JPH0670792A - ホスファチジルセリン認識蛋白質と反応性を有するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 プロテインキナ−ゼＣ又は血液凝固第Ｖ因子
等のＰＡ認識蛋白質を抗原とせず、ホスファチジルセリ
ンを特異的に認識する抗体を抗原として調製される抗イ
ディオタイプ抗体の提供。 【構成】 ホスファチジルセリン認識蛋白質と反応性を
有するモノクロ−ナル抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ホスファチジルセリン
（ＰＳ）を認識し、さらにその活性化にＰＳを要求する
ＰＳ認識蛋白質、特にプロテインキナ−ゼＣ又は血液凝
固第Ｖ因子と反応性を有するモノクロ−ナル抗体に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】プロテインキナ−ゼＣは１９８６〜１９
８７年にかけ相次いでクロ−ニングされ、分子量約８万
の蛋白質として知られている。プロテインキナ−ゼＣは
活性化の際ホスファチジルセリンあるいはホスファチジ
ルイノシト−ルを特異的に要求する。プロテインキナ−
ゼＣの構造はＣ１、Ｃ２の制御ドメインとＣ３のキナ−
ゼドメインから構成され、Ｃ１ドメインにはリン脂質及
びジアシルグリセロ−ルの、Ｃ２ドメインにはカルシウ
ムイオンの結合ドメインが存在すると考えられている。

【０００３】プロテインキナ−ゼＣは脳に多量に存在
し、ラット脳等よりの精製法が確立されている（J.Bio
l.Chem.、 257,13341-13348等）。プロテインキナ−ゼ
Ｃを抗原として免疫を行いた結果、多数のモノクロ−ナ
ル抗体が作製され、その認識部位の予測も行われている
（J.Biol.Chem.、 262,2291-2297等）。これら抗体を用
いプロテインキナ−ゼＣの機能について多くの知見が得
られているが、残念ながらプロテインキナ−ゼＣのリン
脂質認識様式についての厳密な分子レベルでの認識部
位、認識様式は検討がなされておらず、生体内でのプロ
テインキナ−ゼＣの役割、機能解析はいまだ完成されて
いない。

【０００４】血液凝固第Ｖ因子もその活性化の際、ＰＳ
を特異的に要求することが知られている。しかし、ＰＳ
認識部位の予測はされているものの、やはり厳密な分子
レベルでの認識部位、認識様式は検討はなされていな
い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】プロテインキナ−ゼＣ
あるいは血液凝固第Ｖ因子のリン脂質認識部位あるいは
認識様式を解析をする上で、有用なツ−ルとなりうる抗
体が要望されている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】前記の抗体として、例え
ば、それを作製する際、プロテインキナ−ゼＣ又は血液
凝固第Ｖ因子等のＰＡ認識蛋白質を抗原とせず、ホスフ
ァチジルセリンを特異的に認識する抗体を抗原として調
製される抗イディオタイプ抗体がある。このような抗イ
ディオタイプ抗体は、ＰＳと類似した構造（内的イメ−
ジ）を有しＰＳ認識蛋白質のＰＳ認識部位と交差反応す
る可能性を有しているからである。

【０００７】本発明者らは、ＰＳ特異的抗体を抗原とし
抗イディオタイプ抗体を作製し、ＰＳ認識蛋白質である
プロテインキナ−ゼＣ又は血液凝固第Ｖ因子との交差反
応性を検討した結果、これら蛋白質と交差反応性を有す
る抗体を作製することに成功し、本発明を完成させた。

【０００８】即ち本発明は、ホスファチジルセリン認識
蛋白質と反応性を有するモノクロ−ナル抗体である。以
下に本発明を詳細に説明する。

【０００９】（１）抗原 本発明のモノクロ−ナル抗体は、ＰＳを特異的にするモ
ノクロ−ナル抗体を抗原として調製される。このような
抗原として使用されるモノクロ−ナル抗体としては、例
えば、梅田、五十嵐らにより樹立されたモノクロ−ナル
抗体でＰＳをその立体異性構造まで特異的に認識する抗
体であるＰＳ４Ａ７（J.Immunology、1989,143,2273-22
79）を例示できる。本発明のモノクロ−ナル抗体は、Ｐ
Ｓと類似した構造（内的イメ−ジ）を有する可能性があ
る。

【００１０】（２）免疫およびハイブリド−マの樹立 ハイブリド−マは、動物を抗原で免疫した後、脾細胞を
摘出し、公知の方法にしたがって調製できる。その一例
を示せば、モノクロ−ナル抗ＰＳ抗体ＰＳ４Ａ７抗原と
して使用し、フロイントの完全アジュバントと共に動物
の腹腔に免疫する。数週間後、フロイントの不完全アジ
ュバントと共に同様に追加免疫し、続いて抗体を最終免
疫した後、数日後に動物から脾細胞を摘出し抗体産生細
胞を調製する。上記で調製した脾細胞を従来の細胞融合
技術（Nature,256,495-497,1975)を用いてミエロ−マ細
胞と細胞融合し、ハイブリド−マを調製できる。

【００１１】（３）１次スクリ−ニング 目的とするハイブリド−マの選択は、ＥＬＩＳＡ法(Met
h.Enzymol.70,419-439,1980)を用いてハイブリド−マ培
養上清の分析を行うことで実施できる。例えば前記のよ
うにしてハイブリド−マを調製した場合には、１次スク
リ−ニングとして抗ＰＳ抗体ＰＳ４Ａ７のＰＳへの結合
を阻害する抗体を産生しているハイブリド−マを選択
し、限界希釈法によりハイブリド−マを樹立することが
できる。

【００１２】（４）２次スクリ−ニング １次スクリ−ニングで選択したハイブリド−マ培養上清
を用いプロテインキナ−ゼＣあるいは血液凝固第Ｖ因子
への結合性を有しているものを選択し、以後詳細な反応
性の検討することで２次スクリ−ニングすることができ
る。

【００１３】（５）抗体の回収および精製 以上のようにしてハイブリド−マを調製し、常法にした
がってこのハイブリド−マを生育培地中で培養するか、
又はハイブリド−マをこの細胞が増殖可能な実験動物
（マウスやラット等）の腹腔内に投与し生体内で培養す
ることにより抗体の産生を行う事ができる。抗体は生育
培地でハイブリド−マの増殖を行った場合には培養上清
より、実験動物の腹腔内で増殖を行った場合にはその動
物の腹水より、常法（例えば硫安分画法）により本発明
のモノクロ−ナル抗体を回収することが可能である。さ
らに、ゲル濾過法、アフィニティ−クロマトグラフィ−
等を用いたり、あるいはこれらを組み合わせることによ
り高抗体価の精製品を得ることも可能である。

【００１４】（６）モノクロ−ナル抗体のプロテインキ
ナ−ゼＣへの結合性 作製したモノクロ−ナル抗体のプロテインキナ−ゼＣへ
の結合性は、プロテインキナ−ゼＣを固定化した系を用
い、前記ＥＬＩＳＡ法あるいは免疫沈降法後のプロテイ
ンキナ−ゼＣ残存活性を測定することにより行うことが
可能である。具体的な方法として、本発明の実施例に記
載した方法が例示できる。

【００１５】（７）モノクロ−ナル抗体の血液凝固第Ｖ
因子への結合性 作製したモノクロ−ナル抗体の血液凝固第Ｖ因子への結
合性は、血液凝固第Ｖ因子を固定化した系を用い、前記
ＥＬＩＳＡ法あるいは免疫沈降法後の血液凝固第Ｖ因子
残存活性を測定することにより行うことが可能である。
具体的な方法として、本発明の実施例に記載した方法が
例示できる。

【００１６】

【実施例】以下、実施例にて本発明を更に詳細に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

【００１７】実施例１ モノクロ−ナル抗ＰＳ抗体ＰＳ４Ａ７産生ハイブリド−
マを無血清培地にて培養し、当該モノクロ−ナル抗体を
その培養上清より回収、精製した。培養上清と等量の飽
和硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ７．４）を加え、イムノ
グロブリンを沈殿として回収した後、高速液体クロマト
グラフィ−を用いたゲルろ過法により、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動にて単一バンドとなるまで精製
した。

【００１８】ＰＳ４Ａ７はキャリヤ−としてＫＬＨ（キ
−ホ−ル・リンペット・ヘモシアニン）とグルタ−ルア
ルデヒドにより蛋白濃度１：２（ＰＳ４Ａ７：ＫＬＨ）
で結合させ抗原として用いた。抗原が１ｍｇ／ｍｌとな
るようにリン酸緩衝液に溶解し、フロイントの完全アジ
ュバントと混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウス１匹あたり２０
０μｌを腹腔に免疫した。２週間後、同一の抗原をフロ
イントの不完全アジュバントと共に等量追加免疫し、さ
らに２週間後、同一の抗原をアジュバントと混合せず等
量最終免疫した。３日後、脾細胞を取得し、ミエロ−マ
細胞株P3-X63-Ag653とをDMEM（ダルッベコ変性培地）培
地中、50% ポリエチレングリコ−ル存在下にて細胞融合
させハイブリド−マを調製した。

【００１９】ハイブリド−マのスクリ−ニングは梅田ら
の方法（J.Immunology、1989,143,2273-2279）を応用し
て行った。すなわち、ハイブリド−マ培養上清をビオチ
ン標識したＰＳ４Ａ７と混合し室温にて２時間反応さ
せ、ＰＳをコ−トし牛血清アルブミンにてブロッキング
した９６穴マイクロタイタ−プレ−ト（Daynateck 社
製）に移し２時間反応させた。続いてペルオキシタ−ゼ
標識ストテプトアビジンにてＰＳに結合したＰＳ４Ａ７
を検出した。ここでＰＳ４Ａ７のＰＳへの結合を阻害し
たハイブリド−マを限界希釈によりモノクロ−ン化しそ
の培養上清を常法に従い精製し反応性の検討を行った。
なお、本実施例により、８Ｂ８、８Ｆ７、９Ｄ１２、１
０Ａ８、１０Ｆ４、１１Ａ２、１１Ｂ４、及び１２Ｅ１
１の８種類のモノクロ−ナル抗体を産生する８種類のハ
イブリド−マが調製された。

【００２０】実施例２ 実施例１で調製した８種類のモノクロ−ナル抗体につい
て、ＥＬＩＳＡ法によるプロテインキナ−ゼＣへの反応
性を以下の方法により検討した。ラット脳由来の精製プ
ロテインキナ−ゼＣを９６穴マイクロタイタ−プレ−ト
に５０ｎｇコ−トし、牛血清アルブミンにてブロッキン
グ後、１％牛血清を含む１０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍ
Ｍ塩化ナトリウム溶液（ＴＢＳ）にて希釈したモノクロ
−ナル抗体と室温２時間反応させた。続いてビオチン標
識抗マウス・イムノグロブリン抗体およびペルオキシタ
−ゼ標識ストテプトアビジンにてプロテインキナ−ゼＣ
に結合した抗体を検出した。詳しくは、酵素基質として
ο−フェニレンジアミンを添加して酵素反応を行わせた
後、４９２ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１に示
す。

【００２１】その結果、図１に示す通り、抗体８Ｆ７及
び１１Ａ２は強い反応性を示し、また１１Ｂ４は弱い反
応性を有していた。

【００２２】実施例３ 実施例２で認められた抗体８Ｆ７のプロテインキナ−ゼ
Ｃへの結合のリン脂質による阻害効果を以下の方法によ
り検討した。実施例２同様マイクロタイタ−プレ−トに
プロテインキナ−ゼＣをコ−トし牛血清アルブミンにて
ブロッキングを行い、ＰＳ、ホスファチジルコリン（Ｐ
Ｃ）、ホスファチジルエタノ−ルアミン（ＰＥ）又はホ
スファチジルイノシト−ル（ＰＩ）のリポソ−ムを１．
８〜１２５μＭ濃度で５０μｌづつ各穴に加え、２時間
反応させた。続いて０．６μｇ／ｍｌの抗体８Ｆ７を５
０μｌづつ各穴に加え、さらに２時間反応させた。以下
実施例２と同様にしてプロテインキナ−ゼＣに結合した
抗体を検出した。結果を図２に示す。

【００２３】その結果、図２に示す通り、抗体８Ｆ７の
プロテインキナ−ゼＣへの結合はＰＳによってリン脂質
濃度約３１μＭにてほぼ完全に阻害された。このこと
は、抗体８Ｆ７はプロテインキナ−ゼＣのＰＳ結合部位
に結合していることを強く示唆している。

【００２４】実施例４ ＥＬＩＳＡ法による血液凝固第Ｖ因子への反応性を実施
例２と同様に検討した。すなわち、精製牛血液凝固第Ｖ
因子をマイクロタイタ−プレ−トに５０ｎｇコ−トし、
牛血清アルブミンにてブロッキング後、１％牛血清を含
むＴＢＳにて希釈したモノクロ−ナル抗体と室温２時間
反応させた。続いてビオチン標識抗マウス・イムノグロ
ブリン抗体およびペルオキシタ−ゼ標識ストテプトアビ
ジンにて血液凝固第Ｖ因子（ＦＶ）に結合した抗体を検
出した。なお、検出方法は、実施例２に記載したのと同
様にして行った。また、対照として活性化血液凝固第Ｘ
因子（ＦＸａ）及びプロトロンビン（Ｐｒｏｔｈｒｏｍ
ｂｉｎ）を用いて同様の測定を行った。結果を図３に示
す。

【００２５】その結果、図３に示す通り、抗体１０Ｆ
４、１１Ａ２及び１２Ｅ１１は血液凝固第Ｖ因子に強い
反応性を示し、対照として活性化血液凝固第Ｘ因子およ
びプロトロンビンとは交差反応性を示さなかった。また
プロテインキナ−ゼＣと強い反応性を示した８Ｆ７の血
液凝固第Ｖ因子への反応性は非常に弱いものであった。

【００２６】

【発明の効果】本発明によれば、ＰＳ認識蛋白質である
プロテインキナ−ゼＣ又は血液凝固第Ｖ因子と結合性を
有する事を特徴を有するモノクロ−ナル抗体が提供され
る。このモノクロ−ナル抗体はプロテインキナ−ゼＣ又
は血液凝固第Ｖ因子のホスファチジルセリン認識部位あ
るいは認識部位の一部と結合性を有している。従って、
本発明により提供されるモノクロ−ナル抗体はプロテイ
ンキナ−ゼＣ又は血液凝固第Ｖ因子とＰＳの相互作用の
研究に多大の効果を有するものである。更に、本発明の
抗体は、ＰＳ認識蛋白質の検索、ＰＳ認識蛋白質の共有
するＰＳ認識モチ−フの同定に有用であり、ＰＳ認識蛋
白質のアゴニスト又はアンタゴニストの作製に多大な効
果を有するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例２の結果であり、実施例１で調製
された８種類の抗体のプロテインキナ−ゼＣへの反応性
を示すものである。

【図２】図２は実施例３の結果であり、実施例１で得ら
れた抗体８Ｆ７とプロテインキナ−ゼＣの結合の各種リ
ン脂資による阻害性を示すものである。

【図３】図３は実施例４の結果であり、実施例１でえら
れら８種類の抗体の血液凝固第Ｖ因子に対する反応性を
示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ 8310−2Ｊ 33/573 Ａ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ホスファチジルセリン認識蛋白質と反応性
   を有するモノクロ−ナル抗体。
2. 【請求項２】ホスファチジルセリン認識蛋白質がプロテ
   インキナ−ゼＣである請求項１に記載のモノクロ−ナル
   抗体。
3. 【請求項３】プロテインキナ−ゼＣのリン酸化活性を阻
   害する請求項２に記載のモノクロ−ナル抗体。
4. 【請求項４】ホスファチジルセリン認識蛋白質が血液凝
   固第Ｖ因子である請求項１に記載のモノクロ−ナル抗
   体。
5. 【請求項５】血液凝固第Ｖ因子の活性を阻害する請求項
   ４に記載のモノクロ−ナル抗体。