JPS60188077A - 仔牛プロキモシンｃＤΝＡの全配列を有する新規な発現プラスミド - Google Patents

仔牛プロキモシンｃＤΝＡの全配列を有する新規な発現プラスミド

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JPS60188077A
JPS60188077A JP59044901A JP4490184A JPS60188077A JP S60188077 A JPS60188077 A JP S60188077A JP 59044901 A JP59044901 A JP 59044901A JP 4490184 A JP4490184 A JP 4490184A JP S60188077 A JPS60188077 A JP S60188077A
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coli
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魚住　武司
Katsuhiko Nishimori
克彦 西森
Norio Shimizu
清水　範夫
Yoshiyuki Kawaguchi
嘉之 川口
Noboru Yanagida
柳田　昇
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロキモシン遺伝子を発現させる発現型組換え
プラスミドに関する。より詳しくは、仔牛プロキモシン
（：ＤＮＡの全配列を有し、Ｅ、　ｃｏｌｉｔｒｐプロ
モーターの制御下、大腸菌宿主細胞内でプロキモシンＣ
ＤＮＡ全長を効率よく発現可能な新規の発現型プラスミ
ドに関する。
プロキモシンは修生第４胃から得られチーズ製造の際に
牛乳を凝固させるのに用いられる一種のプロテアーゼで
あるキモシンの前駆体蛋白質である。プロキモシンは分
子量４万、アミノ酸残基数ンを生成する。最近では微生
物起源の凝乳酵素が見い出されて、キモシンに代替しつ
つあるが、チーズ工業における仔牛キモシンに対する潜
在的需豐は依然として大きい。従って、仔牛キモシンを
組換えＤＮＡ技術を用いて微生物に生産させることは遺
伝子工学の実用面での目標のひとつと考えられている。
本発明の目的は宿主細胞中、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｔｒｐプ
プロモーターの制御下、高い発現率でプロキモシンＣＤ
ＮＡ全長の発現を可能にさせる新規の発現シラスミドを
得ることである。
本発明の他の目的は前記の発現プラスミドで宿主を形質
転換し、形質転換株を培養することによりプロキモシン
を生産する方法を提供することである。
本発明の別の目的は前記の発現プラスミドを構成する方
法を提供することである。
組換えＤＮＡ操作を用いて、プロキモシンＣＩ）ＮＡを
大腸菌宿主細胞中で形質発耕させ、プロキモシンを生産
させる方法は既に公知である。例えば、西森ら、Ｇｅｎ
ｅ、　］　９．３３７　（１９８２）、特開昭５８−３
’２８９６号（別府輝彦）、特開昭５７−１４１２８７
号（コラボラティプ・リサーチ）はＥ、　ｃｏｌｉ　ｌ
ａｃオペロンプロモーター制御下、プロキモシンが産゛
生されることを開示している。一方、　ｈ’、　ｃｏｌ
ｉ　ｔｒｐプロモーター制御下でも同様に、プロキモシ
ンが産生されることが、特開昭５８−９．６８７号（セ
ルチック・リミテッド）、清水ら、農芸化学会講演要旨
集２．（−１９（１９８２）、 力初障特願昭５８−３８４３９号（別府輝彦）に記載さ
れている。特に、上記清水らの文献にはプロキモシンの
全構造遺伝子がクローン化されて、１゜ｃｏｌｉ工びプ
ロモーターの制御下、大腸菌宿主細胞内で発現するプラ
スミドｐ　Ｃ’　Ｒ７０１が開示されている。このプラ
スミドは全長約５．３　Ｋ　ｂでプロキモシンのＣＤＮ
Ａの全長がｔｒｐプロモーターの下流ｔｒｐＬ遺伝子の
りポゾーム結合位に挿入されている。第１図にｐｃＲ７
０１の制限酵素地図を示−ｆ、ＳＤ配列とＡ　７’　Ｇ
開始コドンの間には次の１４塩基が存在する。
プロキモシン このプラスミドで形質転換した大腸菌株Ｅ、ｃｏｌｉｃ
６ｏｏｒｋ−ｍｋ−ＣＰＣＲ’ｌ　Ｏ１）は機工研匠寄
託されている（受託番号ＦＥＲＭ１３Ｆ　２６４　）。
しかしながら前述の西森らの文献中に記載されているよ
うに、ｐＣＲ７０１の発現率は他の公知のプラスミドｐ
ＣＲ５０１、ｐＣＲ６０１と比較して非常に低い。プロ
キモシン蛋白の生産量は競合結合ラジオイムノアッセイ
法（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｂｉｎｄｉｎｇ　ｒａｄｉ
ｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　）の測定によると宿主細胞
あたり約７００分子であり、免疫プロッテング法の測定
によると細胞あたシ約１．２，０００分子であった。
本発明はＥ、　ｃｏｌｉ　ｔｒｐプロモーター、オペレ
ーター系とプロキモシンｃＤＮＡ全配列から成り、大腸
菌宿主細胞内でｔｒｐプロモーター制御下、プロキモシ
ンｃＤＮＡ全長を発現可能な発現型組換えプラスミドで
あって、該ＣＤＮＡのＮ末端にＡＴＧ開始コドンが接続
されそして該プロモーター領域内のＳＤ配列とＡＴＧ開
始コドンとの間の塩基対が高発現率を与えるように構成
されていることを特徴とするプラスミドを提供する。
又、本発明はプラスミドｐｃＲ’ｌ　Ｏ１のＳＤ配列と
ＡＴＧ開始コドン−との間を制限酵素によってより発現
率の高い新規のシラスミドを得る方法を提供する。前述
の方法に於いて、制限酵素による切断後、一本鎖構造部
分を修復して切断末端を貴連結し、ＳＤ配列とＡＴＧ開
始コドンとの間の距離をのばすことも、逆に一本鎖構造
部分を除去して切断末端を再連結し、ＳＤ配列とＡＴＧ
開始コドンとの間の距離を縮めることも可能であるが、
好ましくは後者の手法（距離を縮める）が用いられる。
本発明は、かくして得られた発現効率の高い発現プラス
ミドを宿主細胞に形質転換法により導入し、形質転換細
胞を培養することからなるプロキモシンの生産方法をも
提供する。更に、本発明は形質転換された微生物そして
それから産生されたプロキモシンを包含する。
本発明に於いて、用いられる宿主微生物は、本発明の発
現グラスミドを受容し、宿主細胞が増殖し゛て、プロキ
モシンを産生するものなら、特定の菌株に限定されない
が、実用的な理由から大腸菌Ｃ６００由来株の利用が好
ましい。特罠好ましくは、大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６
００ｒｋ−ｍｋ−株が用いられる。本発明の方法で生産
されるプロキモシンは全てＮ末端にメチオニルが付着し
たメチオニルプロキモシンであるが明細書中単にプロキ
モシンと称する。
以下に好適な実施態様を例にして本発明をよシ詳しく説
明する。
プラスミドｐｃＲ’ｌ　Ｏ１をまず、制限酵素Ｈｉｎｄ
■で切断する。一本鎖構造部分を有する両末端をＤＮＡ
７１？リメラーゼを用いて修復する。修復された平滑末
端を７４ＤＮＡリガーゼで連結する。これらの操作で、
ＳＤ配列−Ａ　ＴＧ開始コドン間の距離は４塩基対増加
して、１８塩基対となる。得られた新シラスミドｐｃＲ
Ｔ　１１は５Ｄ−Ａｒ１間の塩基配列以外ｐｃＲ７０１
と全く同一である。
ＳＤ配列とＡＴ’Ｇ開始コドンとの間のＤＮＡ配列はＭ
ａｘａｍ　−Ｇ　ｉｌ　ｂｅｒｔ法で解析すると以下の
；Ｉｎりである。
ｐｃＲ７０１からｐｃＲ’ｌ　１１を構成する模様を第
２図に示す。ｐに’Ｒ７１１で形☆転換した宿主細胞Ｆ
＝、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｒｋ−ｍ　ｋ−の内、アンピ
シリン耐性株を選択すると、これらの株はプラスミドｐ
ｃＲ７１１を保有し、ｔｒｐプロモーターの制御下でプ
ロキモシンを産生ずる。
プラスミドｐ　ＣＲ７０１を前記と同様に１ｌｉｎｄ■
１で切断する。得られた一本鎖構造部位を有する末端を
ヌクレアーゼ（Ｎｕｃｔｅαａｇ）Ｓｌで除去する。続
いて平滑末端をＴ４ＤＮＡＩ）ガーゼで畏連結する。こ
の際切断東件の差違（主に、緩衝液の組成の違い）によ
＃）ＳＤ配列−ＡＴＧコドン間の長さの異っているシラ
スミドｐｃＲ”７１２又はｐｃＲ’ｌ　１３が別個に生
成する。両ゾ２スミド共ＳＤ配列−ＡＴＧコドン間の塩
基配列以外はｐＣＲ７０１と全く同一である。新プラス
ミド７）ＣＲ７１２の該塩基配列をＭａｘａｍ　−Ｇ１
１ｂｅｒｔ法で解析すると次の通如である。
又、新プラスミドｐｃＲ’ｌ　１３の該塩基配列をＭａ
ｚａｔｎ　−Ｇ１１ｂｅｒｔ法で解析すると次の通りで
ある。
ＳＤ　Ｍｅｔ ｐｃＲ’ｌ　Ｑ　ｌからｐＣＲＴ　１２又は′ｐＣＲ７
１３を構成する模様を第２図に示す。ｐＣＲ７１２で形
質転換した宿主細胞Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｒｋ−ｍ
ｋ−の内アンピシリン耐性株を選択する。これらの株は
プラスミドｐＣＲＴ　１２を保有し、ｔｒｐプロモータ
ーの制御下でプロキモシンを産生ずる。同様に、ｐＣＲ
７１３を保有する形質転換株Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００ｒｋ
−ｍｋ−（ｐＣＲＴ　１３　）もプＯ＊　モシンを産出
する。
プラスミドｐｃＲＴ　１２を制限酵素ｃｌａ　Ｉで切断
し、ｄＧＴＰ　、ｄＣＴＰの存在下、Ｉ）　Ｎ　Ａポリ
メラーゼを用いて斯くて切断された一本鎖構造部分を部
分的に修復、例えば、ＣＧ部位のみをイし復し、突出し
た末端を有するままＴ４　ＤＮＡリガーゼで再連結する
とプラスミドｐｃＲ７１４が得られる。これら一連の操
作で、ｐｃＩ？Ｔ１２の５Ｄ−ＡＴＧコドン間の塩基数
が２減少して６塩基対となる。この部位以外はｐＣＲＴ
　１２と全く同一である。ｐＣＲＴ　１４のＳＤ配列と
ＡＴＧコドンとの間の塩基配列はＭαｘａｍ−Ｇｉｌｂ
ｅｒｔ法で解析すると次の通りである。
ＳＤ　Ｍｅｔ ｐｃｌ？’ｌＬ２からｐｃＲ’ｌ　１４を構成する模様
を第２図に示す。ｐｃＲ７１４で形質転換した宿主細胞
Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｒｋ−ｍｋ−の内アンピシリ
ン耐性株を選択すると、これらの株はｐｃＲ７１４を保
有し、ｔｒｐプロモーターの制御下でプロキモシンを産
生ずる。
発現実験 プラスミドｐＣＲ７１１、７１２、７１３。
７１４を保有する大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｊ　Ｃ６００ｒｋ
−ｍｋ−杖通常の培養技術によって生育ζせることがで
きる。使用する培地の例は、周知のＬ−Ｂ培地、Ｍ９培
地などであり、これらの培地中、細胞密度が１０′２細
胞／ｌに到達するまで培養し、培養後、菌体抽出液を調
製する。抽出液を競合的ラジオイムノアッセイ法（ｂｉ
ｎｄｉｎｇ　ｃｏｒｎｐｅｔｉｔｉｖｅｒａｄｉｏｉｍ
ｍｕｎｏａｇｓａｙ　）又は蛋白プロツテンク法により
分析した結果、いずれの場合にも、菌体中にプロキモシ
ンと同一分子量で免疫的にも同一の蛋白質が生成してい
ることが認められる。定量的ケ な分析から、各ゲラスト保有株のプロキモシン産生能を
算出したところ、ｐｃＲ１１２株が最高の発現率を示し
く細胞当り約３０万分子のプロキモシン・：蛋白プロテ
ィング法により測定）、親プラスミドｐｃＲ’１０１株
に比べて産生能が約２５倍になっているという驚くべき
事実が見い出される。
他のプラスミド含有株の発現率はｐＣＲ７１２＞＞ｐｃ
Ｒ’１０１≧ｐｃＲＴ　１１＞ｐｃＲ’ｌ　１４＞ｐＣ
ＲＴ　１３の順である。以上の結果よυ、ｐＣＲ７０１
系列のプラスミドのプロキモシン発現効率は必ｆし６ｓ
ｎ配列とＡＴＧ開始コドンとの間の距離だけによらず塩
基配列そのものに依存することは明白である。
生成された微生物由来のプロキモシンは酸性ｐｌｆにさ
らすことによって活性キモシンへと活性化することがで
きる。
本発明を以下の実施例によシさらに詳しく説明するが、
様々な変更又は修正が本発明の技術範囲内で許されるこ
とを理解すべきである。
実　施　例 実施例中宮に用いられるＴＥＮ緩衝液はトリス塩酸２０
ｍＭＸＮａＣＬ５０ｍＭ、ＥＤＴＡＬｍＭを含みｐＨは
７，５である。形質転換及び発現実験に用いる栄養培地
は次の組成を有する。
Ｌ−！３ｒｏｔｈ−／ｌ　（７）ｆｌ　７．２〜７．４
　）Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ　１０　ｔＹｅａｓｔ
　Ｅｘｔｒａｃｔ　５　ｆ グルコース　１２ ＮａＣ１ｓｒ Ｊ／　９−　Ｂｒｏｔｈ／、ｌ Ｎａ１ｉＰ０４６　ｆ Ｋｆｌ、ｐｏ、　３ｆ／ ＮａＣ１５ｆ／ ＮＢ、Ｃ’ｌ　１１ ＣａＣ１２１５１１１＆ Ｍｇ５Ｏ，・　１２０　０．１１ １３１　（チアミンＪｌｃｌ　）　０．２　ｙｃａｓａ
ｍｉ、ｎｏ　ａｃｉｄ　２．５９グルコース　５９ アンｅシリン　５Ｑｍｇ 実施例　１　プラスミドｐＣＲ７１１の組み立てプラス
ミドｐＣＲＴＯ１１Ｏｐｌｉ＜３２μｌ）を１ｉｉｎｄ
　ｍ　（３０単位、５μＪ）、Ｈ４ｎｄｍ緩衝液５ｔｉ
ｌ、Ｈ，Ｏｓ　３ｐｌがら成る総量１００　ｐｌの反応
溶液中、３７℃で２時間保７Ｍ　（インキュベート）す
ることによりｆｉｉｎｄＴｊｉで切断した。生成１）Ｎ
Ａをエタノールで沈殿させ、２０ＡｌｌのＴＥ溶液に溶
解した。次にＩｌｉｎｄｍで消化されたｐｃＲ７０１４
μｙ＜ｓμＡｔ）、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｒｅｎ
ｏｗの断片）　１１．５単位、ｌμ１ｒＥＩＶ）、ポリ
メラーゼ緩衝ｇ４ｆｉｌ、５ｍＭｄＮＴＰ　（４μＡ！
ＴＥＩＪ、ＨｉＯ：２８μＥから成る総量４０μｌの反
応浴ｇ、全３０’Ｃで１Ｏ分間保温することによりＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断された一本鎖部分を修復した。反応は
フェノール処理により停止Ｅシ、）と、ノールをエーテ
ル抽出により除去し、生成りＭＡはエタノールで沈殿さ
せた。沈殿物を２０μノの水に溶解しｆｃｏこのｍ解版
（４μＩのＤＮＡを含む）にＴ、ＤＮＡリガーゼ（３，
６単位、４μ））、３ｍＭＡＴｐ、リグニー７ヨン緩衝
液８μｌを加え最終容駄を４０μｌとした。これを２２
℃で一夜保７品した。生成物をエタノールで沈殿させ、
４０μＡＴＥに酵解した。形質転換は宿主Ｅ、ｃｏｌｉ
　Ｃ６００１１−ｍｋ−をＮ　ｏ　ｒ　ｇ　ａ　ｒ　ｄ
の方法（Ｎｏｒｇａｒｄ、ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ、３．
２７９（１９７Ｂ）に従って転換した。
コンピテントな（ＤＮＡ取り込み能を有する）細胞を調
製し、これに前述のＤＮＡ溶解液を加え、処理し、形・
實転換反応を児了させた後、アンピシリン５０μｇ／−
を含有するＬ培地で生育略せ、アンピシリン耐性形質転
換株を採取した。これらの株Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｒ
ｋ−ｍｋ−（ｐＣＲ７１１）ｕデラズミドｐｃＲ’ｌ　
１１ｉ保有する。
実施例　２　プラスミド　ＣＲ７１２の絹み立て実施例
１で得られたｐｃＲ’１０１のＨｉｎｄｖｔ消化物１ｔ
ｔＩＩ＜２ｔｔｌ）、Ｎｗａｌ：’ａｒｔ　Ｓ　１　（
５０単位、１μｌ）、Ｎ１Ｌｏ　１ｅａｓｅ　Ｓ　１緩
衝液５μ１１Ｍ、０４２μノから成る総量５０μｌの反
応溶液を１６°Ｇで２時間保温した。この反応で用いた
（ＸＩ　Ｏ）　ＮｕｃＬｇａｓｔｒ　Ｓ　１緩衝液の組
成は２、．５Ａｆ　ＮａＣ１，０，５Ｍ　Ａｃ０Ｎａ、
　１０ｍＭ　ＺｎＳＯ４，５％グリセロールでｐＨ４５
である。反応をフェノール処理により停止し、フェノー
ルをエーテル抽出により除去し、生成り、ＮＡをエタノ
ールで沈殿させた。沈殿を１９μノＭ、（。
に溶解した。このＤＮＡ１ｇｇ（１９μり、Ｔ、ＤＮＡ
９ｇ　−セ（’　０．９単位、１／ｊＡＩ）、３′ｒｌ
ＬＭ　ＡＴＰ３μ！、５０％ＰＥＧ６０００＜４μ４）
、すｒ−ジョン緩衝板３μｌから成る総量３０μノの反
応液を２２℃で９Ｏ分間保温した。こうして再連結され
たＤＮＡは実施例１と同様に、宿主及。
ｃｏＬｉ　Ｃ６００ｒ）、−ｍｋ−に形質転換により導
入きれた。、得られたアンピシリン耐性形質重。
換株、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｒｋ−ｎＬｋ−（ｐＣＲ
’１１２）はプラスミドｐに’Ｒ７１２を保有する。こ
の株ｒよ機工研に受託番号ＦＥＲＭ　Ｂｐ−５０２号と
して寄託された。
実施し１］３　プラスミドｐｃＨ’１１３の組み立て実
施例１で得られたｐｃＲ’ｌ　Ｏ１のｌｌ１ｎｄ■消化
物１μｇ（２，ｃｚｌｌ、ＮｕｃＬｅａｓｅ　Ｓ　１（
５０単位、１μ！）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｓ　１緩衝液
５μ７３．Ｈ，０４２μｌから成る総計５０μｌの反応
溶液を２２℃で３０分、４Ｊ保温した。この反応で用い
た緩衝液の組成は実施例２の場合と若干異なっている。
即ら、０．３Ｍ　Ａｃ　０ＮａＳ　Ｏ，５Ｍ　ＮａＣＬ
、　１０ｔｎＭ　Ｚｎ５Ｏ，から成りｐＨ４，６である
。反応をフェノール処理により停とシ、フェノールをエ
ーテル抽出により除去し、生Ｂｚ　ＤＮ　Ａをエタノー
ルで沈殿させた。このＩ）ＮＡ３ａｌ　（２０μ１ＴＥ
Ｎ）、３ｍＭ　ＡＴＰ（８μｌ）、Ｔ、Ｉ）ＮＡりが−
ゼ（１６単位、４μｌ）、すｒ−ジョン緩衝液８μｌか
ら成る総量４０μｌの反応液を２２℃で一夜保温した。
生成りＮＡｆエタノールで沈殿させ１１．沈殿を４０μ
ｌに溶解した。再連結されたＤＮＡｆ′ｉ実施例１と同
様に、宿主Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｒ）、−ｒｎｋ−に
形質転換により導入された。得られたアンピシリン耐性
形質転換法、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｒ／、−ｍｋ−（
ｐｃＲ’ｌ　１３　）はプラスミドｐＣＲ７１３を保有
する。
実施例　４　プラスミドｐｃＲ１１４の組み立て実施例
４で侍られたｐｃＲ’１０１２ａｇ（ｘｓμＪ）、　Ｃ
Ｌａ　１（１８単位、ａｐｌ）、Ｃ１ａ　Ｉ緩衝ｆｊ、
５ｐｌ、Ｈ２Ｏ２７／ｊＡ！から成る総量５０μノの反
応液を３７℃で２時間保温して、ｐｃＲＴＯｌをｃｌａ
　Ｉで消化した。生成物をエタノールで沈殿させ、４１
．５μＩＨ，０に溶解した。この溶液に２０ｙａＭ　ｄ
ＣＴＰ（１，２５μｌ）、２０ｙａ　ノＶ　ｄＧＴＰ＜
　１．２　ｓ　μ　４？　）　、　ＤＮＡ　ポ　リメラ
ーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ　＠片１（１，５単位、１μ７
り、ポリメラーゼ緩衝ｇ、（５μ６）ｋ加え、＾ポ量５
０μｌとして、３０℃で１０分間保温した。
反応をフェノール処理により停止し、フェノールをエー
テル抽出により除去し、生成りＮＡ２エタノールで沈殿
させ、更に沈殿生成物を２８μｌのＨ，０に溶解させた
。この爵故に、３ｍＭ　ＡＴＰ（６μ））、Ｔ、ＤＮＡ
りが−ゼ（１，８単位、２℃ｇｌ　ｌ、すｌ”　−ショ
ア緩衝１ｆｆｌ　（４μｌ　）　ｆ加え、最終容量４０
μノとし２２℃で一夜保温した。生成り　＃　Ａ　／−
ｚエタノールで沈殿させ、沈殿を４０μｌに溶解させた
。再連結されたＤＮＡ′ｆ：実施例ｌと同様に、宿主Ｅ
、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｒｋ−ｍｋ−に形質転換により導
入した。得られた了ニビシリン耐性形質転換株、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　Ｃ６００ｒ１．−ｔｎｋ−（ｐｃＲ’１１４）
はプラスミドｐｃＲ７１４を保有する、 実施例　５　＠現実験 プラスミドｐｃＲ’ｌ　１１、ｐｃＲＴ１２、ｐｃＲ７
１３、ｐｃＲ’ｌ　１４を保有する形質転換株をＬＢ培
地中、３７°Ｃで一夜培養した陵、培養物１ｍ１ｋ：１
０℃君の新軒なＭ９培地に接種し、１時間培養した。そ
れに１５μＩ　／　ｍｌの３−ベーターインドールアク
リル酸を添加し、３時間培養した。培養により入腸菌は
４．０Ｘ１０’細胞ｍｅの密度まで生育した。培養後、
遠心分離により集菌し、これｆｌｍＭ　ｐＭ５Ｆ（フェ
ニルメチルスルホニルフルオライド）を含有するＰＢＳ
緩衝液（２０惧−Ｈリン酸ナトリウム緩衝剤中１５０ｍ
Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ７，ｏ）３−に懸濁させ
た。この１１１１濁液に２５０ｍＭのＥＤＴＡ（６０ｔ
ｔｌ）と１０ｑ／ｌのリゾチーム（３０μｌ）を加え０
℃で３０分間保温した。生成したスフエロプラスト（５
ｐｅｒｏｐｔａｓｔ　ｌを音波で破壊し、これに尿素を
加えて、尿素の最終ｃｒＮ　Ｉｆ　’ｃ　８　Ｍとした
。細胞処理溶解物（ｃｔｔｌｌ　ｌｙｇａｔｅ　）　ｆ
３７℃で１時間保温した。これを３００００ｒｍｐで３
０分間遠心分離にかけた後、上澄液をｐ　Ｈ５緩価液に
透析し、Ｔノ髪析故に競合結合ラジオイムノアッセイ（
ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃｏｍｐｇｔｉｔｉｖｅ　ｒａｄｉｏ
ｉｍｍｕ−ｎｏａｓｓａｙ）を適用した。標準的ｆｒ千
法ｌｌ１ｉタリえば、西森らＧｏｎｅ、１９．３３７（
１９８２１に記載されている。
前記の音波処理した無細胞抽出ｆＬを４Ｍ尿素で処理し
、遠心分離した後、ＳＤＳ／Ｉ′″ル翫気泳拗にかけた
。移動した蛋白をニトロセルローゼ上に転写し、プロキ
モシン抗体と結合するバンドをオートラジオグラフで検
出した（蛋白プロティング法）。
いづれのプラスミドを保有する大腸菌についても、標品
プロキモシンに対応するバンドが観察された。
この帯の密度と標品のそれと比較することにより定量的
にプロキモシンの量が、算出された。会Ｏ寺ゾロキモシ
ン産生能はｐｃＲｌ　１２）Ｔ）ＣＲ７０１≧ｐＣＲ７
１１＞ｐｃＲ７１４＞ｐＣＲ７１３の順で４漁のｐｃＲ
’ｌ　０１と比べるとｐｃＲ７１２は実に約２５倍の発
現効果を示した。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドｐｃＲＴ　０１の制限酵素地図であ
る。 第２図りよプラスミドｐｃＲＴ　０１、ｐ　ＣＲ７１１
、ｐｃＲ’ｌ　１２、ｐｃＲｌ　１３、ｐｃＲ’ｌ　１
４のＳＤ配列とＡＴＧ開始コドンとの間の塩基配列とｐ
ｃＲ’１０１から他のプラスミドを溝成するフローチャ
ートを示す。 特許出願人　別　府　輝　彦 外１名

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、Ｅ、ｃｏｌｉ、ｔｒｐプａモーター、オＳ　Ｖ　−
    ｐ−系とプロキモシン・ｃｌ）’ＨＡ全配列から成り、
    大腸菌宿主細胞内でｔｒｐ７″ロモーター制御下、プロ
    キモシンｃｌＪ）ＨＡ全全長発現可能な発現型組換えプ
    ラスミドであって、該ＱＤＮＡのＮ末端にＡＴＧ開始コ
    ドンが接続され、そして該プロモーター領域内のＳＩ）
    配列とＡＴＧ開始コドンとの間の塩基対が高発現率を与
    えるように構成されていることを特徴とするプラスミド
    。 のプラスミド。 α）ＧＴＡＴＣＧ　ｂ　）ＧＴＣＧＡＴＣＡＴＡＧＣＣ
    ＡＧＣ１’Ａ ｃ　）ＧＴＡＴＣＧＡＴ ＣＡＴＡＧＣＴＡ 記載のプラスミド。 ４、　次の工程よ構成るｐｃＲ７１１プラスミドの構成
    方法。 ａ）ｆラスミドｐｃＲ’ｌＯ１をノｌ１ｎｄＩＩＪで消
    化すること、 ｂ）斯くで切断された一本鎖構造部分をＤＮＡポリメラ
    ーゼにより修復すること、 ｃ　）　Ｔ４Ｄ’ＮＡ　ＩＪガーゼを用いて上記修復さ
    れた平滑末端を連結すること。 ５　次の工程より成るｐｃＲ７１２プラスミド又はｐｃ
    Ｒ’ｌ１３プラスミドの構成方法。 α）プラスミドｐｃＲ’１０１をＨｉｎｄ　ｉｌｌで消
    化すること、 ｂ）斯くて切断された一本鎖構造部分をヌクレアーゼＳ
    １で分解薩去すること、 ｃ）Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて切断末端を連結する１
    こと。 ６、　次の工程よ構成るｐｃＲ’ｌ　１４グラスミドの
    構成方法。 ａ）プラスミド１３ＣＲ７１２ヲ’ｃｌａ　Ｉ　テ消化
    ｆること、 ｂ　）ｄＧＴＰ　、ｄＣＴＰの存在下、ＤＮＡポリメラ
    ーゼで斯くて切断された一本鎖構造部分を部分的に修復
    すること、 ｃ）Ｔ４１Ｊ）ＨＡ’）ガーゼを用いて切断末端を連結
    すること。 ７、発現プラスミドｐ（１’Ｒ７１１，７１２゜７１３
    ．７１４からなる群から選択されたプラスミドを形質転
    換により大腸菌宿主に導入し、得られた形質転換株を培
    養することを％徴とするプロキモシ／の製法。 ９　発現プラスミドｐＣＲ７１１、７１２。 ７１３．７１４からなる群から選択されたプラスミドで
    形質転換された大腸菌。 １０、大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ６００ｒｋ−ｍｋ−（ｐ
    ｃＲ７１２＞（機工研ＦＥＲｋｆ−ＢＰ−Ｓｏ２号）。 １１、機工研に受託番号ＦＥＲＭＢＰ　−５０２号とし
    て寄託された大腸菌中に見い出される組換えプラスミド
    ｐｃＲＴ　１２゜
JP59044901A 1984-03-09 1984-03-09 仔牛プロキモシンｃＤΝＡの全配列を有する新規な発現プラスミド Granted JPS60188077A (ja)

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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3514113A1 (de) * 1985-04-19 1986-10-23 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Veraenderung der dna-sequenz zwischen shine-dalgarno-sequenz und startcodon des trp-operons zur steigerung der proteinexpression
IT1221765B (it) * 1986-05-07 1990-07-12 Eniricerche Spa Sequenza nucleotidica capace di indurre alti livelli di traduzione di un gene eterologo in bacillus subtilis ed escherichia coli
US5045471A (en) * 1986-12-02 1991-09-03 The Regents Of The University Of California Cloned DNA for P450scc and expression thereof
JPH05505308A (ja) * 1990-03-13 1993-08-12 ハワイ・バイオテクノロジー・グループ・インコーポレイテツド アオパンカビ発現システム
EP1745068A4 (en) * 2004-03-30 2009-11-04 Sudershan Biotech Ltd RECOMBINANT CALM CHYMOSIN AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS589687A (ja) * 1981-06-17 1983-01-20 セルテク　リミテッド ポリペプチドの生産方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666847A (en) * 1981-01-16 1987-05-19 Collaborative Research, Inc. Recombinant DNA means and method
IE53517B1 (en) * 1981-06-17 1988-12-07 Celltech Ltd Process for the production of a polypeptide
JPS58110600A (ja) * 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
JPS59166086A (ja) * 1983-03-09 1984-09-19 Teruhiko Beppu 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS589687A (ja) * 1981-06-17 1983-01-20 セルテク　リミテッド ポリペプチドの生産方法

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