を、塗布された自己支持性層であるかまたは非多孔質支
持体上に塗布された層であることのできる領域全体に分
散させる。特に興味のある要素はＥａｓｔｍａｎ　Ｋｏ
ｄａｋ社（米国ニー−ヨーク州ロチェスター）からＥｋ
ｔａｃｈｅｍ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ＋Ｊｅｍ＋　ｓ　ｔｎ
ｙ分析用スライドとして最近市販されたものである。そ
の要素は、最外の多孔質拡散層を除去することによって
変性することができる。

代表的な例を後記の実施例で説明する。他の有用な分析
用要素は、拡散層を含んでまたは含まないで、米国特許
第３，９９２，１５８号、第４，０４２，３３５号、第
４，１４４，３０６号、第４．２５９．　ＯＯ１号およ
び第４，４３０，４３６号明細書に記載されている。

扱紮は、一般に、水不溶性バインダー材料１種からなる
１以上の領域または層を含んでなる。を気泳動プレート
と接触する要素の少なくとも最外の領域または層は水不
溶性バインダー材料から構成されており、従って最小量
の水を含有することのあるプレートに対してその要素が
粘着性でないことが必要である。前記のバインダー材料
の２０℃における水溶性は、１重量％未満の程度である
。

有用な・ぐインダー材料としては、繊維材料例えば戸紙
、織物、繊維フリースまたはマントが含まれる。好まし
い態様において、非繊維材料例えば硬化によって高水不
浴性にすることのできる天然または合成コロイド（例え
ばゼラチン、多糖等）、アクリルアミドポリマー、ビニ
ルピロリドンポリマー、セルロースエステル、セルロー
スエーテル、ホリビニルエステル、ビニルアセタール等
ｋ　使用する。硬化ゼラチンは好ましいバインダー材料
であるＯ 前記の要素は、相互作用組成物の成分１以上または全部
を自身の中に含有する試薬層１層以上をもつことができ
る。所望によシ、他の層を存在させることができる。例
えば、下塗り層、輻射線遮断層、反射層、位置合せ層、
障壁層、拡散層および当業者に公知のもの等である。１
層で複数の機能を果すことができる。例えば試薬層でも
ある拡散層である。通常はポリマー材料例えばセルロー
スアセテート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ
カーブネートまたはポリビニル化合戦１例えばポリスチ
レンである適当な非孔質支持体上に前記の層を置く。支
持体の選択は意図する検出モートに適合させる。好まし
い支持体は、波長範囲２００〜９００ｎｍの’ａ　ｍ　
輻射線および放射能による放射線を臥過する輻射線透過
性のものである。電気泳動プレート上への上張シにとっ
て適当な可撓性を提供するためＫは、好ましい支持体は
比較的薄いもの、例えば０．２　ｌｌｌｘ未満の厚さの
ものである。

要素中に導入する相互作用組成物は、目的の被分析物に
依存する。本発明は、被分析物に応じて非拡販性で検出
可能な種を提供する反応１株以上に参加する有用な組成
物の範囲に限定することを意図するものではない。臨床
化学の当業者は特定の被分析物に適した組成物を決定す
ることができるものと考える。

相互作用組成物は要素中で成る方法によって検出するこ
とのできる非拡散仕種を提供することが必要である。本
明細書において「非拡散性」とは、種が認識できる程度
には要素の外側に拡散することができないこと、そして
髪素内において横方向へ移動することができないことを
意味する。しかしながら、組成物の他の成分は要素内の
領域間または層間を移動することができてもよい。水不
溶性種が非拡散性を獲得することが好ましい。これらの
水不溶性種は、塗布または不動化の目的で種を可溶化す
る有機溶媒中で塗布することができる。

有用な非拡散仕種の例は、水不溶性ロイコ染料例えば米
国特許第４，０８９，７４７号明細書記載のトリアリー
ルイミダゾールから形成される染料である。他の有用な
非拡散仕種またはその前駆体は当業者には公知のもので
ある。

あるいは、検出可能な釉は水溶性であることができるが
、適当な様式例えば媒染剤または不動性バインダーによ
って要素中で非拡散性にすることができる。前記の水溶
性釉および不動性材料は多数あシ、届業者に公知である
。

本発明の好ましい態様においては、クレアチンキナーゼ
（ＣＫ）決定用に設計した分析用要素を使用してＣＫア
イソエンディムを分離しそして同定する。この態様の１
つを後記の実施例１に記載する。その要素中の相互作用
組成物としてはペルオキシダーゼ、α−グリセロホスフ
ェートオキシダーゼ、アイソエンザイムの反応に応答し
て水不溶性検出可能染料を提供することのできる水不溶
性トリアリールイミダゾールロイコ染料、アデノシンノ
ホスフェート、グリセロールおよびグリセロールキナー
ゼが含まれる。これらの試薬は要素中の同じまたは別異
の層中に位置させることができる。他のクレアチンキナ
ーゼ相互活性組成物は当業界において公知である。

本発明方法の重要な長所は、本発明方法を使用すること
により、単独の電気泳動プレートと液体試料と多杼な乾
式分析用要素とを連続的に使用して複数個（本明細書で
はＮと称する）の被分析物を決定することができる点で
ある。この方法は、（Ａ）　　電気的に誘発される移動
に適応させてあシ、そして電気的に相互に分離されてい
る複数の被分析物を含むグレートと、 第１の被分析物と反応して検出可能な種を第１の要素中
だけに提供する相互作用組成物を自身の中に分散させて
もつ水不溶性パイングー材料を含有する第１の分析用要
素と を接触させることによってラミネート体を形成し、（Ｂ
）　　前記グレートから前記の第１の要素を取り去り、
そして （Ｃ）　　前記工程（ト）および申）をＮ−１回繰返す
が、その工程（Ａ）および（Ｂ）の各繰返しにおいて、
各々の被分析物と反応して検出可能な各々の釉を各々別
異の要素中だけに提供する各々の相互作用組成物を自身
の中に分散させてもつ水不溶性バインダー材料を含有す
る各々別異の乾式分析用要素と前記プレートとを使用す
る （ここで少なくとも最初の（Ｎ−１）決定の相互作用組
成物は各々の被分析物と反応して各々の要素中の各々の
非拡散性検出可能種を提供するものとする） 各工程を含んでなる。

前記の態様において各要素に生成した検出可能な種は、
グレートから取シ去った直後に測定することができ、ま
たはその要素を後の測定用に適当な環境に保存すること
ができる。この態様による複数の被分析物の測定は後記
の実施例３で説明する。

あるいは、一連の決定において、先の各決定を非拡散性
種で実施している限シ、最後の決定を拡散性検出可能社
で実施することができる。この最後の試験で製造される
検出可能棟は拡散性であるので、それがグレート中へ移
動し、そのために以下の試験用にはプレートを汚染する
ことがある。

更に別の態様においては、一連の決定の最後の２つの決
定を別異の拡散性相互作用組成物で連続的に実施するこ
とができる。これは、それによって生成される検出可能
種が別異のものであシ、別別に測定することができるも
のである場合である。

例えば、１つの試験が螢光定量信号を生成することがで
き、一方、第２の試験が比色定量信号を生成することが
できる。しかしながら、これらの決定は、非拡散性相互
作用様を生成して測定する１以上の試験の後であること
が必要である。

分析用要素と、被分析物の電気誘発性移動に適合させた
プレート（電気泳動または等１点電気泳動）とを、個々
に得るかまたは診断キットとして一緒に得ることができ
る。同一の被分析物用または別異の被分析物用のキット
中に１よシ多い要素を含ませることができる。

〔実施例〕

以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する。

本明細荘において１．Ｕ、とけ酵素活性の国際単位であ
シ、Ｉｌ、Ｕ、は酵素の標準用および温度条件下必要な
酵素活性量であるものと定義される。

（Ａ）　　従来技術の電気泳動は、使用する装置の製造
業者が推奨する方法によって実施した。試料をＮ−アセ
チル−Ｌ−システイン２０ｒｎモルでスノセイクしてタ
レアチンキナーゼ（ＣＫ）性能を強化した。Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−システィンは分析用要素中には存在しなかった
。これらの方法の重要な部分は以下のとおシである。

（１）　　ＣＫ％気泳動法、Ｈｅ１ｅｎａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ　。

Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　Ａ　２０　　（日付８／８０）ト
リスーパルビタール緩衝液中でセルロースアセテート電
気泳動プレート上で彼らの電気泳動移動度に従ってＣＫ
のアイソエンザイムを分離する。

分離後、Ｈｅ１ｅｎａ　ＣＫ　ｒｓｏｅｎｚｙｍｅ　Ｒ
ｅａｇａｎｔ基質上張シにセルロースアセテートプレー
トをラミネートＬ、３’７〜４０℃テインキエペーショ
ンする。

インキュベーション期間（２５〜３０分間）の終了時に
、ラミネート化材料を分離し、着色セルロースアセテー
トプレートをインキュベーク−中で完全に乾燥した。

Ｗ色セルロースアセテートプレート上に得られるＣＫバ
ンドは、ＵＶランプを使用して肉眼で見えるようにする
か、あるいは可視光線または紫外縁および螢光消光を使
用してデンシトメーター中で定量した。

（２）ポリアクリルアミドダル（ＰＡＧ　）中での分析
用等電点電気泳動 アノード電極　　　１モルＨ３ＰＯ４ＨＥｐＥｓ緩衝ｉ
＊＊０．４モル 溶液緩衝液 カソード ｍａｓ液　　　　　”モｋ　ＮａＯＨＯ，１モｋ　Ｎａ
ＯＨ冷却　　　　１０℃　　　１０℃ 電源セット　　　電力＝３０ワット　電力＝３０ワット
電圧＝１８００　　　　電圧＝１８００電流−最大　　
　　電流＝最大 時間　　　１．５ｈｒ　　　　２．５ｈｒ以下余白 （３）アガロース中での分析用＃電点電気泳動（ＥＦ）
アノード ７、＋ン、、Ｉ敲　　　０，５−一酢酸　　　Ｏ”０４
ゞ″−′″タミン 散ソード 電、、、　　　　０．５　％／′ＮａＯＨＯ，５％ｈＮ
ＩＬＯＨ冷却　　　１０℃　　　１０’Ｃ 電　源　　　電圧＝ん犬　　　　電圧＝最大セント 電流＝最大　　　　電流＝最大 ＊　この方法での電気的ノ４ラメ−ターのセットによシ
、任意の寸法のダルに対して推選されるセットを使用す
ることができる。

＊＊　ＨＥＰＬＳ緩衝液は４−（２−ヒドロキシメチル
）−１−ピＲラゾンエタンスルホン酸である。

力１ζ１ゝｒ″奪 （Ｂ）　　等電点電気泳動は以下の方法で実施する。

（１）標準Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ電気泳動装置の冷却プレ
ートをケロシンで塗布した。

（２）冷却プレート上に鋳型を置き、気泡を除去した。

（３）鋳型をケロシンで塗布した。

（４）鋳型の頂上にアガロースダルを載せ、この際プラ
スチック側を下にして気泡を含ませることを回避した。

（５）適当な電極溶液で電極ストリップを均質に飽和し
た。ストリップを適切に湿らせると、“ｎ気のかすかな
跡がホイル上に残留した。過剰の溶液はいずれも吸取（
ｂｌｏｔｔｉｎｇ　）によって除去した。

（６）鋳型によって示される正しい位置に、できる限り
１つすぐに芯（ｗｉｃｋ）を詩いた。

（７）ダルの縁を除いて芯を鋭く切断した。

（８）ダルの縁部を避けて、試料を所望のとおりに与え
た。試料の体積は１５〜２０μｌであった。

夕景の体積（例えば２μｌ）をデル表面上に直接ピペッ
トシた。多くのタン・！り質に対して、与える最良の位
置はカソードストリップから２〜４４ｍである。高分子
量タンパク質はそれらの予想されるｐ１位竹の近くに与
えた。

（９））ｒ″ルを横切るフォーカシング用の等電点電気
泳動フタを与え、電極組を電極ストＩＪツブに沿って整
列させ、そして赤および黒の線を接続させた。

０υ　圧力棒（ｐＨ３，５〜９．５の範囲の両性電解質
をもつグルには不要である）を安全フタ中に挿入し、フ
タを正しい位置に置いた。

α］）％源をオンにした。

（６）　フォーカシングの２０〜３０分間後、電源をオ
フにし、試料投与片を除去した。フタをもとの場所に置
き、同じ電力セットの下でフォーカシングを続けた。

実施例１：クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソエンザイ
ムの決定一本発明と公知方法と の比較 声範囲３．５〜９５の両性電４＠質を台上するポリアク
リルアミドダルプレートに、血清試料の繰返しシリーズ
を与えた。その試料の等電点電気泳動を前記の方法に従
って９０分間実施した。その後で、プレートを半分ずつ
に切断し、過剰の水分を除去した。一方の半分部分には
、ＣＫアイソエンデイム検出（可視化）用の修正Ｅｋｔ
ａｃｈｅｍ乾式分析用袂素（後述する）を本発明に従っ
て与えた。

別の半分部分には、暖かい基質−染色・アガロース溶液
を載せ、冷却す不にまかせて対照用′＋’ｉ；、気泳動
プレート・上張りラミネートを形成した。両方の半分部
分をインキ−ベーター中に置き、同じ期間の時間に亘っ
て３７℃で反応させるにまかせた。

各々のＰＡＧグレートから両上張シを取シ去った。

観察すると、本発明で使用した乾式分析用要素上のバン
ドは輪郭を明瞭に示すのに対し、アガロース上張り（対
照）上のバンドは拡散しており輪郭も明瞭ではなかった
。更に、対照用の電気泳動グレート上にバンドがはっき
りと表われていた。これは上張りからプレートへの拡散
が起こったことを示すものである。本発明で使用したプ
レート上にはバンドは表われなかった。

電気泳動的に分離したクレアチンキナーゼの決定に使用
した前記の分析用要素は以下の構成をもつものであった
。

ゼラチン（硬化）　　　　　　　　　　　　　　　５　
ｆ／揃８トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−２００Ｅ界面活
性剤　　０．１ｐピストリス緩衝剤＊　　　　　　　　
　　　　　　　２　ｆ／ｎ２クレアチンホスフェート　
　　　　　　　　　１．７１ｂ’ｍ”アデノシンジホス
フェート（ＡＤＰ）　　　　　　　０．２　、Ｐ、Δｉ
アデノシンモノホスフェート（ＡＭＰ）　　　　　０，
２　ｙ／−ｚグリセロール　　　　　　　　　　　　　
　　０．２９ｉ侮２酢酸マグネシウム　　　　　　　　
　　　　　０．２７／ｌｎ’ジアデノシン−２７タホヌ
フエート（ＤＡＰＰ）　０．００５　Ｖ′ｒｎ２グリセ
ロールキナーゼ　　　　　　　　４５００１．Ｕ、７ｍ
”ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　５　
、Ｐ／ｍ２トリス緩衝剤　　　　　　　　　　　　　　
　　２１ｆ／ｍ”ジメドン　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．０５　ｉＰ／Ｉｎ２臥下余白 ２．４−Ｄｉ−ｎ−ペンチルフェノール　　　　　　１
．３　ｙ／ｍ２トリトン（Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ）Ｘ−２０
０Ｅ界面活性剤　　０．１　７７ｍ”グリコール酸　　
　　　　　　　　　　　　　　０．３〃匍アスコルビン
醒オキシダーゼ　　　　　１１，０００１．ｔＪ、Δ−
にルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　３３，０００
１．口、ｌＪ／Ｌ２α−グリセロポスフェートオキ・ン
ダーゼ　３．２０Ｏｒ、ｕ、ＡンＬ２支持体 ＊ビストリステ２−ビス（２−ビトロキシエチル）アミ
ノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−グロパンジメ
ール 実施例２：クレアチンキナーゼアイソエンザイムの決定
一本発明方法とＨｓｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのセルロースアセテート電気
泳動プレート法との比較 本発明方法およびＨｅ１ｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓのＣＫ電気泳動法を使用して実施例１を繰返した。

セルロースアセテート媒質含有の２枚のグレートを電極
緩衝液中に浸漬し、吸取そして各々に同じ血清試料を与
えた。両方のプレートを、製造業者の指示どおりに調製
した標４Ｈｅｌｅｎａチャンバー中にｆ？＝いた。電気
泳動の後、プレートを取シ出し、以下のように処理した
。

（１）−力のプレートは前記実施例１に記載の乾式分析
用要素とラミネート体にした。界面で気泡を除き、ラミ
ネート体を３７°Ｃでインキュベーションした。

（２）他方のプレートは以下の方法でぴ（製した第２の
セルロースアセテートプレートとラミネート体にした。

すなわち、 θ−）電相・動衝液に浸漬してから吸取り、（ｂ）ｃＫ
剤でセルロースアセテートを塗布しそれを吸着させるこ
とによって基質−染料容液を挿入する 方法で前記プレートを調製した。

得られたラミネート体を３７℃でインキュベーター内な
置いて現像させた。特定の時間が終了した後で、両ラミ
ネート体をインキュベーターから取出し、上張りをプレ
ートから剥した。

両方のセルロースアセテート上張シおよびその相当する
電気泳動プレート上のバンドは、通常の室内光線下では
肉眼で見えなかった。乾燥させ、紫外縁下に置くと、上
張りおよび電気泳動プレートのどちらもバント０を示し
た。上張り上のバンドはプレート上のバンドと比較して
非常に弱かった。

上張りのバンドは拡散もしていた。これは、電気泳動お
よびそれに続く乾燥工程の際に、染料が毛細管作用によ
ってセルロースアセテートを通って運ばれ、バンドを不
鮮明にするからである。

これに対して、乾式分析用検索を使用する本発明による
試験では通常の室内光線中でバンドを示した。相当する
電気泳動プレートはバンドを示さなかった。前記要素お
よび相当するセルロースアセテートを気泳動グレートを
紫外線下に置くと。

要素は螢光パックグランドに対して消光したバンドを示
した。セルロースアセテート電気泳動グレート上にはバ
ンドが見られなかった。これは、試薬および反応生成物
が要素から電気泳動グレートへ拡散しなかったからであ
る。要素上に存在する・マントは等電点フォーカシング
後に観察されるバンドよりも広かった。これは、−勾配
における電気泳動のフォーカシング効果がないと、ＣＫ
アイソエンザイムが電場中での分離の際に拡散する傾向
があるからである。これに対して、乾式要素はセルロー
スアセテート上張シを使用するプレートよりも非常に鮮
明であった。

実施例３：単独の電気泳動プレートを使用する複数回分
析 使用したＣＫ要素は実施例１に記載したものであった。

本例の検査で使用したアルカリホスフプターゼ（ＡＬＰ
）要素を以下に示す。二酸化チタンをｒル層中に装入し
て、アイソエ／ディムバンドの現像の際に発生する黄色
染料に対する白色パックグランドを提供した。

以下余白 ゼラチン（硬化）　　　　　　　　　　２２ｉ扁♂塩化
　Ｍｇ　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０２Ｐｉ血２
ｐ−ニトロフェニルホスフェ−ｔ’　　　　　０．５４
７７ｍ２ＴＩＯ２３０？／’婉２ 反射性　ゼラチン（硬化）　　　　　　　　　　２２　
？／ｍ２ｒル層 支持体 血清試料を２枚のポリアクリルアミドダルプレート上に
与え、電気泳動分離を前記のとおりに実施した。

プレート（Ｉ）に対してはＡＬＰ要素を与えて、３〜５
分間、前記の方法でインキュペーショ７Ｌ、ｆｃ−０こ
の要素の上張シは、この基質のＡＬＰ反応の特徴である
黄色バンドを現像した。グルプレート中に現像されたバ
ンドは無かった。なぜなら、短かい反応時間の間には、
認識可能な染料の拡散が起きなかったからである。

第２のプレート（■）は、実施例１に記載の修正ＣＫ要
素で上張シした。実施例１と同様に、上張り中に明瞭な
バンドが表われた。グルグレート中にはバンドは現像さ
れなかった。

新しい要素の組を、同じポリアクリルアミドデルプレー
ト上に再び上から載せた。しかしながら、この場合には
上張シの順序を逆にした。プレート（１）にはＣＫ要素
を、そしてプレート（■）にはＡＬＰ長累を与えた。前
記と同様に、得られたラミネート体をインキエペーシロ
ンし、乾燥させた。

両要素とも、検出を意図した被分析物の色および外観に
特徴的なバンドが現像された。電気泳動グルはどちらの
場合にもバンド形成を示さなかった。

この実施例は本発明による複数回の能力を示すものであ
る。単独の電気泳動プレートに乾式分析要素を連続的に
与えることを使用して、各要素が検出することを予定す
るそれら被分析物を決定することができる。

実Ｍζ例４：本発明と従来技術の方法との比較本例は、
Ｒ，Ｅ、　Ｓｍ１ｔｈがＪ、　Ｈｌ　ａｔｏｃｈｅｍ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　、　３２　（１２）　、　１２６
５〜１２７４頁（１９８４）に記載したＥｎｚｙｍｅ　
Ｕｖｅｒｌａｙ　Ｍｅｍｂｒａｎａ　を使用する被分析
物の決定と本発明方法とを比較するものである。

トリプシンアイソエンザイム検出用の基質含浸セルロー
スアセテートからなる酵素上張ｂａ（ＥＯＭ　：　ｅｎ
ｚｙｍｅ　ｏｖｅｒｌａｙ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　）を、
ＥｎｚｙｍｅＳｙｓｔｅｍｓ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　（
米国力リホルニア州リバーモアー）から購入した。これ
らの膜は、アガロースおよびポリアクリルアミド電気泳
動グレート上でアイソエンデイム活性パターンを検出す
るために螢光トリジシン基質を含有している。

−範囲３．５〜９．５においてＬＫＢ水平電気泳動系を
使用して、０．５１１翼厚のポリアクリルアミドデルプ
レート上で等電点フォーカシングを実施した。

等電点電気泳動の温度は５℃に維持した。電源は、電圧
−１８００，電力＝＝２０ワットおよび電流＝２００ミ
リアンペアにセットした。フォーカシングは約２．５時
間実施した。

高いトリプシン活性をもつことが予想される患者の血清
試料を以下のとおシに調製した。すなわち、（１）生の
状態に保ったもの、（２＞　１０００１．Ｕ、／ｌ過剰
の計算値活性をもつ重炭酸塩緩衝化トリプシン（ｐ）１
６．６）でスパイクしたもの、（３）トリジン／・スパ
イク化試料を緩衝剤で１：１に希釈したもの、（４）ト
リプシン・スパイク化試料を緩衝剤で３：１に希釈した
ものである。

各血清試料を前記のとおシミ気泳動にかけた。

ＥＯ？Ｉｉを蒸留水石中に浸して湿潤化、そして気泡を
取シ込まないように注意して各グルプレート上に載せた
。得られたラミネート体を１０〜３０分間３７°Ｃでイ
ンキユベーシヨンした。紫外線（長波長）ランプを使用
して各ラミネート中の反応を監視した。Ｍ適の螢光が得
られたら、上張シを剥がした。一方、グルプレートは湿
らしたままにした。

膜を放置して乾かした。膜およびプレートを観察したと
ころ、以下のことが分かった。

最初の血清試料は、プレートの両適用領域すなわちＶ１
８．５およびｐＨ４，０においてわずかな活性を示した
。拡散螢光の非常に明るい筋が主要活性の領域を連結し
ていた。

トリプシン・スパイク化試料は同じ領域に主要活性を示
した。しかしながら、主要バンド間の領域の活性は、拡
散螢光によって囲まれた、更に良好に輪郭を示すバンド
に分解した。ス・母イク化試料の希釈体は、予想される
低下活性とほぼ相関した低下螢光を示した。螢光は、評
価するトリプシン検査における等電点フォーカシンググ
ルの一勾配によって影響を受けないように見える。

ゲルプレート中へのまたは上への螢光基質の拡散を検査
するために、予めＥＯＭで上張シしたグルプレー）Ｋ、
ｌｌ掛未処理セルロースアセテートシートを与えた。乾
燥したセルロースアセテートを観察したところ、ＥＯＭ
　−ｆル反応の領域中に拡散螢光があった。

市販のＥＯＭを使用する欠点は以下のとおシ明白である
。（１）基質を活性化するためにＥＯＭは湿潤状態であ
ることが必要であり、このために溶解性基質による望ま
しくない拡散が起きる。（２）複数回の試験において、
後の上張υは連続的に明瞭性の劣ったバンドを示す。（
３）血清成分の日常的臨床分析に有用な基質は利用でき
ない。（４）　ＥＯＭは透明ではないので、直接または
透過分光測光に使用することができない。そして（５）
それらは比較的高価である。

前記の検査を、実施例１に記載の本発明によって実施し
た検査と比較した。本発明は乾式要素中に非常に明瞭な
バンドを提供し、一方で電気泳動プレートは観察可能な
バンドをもたず再使用が可能であった。

〔発明の効果〕

本発ツｊは、同じ電気泳動グレートを使用して、電気的
に分離した１以上の被分析物を同定する手段を提供する
。換言すれば、本発明は袂数回試験検出法を提供する。

本発明方法は使用が容易で、比較的安価で、感受性が高
い。好ましい態様においては、比色的にまたは螢光的に
検出可能な種に使用することができる。

前記の長所は、目的の被分析物と反応して非拡散性検出
可能種を提供する試薬を自身の内に分散してもつ水溶性
バインダー材料を含有する分析用要素を上張シとして使
用することによって達成される。被分析物の反応はグレ
ートと上張シとの界面で起り、非常に輪郭の明瞭なバン
ドが与えられる。検出可能種は水中で非拡散性であるの
で、上張シからプレートへ移動しない。従って、１種以
上の分析物を決定する無制限の回数の連続的試験におい
て同じプレートを繰返し使用することができる。

更に、検査は実質的に乾式条件下で実施され、そのため
に、上張シ中でのバンドの拡散および感度を低下させる
公知方法における条件を最小にする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（Ａ）電気的に誘発される移動に適応させてあり、
   そして電気的に相互に分離されている複数の被分析物を
   含むプレートと、 被分析物少なくとも１種と反応して非拡散性で検出可能
   な種を要素中だけに提供する相互作用組成物を自身の中
   に分散させてもつ水不溶性バインダー材料を含有する分
   析用要素と を接触させることによってラミネート体を形成し、そし
   て （Ｂ）前記プレートから前記要素を取り去り、そしてそ
   の要素中の検出可能種を決定する 各工程を含んでなる、被分析物の決定方法。