JPH0672890B2 - 細胞膜蛋白質の検出法 - Google Patents

細胞膜蛋白質の検出法

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JPH0672890B2
JPH0672890B2 JP60174948A JP17494885A JPH0672890B2 JP H0672890 B2 JPH0672890 B2 JP H0672890B2 JP 60174948 A JP60174948 A JP 60174948A JP 17494885 A JP17494885 A JP 17494885A JP H0672890 B2 JPH0672890 B2 JP H0672890B2
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ベクトン・デイツキンソン・アンド・カンパニ−
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56927—Chlamydia

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に微生物の細胞蛋白質の検出に関する。特
に関心のあるものは、クラミジア・トラコマチス（Chla
mydia trachomatis）の主要外膜蛋白質である。この蛋
白質はクラミジア・トラコマチスのあらゆる血清型に共
通の抗原性を示すので、その検出は診断指標として有用
である。
イムノアツセイは微生物による感染を検出するために多
くの場合選ばれる方法である。特異的診断の補助とし
て、アツセイは特定の種の微生物を高度の信頼性をもつ
て同定できなければならない。このためには大部分の場
合、種特異性抗原を適宜な抗体との反応のために単離す
る必要がある。この種の分析に従う種類の微生物の代表
例はクラミジア・トラコマチスである。これはクラミジ
ア属（Chlamydiaceae）またはクラミジアレス属（Chlam
ydiales）の２種の微生物のうちの１つである。他方の
種はクラミジア・プシタツシ（Chlamydia psittasi）
である。クラミジアトラコマチス（約50株）はヒトの多
種の眼病および生殖器疾患の病因であり、これにはトラ
コーマ、封入体結膜炎、性病性リンパ肉芽腫、“非特異
性”または非淋菌性の尿道炎および直腸炎が含まれる。
クラミジア・トラコマチス感染は全集団に及ぶ。たとえ
ばクラミジア・トラコマチスは年間数百万病例の非淋菌
性尿道炎に関与していると推定される。
クラミジア・トラコマチスにより媒介される疾病は広範
にわたるので、適切な処置をとることができるために存
在する微生物に対する簡単なかつ費用のかからない試験
法が強く望まれており、かつきわめて重要である。現在
用いられている唯一の血清学的試験はミクロ免疫螢光試
験である。しかしこの試験はクラミジア・トラコマチス
の菌株を血清学的試験用抗原として用いることを必要と
する。さらにこの試験を行う設備は世界中で限られた数
の研究室にあるにすぎない。この試験はきわめて労力を
要し、時間がかかり、かつ実施するのが困難である。
最近、米国特許第4,118,469号明細書に性病性リンパ肉
芽腫および非淋菌性尿道炎の血清学的試験に有用なクラ
ミジア・トラコマチスの抗原の調製法が記述された。こ
の抗原はクラミジア・トラコマチス生体から、アガロー
スゲルカラムに共有結合した特異的リガンドとして単一
特異性抗血清を用いる免疫吸着クロマトグラフイーによ
り精製された。この抗原はわずか約160,000ダルトンの
分子量をもち、向流免疫電気泳動試験において性病性リ
ンパ肉芽腫患者の血清から抗体を検出することができ
た。しかし非淋菌性尿道炎患者の血清を用いる同様な試
験に使用した場合、この抗原は抗体を検出することがで
きなかつた。しかし抗体を二次元免疫電気泳動試験によ
り検出する際にはこれは有効であつた。
しかしいずれにしろ、感染を好ましくは一般的に行われ
ている抗原−抗体アツセイ法により感染を検出できる、
微生物たとえばクラミジア・トラコマチスの種特異性抗
原の単離にはなお医学上大きな関心がもたれている。従
つて本発明の目的は、これらの種特異性抗原を単離する
ための改良法を提供することである。
本発明は細胞蛋白質を検出するための診断試験法に関す
る。本発明をクラミジア・トラコマチスに関して詳述す
るが、本発明は微生物一般の細胞膜蛋白質に同等に適用
されると解すべきである。
多くの微生物において細胞膜蛋白質は種特異性抗原であ
る。すなわちすべての血清型の微生物に由来する抗体に
対して試験した場合、この蛋白質は種特異性をもつて反
応する。このようにこの蛋白質はあらゆる血清型の微生
物に共通の特殊な蛋白質であり、抗原としてこれらの血
清型をすべて同定するための基礎を与える。
細胞膜蛋白質を微生物から放出させるための本発明方法
には下記の工程が含まれる。特定の微生物を含有する疑
いのある被験試料を採取し、試料をpH約6.0〜約8.0の第
１緩衝液と混合し、これにより試料溶液を調製し、試料
のpHを塩基溶液により約8.0〜約12.5の値に調整し、試
料を約20〜約105℃の温度で約５〜約30分間インキュベ
ートし、pH約1.0〜7.0の中和用第２緩衝液を添加して試
料のpHを約7.0〜約8.0の最終値となし、そして試料をア
ッセイして抗原の存在を検出する。本願発明者は、鋭意
研究の結果、このような各条件の下で処理を行うことに
よって、微生物から細胞膜蛋白質をその抗原活性を損な
うことなく分離抽出してイムノアッセイによって分析す
ることができることを見出し、本発明を完成するに至っ
たものである。
本発明の特定の実施態様においては、クラミジア・トラ
コマチスから主要外膜蛋白質を放出させる試験に下記の
工程が含まれる。頚管または尿道の試験スワブなどの試
料を採取し、試料をpH約7.0のシユクロースホスフエー
トからなる第１緩衝液に入れ、スワブを緩衝液と混合し
て試料溶液を調製し、試料溶液に約0.4Mの水酸化ナトリ
ウム溶液を一定量添加し、これにより試料溶液のpHを約
11.0〜約11.8に高め、試料溶液の温度を約100℃に高
め、試料溶液を約15分間インキユベート、試料溶液を約
20〜約30℃の温度に冷却し、冷却した試料溶液のpHをpH
約6.1の中和用ホスフエート緩衝液により約7.2〜約7.8
に低下させ、そして試料をアツセイして抗原の存在を検
出させる。
目的とする多種の微生物の細胞膜蛋白質はこれらの微生
物のあらゆる血清型に対する種特異性抗原である。この
種の蛋白質の１つはクラミジア・トラコマチスの主要外
膜蛋白質である。この蛋白質はクラミジア・トラコマチ
スの随伴する外膜蛋白質全体の約60％からなり、サブユ
ニツト分子量約30,000〜約44,000ダルトン、平均分子量
約39,500ダルトンの大きさをもつ。以下呼びやすくする
ためにこの主要外膜蛋白質群をMP39.5と呼ぶ。これは
“平均サブユニツト分子量39,500ダルトンの主要外膜蛋
白質”を表わす。
細胞膜蛋白質が検出されたことは、ある個体がその微生
物に感染していることを示す。有効に検出するために
は、その蛋白質が微生物細胞の感染粒子内から放出さ
れ、および／または露出する必要がある。これが行われ
ると、検出は各種のアツセイにより、たとえばラジオイ
ムノアツセイ（RIA）、酵素結合イムノソルベントアツ
セイELISA）などにより達成できる。
本発明方法によれば、微生物の潜在が疑われる試料また
は検体を採取し、この試料をアルカリ溶液および場合に
より熱で処理することを伴う、微生物細胞内の感染粒子
の処理法が開示される。
本発明者は、細胞をアルカリ溶液で処理することにより
細胞膜蛋白質が放出され、および／または露出すること
を見出し、本発明者はさらに、この処理法に熱を加える
ことにより、蛋白質の放出および／または露出の効率が
高められることを見出した。継いで各種のアツセイを行
つて、処理細胞を含有する試料中に蛋白質が存在するこ
とを検出することができる。
本発明による一般的操作は下記のとおりである。
すなわち被験資料をまずpH約6.0〜約8.0の緩衝塩溶液と
混合する。適切な緩衝剤には糖ホスフエート緩衝剤たと
えばシユクロースホスフエート、その他当技術分野で既
知の糖含有緩衝剤が含まれる。望ましくは緩衝液のpHは
約6.8〜約7.2である。
試料および緩衝塩溶液を十分に混和したのち、一定量の
アルカリ溶液を試料に添加してpHを約8.0〜約12.5に高
める。望ましくはpHは約10.0〜約12.0であり、約11.0〜
約11.8が好ましい。適切なアルカリ溶液には水酸化ナト
リウム、水酸化カリウム、リン酸三ナトリウムおよびト
リ（ヒドロキシメチル）アミノメタンの溶液が含まれ、
水酸化ナトリウムが好ましい。
pHが希望する水準に調整されると、試料を約５〜約30分
間インキユベートする。インキユベーシヨンは室温（20
℃）で、または約105℃までの高められた温度で行うこ
とができる。望ましくは試料の温度を約90〜約100℃に
高める。約100℃が好ましい。インキユベーシヨンに際
して高められた温度を採用すると細胞膜蛋白質が放出さ
れ、および／または露出する効率が高まることが認めら
れた。インキユベーシヨン期間後に、試料を加熱した場
合にはこれを約０〜約40℃の温度に冷却する。約25℃が
好ましい。冷却は好ましくは氷浴中に浸漬することによ
り行う。
試料を冷却したのち、pH約1.0〜約7.0の中和用第２緩衝
液を添加して試料のpHを約7.0〜約8.0の最終値にする。
アツセイするための最適条件は一般にこのpH値、すなわ
ち中性ないしわずかにアルカリ性で得られる。好ましく
は溶液は約7.2〜約7.8の最終pHをもつ。適切な中和用緩
衝液には各種のホスフエート緩衝液（PBS）が含まれ、
シユクロースホスフエートが好ましい。他の適切な緩衝
液にはクエン酸、塩酸、および塩酸トリ（ヒドロキシメ
チル）アミノメタンが含まれる。このpH調整後に試料は
それ以上調整することなくアツセイすることができる。
先きの記述から明らかなように、各種の緩衝塩、pHを高
めるためのアルカリ溶液、および中和用緩衝液、ならび
に広範なインキユベーシヨン時間および温度を本発明方
法に用いることができる。実際の反応成分および条件は
MP39.5その他の蛋白質を放出させる方法を、目的とする
特定の検出アツセイ、たとえば酵素イムノアツセイ（EI
A）、ラジオイムノアツセイ（RIA）、ラテツクスイムノ
アツセイなどと結びつけるように選ぶことができる。一
般に既知のイムノアツセイ法のいずれの型をも用いるこ
とができる。
たとえばMP39.5抗原に対する単一特異性抗体は実験動
物、たとえばマウスまたはウサギを用いた適切な接種操
作により産生させることができる。動物により産生され
た抗体は他の哺乳動物におけるクラミジア属菌感染のア
ツセイに用いることができる。これらのアツセイは感染
した被験者における細胞性抗原の存在をアツセイするた
めの周知の方法により行うことができる。MP39.5抗原接
種した実験動物からの単一特異性抗体の供給が確立され
ると、クラミジア属菌感染の潜在が疑われる検体を用い
る直接または間接アツセイ操作を行うことができる。
直接アツセイ操作においては、膜蛋白質に対する単一特
異性抗体を固相支持体系に共有結合または非共有結合に
より付着させることができる。これらの方法に一般的な
ように、支持体系はガラス、プラスチツクなどであつて
よい。
特定の膜蛋白質に対する単一特異性抗体が付着した固相
支持体を先きに概説した方法で調製された検体と共にイ
ンキユベートする。次いで、あらかじめ既知の方法によ
り放射性標識されたまたは酵素と結合した、膜蛋白質抗
原に対する単一特異性抗体を次いで支持体系に対して平
衡化する。検体中に存在しており、支持体系上の抗体に
結合していた抗原は今度は放射性標識された、または酵
素に結合した抗体と結合するであろう。
放射性標識された抗体を用いる場合、次いで試料中の残
存放射能の量を測定する。この値を膜蛋白質抗原不含で
あると判定されている検体と比較する。酵素と結合した
抗体を用いる場合、その酵素に対し特異的な置換体を固
体支持体反応混合物に添加し、生じた色の変化を吸光分
光分析により記録する。この色の変化を蛋白質抗原不含
であることがわかつている試料と比較する。この方法で
検体中の抗原の存在を直接にアツセイすることができ
る。
あるいは間接アツセイ法を用いることもできる。詳細に
は、抗原を適切な固相支持体系に共有結合または非共有
結合により結合させることができる。先きに概説した方
法で調製した検体を、既知量の放射性標識されたまたは
酵素と結合した、膜蛋白質に対する抗体（あらかじめ実
験動物源から確保したもの）と混合する。次いで検体抽
出液−抗体混合物を固体支持体系およびその結合抗原と
共にインキユベートする。
固体支持体系の放射能を測定するか、または結合系にお
ける発色を測定し、標準として同様に処理され、目的と
する抗原を含有しない検体と比較する。
微生物を含有する疑いのある臨床試料が放射性標識され
たまたは酵素と結合した抗体の固体支持体への結合を抑
制する能力は、臨床検体中に膜蛋白質抗原が存在するこ
と、または存在しないことを明らかにする。何らかの抑
制が証明された場合、感染を示す。他の適切なアツセイ
法および変法はこの種のアツセイ技術の分野における専
門家には明らかであろう。
下記の実施例はクラミジア・トラコマチスMP39.5の検出
に適用した本発明を示す。上記の方法をほとんどまたは
全く変更することなく、各種微生物中の他の種類の細胞
蛋白質の検出に用いることができる。
実施例 100例の臨床スワブを採取し、クラミジア属菌の存在を
調べた。試薬配合物は下記のとおり調製された。
A.水酸化ナトリウム（0.42M）溶液 50％（12.5M）NaOH 34ml 適量を加えて1.0にする。
B.中和用緩衝液 蒸留水900mlに下記のものを添加する。
NaH2PO4・H2O 13.8g NaOHでpHを6.10±0.05に調整。
BSA 2.0g NaN3 1.0g C.標準希釈液 蒸留水800mlに下記のものを添加する。
NaH2PO4・H2O 6.90g BSA 1.000g NaN3 0.50g シヨ糖 34.25g K2HPO4 1.044g KH2PO4 0.544g 熱処理したウシ胎仔血清 25.0ml ストレプトマイシン 25mg バンコマイシン 50mg ナイスタチン 12,500単位 0.42M・NaOHによりpHを7.45±0.05に調整。
適量を加えて1.0にする。
0.22μｍのフイルターで過。
D.酵素結合体用緩衝液 蒸留水600mlに下記のものを添加する。
KH2PO4 0.532g K2HPO4 2.80g チメロサール 0.20g 熱処理したウシ胎仔血清 250.ml pHを7.4±0.1に調整。
適量を加えて1.0にする。
0.22μｍのフイルターで過。
E.穴洗浄用緩衝液 蒸留水900mlに下記のものを添加する。
KH2PO4 0.532g K2HPO4 2.800g BSA 1.000g pHを7.4±0.1に調整。
蒸留水を適量加えて1.0にする。
F.基質用緩衝液 蒸留水900mlに下記のものを添加する。
酢酸ナトリウム（無水） 8.203g 1Mクエン酸でpHを6.0±0.1に調整。
蒸留水を適量加えて１にする。
G.テトラメチルベンジジン（TMB）基質 ジメチルスルホキシド（DMSO）（スペクトル用、凝固点
18℃）900mlに下記のものを添加する。
3,3′,5,5′‐テトラメチルベンジジン 10.0g DMSOを適量添加して1.0にする。
室温に保存。
H.0.5M過酸化水素溶液 安定化した３％H2O2・500mlに蒸留水500mlを添加して混
合する。
I.停止液−2M硫酸 蒸留水800mlに下記のものを添加する。
濃硫酸111ml（慎重に）室温に冷却。
蒸留水を適量添加して1.0にする。
J.2SP輸送用媒質 蒸留水900mlに下記のものを添加する。
シヨ糖 68.5g K2HPO4 2.088g KH2PO4 1.088g 加熱処理したウシ胎仔血清 50ml ストレプトマイシン 50mg バンコマイシン 100mg ナイスタチン 25,000単位 pHを7.0に調整し、適量を加えて1.0にする。
無菌0.22μｍのフイルターで過。
試料の処理 試料（ダクロンスワブ）を綿のすぐ上で切断し、直接に
10×75mmのガラス製試験管に入れた。ブランクとして未
使用スワブを用いた２本の試験管も用意した。2SP輸送
用媒地を各試験管に添加し、混合物を10〜20秒間激しく
磁気撹拌したのち、0.42M・NaOH50μｌを各試験管に添
加した。次いで混合物を10〜20秒間激しく磁気撹拌した
のち100℃（±２℃）で15分間インキユベートした。次
いで試験管を氷浴に入れて約25℃にまで冷却し、次いで
中和用緩衝液500μｌを添加した。次いで混合物を10〜2
0秒間激しく磁気撹拌した。こうして試料はアツセイで
きる状態になつた。
アツセイのプロトコール−酵素結合イムノソルベントア
ツセイ（ELISA） 抗体を塗布したプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄し、
水切りした。標準、対照、ブランク、または処理済試料
100μｌを対応する２個ずつの穴に入れたのち混合し
た。対照はクラミジア基本小体を含有することがわかつ
ており、前記に従つて処理された試料スワブであつた。
基本小体を含有することがわかつている第２組の対照を
中和用緩衝液500μｌおよびNaOH50μｌで処理した。こ
の組の対照は処理しなかつた。これらのプレートを次い
でプレートシーラー（スズ箔）で覆い、周囲温度で一夜
インキユベートした。次いで穴の内容物を捨て、プレー
トを再度上記に従つて洗浄した。酵素結合体100μｌを
各穴に添加したのち混合し、プレートシーラーで覆つ
た。次いでプレートを37℃で２〜３時間インキユベート
した。再び穴の内容物を捨て、プレートを前記に従つて
洗浄したのち、作業用TMB基質溶液200μｌを添加した。
作業溶液は下記の組成を有していた。
基質緩衝液 10.0ml TMB基質原液 100μｌ 0.5M・H2O 30μｌ 溶液を十分に混合する。
混合物を時々混和しながら周囲温度で30分間インキユベ
ートした。次いで2M・H2SO450μｌの添加により反応を
停止した。基質200μｌおよび2M・H2SO450μｌを一連の
穴に450nmのフイルターを用いて添加することにより調
製した基質ブランクに対してプレートを読み取つた。
計算および結果の解釈 ブランクスワブの吸光度は0.0ng/mlの標準液に相当する
はずである。標準液の穴、対照および試料の吸光度をそ
れぞれ平均した。0.0ng/mlの平均吸光度をすべての標準
液の平均吸光度から差し引いた。ブランクの平均吸光度
をすべての試料および対照の平均吸光度から差し引い
た。次いで各標準液の補正済平均吸光度を濃度（ng/m
l）に対してプロツトし、プロツトした曲線から回収率
を判定した。回収率の値0.5ng/mlを陽性とみなした。
陽性の試料すべてにつき、上記のプロツトコールおよび
下記の確認アツセイの双方により反復試験した。
陽性の試料に関する確認アツセイのプロトコールELISA
の各穴に塗布したものと同一のクラミジア抗体を用い
て、標準緩衝液希釈液中に1mg/mlを含有する溶液を調製
した。10×75mmの試験管を、処理すべき消化した陽性の
試料および対照各250μｌの添加により標識した。抗体
溶液５μｌをすべての試験管に添加し、次いでこれを磁
気撹拌により十分に混合し、５分間放置した。対応する
２個ずつの穴に抗体処理した試料100μｌを添加した。
消化した試料の一定部分からなる各２個の穴も設けた
（抗体で処理していないもの）。次いで上記に従つてア
ツセイを行つた。
確認試験により得た結果の解釈 陽性の結果は、抗体で処理しなかつた試料を含む穴にお
けるMP39.5回収率0.5ng/ml、および抗体処理した試料
における回収率の有意の低下（抑制率＞70％）を伴う試
料に対し与えられた。最初にアツセイされた時点では陽
性または擬陽性とアツセイされ、確認試験で陰性となつ
た試料は陰性とみなした。これは反復試験において0.
5ng/mlが回収されたことにより（抗体で処理しなかつた
一定部分）または抗体で処理した一定部分が有意の回収
率低下を示さなかつた場合に生じた。
結 果 処理した100個の試料のうち62個は陰性、38個は陽性で
あつた。陽性の結果の確認は抑制アツセイにより行つ
た。対照における基本小体（EB）を処理群と未処理群に
分けて、MP39.5放出の効率を判定した。処理したEBにつ
いては450nmにおける平均吸光度は0.611であり、一方未
処理EBは450nmで0.018の吸光度を与えた。

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】特定の微生物を含有する疑いのある被験試
    料を採取し； 試料をpH6.0〜8.0の第１緩衝液と混合し、これにより試
    料溶液を調製し； 試料のpHを塩基溶液により8.0〜12.5の値に調整し； 試料を、20〜105℃の温度で５〜30分間インキュベート
    し； pH1.0〜7.0の中和用第２緩衝液を添加して、試料のpHを
    7.0〜8.0の最終値となし；そして 試料をアッセイして抗原の存在を検出する； 工程を含むことを特徴とする微生物の細胞膜蛋白質の検
    出法。
  2. 【請求項２】第１緩衝液が糖含有緩衝剤の溶液よりなる
    群から選ばれる特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】塩基が水酸化ナトリウム、KOH、リン酸三
    ナトリウム及びトリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン
    よりなる群から選ばれる特許請求の範囲第２項に記載の
    方法。
  4. 【請求項４】試料のpHを調整したのち試料溶液を20〜10
    5℃の温度に加熱し、試料をこの温度でインキュベート
    し、そして試料溶液をインキュベーション後に０〜40℃
    に冷却する工程を更に含む特許請求の範囲第３項に記載
    の方法。
  5. 【請求項５】第１緩衝液がシュクロースホスフェートで
    ある特許請求の範囲第４項に記載の方法。
  6. 【請求項６】試料を90〜100℃の温度に加熱する特許請
    求の範囲第５項に記載の方法。
  7. 【請求項７】中和用第２緩衝液がpH1.0〜7.0のホスフェ
    ート、クエン酸、塩酸及び塩酸トリ（ヒドロキシメチ
    ル）アミノメタンの溶液よりなる群から選ばれる特許請
    求の範囲第６項に記載の方法。
  8. 【請求項８】試料の最終pHが7.2〜7.8である特許請求の
    範囲第７項に記載の方法。
  9. 【請求項９】試料を第１緩衝液と混合したのち試料のpH
    を11.0〜11.8に調整する特許請求の範囲第８項に記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】塩基が水酸化ナトリウムである特許請求
    の範囲第９項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】試料溶液を90〜100℃の温度に加熱する
    特許請求の範囲第10項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】クラミジア・トラコマチス（Chlamydia
    trachomatis）の主要外膜蛋白質を検出するために用
    いられる特許請求の範囲第11項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】試料を加熱したのちに25℃に冷却する特
    許請求の範囲第12項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】中和用第２緩衝液がシュクロースホスフ
    ェートである特許請求の範囲第13項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】アッセイがラジオイムノアッセイである
    特許請求の範囲第14項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】アッセイが酵素結合免疫吸着アッセイで
    ある特許請求の範囲第14項に記載の方法。
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