JPH0673455B2 - プロキモシンの製造方法 - Google Patents
プロキモシンの製造方法Info
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- JPH0673455B2 JPH0673455B2 JP30063292A JP30063292A JPH0673455B2 JP H0673455 B2 JPH0673455 B2 JP H0673455B2 JP 30063292 A JP30063292 A JP 30063292A JP 30063292 A JP30063292 A JP 30063292A JP H0673455 B2 JPH0673455 B2 JP H0673455B2
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- JP
- Japan
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- prochymosin
- coli
- plasmid
- sequence
- dna
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Description
【０００１】本発明はプロキモシン遺伝子を発現させる
発現型組換えプラスミドによる形質転換微生物を用いる
プロキモシンの製造方法に関する。より詳しくは、仔牛
プロキモシンｃＤＮＡの全配列を有し、Ｅ．ｃｏｌｉ
ｔｒｐプロモーターの制御下に大腸菌宿主細胞内でプロ
キモシンｃＤＮＡ全長を効率よく発現可能な新規な発現
型組換えプラスミドを大腸菌宿主微生物に形質転換によ
り導入し、得られる形質転換株を培養することにより、
プロキモシンを製造する方法に関する。
発現型組換えプラスミドによる形質転換微生物を用いる
プロキモシンの製造方法に関する。より詳しくは、仔牛
プロキモシンｃＤＮＡの全配列を有し、Ｅ．ｃｏｌｉ
ｔｒｐプロモーターの制御下に大腸菌宿主細胞内でプロ
キモシンｃＤＮＡ全長を効率よく発現可能な新規な発現
型組換えプラスミドを大腸菌宿主微生物に形質転換によ
り導入し、得られる形質転換株を培養することにより、
プロキモシンを製造する方法に関する。
【０００２】プロキモシンは仔牛第４胃から得られチー
ズ製造の際に牛乳を凝固させるのに用いられる一種のプ
ロテアーゼであるキモシンの前駆体蛋白質である。プロ
キモシンは分子量４万、アミノ酸残基数３６５よりな
り、そのＮ末端４２個のアミノ酸よりなるペプチドが自
己消化により切断されてキモシンを生成する。最近では
微生物起源の凝乳酵素が見い出されて、キモシンに代替
しつつあるが、チーズ工業における仔牛キモシンに対す
る潜在的需要は依然として大きい。従って、仔牛キモシ
ンを組換えＤＮＡ技術を用いて微生物に生産させること
は遺伝子工学の実用面での目標のひとつと考えられてい
る。
ズ製造の際に牛乳を凝固させるのに用いられる一種のプ
ロテアーゼであるキモシンの前駆体蛋白質である。プロ
キモシンは分子量４万、アミノ酸残基数３６５よりな
り、そのＮ末端４２個のアミノ酸よりなるペプチドが自
己消化により切断されてキモシンを生成する。最近では
微生物起源の凝乳酵素が見い出されて、キモシンに代替
しつつあるが、チーズ工業における仔牛キモシンに対す
る潜在的需要は依然として大きい。従って、仔牛キモシ
ンを組換えＤＮＡ技術を用いて微生物に生産させること
は遺伝子工学の実用面での目標のひとつと考えられてい
る。
【０００３】本発明の主たる目的は宿主細胞中でＥ．ｃ
ｏｌｉ ｔｒｐプロモーターの制御下に高い発現率でプ
ロキモシンｃＤＮＡ全長の発現を可能にさせる新規な発
現プラスミドで宿主を形質転換し、形質転換株を培養す
ることによりプロキモシンを生産する方法を提供するこ
とである。
ｏｌｉ ｔｒｐプロモーターの制御下に高い発現率でプ
ロキモシンｃＤＮＡ全長の発現を可能にさせる新規な発
現プラスミドで宿主を形質転換し、形質転換株を培養す
ることによりプロキモシンを生産する方法を提供するこ
とである。
【０００４】組換えＤＮＡ操作を用いて、プロキモシン
ｃＤＮＡを大腸菌宿主細胞中で形質発現させ、プロキモ
シンを生産させる方法は既に公知である。例えば、西森
ら、Ｇｅｎｅ，１９、３３７（１９８２）、特開昭５８
−３２８９６号（別府輝彦）、特開昭５７−１４１２８
７号（コラボラテイブ・リサーチ）はＥ．ｃｏｌｉｌａ
ｃオペロンプロモーター制御下、プロキモシンが産生さ
れることを開示している。一方、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐ
プロモーター制御下でも同様に、プロキモシンが産生さ
れることが、特開昭５８−９６８７号（セルテック・リ
ミテッド）清水ら、農芸化学会講演要旨集２Ａ−１９
（１９８２）、特開昭５８−３８４３９号（別府輝彦）
に記載されている。特に、上記清水らの文献にはプロキ
モシンの全構造遺伝子がクローン化されて、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ｔｒｐプロモーターの制御下、大腸菌宿主細胞内で
発現するプラスミドｐＣＲ７０１が開示されている。こ
のプラスミドは全長約５．３ＫｂでプロキモシンのｃＤ
ＮＡの全長がｔｒｐプロモーターの下流ｔｒｐ Ｌ遺伝
子のリポゾーム結合位に挿入されている。図１にｐＣＲ
７０１の制限酵素地図を示す。ＳＤ配列とＡＴＧ開始コ
ドンの間には次の１４塩基が存在する。
ｃＤＮＡを大腸菌宿主細胞中で形質発現させ、プロキモ
シンを生産させる方法は既に公知である。例えば、西森
ら、Ｇｅｎｅ，１９、３３７（１９８２）、特開昭５８
−３２８９６号（別府輝彦）、特開昭５７−１４１２８
７号（コラボラテイブ・リサーチ）はＥ．ｃｏｌｉｌａ
ｃオペロンプロモーター制御下、プロキモシンが産生さ
れることを開示している。一方、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐ
プロモーター制御下でも同様に、プロキモシンが産生さ
れることが、特開昭５８−９６８７号（セルテック・リ
ミテッド）清水ら、農芸化学会講演要旨集２Ａ−１９
（１９８２）、特開昭５８−３８４３９号（別府輝彦）
に記載されている。特に、上記清水らの文献にはプロキ
モシンの全構造遺伝子がクローン化されて、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ｔｒｐプロモーターの制御下、大腸菌宿主細胞内で
発現するプラスミドｐＣＲ７０１が開示されている。こ
のプラスミドは全長約５．３ＫｂでプロキモシンのｃＤ
ＮＡの全長がｔｒｐプロモーターの下流ｔｒｐ Ｌ遺伝
子のリポゾーム結合位に挿入されている。図１にｐＣＲ
７０１の制限酵素地図を示す。ＳＤ配列とＡＴＧ開始コ
ドンの間には次の１４塩基が存在する。
【０００５】 ５′−ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＴ−３′ ＳＤ Ｍｅｔ Ａｌａ プロキモシン このプラスミドで形質転換した大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｃ６００ｒk−ｍk−ＣＰＣＲ７０１）は微工研に寄託さ
れている（受託番号ＦＥＲＭＢＰ２６４）。しかしなが
ら前述の西森らの文献中に記載されているように、ｐＣ
Ｒ７０１の発現率は他の公知のプラスミドｐＣＲ５０
１、ｐＣＲ６０１と比較して非常に低い。プロキモシン
蛋白の生産量は競合結合ラジオイムノアツセイ法（Ｃｏ
ｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｄｉｏｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ）の測定によると宿主細胞あたり約
７００分子であり、免疫ブロッテング法の測定によると
細胞あたり約１２，０００分子であった。
Ｃ６００ｒk−ｍk−ＣＰＣＲ７０１）は微工研に寄託さ
れている（受託番号ＦＥＲＭＢＰ２６４）。しかしなが
ら前述の西森らの文献中に記載されているように、ｐＣ
Ｒ７０１の発現率は他の公知のプラスミドｐＣＲ５０
１、ｐＣＲ６０１と比較して非常に低い。プロキモシン
蛋白の生産量は競合結合ラジオイムノアツセイ法（Ｃｏ
ｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｄｉｏｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ）の測定によると宿主細胞あたり約
７００分子であり、免疫ブロッテング法の測定によると
細胞あたり約１２，０００分子であった。
【０００６】本発明によれば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプ
ロモーター、オペレーター系とプロキモシンｃＤＮＡ全
配列から成り、大腸菌宿主細胞内でｔｒｐプロモーター
制御下、プロキモシンｃＤＮＡ全長を発現可能な発現型
組換えプラスミドであって、該ｃＤＮＡのＮ末端にＡＴ
Ｇ開始コドンが接続されそして該プロモーター領域内の
ＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンとの間の塩基対が高発現率
を与えるように構成されていることを特徴とするプラス
ミドが提供される。
ロモーター、オペレーター系とプロキモシンｃＤＮＡ全
配列から成り、大腸菌宿主細胞内でｔｒｐプロモーター
制御下、プロキモシンｃＤＮＡ全長を発現可能な発現型
組換えプラスミドであって、該ｃＤＮＡのＮ末端にＡＴ
Ｇ開始コドンが接続されそして該プロモーター領域内の
ＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンとの間の塩基対が高発現率
を与えるように構成されていることを特徴とするプラス
ミドが提供される。
【０００７】本発明によればまた、プラスミドｐＣＲ７
０１のＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンとの間を制限酵素に
よって切断し、再連結することにより該ＳＤ配列とＡＴ
Ｇ開始コドンとの間の塩基対のたとえば種類及び／又は
数の如き構成を変化させ、より発現率の高い新規のプラ
スミドを得る方法が提供される。
０１のＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンとの間を制限酵素に
よって切断し、再連結することにより該ＳＤ配列とＡＴ
Ｇ開始コドンとの間の塩基対のたとえば種類及び／又は
数の如き構成を変化させ、より発現率の高い新規のプラ
スミドを得る方法が提供される。
【０００８】前述の方法において、制限酵素による切断
後、一本鎖構造部分を修復して切断末端を再連結し、Ｓ
Ｄ配列とＡＴＧ開始コドンとの間の距離をのばすこと
も、逆に一本鎖構造部分を除去して切断末端を再連結
し、ＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンとの間の距離を縮める
ことも可能であるが、好ましくは後者の手法（距離を縮
める）が用いられる。
後、一本鎖構造部分を修復して切断末端を再連結し、Ｓ
Ｄ配列とＡＴＧ開始コドンとの間の距離をのばすこと
も、逆に一本鎖構造部分を除去して切断末端を再連結
し、ＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンとの間の距離を縮める
ことも可能であるが、好ましくは後者の手法（距離を縮
める）が用いられる。
【０００９】本発明は、かくして得られる発現効率の高
い発現プラスミドを宿主細胞に形質転換法により導入
し、形質転換細胞を培養することからなるプロキモシン
の生産方法を提供するものである。
い発現プラスミドを宿主細胞に形質転換法により導入
し、形質転換細胞を培養することからなるプロキモシン
の生産方法を提供するものである。
【００１０】本発明において、用いられる宿主微生物
は、本発明の発現プラスミドを受容し、宿主細胞が増殖
して、プロキモシンを産生するものなら、特定の菌株に
限定されないが、実用的な理由から大腸菌Ｃ６００由来
株の利用が好ましい。特に好ましくは、大腸菌Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｃ６００ｒk−ｍk−株が用いられる。本発明の方
法で生産されるプロキモシンは全てＮ末端にメチオニル
が付着したメチオニルプロキモシンであるが明細書中単
にプロキモシンと称する。
は、本発明の発現プラスミドを受容し、宿主細胞が増殖
して、プロキモシンを産生するものなら、特定の菌株に
限定されないが、実用的な理由から大腸菌Ｃ６００由来
株の利用が好ましい。特に好ましくは、大腸菌Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｃ６００ｒk−ｍk−株が用いられる。本発明の方
法で生産されるプロキモシンは全てＮ末端にメチオニル
が付着したメチオニルプロキモシンであるが明細書中単
にプロキモシンと称する。
【００１１】以下に好適な実施態様を例にして本発明を
より詳しく説明する。
より詳しく説明する。
【００１２】プラスミドｐＣＲ７１１ プラスミドｐＣＲ７０１をまず、制限酵素Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩで切断する。一本鎖構造部分を有する両末端をＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて修復する。修復された平滑末端
をＴ4 ＤＮＡリガーゼで連結する。これらの操作で、
ＳＤ配列−ＡＴＧ開始コドン間の距離は４塩基対増加し
て、１８塩基対となる。得られた新プラスミドｐＣＲ７
１１はＳＤ−ＡＴＧ間の塩基配列以外ｐＣＲ７０１と全
く同一である。ＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンとの間のＤ
ＮＡ配列はＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法で解析すると
以下の通りである。
ＩＩで切断する。一本鎖構造部分を有する両末端をＤＮ
Ａポリメラーゼを用いて修復する。修復された平滑末端
をＴ4 ＤＮＡリガーゼで連結する。これらの操作で、
ＳＤ配列−ＡＴＧ開始コドン間の距離は４塩基対増加し
て、１８塩基対となる。得られた新プラスミドｐＣＲ７
１１はＳＤ−ＡＴＧ間の塩基配列以外ｐＣＲ７０１と全
く同一である。ＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンとの間のＤ
ＮＡ配列はＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法で解析すると
以下の通りである。
【００１３】 ５′−ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＧ−３′ ＳＤ Ｍｅｔ ｐＣＲ７０１からｐＣＲ７１１を構成する模様を図２に
示す。ｐＣＲ７１１で形質転換した宿主細胞Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｃ６００ｒk−ｍk−の内、アンピシリン耐性株を選
択すると、これらの株はプラスミドｐＣＲ７１１を保有
し、ｔｒｐプロモーターの制御下でプロキモシンを産生
する。
示す。ｐＣＲ７１１で形質転換した宿主細胞Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｃ６００ｒk−ｍk−の内、アンピシリン耐性株を選
択すると、これらの株はプラスミドｐＣＲ７１１を保有
し、ｔｒｐプロモーターの制御下でプロキモシンを産生
する。
【００１４】プラスミドｐＣＲ７１２及びｐＣＲ７１３ プラスミドｐＣＲ７０１を前記と同様にＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉで切断する。得られた一本鎖構造部位を有する末端を
ヌクレアーゼ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）Ｓ１で除去する。続
いて平滑末端をＴ4 ＤＮＡリガーゼで再連結する。こ
の際切断条件の差違（主に、緩衝液の組成の違い）によ
りＳＤ配列−ＡＴＧコドン間の長さの異なっているプラ
スミドｐＣＲ７１２又はｐＣＲ７１３が別個に生成す
る。両プラスミド共ＳＤ配列−ＡＴＧコドン間の塩基配
列以外はｐＣＲ７０１と全く同一である。新プラスミド
ｐＣＲ７１２の該塩基配列をＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒ
ｔ法で解析すると次の通りである。
Ｉで切断する。得られた一本鎖構造部位を有する末端を
ヌクレアーゼ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）Ｓ１で除去する。続
いて平滑末端をＴ4 ＤＮＡリガーゼで再連結する。こ
の際切断条件の差違（主に、緩衝液の組成の違い）によ
りＳＤ配列−ＡＴＧコドン間の長さの異なっているプラ
スミドｐＣＲ７１２又はｐＣＲ７１３が別個に生成す
る。両プラスミド共ＳＤ配列−ＡＴＧコドン間の塩基配
列以外はｐＣＲ７０１と全く同一である。新プラスミド
ｐＣＲ７１２の該塩基配列をＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒ
ｔ法で解析すると次の通りである。
【００１５】 又、新プラスミドｐＣＲ７１３の該塩基配列をＭａｘａ
ｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法で解析すると次の通りである。
ｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法で解析すると次の通りである。
【００１６】 ｐＣＲ７０１からｐＣＲ７１２又はｐＣＲ７１３を構成
する模様を図２に示す。ｐＣＲ７１２で形質転換した宿
主細胞Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００ｒk−ｍk−の内アンピシ
リン耐性株を選択する。これらの株はプラスミドｐＣＲ
７１２を保有し、ｔｒｐプロモーターの制御下でプロキ
モシンを産生する。同様に、ｐＣＲ７１３を保有する形
質転換株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００ｒk−ｍk−（ｐＣＲ７
１３）もプロキモシンを産出する。
する模様を図２に示す。ｐＣＲ７１２で形質転換した宿
主細胞Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００ｒk−ｍk−の内アンピシ
リン耐性株を選択する。これらの株はプラスミドｐＣＲ
７１２を保有し、ｔｒｐプロモーターの制御下でプロキ
モシンを産生する。同様に、ｐＣＲ７１３を保有する形
質転換株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００ｒk−ｍk−（ｐＣＲ７
１３）もプロキモシンを産出する。
【００１７】プラスミドｐＣＲ７１４ プラスミドｐＣＲ７１２を制限酵素ｃｌａ Ｉで切断
し、ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰの存在下、ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて斯くて切断された一本鎖構造部分を部分的に修
復し、例えば、ＣＧ部位のみを修復し、突出した末端を
有するままＴ4ＤＮＡリガーゼで再連結するとプラスミ
ドｐＣＲ７１４が得られる。これら一連の操作で、ｐＣ
Ｒ７１２のＳＤ−ＡＴＧコドン間の塩基数が２減少して
６塩基対となる。この部位以外はｐＣＲ７１２と全く同
一である。ｐＣＲ７１４のＳＤ配列とＡＴＧコドンとの
間の塩基配列はＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法で解析す
ると次の通りである。
し、ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰの存在下、ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて斯くて切断された一本鎖構造部分を部分的に修
復し、例えば、ＣＧ部位のみを修復し、突出した末端を
有するままＴ4ＤＮＡリガーゼで再連結するとプラスミ
ドｐＣＲ７１４が得られる。これら一連の操作で、ｐＣ
Ｒ７１２のＳＤ−ＡＴＧコドン間の塩基数が２減少して
６塩基対となる。この部位以外はｐＣＲ７１２と全く同
一である。ｐＣＲ７１４のＳＤ配列とＡＴＧコドンとの
間の塩基配列はＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法で解析す
ると次の通りである。
【００１８】 ｐＣＲ７１２からｐＣＲ７１４を構成する模様を図２に
示す。ｐＣＲ７１４で形質転換した宿主細胞Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｃ６００ｒk−ｍk−の内アンピシリン耐性株を選択
すると、これらの株はｐＣＲ７１４を保有し、ｔｒｐプ
ロモーターの制御下でプロキモシンを産生する。
示す。ｐＣＲ７１４で形質転換した宿主細胞Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｃ６００ｒk−ｍk−の内アンピシリン耐性株を選択
すると、これらの株はｐＣＲ７１４を保有し、ｔｒｐプ
ロモーターの制御下でプロキモシンを産生する。
【００１９】発現実験 プラスミドｐＣＲ７１１、７１２、７１３、７１４を保
有する大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００ｒk−ｍk−は通常
の培養技術によって生育させることができる。使用する
培地の例は、周知のＬ−Ｂ培地、Ｍ９培地などであり、
これらの培地中、細胞密度が１０12細胞／ｌに到達する
まで培養し、培養後、菌体抽出液を調製する。抽出液を
競合的ラジオイムノアツセイ法（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏ
ｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ）又は蛋白ブロッテング法により分析した結果、いず
れの場合にも、菌体中にプロキモシンと同一分子量で免
疫的にも同一の蛋白質が生成していることが認められ
る。定量的な分析から、各プラスミド保有株のプロキモ
シン産生能を算出したところ、ｐＣＲ７１２株が最高の
発現率を示し（細胞当り約３０万分子のプロキモシン：
蛋白ブロテイング法により測定）、新プラスミドｐＣＲ
７０１株に比べて産生能が約２５倍になっているという
驚くべき事実が見い出される。他のプラスミド含有株の
発現率はｐＣＲ７１２》ｐＣＲ７０１≧ｐＣＲ７１１＞
ｐＣＲ７１４＞ｐＣＲ７１３の順である。以上の結果よ
り、ｐＣＲ７０１系列のプラスミドのプロキモシン発現
効率は必ずしもＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンとの間の距
離だけによらず塩基配列そのものに依存することは明白
である。
有する大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００ｒk−ｍk−は通常
の培養技術によって生育させることができる。使用する
培地の例は、周知のＬ−Ｂ培地、Ｍ９培地などであり、
これらの培地中、細胞密度が１０12細胞／ｌに到達する
まで培養し、培養後、菌体抽出液を調製する。抽出液を
競合的ラジオイムノアツセイ法（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏ
ｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ）又は蛋白ブロッテング法により分析した結果、いず
れの場合にも、菌体中にプロキモシンと同一分子量で免
疫的にも同一の蛋白質が生成していることが認められ
る。定量的な分析から、各プラスミド保有株のプロキモ
シン産生能を算出したところ、ｐＣＲ７１２株が最高の
発現率を示し（細胞当り約３０万分子のプロキモシン：
蛋白ブロテイング法により測定）、新プラスミドｐＣＲ
７０１株に比べて産生能が約２５倍になっているという
驚くべき事実が見い出される。他のプラスミド含有株の
発現率はｐＣＲ７１２》ｐＣＲ７０１≧ｐＣＲ７１１＞
ｐＣＲ７１４＞ｐＣＲ７１３の順である。以上の結果よ
り、ｐＣＲ７０１系列のプラスミドのプロキモシン発現
効率は必ずしもＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンとの間の距
離だけによらず塩基配列そのものに依存することは明白
である。
【００２０】生成された微生物由来のプロキモシンは酸
性ｐＨにさらすことによって活性キモシンへと活性化す
ることができる。
性ｐＨにさらすことによって活性キモシンへと活性化す
ることができる。
【００２１】本発明を以下の実施例によりさらに詳しく
説明するが、様々な変更又は修正が本発明の技術範囲内
で許されることを理解すべきである。
説明するが、様々な変更又は修正が本発明の技術範囲内
で許されることを理解すべきである。
【００２２】
実施例 実施例中常に用いられるＴＥＮ緩衝液はトリス塩酸２０
ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭを含みｐ
Ｈは７．５である。形質転換及び発現実験に用いる栄養
培地は次の組成を有する。
ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭを含みｐ
Ｈは７．５である。形質転換及び発現実験に用いる栄養
培地は次の組成を有する。
【００２３】 Ｌ−Ｂｒｏｔｈ／ｌ（ｐＨ７．２〜７．４） Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ １０ｇ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ グルコース １ｇ ＮａＣｌ ５ｇ Ｍ９−Ｂｒｏｔｈ／ｌ ＮａＨＰＯ4 ６ｇ ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ ＮａＣｌ ５ｇ ＮＨ4Ｃｌ １ｇ ＣａＣｌ2 １５ｍｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ｇ Ｂｌ（チアミンＨＣｌ） ０．２ｇ ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ２．５ｇ グルコース ５ｇ ３β−インドリルアクリル酸 １５ｍｇ （３β−indolylacrylic acid） アンピシリン ５０ｍｇ 実施例１ プラスミドｐＣＲ７１１の組み立て プラスミドｐＣＲ７０１ １０μｇ（３２μｌ）をＨｉ
ｎｄ ＩＩＩ（３０単位、５μｌ）、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
緩衝液５μｌ、Ｈ2Ｏ ５３μｌから成る総量１００μ
ｌの反応溶液中、３７℃で２時間保温（インキュベー
ト）することによりＨｉｎｄ ＩＩＩで切断した。生成
ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、２０μｌのＴＥ溶液に
溶解した。次にＨｉｎｄ ＩＩＩで消化されたｐＣＲ７
０１ ４μｇ（８μｌ）、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｒ
ｅｎｏｗの断片）（１．５単位、１μｌ ＴＥＮ）、ポ
リメラーゼ緩衝液４μｌ、５ｍＭ ｄＮＴＰ（４μｌ
ＴＥＮ）、Ｈ2Ｏ ２３μｌから成る総量４０μｌの反
応溶液を３０℃で１０分間保温することによりＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断された一本鎖部分を修復した。反応はフ
ェノール処理により停止し、フェノールをエーテル抽出
により除去し、生成ＤＮＡはエタノールで沈殿させた。
沈殿物を２０μｌの水に溶解した。この溶解液（４μｇ
のＤＮＡを含む）にＴ4 ＤＮＡリガーゼ（３．６単
位、４μｌ）、３ｍＭ ＡＴＰ、リゲエーション緩衝液
８μｌを加え最終容量を４０μｌとした。これを２２℃
で一夜保温した。生成物をエタノールで沈殿させ、４０
μｌ ＴＥに溶解した。形質転換は宿主Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｃ ６００ｒk−ｍk−をＮｏｒｇａｒｄの方法（Ｎｏｒ
ｇａｒｄ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，３、２７９（１９７
８）に従って転換した。
ｎｄ ＩＩＩ（３０単位、５μｌ）、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
緩衝液５μｌ、Ｈ2Ｏ ５３μｌから成る総量１００μ
ｌの反応溶液中、３７℃で２時間保温（インキュベー
ト）することによりＨｉｎｄ ＩＩＩで切断した。生成
ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、２０μｌのＴＥ溶液に
溶解した。次にＨｉｎｄ ＩＩＩで消化されたｐＣＲ７
０１ ４μｇ（８μｌ）、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｒ
ｅｎｏｗの断片）（１．５単位、１μｌ ＴＥＮ）、ポ
リメラーゼ緩衝液４μｌ、５ｍＭ ｄＮＴＰ（４μｌ
ＴＥＮ）、Ｈ2Ｏ ２３μｌから成る総量４０μｌの反
応溶液を３０℃で１０分間保温することによりＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断された一本鎖部分を修復した。反応はフ
ェノール処理により停止し、フェノールをエーテル抽出
により除去し、生成ＤＮＡはエタノールで沈殿させた。
沈殿物を２０μｌの水に溶解した。この溶解液（４μｇ
のＤＮＡを含む）にＴ4 ＤＮＡリガーゼ（３．６単
位、４μｌ）、３ｍＭ ＡＴＰ、リゲエーション緩衝液
８μｌを加え最終容量を４０μｌとした。これを２２℃
で一夜保温した。生成物をエタノールで沈殿させ、４０
μｌ ＴＥに溶解した。形質転換は宿主Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｃ ６００ｒk−ｍk−をＮｏｒｇａｒｄの方法（Ｎｏｒ
ｇａｒｄ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，３、２７９（１９７
８）に従って転換した。
【００２４】コンピテントな（ＤＮＡ取り込み能を有す
る）細胞を調製し、これに前述のＤＮＡ溶解液を加え、
処理し、形質転換反応を完了させた後、アンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含有するＬ培地で生育させ、アンピシリ
ン耐性形質転換株を採取した。これらの株Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｃ ６００ｒk−ｍk−（ｐＣＲ７１１）はプラスミド
ｐＣＲ７１１を保有する。
る）細胞を調製し、これに前述のＤＮＡ溶解液を加え、
処理し、形質転換反応を完了させた後、アンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含有するＬ培地で生育させ、アンピシリ
ン耐性形質転換株を採取した。これらの株Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｃ ６００ｒk−ｍk−（ｐＣＲ７１１）はプラスミド
ｐＣＲ７１１を保有する。
【００２５】実施例２ プラスミドｐＣＲ７１２の組み
立て 実施例１で得られたｐＣＲ７０１のＨｉｎｄ ＩＩＩ消
化物１μｇ（２μｌ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ１（５０
単位、１μｌ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ１緩衝液５μ
ｌ、Ｈ2Ｏ ４２μｌから成る総量５０μｌの反応溶液
を１６℃で２時間保温した。この反応で用いた（Ｘ１
０）Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ１緩衝液の組成は２．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＡｃＯＮａ、１０ｍＭ ＺｎＳＯ
4、５％グリセロールでｐＨ４．５である。反応をフェ
ノール処理により停止し、フェノールをエーテル抽出に
より除去し、生成ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。沈
殿を１９μｌ Ｈ2Ｏに溶解した。このＤＮＡ １μｇ
（１９μｌ）、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（０．９単位、１
μｌ）、３ｍＭ ＡＴＰ ３μｌ、５０％ＰＥＧ ６０
００（４μｌ）、リゲーション緩衝液３μｌから成る総
量３０μｌの反応液を２２℃で９０分間保温した。こう
して再連結されたＤＮＡは実施例１と同様に、宿主Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｃ ６００ｒk−ｍk−に形質転換により導入
された。得られたアンピシリン耐性形質転換株、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ Ｃ ６００ｒk−ｍk−（ｐＣＲ７１２）はプラ
スミドｐＣＲ７１２を保有する。この株は微工研に受託
番号ＦＥＲＭＢＰ−５０２号として寄託された。
立て 実施例１で得られたｐＣＲ７０１のＨｉｎｄ ＩＩＩ消
化物１μｇ（２μｌ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ１（５０
単位、１μｌ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ１緩衝液５μ
ｌ、Ｈ2Ｏ ４２μｌから成る総量５０μｌの反応溶液
を１６℃で２時間保温した。この反応で用いた（Ｘ１
０）Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ１緩衝液の組成は２．５Ｍ
ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＡｃＯＮａ、１０ｍＭ ＺｎＳＯ
4、５％グリセロールでｐＨ４．５である。反応をフェ
ノール処理により停止し、フェノールをエーテル抽出に
より除去し、生成ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。沈
殿を１９μｌ Ｈ2Ｏに溶解した。このＤＮＡ １μｇ
（１９μｌ）、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（０．９単位、１
μｌ）、３ｍＭ ＡＴＰ ３μｌ、５０％ＰＥＧ ６０
００（４μｌ）、リゲーション緩衝液３μｌから成る総
量３０μｌの反応液を２２℃で９０分間保温した。こう
して再連結されたＤＮＡは実施例１と同様に、宿主Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｃ ６００ｒk−ｍk−に形質転換により導入
された。得られたアンピシリン耐性形質転換株、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ Ｃ ６００ｒk−ｍk−（ｐＣＲ７１２）はプラ
スミドｐＣＲ７１２を保有する。この株は微工研に受託
番号ＦＥＲＭＢＰ−５０２号として寄託された。
【００２６】実施例３ プラスミドｐＣＲ７１３の組み
立て 実施例１で得られたｐＣＲ７０１のＨｉｎｄ ＩＩＩ消
化物１μｇ（２μｌ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ１（５０
単位、１μｌ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ１緩衝液５μ
ｌ、Ｈ2Ｏ ４２μｌから成る総量５０μｌの反応溶液
を２２℃で３０分間保温した。この反応で用いた緩衝液
の組成は実施例２の場合と若干異なっている。即ち、
０．３Ｍ ＡｃＯＮａ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
ＺｎＳＯ4から成りｐＨ４．６である。反応をフェノ
ール処理により停止し、フェノールをエーテル抽出によ
り除去し、生成ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。この
ＤＮＡ３μｇ（２０μｌ ＴＥＮ）、３ｍＭ ＡＴＰ
（８μｌ）、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（３．６単位、４μ
ｌ）、リゲーション緩衝液８μｌから成る総量４０μｌ
の反応液を２２℃で一夜保温した。生成ＤＮＡをエタノ
ールで沈殿させ、沈殿を４０μｌに溶解した。再連結さ
れたＤＮＡは実施例１と同様に、宿主Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ
６００ｒk−ｍk−に形質転換により導入された。得ら
れたアンピシリン耐性形質転換株、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ
６００ｒk−ｍk−（ｐＣＲ７１３）はプラスミドｐＣＲ
７１３を保有する。
立て 実施例１で得られたｐＣＲ７０１のＨｉｎｄ ＩＩＩ消
化物１μｇ（２μｌ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ１（５０
単位、１μｌ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ１緩衝液５μ
ｌ、Ｈ2Ｏ ４２μｌから成る総量５０μｌの反応溶液
を２２℃で３０分間保温した。この反応で用いた緩衝液
の組成は実施例２の場合と若干異なっている。即ち、
０．３Ｍ ＡｃＯＮａ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
ＺｎＳＯ4から成りｐＨ４．６である。反応をフェノ
ール処理により停止し、フェノールをエーテル抽出によ
り除去し、生成ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。この
ＤＮＡ３μｇ（２０μｌ ＴＥＮ）、３ｍＭ ＡＴＰ
（８μｌ）、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（３．６単位、４μ
ｌ）、リゲーション緩衝液８μｌから成る総量４０μｌ
の反応液を２２℃で一夜保温した。生成ＤＮＡをエタノ
ールで沈殿させ、沈殿を４０μｌに溶解した。再連結さ
れたＤＮＡは実施例１と同様に、宿主Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ
６００ｒk−ｍk−に形質転換により導入された。得ら
れたアンピシリン耐性形質転換株、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ
６００ｒk−ｍk−（ｐＣＲ７１３）はプラスミドｐＣＲ
７１３を保有する。
【００２７】実施例４ プラスミドｐＣＲ７１４の組み
立て 実施例４で得られたｐＣＲ７０１ ２μｇ（１５μ
ｌ）、ｃｌａ Ｉ（１８単位、３μｌ）、ｃｌａ Ｉ緩
衝液５μｌ、Ｈ2Ｏ ２７μｌから成る総量５０μｌの
反応液を３７℃で２時間保温して、ｐＣＲ７０１をｃｌ
ａ Ｉで消化した。生成物をエタノールで沈殿させ、４
１．５μｌ Ｈ2Ｏに溶解した。この溶液に２０ｍＭ
ｄＣＴＰ（１．２５μｌ）、２０ｍＭ ｄＧＴＰ（１．
２５μｌ）、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断
片）（１．５単位、１μｌ）、ポリメラーゼ緩衝液（５
μｌ）を加え、総量５０μｌとして、３０℃で１０分間
保温した。反応をフェノール処理により停止し、フェノ
ールをエーテル抽出により除去し、生成ＤＮＡをエタノ
ールで沈殿させ、更に沈殿生成物を２８μｌのＨ2Ｏに
溶解させた。この溶液に、３ｍＭ ＡＴＰ（６μｌ）、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１．８単位、２μｌ）、リゲー
ション緩衝液（４μｌ）を加え、最終容量４０μｌとし
２２℃で一夜保温した。生成ＤＮＡをエタノールで沈殿
させ、沈殿を４０μｌに溶解させた。再連結されたＤＮ
Ａを実施例１と同様に、宿主Ｅ．ｃｏｌｉＣ ６００ｒ
k−ｍk−に形質転換により導入した。得られたアニピシ
リン耐性形質転換株、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ ６００ｒk−
ｍk−（ｐＣＲ７１４）はプラスミドｐＣＲ７１４を保
有する。
立て 実施例４で得られたｐＣＲ７０１ ２μｇ（１５μ
ｌ）、ｃｌａ Ｉ（１８単位、３μｌ）、ｃｌａ Ｉ緩
衝液５μｌ、Ｈ2Ｏ ２７μｌから成る総量５０μｌの
反応液を３７℃で２時間保温して、ｐＣＲ７０１をｃｌ
ａ Ｉで消化した。生成物をエタノールで沈殿させ、４
１．５μｌ Ｈ2Ｏに溶解した。この溶液に２０ｍＭ
ｄＣＴＰ（１．２５μｌ）、２０ｍＭ ｄＧＴＰ（１．
２５μｌ）、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断
片）（１．５単位、１μｌ）、ポリメラーゼ緩衝液（５
μｌ）を加え、総量５０μｌとして、３０℃で１０分間
保温した。反応をフェノール処理により停止し、フェノ
ールをエーテル抽出により除去し、生成ＤＮＡをエタノ
ールで沈殿させ、更に沈殿生成物を２８μｌのＨ2Ｏに
溶解させた。この溶液に、３ｍＭ ＡＴＰ（６μｌ）、
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１．８単位、２μｌ）、リゲー
ション緩衝液（４μｌ）を加え、最終容量４０μｌとし
２２℃で一夜保温した。生成ＤＮＡをエタノールで沈殿
させ、沈殿を４０μｌに溶解させた。再連結されたＤＮ
Ａを実施例１と同様に、宿主Ｅ．ｃｏｌｉＣ ６００ｒ
k−ｍk−に形質転換により導入した。得られたアニピシ
リン耐性形質転換株、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ ６００ｒk−
ｍk−（ｐＣＲ７１４）はプラスミドｐＣＲ７１４を保
有する。
【００２８】実施例５ 発現実験 プラスミドｐＣＲ７１１、ｐＣＲ７１２、ｐＣＲ７１
３、ｐＣＲ７１４を保有する形質転換株をＬＢ培地中、
３７℃で一夜培養した後、培養物１ｍｌを１０ｍｌの新
鮮なＭ９培地に接種し、１時間培養した。それに１５μ
ｇ／ｍｌの３−ベータ−インドールアクリル酸を添加
し、３時間培養した。培養により大腸菌は４．０×１０
8細胞ｍｌの密度まで生育した。培養後、遠心分離によ
り集菌し、これを１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルス
ルホニルフルオライド）を含有するＰＢＳ緩衝液（２０
ｍＨリン酸ナトリウム緩衝剤中１５０ｍＭの塩化ナトリ
ウムを含むｐＨ７．０）３ｍｌに懸濁させた。この懸濁
液に２５０ｍＭのＥＤＴＡ（６０μｌ）と１０ｍｇ／ｌ
のリゾチーム（３０μｌ）を加え０℃で３０分間保温し
た。生成したスフエロプラスト（ｓｐｅｒｏｐｌａｓ
ｔ）を音波で破壊し、これに尿素を加えて、尿素の最終
濃度を８Ｍとした。細胞処理溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓ
ａｔｅ）を３７℃で１時間保温した。これを３００００
ｒｐｍで３０分間遠心分離にかけた後、上澄液をｐＢＳ
緩衝液に透析し、透析液に競合結合ラジオイムノアツセ
イ（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｒａｄ
ｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を適用した。標準的な手
法は例えば、西森らＧｅｎｅ，１９、３３７（１９８
２）に記載されている。
３、ｐＣＲ７１４を保有する形質転換株をＬＢ培地中、
３７℃で一夜培養した後、培養物１ｍｌを１０ｍｌの新
鮮なＭ９培地に接種し、１時間培養した。それに１５μ
ｇ／ｍｌの３−ベータ−インドールアクリル酸を添加
し、３時間培養した。培養により大腸菌は４．０×１０
8細胞ｍｌの密度まで生育した。培養後、遠心分離によ
り集菌し、これを１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメチルス
ルホニルフルオライド）を含有するＰＢＳ緩衝液（２０
ｍＨリン酸ナトリウム緩衝剤中１５０ｍＭの塩化ナトリ
ウムを含むｐＨ７．０）３ｍｌに懸濁させた。この懸濁
液に２５０ｍＭのＥＤＴＡ（６０μｌ）と１０ｍｇ／ｌ
のリゾチーム（３０μｌ）を加え０℃で３０分間保温し
た。生成したスフエロプラスト（ｓｐｅｒｏｐｌａｓ
ｔ）を音波で破壊し、これに尿素を加えて、尿素の最終
濃度を８Ｍとした。細胞処理溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓ
ａｔｅ）を３７℃で１時間保温した。これを３００００
ｒｐｍで３０分間遠心分離にかけた後、上澄液をｐＢＳ
緩衝液に透析し、透析液に競合結合ラジオイムノアツセ
イ（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｒａｄ
ｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）を適用した。標準的な手
法は例えば、西森らＧｅｎｅ，１９、３３７（１９８
２）に記載されている。
【００２９】前記の音波処理した無細胞抽出液を４Ｍ尿
素で処理し、遠心分離した後、ＳＤＳゲル電気泳動にか
けた。移動した蛋白をニトロセルローゼ上に転写し、プ
ロキモシン抗体と結合するバンドをオートラジオグラフ
で検出した（蛋白ブロテイング法）。いづれのプラスミ
ドを保有する大腸菌についても、標品プロキモシンに対
応するバンドが観察された。この帯の密度と標品のそれ
と比較することにより定量的にプロキモシンの量が算出
された。
素で処理し、遠心分離した後、ＳＤＳゲル電気泳動にか
けた。移動した蛋白をニトロセルローゼ上に転写し、プ
ロキモシン抗体と結合するバンドをオートラジオグラフ
で検出した（蛋白ブロテイング法）。いづれのプラスミ
ドを保有する大腸菌についても、標品プロキモシンに対
応するバンドが観察された。この帯の密度と標品のそれ
と比較することにより定量的にプロキモシンの量が算出
された。
【００３０】プロキモシン産生能はｐＣＲ７１２》ｐＣ
Ｒ７０１≧ｐＣＲ７１１＞ｐＣＲ７１４＞ｐＣＲ７１３
の順で基準のｐＣＲ７０１と比べるとｐＣＲ７１２は実
に約２５倍の発現効果を示した。
Ｒ７０１≧ｐＣＲ７１１＞ｐＣＲ７１４＞ｐＣＲ７１３
の順で基準のｐＣＲ７０１と比べるとｐＣＲ７１２は実
に約２５倍の発現効果を示した。
【図１】図１はプラスミドｐＣＲ７０１の制限酵素地図
である。
である。
【図２】図２はプラスミドｐＣＲ７０１、ｐＣＲ７１
１、ｐＣＲ７１２、ｐＣＲ７１３、ｐＣＲ７１４のＳＤ
配列とＡＴＧ開始コドンとの間の塩基配列とｐＣＲ７０
１から他のプラスミドを構成するフローチャートを示
す。
１、ｐＣＲ７１２、ｐＣＲ７１３、ｐＣＲ７１４のＳＤ
配列とＡＴＧ開始コドンとの間の塩基配列とｐＣＲ７０
１から他のプラスミドを構成するフローチャートを示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 柳田 昇 神奈川県横浜市榎ケ丘10−９ 日本ゼオン 青葉寮 (56)参考文献 特開 昭58−9687（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主微生物に、
プロキモシンのｃＤＮＡ全配列と、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒ
ｐプロモーターの制御下にプロキモシンのｃＤＮＡ全長
を発現可能なＥ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーターオペレ
ーター系から成り、ＡＴＧ開始コドンが該ｃＤＮＡのＮ
−末端に結合しており、そして該プロモーター領域内の
ＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンとの間の塩基対が ＧＴＡＴＣＧＡＴ ＣＡＴＡＧＣＴＡ から成る発現型組換えプラスミドを形質転換により導入
し、そして得られる形質転換株を培養することを特徴と
するプロキモシンの製造方法。 - 【請求項２】 発現型組換えプラスミドがプラスミドｐ
ＣＲ７１２である請求項１記載の方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30063292A JPH0673455B2 (ja) | 1992-10-14 | 1992-10-14 | プロキモシンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30063292A JPH0673455B2 (ja) | 1992-10-14 | 1992-10-14 | プロキモシンの製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59044901A Division JPS60188077A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | 仔牛プロキモシンｃＤΝＡの全配列を有する新規な発現プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05268958A JPH05268958A (ja) | 1993-10-19 |
| JPH0673455B2 true JPH0673455B2 (ja) | 1994-09-21 |
Family
ID=17887205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30063292A Expired - Lifetime JPH0673455B2 (ja) | 1992-10-14 | 1992-10-14 | プロキモシンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0673455B2 (ja) |
-
1992
- 1992-10-14 JP JP30063292A patent/JPH0673455B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05268958A (ja) | 1993-10-19 |
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