JPH0672103B2 - 慢性関節リウマチ性貧血治療剤 - Google Patents
慢性関節リウマチ性貧血治療剤Info
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- JPH0672103B2 JPH0672103B2 JP61022930A JP2293086A JPH0672103B2 JP H0672103 B2 JPH0672103 B2 JP H0672103B2 JP 61022930 A JP61022930 A JP 61022930A JP 2293086 A JP2293086 A JP 2293086A JP H0672103 B2 JPH0672103 B2 JP H0672103B2
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- epo
- anemia
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明はヒトエリスロポエチン（以下「ヒトEPO」とい
う）を有効成分として含有する慢性関節リウマチ性貧血
治療剤に関する。
う）を有効成分として含有する慢性関節リウマチ性貧血
治療剤に関する。
本願明細書においてヒトEPOとは、ヒト固有のアミノ酸
配列を有するポリペプタイドであって、適宜糖鎖を有す
るかまたは有さないものであり、例えばヒト尿由来のも
の（以下「ヒト尿EPO」という）、ヒトEPOのアミノ酸配
列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現させるこ
とにより得られるもの（以下「ヒトrEPO」という）ヒト
腎癌細胞の組織培養物から得られるもの、あるいはヒト
EPO産生能を有するヒト由来の細胞株を細胞融合して得
たハイブリドーマを培養して得られるもの等を含む。ま
た単にエリスロポエチン（以下「EPO」という）という
場合、それはヒトに限らず、種々の動物において骨髄に
存在する赤芽球系幹細胞に働いて、赤血球系細胞への分
化成熟、増殖を促進する作用を示す微量生理活性物質を
いう。
配列を有するポリペプタイドであって、適宜糖鎖を有す
るかまたは有さないものであり、例えばヒト尿由来のも
の（以下「ヒト尿EPO」という）、ヒトEPOのアミノ酸配
列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現させるこ
とにより得られるもの（以下「ヒトrEPO」という）ヒト
腎癌細胞の組織培養物から得られるもの、あるいはヒト
EPO産生能を有するヒト由来の細胞株を細胞融合して得
たハイブリドーマを培養して得られるもの等を含む。ま
た単にエリスロポエチン（以下「EPO」という）という
場合、それはヒトに限らず、種々の動物において骨髄に
存在する赤芽球系幹細胞に働いて、赤血球系細胞への分
化成熟、増殖を促進する作用を示す微量生理活性物質を
いう。
ヒト尿EPOに関する研究は多数報告されているが、ヒトE
POの医薬としての有効性については未だ不明である。
POの医薬としての有効性については未だ不明である。
近年、慢性関節リウマチ患者に於ける合併症として、貧
血症が高頻度で認められており、［例えば、Nilsson F;
アクタ メディカ スカンジナビカ サプリメンタム
（Acta Med.Scand.Suppl.）210巻193頁（1948年）、Rob
erts FD等；ブラッド（Blood）21巻470頁（1963年）な
どを参照］、特に重度の貧血は臨床的に患者の治療上重
要な問題となっている。
血症が高頻度で認められており、［例えば、Nilsson F;
アクタ メディカ スカンジナビカ サプリメンタム
（Acta Med.Scand.Suppl.）210巻193頁（1948年）、Rob
erts FD等；ブラッド（Blood）21巻470頁（1963年）な
どを参照］、特に重度の貧血は臨床的に患者の治療上重
要な問題となっている。
貧血の機序としては、一般的に鉄代謝以上による網内系
に於ける鉄補足、鉄放出障害、脾の関与、EPO産生障
害、溶血、造血幹細胞の異常などが考えられるが、慢性
関節リウマチ性貧血の場合、大部分が正球性低色素性貧
血であること、平均赤血球ヘモグロビン濃度が低下して
いること、骨髄中の赤芽球が減少していること、赤血球
中の遊離プロトポルフィリンが増加しているなどの事実
から［例えば、Wintrobe MM;クリニカル ヘマトロジー
（Clinical Hematology）671頁，リー アンド フェビ
ガー ロンドン（Lea＆Febiger London）（1974年）を
参照］鉄代謝異常による赤血球内の鉄不足に起因して貧
血が起こると考えられている。
に於ける鉄補足、鉄放出障害、脾の関与、EPO産生障
害、溶血、造血幹細胞の異常などが考えられるが、慢性
関節リウマチ性貧血の場合、大部分が正球性低色素性貧
血であること、平均赤血球ヘモグロビン濃度が低下して
いること、骨髄中の赤芽球が減少していること、赤血球
中の遊離プロトポルフィリンが増加しているなどの事実
から［例えば、Wintrobe MM;クリニカル ヘマトロジー
（Clinical Hematology）671頁，リー アンド フェビ
ガー ロンドン（Lea＆Febiger London）（1974年）を
参照］鉄代謝異常による赤血球内の鉄不足に起因して貧
血が起こると考えられている。
しかしながら、慢性関節リウマチ患者に於ける血中EPO
値は貧血の程度が強くなっても対応して上昇しないこと
が報告されており［例えば、Ward HP等；ジャーナル
オブ ラボラトリーアンド クリニカル メデイシン
（J.Lab.Clin.Med.）74巻93頁（1969年）、Pavlovic-Ke
ntera V等；スカンジナビアン ジャーナル オブ ヘ
マトロジー（Scand.J.Haematol.）23巻141頁（1979年）
などを参照］、この事は慢性関節リウマチ性貧血にEPO
産生障害も関与している可能性を示唆しているが、慢性
関節リウマチ患者に於いてはEPOの産生臓器である腎や
甲状腺等での異常が観察されていない事から実際にEPO
産生障害が生じているか否かは不明である。従って血中
EPO値が上昇しない理由として、その他、EPOに対する骨
髄での感受性が低下していることや、EPOのインヒビタ
ーが産生されている可能性が考えられている。
値は貧血の程度が強くなっても対応して上昇しないこと
が報告されており［例えば、Ward HP等；ジャーナル
オブ ラボラトリーアンド クリニカル メデイシン
（J.Lab.Clin.Med.）74巻93頁（1969年）、Pavlovic-Ke
ntera V等；スカンジナビアン ジャーナル オブ ヘ
マトロジー（Scand.J.Haematol.）23巻141頁（1979年）
などを参照］、この事は慢性関節リウマチ性貧血にEPO
産生障害も関与している可能性を示唆しているが、慢性
関節リウマチ患者に於いてはEPOの産生臓器である腎や
甲状腺等での異常が観察されていない事から実際にEPO
産生障害が生じているか否かは不明である。従って血中
EPO値が上昇しない理由として、その他、EPOに対する骨
髄での感受性が低下していることや、EPOのインヒビタ
ーが産生されている可能性が考えられている。
従って慢性関節リウマチ性貧血患者にヒトEPOを投与し
ても貧血治療に有効であるか否かは疑問であった。ヒト
尿EPOの作用効果に関してはこれまで多数報告されてい
るがヒト尿EPOをはじめとするヒトEPOが慢性関節リウマ
チ性貧血の治療薬として有効であることをヒト又は動物
に実際に投与することによって実証した者はない。本発
明者等は高純度に精製したヒト尿EPOおよびヒトEPOのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現
させて得たヒトrEPOを用いて慢性関節リウマチ疾患の動
物モデルについて貧血治療効果を調べたところ、これら
のヒトEPOが顕著な貧血治療効果を示したことから慢性
関節リウマチ性貧血治療薬として有効であることを見い
出し本発明を完成した。
ても貧血治療に有効であるか否かは疑問であった。ヒト
尿EPOの作用効果に関してはこれまで多数報告されてい
るがヒト尿EPOをはじめとするヒトEPOが慢性関節リウマ
チ性貧血の治療薬として有効であることをヒト又は動物
に実際に投与することによって実証した者はない。本発
明者等は高純度に精製したヒト尿EPOおよびヒトEPOのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で形質発現
させて得たヒトrEPOを用いて慢性関節リウマチ疾患の動
物モデルについて貧血治療効果を調べたところ、これら
のヒトEPOが顕著な貧血治療効果を示したことから慢性
関節リウマチ性貧血治療薬として有効であることを見い
出し本発明を完成した。
本発明は新規な慢性関節リウマチ性貧血治療剤の提供に
係るものである。
係るものである。
すなわち本発明はヒトEPOを有効成分として含有する慢
性関節リウマチ性貧血治療剤である。
性関節リウマチ性貧血治療剤である。
本発明に用いられるヒトEPOは種々の手段によって得る
ことができ、例えば、ヒト尿EPOは正常人尿や再生不良
性貧血患者の尿から抽出することにより得ることができ
る［T.MIYAKE等、ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（J.B.C.）、252巻5558頁（1977年）;J.P.
Lewin等、ジャーナル オブ ラボラトリー アンド
クリニカル メディシン（J.Lad.Clin.Med.）66巻987頁
（1965年）］。
ことができ、例えば、ヒト尿EPOは正常人尿や再生不良
性貧血患者の尿から抽出することにより得ることができ
る［T.MIYAKE等、ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（J.B.C.）、252巻5558頁（1977年）;J.P.
Lewin等、ジャーナル オブ ラボラトリー アンド
クリニカル メディシン（J.Lad.Clin.Med.）66巻987頁
（1965年）］。
またヒトrEPOはヒトEPOのアミノ酸配列に対応するメッ
センジャーRNA（mRNA）を採取し、そのmRNAを利用して
組換DNA体を作製し、次いで適当な宿主細胞（例えば、
大腸菌の如き細菌類、酵母類、植物又は動物の細胞株
等）で生産させるような、所謂、遺伝子工学的方法によ
って得られる。［例えば、SYLVIA L.H.等；プロシーデ
ィングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザー ユー エス エー（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）81巻2708頁（1984年）を参
照。］ 前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができる
が好ましくはヒト又は哺乳動物由来の培養細胞株であ
り、例えば、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（C
HO）細胞、マウスC-127細胞などを挙げることができ
る。この他、ヒト腎癌細胞の組織培養物から製造する方
法［特開昭54-55790］、ヒトEPO産生能を有するヒト由
来のリンパ芽球様細胞から製造する方法［特開昭57-404
11］、ヒト細胞株を細胞融合して得られるハイブリドー
マを培養して得る方法等によっても製造することができ
る。
センジャーRNA（mRNA）を採取し、そのmRNAを利用して
組換DNA体を作製し、次いで適当な宿主細胞（例えば、
大腸菌の如き細菌類、酵母類、植物又は動物の細胞株
等）で生産させるような、所謂、遺伝子工学的方法によ
って得られる。［例えば、SYLVIA L.H.等；プロシーデ
ィングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザー ユー エス エー（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）81巻2708頁（1984年）を参
照。］ 前記の動物細胞株は種々の細胞株を用いることができる
が好ましくはヒト又は哺乳動物由来の培養細胞株であ
り、例えば、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（C
HO）細胞、マウスC-127細胞などを挙げることができ
る。この他、ヒト腎癌細胞の組織培養物から製造する方
法［特開昭54-55790］、ヒトEPO産生能を有するヒト由
来のリンパ芽球様細胞から製造する方法［特開昭57-404
11］、ヒト細胞株を細胞融合して得られるハイブリドー
マを培養して得る方法等によっても製造することができ
る。
これらの方法によって得られたヒトEPOは慢性関節リウ
マチ性貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬機
能を有する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発
明に使用され得る。
マチ性貧血の治療に有効であるような十分な酸素運搬機
能を有する成熟赤血球細胞を増殖させる限り、全て本発
明に使用され得る。
上記の方法に於いて、尿または培養上清中に含まれてい
るヒトEPOは、所望により通常の単離・精製法によって
さらに濃縮・精製される。例えば、安息香酸、エタノー
ル、アセトン、タンニン酸等の有機溶媒による沈殿法、
硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透析法、ゲルろ
過クロマトグラフイー、イオン交換クロマトグラフイ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種のクロ
マトグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気泳動等の
電気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単独でまた
は適宜組合せて用いてもよい。
るヒトEPOは、所望により通常の単離・精製法によって
さらに濃縮・精製される。例えば、安息香酸、エタノー
ル、アセトン、タンニン酸等の有機溶媒による沈殿法、
硫安等による塩析法、濃縮真空透析等の透析法、ゲルろ
過クロマトグラフイー、イオン交換クロマトグラフイ
ー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種のクロ
マトグラフィー法、等電点電気泳動、ゲル電気泳動等の
電気泳動法などが挙げられ、これらの方法は単独でまた
は適宜組合せて用いてもよい。
得られたヒトEPOは凍結保存とするかまたは凍結乾燥、
真空乾燥等の手段により水分を除去して保存することが
できる。さらにはヒトEPO含有水溶液に水溶性塩類もし
くは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ、得
られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。また所
望により、ヒトEPOを適当な緩衝液に溶解した後、ミリ
ポアフィルター等で無菌ろ過して注射剤とすることがで
きる。
真空乾燥等の手段により水分を除去して保存することが
できる。さらにはヒトEPO含有水溶液に水溶性塩類もし
くは親水性有機溶媒を添加して有効成分を析出させ、得
られた沈殿物を乾燥して保存することもできる。また所
望により、ヒトEPOを適当な緩衝液に溶解した後、ミリ
ポアフィルター等で無菌ろ過して注射剤とすることがで
きる。
本発明の慢性関節リウマチ性貧血治療剤は場合によりそ
の他の貧血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンB12製剤、男
性ホルモン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混
合することができ、前記鉄剤の例として乾燥硫酸第一
鉄、フマール酸鉄、グルコン酸鉄、デキストラン鉄、グ
ルクロン酸鉄、オロチン酸鉄等が挙げられる。
の他の貧血治療剤、例えば鉄剤、ビタミンB12製剤、男
性ホルモン剤等を処方的に配合するかまたは使用時に混
合することができ、前記鉄剤の例として乾燥硫酸第一
鉄、フマール酸鉄、グルコン酸鉄、デキストラン鉄、グ
ルクロン酸鉄、オロチン酸鉄等が挙げられる。
本発明の慢性関節リウマチ性貧血治療剤に含まれるヒト
EPOの投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮
して決めることができるが通常９×104u/mgヒトEPOとし
て成人１人当たり0.1〜500μｇ好ましくは５〜100μｇ
のヒトEPOを含有する製剤を１週間に１〜７回投与する
ことができる。
EPOの投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮
して決めることができるが通常９×104u/mgヒトEPOとし
て成人１人当たり0.1〜500μｇ好ましくは５〜100μｇ
のヒトEPOを含有する製剤を１週間に１〜７回投与する
ことができる。
本発明の慢性関節リウマチ性貧血治療剤は安定化物質を
含んでいてもよく、該安定化物質として、例えば、ポリ
エチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無
機塩、有機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの１
つ又は２つ以上を含有してもよい。
含んでいてもよく、該安定化物質として、例えば、ポリ
エチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無
機塩、有機塩および含硫還元剤が挙げられ、これらの１
つ又は２つ以上を含有してもよい。
これらの安定化物質の添加量は、ヒトEPOの１重量部に
たいして0.11〜10000重量部の割合で配合することが好
ましい。なお、２つ以上の安定化物質を混合して使用す
る場合においてもそれらの総量が上記範囲以内であれば
よい。
たいして0.11〜10000重量部の割合で配合することが好
ましい。なお、２つ以上の安定化物質を混合して使用す
る場合においてもそれらの総量が上記範囲以内であれば
よい。
これらの安定化物質は相当する量を適当な濃度とpHの水
溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は0.1
〜3.0の範囲とし、より好ましくは0.8〜1.2である。水
溶液のpHは5.0〜9.0に調整し、特にpH6〜８に調整する
のが好ましい。また本発明の慢性関節リウマチ性貧血治
療剤を調整するにあたっては、吸着防止剤を添加しても
よい。
溶液に調整して使用する。この水溶液の浸透圧比は0.1
〜3.0の範囲とし、より好ましくは0.8〜1.2である。水
溶液のpHは5.0〜9.0に調整し、特にpH6〜８に調整する
のが好ましい。また本発明の慢性関節リウマチ性貧血治
療剤を調整するにあたっては、吸着防止剤を添加しても
よい。
参考例１ ヒト尿EPOの製造 Step １）人尿からの部分精製 MIYAKE.T.等の方法［ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（J.B.C.）252巻5558頁（1977年）］
に従って再生不良性貧血患者尿から、１）SephadexG50
による脱塩、２）DEAEセルロースによるバッチ吸着、
３）エタノール沈殿、４）DEAEアガロースカラムクロマ
トグラフィーを用いて部分精製されたヒト尿EPOを得
た。
ル ケミストリー（J.B.C.）252巻5558頁（1977年）］
に従って再生不良性貧血患者尿から、１）SephadexG50
による脱塩、２）DEAEセルロースによるバッチ吸着、
３）エタノール沈殿、４）DEAEアガロースカラムクロマ
トグラフィーを用いて部分精製されたヒト尿EPOを得
た。
Step ２）逆相クロマトグラフィー 得られた部分精製ヒト尿EPOを24％プロパノール（和光
純薬社製）を含む0.1％トルフルオロ酢酸（Aldrich社
製）溶液に溶解せしめたのちHPLCにより精製を行った。
HPLC装置は日立638-50型を用い280nmと220nmの紫外部吸
収により検出を行った。
純薬社製）を含む0.1％トルフルオロ酢酸（Aldrich社
製）溶液に溶解せしめたのちHPLCにより精製を行った。
HPLC装置は日立638-50型を用い280nmと220nmの紫外部吸
収により検出を行った。
24％ｎ−プロパノールを含んだ0.1％トリフルオロ酢酸
溶液で予め平衡化したYMC-C8カラム（6mm×30cm山村化
学社製）に上記で得られた試料を注入し、前記平衡化溶
液で溶出させた。未吸着画分が溶出後、ｎ−プロパノー
ルの濃度を26％に高めて溶出させた。EPOの活性画分を
集めた後、Centricon-100（Amicon社製商品名）を用い
た限外ろ過により、0.1〜0.2mlに濃縮した。
溶液で予め平衡化したYMC-C8カラム（6mm×30cm山村化
学社製）に上記で得られた試料を注入し、前記平衡化溶
液で溶出させた。未吸着画分が溶出後、ｎ−プロパノー
ルの濃度を26％に高めて溶出させた。EPOの活性画分を
集めた後、Centricon-100（Amicon社製商品名）を用い
た限外ろ過により、0.1〜0.2mlに濃縮した。
Step ３）高速分子篩クロマトグラフィー 上記濃縮試料を26％ｎ−プロパノールを含む0.1％TFA溶
液を予め平衡化したTSK-G3000SWカラム（7.8mm×60cm東
洋曹達社製）に注入し、前記平衡液で溶出させた。分子
量25000〜30000の位置にEPO活性を有するピークが得ら
れたので、この部分を集めて凍結乾燥した。比活性は約
９×104u/mgであった。
液を予め平衡化したTSK-G3000SWカラム（7.8mm×60cm東
洋曹達社製）に注入し、前記平衡液で溶出させた。分子
量25000〜30000の位置にEPO活性を有するピークが得ら
れたので、この部分を集めて凍結乾燥した。比活性は約
９×104u/mgであった。
各ステップに於けるヒトEPO活性を表Ｉに示す。
参考例２ CHO細胞由来ヒトrEPOの製造 昭和59年12月27日に出願された発明の名称「真核細胞の
形質転換のための補助DNAを含むベクター」（特願昭59-
281862）に開示された方法に従って、ヒトEPOのアミノ
酸配列をコードする遺伝子を組込んだプラスミドをチャ
イニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）で形質発現さ
せることによってヒトrEPOを得た。要約すると以下の如
くである。
形質転換のための補助DNAを含むベクター」（特願昭59-
281862）に開示された方法に従って、ヒトEPOのアミノ
酸配列をコードする遺伝子を組込んだプラスミドをチャ
イニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）で形質発現さ
せることによってヒトrEPOを得た。要約すると以下の如
くである。
ヒト胎児肝細胞から得られたヒトEPOのアミノ酸配列を
コードする遺伝子を組込んだラムダHEPOFL13クローンか
らのDNAをEcoR1で消化させ、ヒトEPOのアミノ酸配列を
コードする遺伝子を含む小さなR1フラグメントを取り出
しプラスミドRKI-4のEcoR1部位へ挿入した。このヒトEP
O遺伝子を組込んだプラスミドRKI-4をDHFR−欠損CHO細
胞に組入れて形質転換させた。CHO細胞を核酸を欠如し
たアルファ媒地中で培養することによって少なくとも１
つのDHFR遺伝子を有する細胞を選択した後、段階的にメ
トトレキサートの濃度を高めてゆくことによってヒトrE
POを産生させた。
コードする遺伝子を組込んだラムダHEPOFL13クローンか
らのDNAをEcoR1で消化させ、ヒトEPOのアミノ酸配列を
コードする遺伝子を含む小さなR1フラグメントを取り出
しプラスミドRKI-4のEcoR1部位へ挿入した。このヒトEP
O遺伝子を組込んだプラスミドRKI-4をDHFR−欠損CHO細
胞に組入れて形質転換させた。CHO細胞を核酸を欠如し
たアルファ媒地中で培養することによって少なくとも１
つのDHFR遺伝子を有する細胞を選択した後、段階的にメ
トトレキサートの濃度を高めてゆくことによってヒトrE
POを産生させた。
最終的な培養上清中のヒトrEPOの活性は20u/mlであっ
た。
た。
CHO細胞を無血清培養液で３日間培養した後、ヒト尿EPO
で用いた精製方法に準じてヒトrEPOを精製した。得られ
たヒトrEPOはKrystal等の方法［ジャーナル オブ ラ
ボラトリー アンド クリニカル メディスン（J.Lab.
Clin.Med.）97巻144頁（1981年）］により6600u/mlの活
性を有していた。またこのヒトrEPOはSDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動の結果、単一のバンドであることが
確認された。
で用いた精製方法に準じてヒトrEPOを精製した。得られ
たヒトrEPOはKrystal等の方法［ジャーナル オブ ラ
ボラトリー アンド クリニカル メディスン（J.Lab.
Clin.Med.）97巻144頁（1981年）］により6600u/mlの活
性を有していた。またこのヒトrEPOはSDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動の結果、単一のバンドであることが
確認された。
得られたヒトrEPOに0.1％BSAを加え、生理食塩水にて透
析した後、実験に供した。
析した後、実験に供した。
〈実験例〉アジュバンド関節炎ラットに於ける貧血治療
効果 1.アジュバント関節炎ラットの作製 ８週令の雌性LEW/Crjラット（日本チャールスリバー社
より購入）にアジュバント（青山Ｂ株50mg/ml）0.05ml
をラット尾部に皮下投与した。投与後27日目のアジュバ
ント処理ラットについて関節炎の生起を確認した後、種
々の赤血球パラメーターを測定した。（表Ｉ） 〈測定項目〉 ・ヘモグロビン量：眼から採血ののち分光光度計（RaBA
Super発売元中外製薬）により測定 ・ヘマトクリット値：ヘマトクリット管により眼から採
血ののち常法にて測定 ・赤血球数：眼から採血した血液を希釈液［ISOTON（コ
ールターエレクトロニクス社商品名）］で希釈しコール
ターカウンターMode1ZBIにて測定した。
効果 1.アジュバント関節炎ラットの作製 ８週令の雌性LEW/Crjラット（日本チャールスリバー社
より購入）にアジュバント（青山Ｂ株50mg/ml）0.05ml
をラット尾部に皮下投与した。投与後27日目のアジュバ
ント処理ラットについて関節炎の生起を確認した後、種
々の赤血球パラメーターを測定した。（表Ｉ） 〈測定項目〉 ・ヘモグロビン量：眼から採血ののち分光光度計（RaBA
Super発売元中外製薬）により測定 ・ヘマトクリット値：ヘマトクリット管により眼から採
血ののち常法にて測定 ・赤血球数：眼から採血した血液を希釈液［ISOTON（コ
ールターエレクトロニクス社商品名）］で希釈しコール
ターカウンターMode1ZBIにて測定した。
表IIに示す如くアジュバント処理ラットは、赤血球パラ
メーターについてのすべての測定値（ヘモグロビン量、
ヘマトクリット値、赤血球数）で正常ラットに対して有
意な差を示し貧血状態に陥っていることを示した。
メーターについてのすべての測定値（ヘモグロビン量、
ヘマトクリット値、赤血球数）で正常ラットに対して有
意な差を示し貧血状態に陥っていることを示した。
2.アジュバント関節炎ラットに於けるヒト尿EPOの貧血
治療効果 １のアジュバント処理ラットについてアジュバント注射
後18日目から７日間ヒト尿EPO（25u/ラット／日）を腹
腔内に連日投与した群と無投与群との赤血球パラメータ
ーを比較した。
治療効果 １のアジュバント処理ラットについてアジュバント注射
後18日目から７日間ヒト尿EPO（25u/ラット／日）を腹
腔内に連日投与した群と無投与群との赤血球パラメータ
ーを比較した。
（表III） 3.アジュバント関節炎ラットに於けるCHO細胞由来ヒトr
EPOの貧血治療効果 １のアジュバント処理ラットについてアジュバント注射
後18日目から７日間CHO細胞由来ヒトrEPO（10u/ラット
／日）を腹腔内に連日投与した群と無投与群との赤血球
パラメーターを比較した。（表IV） 表III、IVに示される如くアジュバントラット群に比べ
てヒトEPO投与群ではヘマトクリット値、ヘモグロビン
量、赤血球数の有意な改善効果が見られたことから貧血
治療に有効であることがわかった。
EPOの貧血治療効果 １のアジュバント処理ラットについてアジュバント注射
後18日目から７日間CHO細胞由来ヒトrEPO（10u/ラット
／日）を腹腔内に連日投与した群と無投与群との赤血球
パラメーターを比較した。（表IV） 表III、IVに示される如くアジュバントラット群に比べ
てヒトEPO投与群ではヘマトクリット値、ヘモグロビン
量、赤血球数の有意な改善効果が見られたことから貧血
治療に有効であることがわかった。
またこれ等の実験条件下に於いて毒性は認められなかっ
た。
た。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発
明はこれ等に限定されるべきものではない。
明はこれ等に限定されるべきものではない。
実施例１ CHO細胞由来ヒトrEPO １重量部 ヒト血清アルブミン 100重量部 注射用蒸留水にて全量 100000重量部 上記組成比で無菌的に溶液を調整し、バイアル瓶に分注
し、凍結乾燥し密封した。
し、凍結乾燥し密封した。
実施例２ 実施例１におけるヒト血清アルブミンに代えてデキスト
ラン40を100重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を作製
した。
ラン40を100重量部用い、同様にて凍結乾燥製剤を作製
した。
実施例３ 100ml中にマンニトール5g、ヒト尿EPO 1mg、ヒト血清ア
ルブミン100mg、アセチルトリプトファンナトリウム2.1
54mg、カプリル酸ナトリウム1.33mgを含む水溶液を無菌
的に調整し、1mlずつバイアルに分注し凍結乾燥示し密
封する。
ルブミン100mg、アセチルトリプトファンナトリウム2.1
54mg、カプリル酸ナトリウム1.33mgを含む水溶液を無菌
的に調整し、1mlずつバイアルに分注し凍結乾燥示し密
封する。
実施例４ pH7.0の0.05Mリン酸緩衝液100ml中にヒト尿EPO1mg、ポ
リエチレングリコール4000 500mg、エチレンオキサイド
プロピレンオキサイド共重合体30mg、塩化ナトリウム80
0mgを含む水溶液に無菌的に調整し、1mlずつアンプルに
分注熔閉する。
リエチレングリコール4000 500mg、エチレンオキサイド
プロピレンオキサイド共重合体30mg、塩化ナトリウム80
0mgを含む水溶液に無菌的に調整し、1mlずつアンプルに
分注熔閉する。
実施例５ pH7.0の0.05Mリン酸緩衝液50ml中にCHO細胞由来ヒトrEP
O0.5mg、グリシン1g、ソルピトール1gを含む水溶液を無
菌的に調整し、0.5mlずつバイアルに分注し、凍結乾燥
し密封する。別に0.1％メチルセルロース水溶液を無菌
的に調整し、1mlずつアンプルに分注し、溶解用溶液と
する。
O0.5mg、グリシン1g、ソルピトール1gを含む水溶液を無
菌的に調整し、0.5mlずつバイアルに分注し、凍結乾燥
し密封する。別に0.1％メチルセルロース水溶液を無菌
的に調整し、1mlずつアンプルに分注し、溶解用溶液と
する。
実施例６ 100ml中にヒト尿EPO1mg、ヒト血清アルブミン50mg、マ
ンニトール500mgを含む水溶液を無菌的に調整し、1mlず
つバイアルに分注し凍結乾燥し密封する。
ンニトール500mgを含む水溶液を無菌的に調整し、1mlず
つバイアルに分注し凍結乾燥し密封する。
別に300ml中にグリコン酸第二鉄3g、NaCl 2.7gを含む水
溶液を無菌的に調整し、3mlずつアンプルに分注し、熔
封する。
溶液を無菌的に調整し、3mlずつアンプルに分注し、熔
封する。
上記１バイアルを１アンプルに溶解し徐々に（２〜３分
で）静注する。
で）静注する。
Claims (6)
- 【請求項１】ヒトエリスロポエチンを有効成分として含
有する慢性関節リウマチ性貧血治療剤。 - 【請求項２】ヒトエリスロポエチンが人尿由来のもので
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の慢性
関節リウマチ性貧血治療剤。 - 【請求項３】ヒトエリスロポエチンがヒトエリスロポエ
チンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞内で
形質発現させて得たものであることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の慢性関節リウマチ性貧血治療剤。 - 【請求項４】宿主細胞が大腸菌、酵母、植物または動物
の細胞株のいずれかであることを特徴とする特許請求の
範囲第３項記載の慢性関節リウマチ性貧血治療剤。 - 【請求項５】宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細
胞であることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の
慢性関節リウマチ性貧血治療剤。 - 【請求項６】宿主細胞がCOS細胞であることを特徴とす
る特許請求の範囲第３項記載の慢性関節リウマチ性貧血
治療剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2116585 | 1985-02-06 | ||
| JP60-21165 | 1985-02-06 |
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|---|---|
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| JPH0672103B2 true JPH0672103B2 (ja) | 1994-09-14 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61022930A Expired - Lifetime JPH0672103B2 (ja) | 1985-02-06 | 1986-02-06 | 慢性関節リウマチ性貧血治療剤 |
Country Status (4)
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| JP (1) | JPH0672103B2 (ja) |
| FR (1) | FR2576792B1 (ja) |
| GB (1) | GB2171304B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| GB2177914B (en) * | 1985-06-04 | 1989-10-25 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | A pharmaceutical composition containing human erythropoietin and a surface active agent for nasal administration for the treatment of anemia |
| US4954437A (en) * | 1986-09-15 | 1990-09-04 | Integrated Genetics, Inc. | Cell encoding recombinant human erythropoietin |
| KR880012235A (ko) * | 1987-04-10 | 1988-11-26 | 벤자민 에프.람버트 | 정상 포유동물의 헤마토크릿을 증가시키는 방법 |
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| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US5912015A (en) * | 1992-03-12 | 1999-06-15 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Modulated release from biocompatible polymers |
| US5674534A (en) * | 1992-06-11 | 1997-10-07 | Alkermes, Inc. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
| US20030035845A1 (en) * | 1992-06-11 | 2003-02-20 | Zale Stephen E. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
| US5716644A (en) * | 1992-06-11 | 1998-02-10 | Alkermes, Inc. | Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin |
| US5614184A (en) | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
| US6153407A (en) * | 1992-07-28 | 2000-11-28 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics |
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| US6696411B1 (en) * | 1998-04-22 | 2004-02-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine erythropoietin gene and recombinant protein |
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| AU2005225151B2 (en) * | 2000-05-15 | 2008-05-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | New pharmaceutical composition |
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| US8614204B2 (en) | 2003-06-06 | 2013-12-24 | Fibrogen, Inc. | Enhanced erythropoiesis and iron metabolism |
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-
1986
- 1986-02-03 US US06/825,222 patent/US4732889A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-05 GB GB8602788A patent/GB2171304B/en not_active Expired
- 1986-02-06 JP JP61022930A patent/JPH0672103B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-06 FR FR868601641A patent/FR2576792B1/fr not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．４１Ｎｏ．１（１９７３），Ｐ．３７−４４ |
| ＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ（１９８３）５９，Ｐ．５４３−５５０ |
Also Published As
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|---|---|
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| GB2171304A (en) | 1986-08-28 |
| FR2576792A1 (fr) | 1986-08-08 |
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| US4732889A (en) | 1988-03-22 |
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