JPH0672160B2 - 固定化ロドプシン及びその製造方法 - Google Patents
固定化ロドプシン及びその製造方法Info
- Publication number
- JPH0672160B2 JPH0672160B2 JP1003841A JP384189A JPH0672160B2 JP H0672160 B2 JPH0672160 B2 JP H0672160B2 JP 1003841 A JP1003841 A JP 1003841A JP 384189 A JP384189 A JP 384189A JP H0672160 B2 JPH0672160 B2 JP H0672160B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rhodopsin
- immobilized
- light
- producing
- gel
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Photometry And Measurement Of Optical Pulse Characteristics (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は光感覚蛋白質であるロドプシンの固定化に係
り、特にバイオセンサーやバイオ素子に好適な固定化ロ
ドプシン及びその製造方法に関する。
り、特にバイオセンサーやバイオ素子に好適な固定化ロ
ドプシン及びその製造方法に関する。
［従来の技術］ 眼球の網膜にある光受容細胞にはロドプシンという光受
容色素蛋白質があり、光を受けて電気的シグナルとして
神経に送り出す最初の段階を受けもっている。ロドプシ
ンは分子内にレチナールを有し、光を受けてレチナール
が化学構造変化することにより、ロドプシンのプロトン
化が生じて信号が出される。このように、ロドプシンは
光を受容する蛋白質であるので、この性質を利用してロ
ドプシン含有膜を作製し、バイオセンサーやバイオ素子
として利用する研究がなされている。ロドプシンを人工
的に利用するため、ハロバクテリウム ハロビウム（Ha
lo bacterium halobium）が生産するバクテリオロドプ
シンをリン脂質に埋め込んで光スイツチ素子モデルを作
成した例（エレクトロニクス,p55,昭和60年12月号）や
電着により紫膜フィルムを作成した例（第６回新機能素
子技術シンポジウム予稿集,p297,昭和62年11月，大阪）
等がある。これらはバクテリオロドプシンを一定方向に
配向させる必要があり、種々の工夫がなされている。
容色素蛋白質があり、光を受けて電気的シグナルとして
神経に送り出す最初の段階を受けもっている。ロドプシ
ンは分子内にレチナールを有し、光を受けてレチナール
が化学構造変化することにより、ロドプシンのプロトン
化が生じて信号が出される。このように、ロドプシンは
光を受容する蛋白質であるので、この性質を利用してロ
ドプシン含有膜を作製し、バイオセンサーやバイオ素子
として利用する研究がなされている。ロドプシンを人工
的に利用するため、ハロバクテリウム ハロビウム（Ha
lo bacterium halobium）が生産するバクテリオロドプ
シンをリン脂質に埋め込んで光スイツチ素子モデルを作
成した例（エレクトロニクス,p55,昭和60年12月号）や
電着により紫膜フィルムを作成した例（第６回新機能素
子技術シンポジウム予稿集,p297,昭和62年11月，大阪）
等がある。これらはバクテリオロドプシンを一定方向に
配向させる必要があり、種々の工夫がなされている。
［発明が解決しようとする課題］ 上記従来技術は用いられているロドプシンの機能性や安
定性についての配慮がなされておらず、ロドプシンの配
列に複雑で高度な技術が必要になるという問題があっ
た。
定性についての配慮がなされておらず、ロドプシンの配
列に複雑で高度な技術が必要になるという問題があっ
た。
本発明の目的は頭足類のロドプシンをゲルに包括固定す
ることにより、機能性と安定性に優れた固定化ロドプシ
ンを提供することにある。
ることにより、機能性と安定性に優れた固定化ロドプシ
ンを提供することにある。
［課題を解決するための手段］ 第１の発明の特徴は、頭足類の光受容蛋白質であるロド
プシンをジェランガムゲルに包括した固定化ロドプシン
にある。
プシンをジェランガムゲルに包括した固定化ロドプシン
にある。
第２の発明の特徴は、頭足類の光受容蛋白質であるロド
プシンをジェランガムゲルで包括し固定する固定化ロド
プシンの製造方法にある。
プシンをジェランガムゲルで包括し固定する固定化ロド
プシンの製造方法にある。
ロドプシンとしては、タコロドプシンの他にイカロドプ
シンでも同様な性質を持つので適用できる。
シンでも同様な性質を持つので適用できる。
ロドプシンには、脊椎動物のロドプシンのように光を受
容した後レチナールが遊離する種類のものや、バクテリ
オロドプシンのように光を受信してプロトンポンプとし
て働き、プロトンを膜外に輸送するものがある。これら
に対して、本発明では、無脊椎動物である頭足類のロド
プシンを採用することにした。特にタコのロドプシンは
その代表的な例である。タコロドプシンは、青色光を受
容すると、レチナールと蛋白質が形成しているシッフ塩
基にプロトンが付いた酸性メタロドプシンという段階に
比較的安定に止まり、これに赤色光を照射すると、元の
ロドプシンに戻ることができる性質を有する。光感反応
の経路を第１図に示す。このように照射光の波長を変え
ることで、ロドプシンを２つの状態に変えることがで
き、それらの状態が安定に存在し得るという性質は、目
的とするバイオセンサーやバイオ素子を作製するには非
常に都合の良い性質である。頭足類にはタコの他にイカ
等があり、このロドプシンもタコと同様な性質であり、
使用可能である。
容した後レチナールが遊離する種類のものや、バクテリ
オロドプシンのように光を受信してプロトンポンプとし
て働き、プロトンを膜外に輸送するものがある。これら
に対して、本発明では、無脊椎動物である頭足類のロド
プシンを採用することにした。特にタコのロドプシンは
その代表的な例である。タコロドプシンは、青色光を受
容すると、レチナールと蛋白質が形成しているシッフ塩
基にプロトンが付いた酸性メタロドプシンという段階に
比較的安定に止まり、これに赤色光を照射すると、元の
ロドプシンに戻ることができる性質を有する。光感反応
の経路を第１図に示す。このように照射光の波長を変え
ることで、ロドプシンを２つの状態に変えることがで
き、それらの状態が安定に存在し得るという性質は、目
的とするバイオセンサーやバイオ素子を作製するには非
常に都合の良い性質である。頭足類にはタコの他にイカ
等があり、このロドプシンもタコと同様な性質であり、
使用可能である。
タコロドプシンの光による吸光波長変化やプロトン移動
現象を利用して、バイオセンサーやバイオ素子を造成す
るには、ロドプシンを固定化する必要がある。固定化方
法としてはリン脂質膜に埋め込む方法、担体に化学結合
や架橋結合させる化学的固定化方法並びに吸着や包括に
よる物理的固定化方法等がある。本発明者らは種々検討
した結果、ゲルによる包括固定化方法がロドプシンの光
感反応を阻害することなく、安定に機能を維持できるこ
とを見い出した。
現象を利用して、バイオセンサーやバイオ素子を造成す
るには、ロドプシンを固定化する必要がある。固定化方
法としてはリン脂質膜に埋め込む方法、担体に化学結合
や架橋結合させる化学的固定化方法並びに吸着や包括に
よる物理的固定化方法等がある。本発明者らは種々検討
した結果、ゲルによる包括固定化方法がロドプシンの光
感反応を阻害することなく、安定に機能を維持できるこ
とを見い出した。
ロドプシンのゲル包括に用いられる材料としては、ポリ
アクリルアミドゲル，ジェランガム，アルギン酸ナトリ
ウムゲルやカラギーナン等が用いられる。これらのゲル
のうち、透明度の点から特にジェランガムを用いるのが
有効である。ジェランガムはPseudomonas elodeaが発酵
生産する多糖類で、生体物質であるのでロドプシン蛋白
質の影響が少ないこと、加熱溶解後冷却することでゲル
を形成できることから、ゲル形成が容易でかつ長期間使
用後に劣化したゲルを除去するのが容易であること及び
透明度が高いことなどの利点がある。ゲル濃度はジェラ
ンガムでは0.2〜１％で望ましくは0.5％程度が良い。
尚、アルギン酸ナトリウムゲル、カラギーナン等のゲル
は光透過性の点で光センサーとしては好ましいものでは
ない。包括されたロドプシンは膜状や粒状に成型され、
イオン選択性電極等のインターフェース基盤に貼付ける
ことによりプロトン濃度変化を検知するか、または光フ
ァイバー等を用いて吸光度変化を検知することによりバ
イオセンサーやバイオ素子としての利用が可能になる。
アクリルアミドゲル，ジェランガム，アルギン酸ナトリ
ウムゲルやカラギーナン等が用いられる。これらのゲル
のうち、透明度の点から特にジェランガムを用いるのが
有効である。ジェランガムはPseudomonas elodeaが発酵
生産する多糖類で、生体物質であるのでロドプシン蛋白
質の影響が少ないこと、加熱溶解後冷却することでゲル
を形成できることから、ゲル形成が容易でかつ長期間使
用後に劣化したゲルを除去するのが容易であること及び
透明度が高いことなどの利点がある。ゲル濃度はジェラ
ンガムでは0.2〜１％で望ましくは0.5％程度が良い。
尚、アルギン酸ナトリウムゲル、カラギーナン等のゲル
は光透過性の点で光センサーとしては好ましいものでは
ない。包括されたロドプシンは膜状や粒状に成型され、
イオン選択性電極等のインターフェース基盤に貼付ける
ことによりプロトン濃度変化を検知するか、または光フ
ァイバー等を用いて吸光度変化を検知することによりバ
イオセンサーやバイオ素子としての利用が可能になる。
［実施例］ 以下、本発明の実施例について具体的に説明するが、本
発明はこれによりなんら限定されるものではない。
発明はこれによりなんら限定されるものではない。
実施例1. タコロドプシンを次の方法で分離精製した。ミズダコの
眼球100個を緩衝液Ａ（10mM MOPS−NaOH,pH7.4,400mM K
cl,5mM MgCl2,2μM P−APMSF［ｐ−アミノフェニルメタ
ンスルフォニルフルオライド塩酸塩］）1.2に懸濁
後、その上清液を40000×g,30分間遠心分離し、沈殿し
た桿体外節を採取した。この桿体外節を緩衝液Ａに34％
になるようにショ糖を添加した液0.3に懸濁し、40000
×g,1時間で２回ショ糖浮遊遠心を行うことにより、粗
感桿分体を得た。この粗感桿分体を緩衝液Ａ 0.6に
懸濁後、40000×g,20分間遠心分離して洗浄した。本操
作を３回行った後、緩衝液Ｂ（10mM MOPS−NaOH,pH7.4,
2μM p−APMSF）0.6で３回洗浄した。ここで得られた
感桿分体の蛋白質は全量で160mgであった。
眼球100個を緩衝液Ａ（10mM MOPS−NaOH,pH7.4,400mM K
cl,5mM MgCl2,2μM P−APMSF［ｐ−アミノフェニルメタ
ンスルフォニルフルオライド塩酸塩］）1.2に懸濁
後、その上清液を40000×g,30分間遠心分離し、沈殿し
た桿体外節を採取した。この桿体外節を緩衝液Ａに34％
になるようにショ糖を添加した液0.3に懸濁し、40000
×g,1時間で２回ショ糖浮遊遠心を行うことにより、粗
感桿分体を得た。この粗感桿分体を緩衝液Ａ 0.6に
懸濁後、40000×g,20分間遠心分離して洗浄した。本操
作を３回行った後、緩衝液Ｂ（10mM MOPS−NaOH,pH7.4,
2μM p−APMSF）0.6で３回洗浄した。ここで得られた
感桿分体の蛋白質は全量で160mgであった。
つぎに、感桿分体をジギトニン溶液（２％ジギトニン,1
00mMNa2HPO4−KH2PO4,pH6.8）16mlに懸濁し、１時間振
とうして、ロドプシンを抽出した。抽出液を25000×ｇ
で１時間遠心分離して残渣を除去した。本操作を２回く
り返して得られた蛋白質は、全量で110mgであった。
00mMNa2HPO4−KH2PO4,pH6.8）16mlに懸濁し、１時間振
とうして、ロドプシンを抽出した。抽出液を25000×ｇ
で１時間遠心分離して残渣を除去した。本操作を２回く
り返して得られた蛋白質は、全量で110mgであった。
ジギトニン抽出液中のオモクロムを除去するために、DE
AE−Sephacel（ファルマシア製）を用いてイオン交換ク
ロマトグラフィーを行った。DEAE−Sephacel 5mlをカラ
ムに充填し、緩衝液Ｃ（0.1％ジギトニン,50mM Na2HPO4
−KH2PO4,pH6.8）で平衡化した後、蛋白質量として30mg
を含む抽出液10mlをカラムにチャージし、緩衝液Ｃでロ
ドプシンを溶出させた。オモクロムはカラムに吸着し溶
出しないので、この操作で抽出液よりオモクロムを除去
できた。
AE−Sephacel（ファルマシア製）を用いてイオン交換ク
ロマトグラフィーを行った。DEAE−Sephacel 5mlをカラ
ムに充填し、緩衝液Ｃ（0.1％ジギトニン,50mM Na2HPO4
−KH2PO4,pH6.8）で平衡化した後、蛋白質量として30mg
を含む抽出液10mlをカラムにチャージし、緩衝液Ｃでロ
ドプシンを溶出させた。オモクロムはカラムに吸着し溶
出しないので、この操作で抽出液よりオモクロムを除去
できた。
次に、Concanavalin A−Sepharose（ファルマシア製）
を用いてロドプシンを精製した。
を用いてロドプシンを精製した。
Concanavaline A−Sepharose 10mlをカラムに充填し、
0.2％ジギトニンを含む50mM Tris−HCl緩衝液（pH7.0）
で平衡化した後、蛋白質量として10mgを含む上記溶出液
16mlをチャージした。緩衝液でカラムを数回洗浄した
後、1Mα−メチルグルコシドを含む緩衝液でロドプシン
を溶出させた。これにより、眼球100個よりロドプシン
蛋白量として44mgを得ることができた。精製したロドプ
シンをSPS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により
純度を検定したところ、ロドプシン以外のバンドは検出
されず高度に精製されたタコロドプシンが得られた。
0.2％ジギトニンを含む50mM Tris−HCl緩衝液（pH7.0）
で平衡化した後、蛋白質量として10mgを含む上記溶出液
16mlをチャージした。緩衝液でカラムを数回洗浄した
後、1Mα−メチルグルコシドを含む緩衝液でロドプシン
を溶出させた。これにより、眼球100個よりロドプシン
蛋白量として44mgを得ることができた。精製したロドプ
シンをSPS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により
純度を検定したところ、ロドプシン以外のバンドは検出
されず高度に精製されたタコロドプシンが得られた。
次にジェランガムゲルへのタコロドプシンの包括はつぎ
のように行った。
のように行った。
ジェランガム（kelco社製）0.056gを50mM Tris.HCl（pH
7.0）4.4mM CaCl2溶液10mlに懸濁後、オートクレーブに
より120℃、20分間加熱して溶解した。43℃まで冷却
後、0.36mlを採取し、精製したタコロドプシン（0.55mg
/ml）0.04mlを添加、混合して、分光々度計用セルに入
れて固化させた。これらの操作は全て遮光して行った。
7.0）4.4mM CaCl2溶液10mlに懸濁後、オートクレーブに
より120℃、20分間加熱して溶解した。43℃まで冷却
後、0.36mlを採取し、精製したタコロドプシン（0.55mg
/ml）0.04mlを添加、混合して、分光々度計用セルに入
れて固化させた。これらの操作は全て遮光して行った。
このようにして作成したジェランガムゲルを包括ロドプ
シンに青色光と赤色光を交互に照射し、光感反応による
光波長の吸光度変化を示したのが第２図である。青色光
を照射することによりロドプシンは酸性メタロドプシン
とロドプシンの混合物に変化し、λmaxは490nmになっ
た。これに赤色光を照射すると酸性メタロドプシンはロ
ドプシンに戻りλmaxは475nmになった。
シンに青色光と赤色光を交互に照射し、光感反応による
光波長の吸光度変化を示したのが第２図である。青色光
を照射することによりロドプシンは酸性メタロドプシン
とロドプシンの混合物に変化し、λmaxは490nmになっ
た。これに赤色光を照射すると酸性メタロドプシンはロ
ドプシンに戻りλmaxは475nmになった。
これより、固定化ロドプシンにおいて青色光と赤色光を
交互に照射することにより光感反応が生じ、かつ４℃に
保持すればロドプシンの失活もなく、光感反応が長期間
生じることが確められた。
交互に照射することにより光感反応が生じ、かつ４℃に
保持すればロドプシンの失活もなく、光感反応が長期間
生じることが確められた。
［発明の効果］ 本発明によれば、ロドプシンをその光受容特性を劣化さ
せることなく、安定に固定化出来る、即ち機能性と安定
化に優れた固定化ロドプシンを得ることができる。従っ
て、光の波長に感受性のあるバイオセンサーやバイオ素
子を作製でき且長寿命を確保し得る効果がある。
せることなく、安定に固定化出来る、即ち機能性と安定
化に優れた固定化ロドプシンを得ることができる。従っ
て、光の波長に感受性のあるバイオセンサーやバイオ素
子を作製でき且長寿命を確保し得る効果がある。
第１図はタコロドプシンの光感反応経路を示す図、第２
図は固定化タコロドプシンの青色光または赤色光照射に
よる光波長の吸光度変化を示す線図である。
図は固定化タコロドプシンの青色光または赤色光照射に
よる光波長の吸光度変化を示す線図である。
Claims (4)
- 【請求項１】頭足類の光受容蛋白質であるロドプシンを
ジェランガムゲルに包括したことを特徴とする固定化ロ
ドプシン。 - 【請求項２】ロドプシンがタコロドプシンであることを
特徴とする請求項１記載の固定化ロドプシン。 - 【請求項３】頭足類の光受容蛋白質であるロドプシンを
ジェランガムゲルで包括し固定することを特徴とする固
定化ロドプシンの製造方法。 - 【請求項４】ロドプシンがタコロドプシンであることを
特徴とする請求項３記載の固定化ロドプシンの製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1003841A JPH0672160B2 (ja) | 1989-01-12 | 1989-01-12 | 固定化ロドプシン及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1003841A JPH0672160B2 (ja) | 1989-01-12 | 1989-01-12 | 固定化ロドプシン及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02186253A JPH02186253A (ja) | 1990-07-20 |
| JPH0672160B2 true JPH0672160B2 (ja) | 1994-09-14 |
Family
ID=11568409
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1003841A Expired - Lifetime JPH0672160B2 (ja) | 1989-01-12 | 1989-01-12 | 固定化ロドプシン及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0672160B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4224602C1 (de) * | 1992-07-23 | 1993-12-23 | Inst Bioprozess Analysenmesst | Anordnung für bioelektrische Anwendungen |
-
1989
- 1989-01-12 JP JP1003841A patent/JPH0672160B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02186253A (ja) | 1990-07-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |