JPH0673463B2 - Ｌ−トリプトフアンの製造法 - Google Patents
Ｌ−トリプトフアンの製造法Info
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- JPH0673463B2 JPH0673463B2 JP5124781A JP12478193A JPH0673463B2 JP H0673463 B2 JPH0673463 B2 JP H0673463B2 JP 5124781 A JP5124781 A JP 5124781A JP 12478193 A JP12478193 A JP 12478193A JP H0673463 B2 JPH0673463 B2 JP H0673463B2
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はトリプトフアンシンター
ゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を有する新規
なプラスミドに関し、さらに詳しくは、宿主内に安定に
維持することのできる、トリプトフアンシンターゼの生
合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片、例えばトリプトフ
アンオペロンを有するプラスミドで形質転換されたエシ
エリヒア・コリを用いるＬ−トリプトフアンの製造法に
関する。
ゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を有する新規
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維持することのできる、トリプトフアンシンターゼの生
合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片、例えばトリプトフ
アンオペロンを有するプラスミドで形質転換されたエシ
エリヒア・コリを用いるＬ−トリプトフアンの製造法に
関する。
【０００２】
【従来の技術および課題】トリプトフアンオペロンのク
ローニングについては従来からいろいろと研究されてい
るが、例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１１８、２５３
（１９８０）に記載されているように、宿主内での安定
性に問題があり、トリプトフアンの工業的製造に応用す
るには多くの困難があると考えられている。
ローニングについては従来からいろいろと研究されてい
るが、例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ
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性に問題があり、トリプトフアンの工業的製造に応用す
るには多くの困難があると考えられている。
【０００３】一方、プラスミドの宿主内での安定性にお
いて、応用的に最も重要な要素は一般に宿主の継代培養
におけるプラスミドの脱落現象である。そのため、従来
よりプラスミドの脱落を防止するために種々の試みがな
されており、例えば、エシエリヒア属のストレプトマイ
シンに依存しないという性質を司る染色体遺伝子ＤＮＡ
フラグメントが組み込まれたプラスミドを、エシエリヒ
ア属のストレプトマイシン依存性変異株に含有せしめ
て、プラスミドを含有する微生物の性質を安定化する方
法が提案されている（特開昭５５−１５６５９１号公
報）。しかしながら、かかる方法は経済的に問題がある
のみならず、目的のプラスミドに複雑な機能を組み込む
必要があるため、宿主の分裂増殖時にプラスミドが安定
に娘細胞に分配され難いことが予想され、工業的に応用
するにはかなりの問題がある。
いて、応用的に最も重要な要素は一般に宿主の継代培養
におけるプラスミドの脱落現象である。そのため、従来
よりプラスミドの脱落を防止するために種々の試みがな
されており、例えば、エシエリヒア属のストレプトマイ
シンに依存しないという性質を司る染色体遺伝子ＤＮＡ
フラグメントが組み込まれたプラスミドを、エシエリヒ
ア属のストレプトマイシン依存性変異株に含有せしめ
て、プラスミドを含有する微生物の性質を安定化する方
法が提案されている（特開昭５５−１５６５９１号公
報）。しかしながら、かかる方法は経済的に問題がある
のみならず、目的のプラスミドに複雑な機能を組み込む
必要があるため、宿主の分裂増殖時にプラスミドが安定
に娘細胞に分配され難いことが予想され、工業的に応用
するにはかなりの問題がある。
【０００４】そこで、本発明者らは、トリプトフアンシ
ンターゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片、例え
ばトリプトフアンオペロンを、親細胞から娘細胞へと継
代的に安定に分配することを可能にする機能をもつプラ
スミドについて鋭意研究を行ない、Ｆ因子プラスミドに
由来する増殖制御分配系を司る遺伝子を含む画分がプラ
スミドの安定化に大きく寄与していることに着目し、先
に、トリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を
含むＤＮＡ断片と、Ｆ因子プラスミドの増殖制御分配系
を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片とを有することを特徴と
する新規なプラスミド、殊に本発明者らがプラスミドｐ
ＭＴＹ−１と称するプラスミドを創製し提案した（特開
昭６０−２１８９号公報参照）。しかし、この新規なプ
ラスミドｐＭＴＹ−１は菌体内で不安定な遺伝子の産物
を産生させるには有用であるが、コピー数が１〜２個と
少なく、菌体内で遺伝子産物を著量産生させる場合には
効率が低いという難点がある。
ンターゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片、例え
ばトリプトフアンオペロンを、親細胞から娘細胞へと継
代的に安定に分配することを可能にする機能をもつプラ
スミドについて鋭意研究を行ない、Ｆ因子プラスミドに
由来する増殖制御分配系を司る遺伝子を含む画分がプラ
スミドの安定化に大きく寄与していることに着目し、先
に、トリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を
含むＤＮＡ断片と、Ｆ因子プラスミドの増殖制御分配系
を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片とを有することを特徴と
する新規なプラスミド、殊に本発明者らがプラスミドｐ
ＭＴＹ−１と称するプラスミドを創製し提案した（特開
昭６０−２１８９号公報参照）。しかし、この新規なプ
ラスミドｐＭＴＹ−１は菌体内で不安定な遺伝子の産物
を産生させるには有用であるが、コピー数が１〜２個と
少なく、菌体内で遺伝子産物を著量産生させる場合には
効率が低いという難点がある。
【０００５】従って、形質転換された微生物菌体内での
コピー数が多く、形質発現効率が高く、しかも安定で脱
落が少なく親細胞から娘細胞へと継代的に確実に分配さ
れるプラスミドを開発することが望まれる。
コピー数が多く、形質発現効率が高く、しかも安定で脱
落が少なく親細胞から娘細胞へと継代的に確実に分配さ
れるプラスミドを開発することが望まれる。
【０００６】そこで、本発明者らはエシエリヒア・コリ
のＣｏｌＥ１系プラスミドが通常細胞染色体当り数十個
のコピー数を有することに着目し、今回、ＣｏｌＥ１系
プラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片
と、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分配系を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片と、上記のトリプトフアンシン
ターゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片とを組合
せることにより、コピー数が多くしかも継代的に安定に
分配可能なプラスミドを創製することに成功し、該プラ
スミドで形質転換されたエシエリヒア・コリを用いれば
効率的にＬ−トリプトフアンの製造が可能なことを見い
出し、本発明を完成するに至った。
のＣｏｌＥ１系プラスミドが通常細胞染色体当り数十個
のコピー数を有することに着目し、今回、ＣｏｌＥ１系
プラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片
と、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分配系を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片と、上記のトリプトフアンシン
ターゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片とを組合
せることにより、コピー数が多くしかも継代的に安定に
分配可能なプラスミドを創製することに成功し、該プラ
スミドで形質転換されたエシエリヒア・コリを用いれば
効率的にＬ−トリプトフアンの製造が可能なことを見い
出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】しかして、本発明によれ
ば、トリプトフアンオペロンに由来するトリプトフアン
シンターゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片と、
Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分配系を司る遺伝
子を含むＤＮＡ断片と、ＣｏｌＥ１系プラスミドの自律
増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を有するプラスミ
ドで形質転換されたエシエリヒア・コリの培養物又はそ
の処理物の存在下に、インドールとＬ−又はＤＬ−セリ
ンとを反応せしめることを特徴とするＬ−トリプトフア
ンの製造方法が提供される。
ば、トリプトフアンオペロンに由来するトリプトフアン
シンターゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片と、
Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分配系を司る遺伝
子を含むＤＮＡ断片と、ＣｏｌＥ１系プラスミドの自律
増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を有するプラスミ
ドで形質転換されたエシエリヒア・コリの培養物又はそ
の処理物の存在下に、インドールとＬ−又はＤＬ−セリ
ンとを反応せしめることを特徴とするＬ−トリプトフア
ンの製造方法が提供される。
【０００８】本発明の方法に用いるプラスミドを構成す
る「トリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を
含むＤＮＡ断片」（以下「Ｔ画分」と略称することがあ
る）とは、インドールとＬ−又はＤＬ−セリンからＬ−
トリプトフアンの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片
を意味し、しかして、Ｔ画分にはトリプトフアンオペロ
ン又はトリプトフアンオペロンを含むもっと大きなＤＮ
Ａ断片、或いは、トリプトフアンオペロン中のトリプト
フアンシンターゼの生合成を司る遺伝子であるＴｒｐＡ
とＴｒｐＢにプロモーター及びオペレーターを結合した
ＤＮＡ断片、又はＴｒｐＡとＴｒｐＢにＴｒｐＣ、Ｔｒ
ｐＤ及びＴｒｐＥの少なくとも１種とプロモーター及び
オペレーターを結合したＤＮＡ断片（例えば、Ｔｒｐ
Ａ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＤ及びＴｒｐＥにプロ
モーター及びオペレーターが結合したＤＮＡ断片）等が
包含される。これらのＴ画分としては実用的には大腸菌
（エシエリヒア・コリ）由来のものが好適に使用され
る。このＴ画分の供給源としては特に制限はないが、エ
シエリヒア・コリＡＴＣＣ２３２８２、エシエリヒア・
コリＡＴＣＣ２３４３７、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ
２３４６１等が有利に使用される。
る「トリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を
含むＤＮＡ断片」（以下「Ｔ画分」と略称することがあ
る）とは、インドールとＬ−又はＤＬ−セリンからＬ−
トリプトフアンの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片
を意味し、しかして、Ｔ画分にはトリプトフアンオペロ
ン又はトリプトフアンオペロンを含むもっと大きなＤＮ
Ａ断片、或いは、トリプトフアンオペロン中のトリプト
フアンシンターゼの生合成を司る遺伝子であるＴｒｐＡ
とＴｒｐＢにプロモーター及びオペレーターを結合した
ＤＮＡ断片、又はＴｒｐＡとＴｒｐＢにＴｒｐＣ、Ｔｒ
ｐＤ及びＴｒｐＥの少なくとも１種とプロモーター及び
オペレーターを結合したＤＮＡ断片（例えば、Ｔｒｐ
Ａ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＤ及びＴｒｐＥにプロ
モーター及びオペレーターが結合したＤＮＡ断片）等が
包含される。これらのＴ画分としては実用的には大腸菌
（エシエリヒア・コリ）由来のものが好適に使用され
る。このＴ画分の供給源としては特に制限はないが、エ
シエリヒア・コリＡＴＣＣ２３２８２、エシエリヒア・
コリＡＴＣＣ２３４３７、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ
２３４６１等が有利に使用される。
【０００９】本発明の方法で用いるプラスミドは前述し
たように、上記のＴ画分を、Ｆ因子プラスミドに由来す
る増殖制御分配系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片と組合
わせる点に１つの特徴を有する。Ｆ因子プラスミドは例
えば「蛋白質 核酸 酵素」第２７巻第１号（１９８
２）の９８頁の図１の遺伝子地図及びＥｃｏＲＩによる
物理的地図に示される如き構造をもつ、分子量が９４．
５ｋｂ（６２×１０6ｄｏｌｔｏｎ）の既知のプラスミ
ドであり、大腸菌などの腸内細菌中に通常１細胞染色体
当り１〜２個のコピー数で存在し、従って染色体が細胞
当り２個あるとすればＦ因子プラスミドとしては２〜４
個しか担われていない。このプラスミドは細胞分裂時に
ちょうど倍化してそれぞれの娘細胞に正確に伝達される
ような機構を備えている（このように、コピー数を低い
レベルに保ちつつ、正確に宿主の増殖とペースを合わせ
て増やす仕組みをｓｔｒｉｎｇｅｎｔな増殖の制御と呼
んでいる）。Ｆ因子プラスミドにおけるこのようなｓｔ
ｒｉｎｇｅｎｔな増殖の制御機能が、ｍｉｎｉ−Ｆと呼
ばれる分子量が９．１ｋｂの自律増殖できる断片に担わ
れていることも既に究明されており、このｍｉｎｉ−Ｆ
がＦ因子プラスミドより制限酵素ＥｃｏＲＩにより切り
出し可能であることも知られている。
たように、上記のＴ画分を、Ｆ因子プラスミドに由来す
る増殖制御分配系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片と組合
わせる点に１つの特徴を有する。Ｆ因子プラスミドは例
えば「蛋白質 核酸 酵素」第２７巻第１号（１９８
２）の９８頁の図１の遺伝子地図及びＥｃｏＲＩによる
物理的地図に示される如き構造をもつ、分子量が９４．
５ｋｂ（６２×１０6ｄｏｌｔｏｎ）の既知のプラスミ
ドであり、大腸菌などの腸内細菌中に通常１細胞染色体
当り１〜２個のコピー数で存在し、従って染色体が細胞
当り２個あるとすればＦ因子プラスミドとしては２〜４
個しか担われていない。このプラスミドは細胞分裂時に
ちょうど倍化してそれぞれの娘細胞に正確に伝達される
ような機構を備えている（このように、コピー数を低い
レベルに保ちつつ、正確に宿主の増殖とペースを合わせ
て増やす仕組みをｓｔｒｉｎｇｅｎｔな増殖の制御と呼
んでいる）。Ｆ因子プラスミドにおけるこのようなｓｔ
ｒｉｎｇｅｎｔな増殖の制御機能が、ｍｉｎｉ−Ｆと呼
ばれる分子量が９．１ｋｂの自律増殖できる断片に担わ
れていることも既に究明されており、このｍｉｎｉ−Ｆ
がＦ因子プラスミドより制限酵素ＥｃｏＲＩにより切り
出し可能であることも知られている。
【００１０】本発明で用いるプラスミドはこのｍｉｎｉ
−Ｆに担われている増殖制御分配系を利用するものであ
り、しかして「Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分
配系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片」「以下Ｆ画分と略
称することがある）とは、上述したようなＦ因子プラス
ミドを娘細胞に正確に伝達する機構を備えた遺伝子ＤＮ
Ａを意味し、そのようなＦ画分の代表例としては約９．
１ｋｂの分子量を有するｍｉｎｉ−Ｆ断片が挙げられ
る。
−Ｆに担われている増殖制御分配系を利用するものであ
り、しかして「Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分
配系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片」「以下Ｆ画分と略
称することがある）とは、上述したようなＦ因子プラス
ミドを娘細胞に正確に伝達する機構を備えた遺伝子ＤＮ
Ａを意味し、そのようなＦ画分の代表例としては約９．
１ｋｂの分子量を有するｍｉｎｉ−Ｆ断片が挙げられ
る。
【００１１】さらに、本発明で用いるプラスミドにおい
て上記Ｔ画分及びＦ画分と組合わせて使用される「Ｃｏ
ｌＥ１系プラスミドの自律増殖を司る遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片」（以下「Ｓ画分」という）は、コピー数が１細
胞染色体当り２０〜３０個であるＣｏｌＥ１系プラスミ
ドの自律増殖を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を意味し、
そのようなＳ画分の代表例としては約４．３ｋｂの長さ
を有するプラスミドｐＢＲ３２２のＳ画分が挙げられ、
その他にプラスミドｐＢＲ３２５等のＳ画分がある。
て上記Ｔ画分及びＦ画分と組合わせて使用される「Ｃｏ
ｌＥ１系プラスミドの自律増殖を司る遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片」（以下「Ｓ画分」という）は、コピー数が１細
胞染色体当り２０〜３０個であるＣｏｌＥ１系プラスミ
ドの自律増殖を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を意味し、
そのようなＳ画分の代表例としては約４．３ｋｂの長さ
を有するプラスミドｐＢＲ３２２のＳ画分が挙げられ、
その他にプラスミドｐＢＲ３２５等のＳ画分がある。
【００１２】本発明で用いるプラスミドは、以上に述べ
たＴ画分、Ｆ画分及びＳ画分の３つの必須の遺伝子画分
を有する限り、他の遺伝子画分、例えば抗生物質耐性マ
ーカーであるアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断
片、カナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片等をさら
に含みうるが、１つの典型的な具体例はＴ画分、Ｆ画分
及びＳ画分の３つの画分から実質的になり、分子量が約
１３．７メガダルトン（約２０．８ｋｂ）のプラスミド
で、本発明者らが「プラスミドｐＭＴＹ−２」と命名し
たものである。なお、本明細書において、プラスミドの
分子量はアガロースゲル電気泳動法により測定した値で
ある。
たＴ画分、Ｆ画分及びＳ画分の３つの必須の遺伝子画分
を有する限り、他の遺伝子画分、例えば抗生物質耐性マ
ーカーであるアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断
片、カナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片等をさら
に含みうるが、１つの典型的な具体例はＴ画分、Ｆ画分
及びＳ画分の３つの画分から実質的になり、分子量が約
１３．７メガダルトン（約２０．８ｋｂ）のプラスミド
で、本発明者らが「プラスミドｐＭＴＹ−２」と命名し
たものである。なお、本明細書において、プラスミドの
分子量はアガロースゲル電気泳動法により測定した値で
ある。
【００１３】以下、このプラスミドｐＭＴＹ−２につい
てさらに詳細に説明する。
てさらに詳細に説明する。
【００１４】プラスミドｐＭＴＹ−２の下記の制限酵素
の感受性（認識部位の数）及び該制限酵素による分解断
片の長さ（ｋｂ）は下記の表に示すとおりである。
の感受性（認識部位の数）及び該制限酵素による分解断
片の長さ（ｋｂ）は下記の表に示すとおりである。
【００１５】
【表１】 制限酵素 認識部位の数 分解断片の長さ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ 2 11.7、9.1 ＢａｍＨＩ 3 17.8、2.4、0.6 Ｓａｌ Ｉ 2 17.0、3.8 Ａｖａ Ｉ 1 20.8 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 4 14.4、3.0、2.6、0.8 Ｐｓｔ Ｉ 5 14.1、3.0、1.8、1.5、0.4 以上に述べた如き特性をもつ本発明で用いるプラスミド
ｐＭＴＹ−２は、例えば次のようにして製造することが
できる。
ｐＭＴＹ−２は、例えば次のようにして製造することが
できる。
【００１６】まず、トリプトフアンオペロンを含むＤＮ
Ａ断片（Ｔ画分）の調製は、例えば、染色体遺伝子中に
トリプトフアンオペロンをもつ大腸菌、例えば、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２（ＩＦＯ３３０
１、ＡＴＣＣ１０７９８、ＡＴＣＣ ｅ２３５６２）な
どに、フアージ、例えばフアージφ８０（ＡＴＣＣ１１
４５６ａ−Ｂ１）などを感染させ、溶源化及び誘発現象
を利用して、フアージＤＮＡ中にトリプトフアンオペロ
ンを取り込んだフアージを大量に調製し［Ｒ．Ｍ．Ｄｅ
ｎｎｅｙ，Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙ；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．，１１８、５０５（１９７４）参照］、それから
常法［Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８２）
ｐ．１６４〜１６５、Ｃｏｌｄ Ｓｐｉｎ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照］に従ってフアージＤＮ
Ａを抽出し、制限酵素、例えばＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ
等を用いてトリプトフアンオペロンを含むＤＮＡ断片を
切り出すことにより行なうことができる。
Ａ断片（Ｔ画分）の調製は、例えば、染色体遺伝子中に
トリプトフアンオペロンをもつ大腸菌、例えば、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２（ＩＦＯ３３０
１、ＡＴＣＣ１０７９８、ＡＴＣＣ ｅ２３５６２）な
どに、フアージ、例えばフアージφ８０（ＡＴＣＣ１１
４５６ａ−Ｂ１）などを感染させ、溶源化及び誘発現象
を利用して、フアージＤＮＡ中にトリプトフアンオペロ
ンを取り込んだフアージを大量に調製し［Ｒ．Ｍ．Ｄｅ
ｎｎｅｙ，Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙ；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．，１１８、５０５（１９７４）参照］、それから
常法［Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８２）
ｐ．１６４〜１６５、Ｃｏｌｄ Ｓｐｉｎ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照］に従ってフアージＤＮ
Ａを抽出し、制限酵素、例えばＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ
等を用いてトリプトフアンオペロンを含むＤＮＡ断片を
切り出すことにより行なうことができる。
【００１７】他方、ｍｉｎｉ Ｆ断片の調製は、例え
ば、Ｆ因子プラスミドを保有する微生物、例えば、大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ１５１５３、
ＡＴＣＣ ｅ２３５８９、ＡＴＣＣ ｅ２３５９０）等
からそれ自体公知の方法で、例えばＰ．Ｇｕｅｒｒｙ，
Ｄ．Ｌ．ＬｅＢｌａｎｃ，Ｓ．Ｆａｌｋｏｗ；Ｊ．Ｂａ
ｃｔ．，１１６、１０６４（１９７３）等の文献に記載
の方法でＦ因子プラスミドを取り出し、それから制限酵
素ＥｃｏＲＩを用いて分子量が約９．１ｋｂのｍｉｎｉ
Ｆ断片を切り出すことにより調製することができる。
ば、Ｆ因子プラスミドを保有する微生物、例えば、大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株（ＡＴＣＣ１５１５３、
ＡＴＣＣ ｅ２３５８９、ＡＴＣＣ ｅ２３５９０）等
からそれ自体公知の方法で、例えばＰ．Ｇｕｅｒｒｙ，
Ｄ．Ｌ．ＬｅＢｌａｎｃ，Ｓ．Ｆａｌｋｏｗ；Ｊ．Ｂａ
ｃｔ．，１１６、１０６４（１９７３）等の文献に記載
の方法でＦ因子プラスミドを取り出し、それから制限酵
素ＥｃｏＲＩを用いて分子量が約９．１ｋｂのｍｉｎｉ
Ｆ断片を切り出すことにより調製することができる。
【００１８】他方、ＣｏｌＥ１プラスミドの自律増殖を
司る遺伝子を含むＤＮＡ断片の供給源としては、Ｃｏｌ
Ｅ１プラスミドとして代表的なプラスミドｐＢＲ３２２
を使用するのが便利である。
司る遺伝子を含むＤＮＡ断片の供給源としては、Ｃｏｌ
Ｅ１プラスミドとして代表的なプラスミドｐＢＲ３２２
を使用するのが便利である。
【００１９】上記の如くして調製されたトリプトフアン
オペロンを含むＤＮＡ断片（Ｔ画分）を、まず、このＴ
画分の切り出しに用いたと同じ制限酵素で処理したプラ
スミドｐＢＲ３２２と一緒にし、Ｔ４フアージ由来のリ
ガーゼのようなリガーゼを作用させて、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２に上記Ｔ画分が組み込まれたプラスミドを作成
する。次いで、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで
開裂させ、上記のようにして調製されたｍｉｎｉ Ｆ断
片と一緒にし、リガーゼを作用させて結合させることに
より、目的とするプラスミドｐＭＴＹ−２を得ることが
できる。
オペロンを含むＤＮＡ断片（Ｔ画分）を、まず、このＴ
画分の切り出しに用いたと同じ制限酵素で処理したプラ
スミドｐＢＲ３２２と一緒にし、Ｔ４フアージ由来のリ
ガーゼのようなリガーゼを作用させて、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２に上記Ｔ画分が組み込まれたプラスミドを作成
する。次いで、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで
開裂させ、上記のようにして調製されたｍｉｎｉ Ｆ断
片と一緒にし、リガーゼを作用させて結合させることに
より、目的とするプラスミドｐＭＴＹ−２を得ることが
できる。
【００２０】なお、プラスミドｐＭＴＹ−２の具体的調
製法については後記参考例１で詳細に説明する。
製法については後記参考例１で詳細に説明する。
【００２１】このようにして調製される本発明で用いる
プラスミドは、コピー数が多く、宿主の細胞分裂に際し
て娘細胞に受け継がれる際に脱落することが少なく安定
であるという優れた特性を有する。
プラスミドは、コピー数が多く、宿主の細胞分裂に際し
て娘細胞に受け継がれる際に脱落することが少なく安定
であるという優れた特性を有する。
【００２２】従って、このプラスミドはトリプトフアン
の製造において工業的に応用することが大いに期待され
る。トリプトフアンの製造に際しては、上記で詳述した
プラスミドで宿主が形質転換される。この形質転換に利
用できる宿主菌としては、例えば、大腸菌、枯草菌、サ
ツカロマイセス等が考えられるが、これらの中でも大腸
菌（エシエリヒア・コリ）が好ましい。更に、これらの
宿主菌をトリプトフアン要求性変異株としたものが特に
好ましいものである。
の製造において工業的に応用することが大いに期待され
る。トリプトフアンの製造に際しては、上記で詳述した
プラスミドで宿主が形質転換される。この形質転換に利
用できる宿主菌としては、例えば、大腸菌、枯草菌、サ
ツカロマイセス等が考えられるが、これらの中でも大腸
菌（エシエリヒア・コリ）が好ましい。更に、これらの
宿主菌をトリプトフアン要求性変異株としたものが特に
好ましいものである。
【００２３】また、これら宿主菌に対する上記のプラス
ミドの導入はそれ自体公知の方法、例えばＭ．Ｍａｎｄ
ｅｌ，Ａ．Ｈｉｇａ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３、１
５９（１９７０）等の文献に記載の方法で行なうことが
できる。
ミドの導入はそれ自体公知の方法、例えばＭ．Ｍａｎｄ
ｅｌ，Ａ．Ｈｉｇａ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３、１
５９（１９７０）等の文献に記載の方法で行なうことが
できる。
【００２４】このようにして形質転換された宿主菌はそ
れ自体公知の方法で培養することにより、トリプトフア
ンシンターゼを菌体内に充分に生産蓄積させた後、イン
ドールとＬ−又はＤＬ−セリンとからＬ−トリプトフア
ンを製造する際の酵素反応に利用することができる。培
養された菌体を該酵素反応に利用する場合、該菌体はそ
のままで使用することができるが、該菌体を超音波処理
等で破砕した破砕物、又はその破砕物をさらに水等で抽
出した抽出物、或いは該抽出物をさらに硫安等で処理し
て酵素成分を沈殿させた粗精製物の形で使用することも
でき、さらに、該菌体又はこれら処理物は必要により固
定化して用いることもできる。
れ自体公知の方法で培養することにより、トリプトフア
ンシンターゼを菌体内に充分に生産蓄積させた後、イン
ドールとＬ−又はＤＬ−セリンとからＬ−トリプトフア
ンを製造する際の酵素反応に利用することができる。培
養された菌体を該酵素反応に利用する場合、該菌体はそ
のままで使用することができるが、該菌体を超音波処理
等で破砕した破砕物、又はその破砕物をさらに水等で抽
出した抽出物、或いは該抽出物をさらに硫安等で処理し
て酵素成分を沈殿させた粗精製物の形で使用することも
でき、さらに、該菌体又はこれら処理物は必要により固
定化して用いることもできる。
【００２５】該菌体又はその処理物の存在下でのインド
ールとＬ−又はＤＬ−セリンとの反応は、通常の酵素反
応と同様に例えば０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜
９．０）あるいは水（ｐＨ７．０〜９．０）等の溶媒中
で、約２０〜約５０℃、好ましくは約３０〜約４０℃の
温度で通常約１０〜約７２時間行なわれる。
ールとＬ−又はＤＬ−セリンとの反応は、通常の酵素反
応と同様に例えば０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜
９．０）あるいは水（ｐＨ７．０〜９．０）等の溶媒中
で、約２０〜約５０℃、好ましくは約３０〜約４０℃の
温度で通常約１０〜約７２時間行なわれる。
【００２６】インドールとＬ−又はＤＬ−セリンの反応
時の使用量には特に制限はないが、一般にはそれぞれを
０．１〜２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度範囲で使用する
のが適当である。また、該菌体又はその処理物の使用量
も特に制限されるものではないが、一般に１〜１０％
（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度で使用することができる。
時の使用量には特に制限はないが、一般にはそれぞれを
０．１〜２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度範囲で使用する
のが適当である。また、該菌体又はその処理物の使用量
も特に制限されるものではないが、一般に１〜１０％
（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度で使用することができる。
【００２７】なお、上記形質転換された菌の培養は宿主
菌の種類によって異なるが、一般には、通常用いられる
合成或いは天然培地を用いて行なうことができる。しか
して炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラ
クトース、シュクロース、糖蜜等の種々の炭水化物が使
用できる。また、窒素源としては、トリプトン、酵母エ
キス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物
等の天然有機窒素源が使用できる。天然有機窒素源の多
くは窒素源と共に炭素源にもなり得る。
菌の種類によって異なるが、一般には、通常用いられる
合成或いは天然培地を用いて行なうことができる。しか
して炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラ
クトース、シュクロース、糖蜜等の種々の炭水化物が使
用できる。また、窒素源としては、トリプトン、酵母エ
キス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解物
等の天然有機窒素源が使用できる。天然有機窒素源の多
くは窒素源と共に炭素源にもなり得る。
【００２８】培養は、振盪培養或いは通気撹拌深部培養
などの好気的条件下に行うことができる。培養温度は一
般に２０〜５０℃であり、培地中の培地のｐＨは中性ま
たは微アルカリ性付近に維持することが望ましい。培養
期間は、通常１〜５日である。
などの好気的条件下に行うことができる。培養温度は一
般に２０〜５０℃であり、培地中の培地のｐＨは中性ま
たは微アルカリ性付近に維持することが望ましい。培養
期間は、通常１〜５日である。
【００２９】上記のような培養方法によって得られた菌
体又はその処理物を用いてインドールとＬ−、又はＤＬ
−セリンを反応せしめて得られる、反応液中に生成した
Ｌ−トリプトフアンの分離・精製は、イオン交換樹脂、
活性炭等による吸着、脱着処理等の公知の方法により行
うことができる。
体又はその処理物を用いてインドールとＬ−、又はＤＬ
−セリンを反応せしめて得られる、反応液中に生成した
Ｌ−トリプトフアンの分離・精製は、イオン交換樹脂、
活性炭等による吸着、脱着処理等の公知の方法により行
うことができる。
【００３０】また、上記のプラスミドで形質転換した宿
主菌はＬ−トリプトフアンの発酵法による生産にも利用
することができる。すなわち、本発明のプラスミドで形
質転換した宿主をインドールを含む培地で培養すれば、
培地中にＬ−トリプトフアンが生産蓄積し、これを採取
することによりＬ−トリプトフアンを製造することがで
きる。
主菌はＬ−トリプトフアンの発酵法による生産にも利用
することができる。すなわち、本発明のプラスミドで形
質転換した宿主をインドールを含む培地で培養すれば、
培地中にＬ−トリプトフアンが生産蓄積し、これを採取
することによりＬ−トリプトフアンを製造することがで
きる。
【００３１】
【実施例】参考例１ ： プラスミドｐＭＴＹ−２の造成 （Ａ）ｍｉｎｉ Ｆ断片の調製 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２菌株（ＡＴＣＣ１５１
５３）を１ ｌのＬ培地（Ｂａｃｔｏ トリプトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース１
ｇ、水１ ｌ；ｐＨ７．２）に接種し、約３７℃で約４
時間振盪培養した後、菌体を集め、リゾチウム処理を行
ない且つドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加して
溶菌させた。この溶菌液を３２，０００×ｇで４０分間
遠心分離処理し、上清を分画し、次いで塩化セシウム−
エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離処理を行な
った後、透析処理により、Ｆ因子プラスミドを含む溶液
を分取した。この溶液にエタノール沈殿を行ない、最終
的に約２０μｇのＦ因子プラスミドを採取した。
５３）を１ ｌのＬ培地（Ｂａｃｔｏ トリプトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース１
ｇ、水１ ｌ；ｐＨ７．２）に接種し、約３７℃で約４
時間振盪培養した後、菌体を集め、リゾチウム処理を行
ない且つドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加して
溶菌させた。この溶菌液を３２，０００×ｇで４０分間
遠心分離処理し、上清を分画し、次いで塩化セシウム−
エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離処理を行な
った後、透析処理により、Ｆ因子プラスミドを含む溶液
を分取した。この溶液にエタノール沈殿を行ない、最終
的に約２０μｇのＦ因子プラスミドを採取した。
【００３２】次にｍｉｎｉ Ｆ断片の調製に際して、上
記のＦ因子プラスミドを５μｇとり、制限酵素であるＥ
ｃｏＲＩを３７℃、１時間作用させて該Ｆ因子プラスミ
ドＤＮＡ鎖を切断し、約９．１ｋｂのｍｉｎｉ Ｆ断片
を含むＤＮＡ溶液を調製した。
記のＦ因子プラスミドを５μｇとり、制限酵素であるＥ
ｃｏＲＩを３７℃、１時間作用させて該Ｆ因子プラスミ
ドＤＮＡ鎖を切断し、約９．１ｋｂのｍｉｎｉ Ｆ断片
を含むＤＮＡ溶液を調製した。
【００３３】（Ｂ）フアージφ８０ｐｔの調製 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株（ＩＦＯ３３０１）
を１００ｍｌのＬ培地（組成は前記と同じ）に接種し、
３７℃で約４時間振盪した培養物の０．２ｍｌと、フア
ージφ８０（ＡＴＣＣ１１４５６ａ−Ｂ１）水溶液（１
０5ヶ／ｍｌ）の０．１ｍｌとを、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培
地＋寒天沫）中に混合したのち、Ｌ培地寒天プレート上
に重層する。該プレートを３７℃にて約５時間培養する
とプラーク（溶菌斑）を生じ、さらに２〜３日間３７℃
にて培養を継続すると、プラーク中にフアージφ８０溶
原菌の生育コロニーを生ずる。該溶原菌をＬ培地にて３
７℃で４時間培養後、上記と同じＬ培地寒天プレート上
に塗抹したのち、紫外線照射（４００〜８００ｅｒｇｓ
／ｍｍ2、１０〜２０秒）による溶原フアージの誘発に
よりフアージφ８０ｐｔ（トリプトフアンオペロンを含
むフアージＤＮＡ）を調製する。
を１００ｍｌのＬ培地（組成は前記と同じ）に接種し、
３７℃で約４時間振盪した培養物の０．２ｍｌと、フア
ージφ８０（ＡＴＣＣ１１４５６ａ−Ｂ１）水溶液（１
０5ヶ／ｍｌ）の０．１ｍｌとを、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培
地＋寒天沫）中に混合したのち、Ｌ培地寒天プレート上
に重層する。該プレートを３７℃にて約５時間培養する
とプラーク（溶菌斑）を生じ、さらに２〜３日間３７℃
にて培養を継続すると、プラーク中にフアージφ８０溶
原菌の生育コロニーを生ずる。該溶原菌をＬ培地にて３
７℃で４時間培養後、上記と同じＬ培地寒天プレート上
に塗抹したのち、紫外線照射（４００〜８００ｅｒｇｓ
／ｍｍ2、１０〜２０秒）による溶原フアージの誘発に
よりフアージφ８０ｐｔ（トリプトフアンオペロンを含
むフアージＤＮＡ）を調製する。
【００３４】 （Ｃ）トリプトフアンオペロンを含むＤＮＡ断片の調製 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株（ＩＦＯ３３０１）
を１ ｌの培地（組成は前記と同じ）に接種し、約３７
℃で約３時間振盪培養し、対数増殖期に２５％（ｗ／
ｖ）グルコース溶液１０ｍｌと上記で調製したフアージ
φ８０ｐｔ溶液を１０11ヶ／ｍｌの濃度で添加し（ｍｏ
ｉ ２０）、５時間振盪を継続後常法通りクロロホルム
の添加により、フアージφ８０ｐｔを大量に調製した
［Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ”（１９８２）ｐ．７６〜８０ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照］。
を１ ｌの培地（組成は前記と同じ）に接種し、約３７
℃で約３時間振盪培養し、対数増殖期に２５％（ｗ／
ｖ）グルコース溶液１０ｍｌと上記で調製したフアージ
φ８０ｐｔ溶液を１０11ヶ／ｍｌの濃度で添加し（ｍｏ
ｉ ２０）、５時間振盪を継続後常法通りクロロホルム
の添加により、フアージφ８０ｐｔを大量に調製した
［Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ”（１９８２）ｐ．７６〜８０ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照］。
【００３５】次に取得したフアージφ８０ｐｔ溶液をト
リス緩衝液（ｐＨ７．８）にて透析後、フェノール法に
より、ＤＮＡ抽出法［上記“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ”ｐ．８５参照］によってフアージＤＮＡを
抽出精製し、これに制限酵素ＢａｍＨＩを与え３０℃で
３０分間反応させ、トリプトフアンオペロンを含むＤＮ
Ａ断片を得た。
リス緩衝液（ｐＨ７．８）にて透析後、フェノール法に
より、ＤＮＡ抽出法［上記“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ”ｐ．８５参照］によってフアージＤＮＡを
抽出精製し、これに制限酵素ＢａｍＨＩを与え３０℃で
３０分間反応させ、トリプトフアンオペロンを含むＤＮ
Ａ断片を得た。
【００３６】（Ｄ）プラスミドｐＭＴＹ−２の造成 前記（Ｃ）で得たトリプトフアンオペロンを含むＤＮＡ
断片に制限酵素ＳａｌＩ、ＸｈｏＩを３７℃にて１時間
反応させ、次いで６５℃で５分間熱処理して制限酵素Ｓ
ａｌＩ、ＸｈｏＩを失活させた後、同様に制限酵素Ｓａ
ｌＩで処理したプラスミドｐＢＲ３２２を添加混合し、
ＡＴＰ（アデノシントリフオスフェート）およびＤＴＴ
（ジチオスレイトール）を加え、さらにＴ４フアージ由
来のＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ結合作用を有する；宝酒造
（株）製「Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ」）を添加した後、１
２℃で２４時間反応を行なった。次いで６５℃で５分間
熱処理して、ＤＮＡリガーゼを失活させた後、この反応
液を用いてエシエリヒア・コリＫ−１２系株（トリプト
フアン要求性変異株）を常法（Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ：Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ６９、２１１０
〜２１１４、１９７２）に従い形質転換させ、形質転換
株［Ｔｒｐ要求性の消失、すなわちプラスミド上のトリ
プトフアンオペロンにより生合成可能となり、最少培地
（Ｋ2ＨＰＯ4７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、（ＮＨ4)2ＳＯ4１ｇ、グルコース２
ｇ、純水１ ｌ）上にて生育可能となった菌株］を得
た。この菌株を常法に従い液体培養し、培養液よりプラ
スミドを精製分離した。
断片に制限酵素ＳａｌＩ、ＸｈｏＩを３７℃にて１時間
反応させ、次いで６５℃で５分間熱処理して制限酵素Ｓ
ａｌＩ、ＸｈｏＩを失活させた後、同様に制限酵素Ｓａ
ｌＩで処理したプラスミドｐＢＲ３２２を添加混合し、
ＡＴＰ（アデノシントリフオスフェート）およびＤＴＴ
（ジチオスレイトール）を加え、さらにＴ４フアージ由
来のＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ結合作用を有する；宝酒造
（株）製「Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ」）を添加した後、１
２℃で２４時間反応を行なった。次いで６５℃で５分間
熱処理して、ＤＮＡリガーゼを失活させた後、この反応
液を用いてエシエリヒア・コリＫ−１２系株（トリプト
フアン要求性変異株）を常法（Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ：Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ６９、２１１０
〜２１１４、１９７２）に従い形質転換させ、形質転換
株［Ｔｒｐ要求性の消失、すなわちプラスミド上のトリ
プトフアンオペロンにより生合成可能となり、最少培地
（Ｋ2ＨＰＯ4７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、（ＮＨ4)2ＳＯ4１ｇ、グルコース２
ｇ、純水１ ｌ）上にて生育可能となった菌株］を得
た。この菌株を常法に従い液体培養し、培養液よりプラ
スミドを精製分離した。
【００３７】次に、このトリプトフアンオペロンを含む
プラスミドに制限酵素ＥｃｏＲＩを３７℃にて１時間反
応させ、次いで６５℃で５分間加熱処理してＥｃｏＲＩ
を失活させた後、前記（Ａ）で得たｍｉｎｉ−Ｆ断片を
添加混合し、ＡＴＰおよびＤＴＴを加えさらにＤＮＡリ
ガーゼを添加した後、１２℃で２４時間反応を行なっ
た。次いで６５℃で５分間熱処理してＤＮＡリガーゼを
失活させた後、この反応液を用いてエシエリヒア・コリ
Ｋ−１２系株（トリプトフアン要求性変異株）を常法に
従い形質転換させ、アンピシリンが５０μｇ／ｍｌの割
合の添加してあるＬ培地（Ｂａｃｔｏ−トリプトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース１
ｇ、水１ ｌ：ｐＨ７．２）に接種し、３７℃にて１８
時間振盪培養後、遠心分離にて集菌し、菌体を洗浄後、
最少培地（組成は前記と同じ）に塗抹して形質転換株を
得た。この菌株を常法に従い液体培養し、培養液よりプ
ラスミドを精製分離した。
プラスミドに制限酵素ＥｃｏＲＩを３７℃にて１時間反
応させ、次いで６５℃で５分間加熱処理してＥｃｏＲＩ
を失活させた後、前記（Ａ）で得たｍｉｎｉ−Ｆ断片を
添加混合し、ＡＴＰおよびＤＴＴを加えさらにＤＮＡリ
ガーゼを添加した後、１２℃で２４時間反応を行なっ
た。次いで６５℃で５分間熱処理してＤＮＡリガーゼを
失活させた後、この反応液を用いてエシエリヒア・コリ
Ｋ−１２系株（トリプトフアン要求性変異株）を常法に
従い形質転換させ、アンピシリンが５０μｇ／ｍｌの割
合の添加してあるＬ培地（Ｂａｃｔｏ−トリプトン１０
ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース１
ｇ、水１ ｌ：ｐＨ７．２）に接種し、３７℃にて１８
時間振盪培養後、遠心分離にて集菌し、菌体を洗浄後、
最少培地（組成は前記と同じ）に塗抹して形質転換株を
得た。この菌株を常法に従い液体培養し、培養液よりプ
ラスミドを精製分離した。
【００３８】得られたプラスミドｐＭＴＹ−２は添付の
第１図に示した制限地図を有する。プラスミドｐＭＴＹ
−２のこの制限地図は、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ
Ｉ、ＳａｌＩ等を単独もしくは組み合わせて用いて処理
した後、アガロースゲル電気泳動にて確認した。このプ
ラスミドｐＭＴＹ−２を保持する形質転換株は、エシエ
リヒア・コリＫ−１２ ＹＫ２００４として、茨城県つ
くば市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術
研究所に、昭和５９年９月７日付で受託番号：微工研菌
寄第７８３８号にて寄託されている（昭和６３年２月１
５日付で国際寄託へ移管；受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−
１７３２）。
第１図に示した制限地図を有する。プラスミドｐＭＴＹ
−２のこの制限地図は、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ
Ｉ、ＳａｌＩ等を単独もしくは組み合わせて用いて処理
した後、アガロースゲル電気泳動にて確認した。このプ
ラスミドｐＭＴＹ−２を保持する形質転換株は、エシエ
リヒア・コリＫ−１２ ＹＫ２００４として、茨城県つ
くば市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術
研究所に、昭和５９年９月７日付で受託番号：微工研菌
寄第７８３８号にて寄託されている（昭和６３年２月１
５日付で国際寄託へ移管；受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−
１７３２）。
【００３９】参考例２： 形質転換株の安定性 前記の最少培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ
に分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、参
考例１で得た形質転換株を植菌し、３７℃にて２４時間
振盪培養を行なった後、同様にして調製したＬ培地１０
０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注し１２０℃で
１５分間滅菌したものに１ｍｌ当り５０ｃｅｌｌｓの割
合になるように植継し、同じく３７℃にて２４時間振盪
培養を行なった。次に遠心分離を用いて集菌し、菌体を
洗浄後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの割合で添加し
たＬ培地および無添加のＬ培地として調製した平板培地
に一定量塗抹し、３７℃にて１日培養後生育コロニー数
をカウントする。
に分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、参
考例１で得た形質転換株を植菌し、３７℃にて２４時間
振盪培養を行なった後、同様にして調製したＬ培地１０
０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注し１２０℃で
１５分間滅菌したものに１ｍｌ当り５０ｃｅｌｌｓの割
合になるように植継し、同じく３７℃にて２４時間振盪
培養を行なった。次に遠心分離を用いて集菌し、菌体を
洗浄後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの割合で添加し
たＬ培地および無添加のＬ培地として調製した平板培地
に一定量塗抹し、３７℃にて１日培養後生育コロニー数
をカウントする。
【００４０】この結果、アンピシリン添加および無添加
培地に生育したコロニーは同数であること、さらにＬ培
地生育コロニーは全てトリプトフアンを含まない最少培
地に生育すること、すなわち該プラスミドの高度の安定
性を確認した。
培地に生育したコロニーは同数であること、さらにＬ培
地生育コロニーは全てトリプトフアンを含まない最少培
地に生育すること、すなわち該プラスミドの高度の安定
性を確認した。
【００４１】実施例１： Ｌ−トリプトフアンの製造 最少培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注
し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに形質転換株
エシエリヒア・コリＫ−１２ ＹＫ２００４を植菌し３
７℃にて１日振盪培養後、同様にして調製したＬ培地５
００ｍｌを５ｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１
５分間滅菌処理したものに１０ｍｌ接種し、同じく３７
℃にて５時間振盪培養した。遠心分離を用いて菌体を回
収し、これをインドール２５ｇ、ＤＬ−セリン１００ｇ
およびピリドキサールリン酸５ｍｇ、を含む１００ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．８）５００ｍｌに懸濁し振盪し
ながら３７℃、２４時間反応を行なった。反応終了後、
液を１０ｍｌとりメタノール１０ｍｌを加えて激しく撹
拌した後、遠心分離により得た上澄液について高速液体
クロマトグラフィーで生成したＬ−トリプトフアンの分
析を行なったところ、２２ｍｇ／ｍｌの生成が認められ
た。
し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに形質転換株
エシエリヒア・コリＫ−１２ ＹＫ２００４を植菌し３
７℃にて１日振盪培養後、同様にして調製したＬ培地５
００ｍｌを５ｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１
５分間滅菌処理したものに１０ｍｌ接種し、同じく３７
℃にて５時間振盪培養した。遠心分離を用いて菌体を回
収し、これをインドール２５ｇ、ＤＬ−セリン１００ｇ
およびピリドキサールリン酸５ｍｇ、を含む１００ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．８）５００ｍｌに懸濁し振盪し
ながら３７℃、２４時間反応を行なった。反応終了後、
液を１０ｍｌとりメタノール１０ｍｌを加えて激しく撹
拌した後、遠心分離により得た上澄液について高速液体
クロマトグラフィーで生成したＬ−トリプトフアンの分
析を行なったところ、２２ｍｇ／ｍｌの生成が認められ
た。
【００４２】反応終了液５００ｍｌに苛性ソーダ水溶液
を加えてｐＨ１０にしたのち、アンモニア型強酸性イオ
ン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ−ＩＢ、三菱化成製）の
カラムを通してＬ−トリプトフアンの粗結晶を析出させ
たのち、これをアセトンで洗浄し乾燥してＬ−トリプト
フアンの結晶を７．７ｇ得た。
を加えてｐＨ１０にしたのち、アンモニア型強酸性イオ
ン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ−ＩＢ、三菱化成製）の
カラムを通してＬ−トリプトフアンの粗結晶を析出させ
たのち、これをアセトンで洗浄し乾燥してＬ−トリプト
フアンの結晶を７．７ｇ得た。
【００４３】実施例２ 最少培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注
し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに形質転換株
エシエリヒア・コリＫ１２ ＹＫ２００４を植菌し、３
７℃にて１日振盪培養後、インドールアクリル酸を１０
０μｇ／ｍｌの濃度で含有するＬ培地の５００ｍｌに実
施例１と同様、前培養物の１０ｍｌを接種し、３７℃に
て５時間振盪培養した。遠心分離にて菌体を回収したの
ち、実施例１と同様の操作にて反応を行い、生成したＬ
−トリプトフアンの分析を行なったところ、４０ｍｇ／
ｍｌの生成が認められた。
し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに形質転換株
エシエリヒア・コリＫ１２ ＹＫ２００４を植菌し、３
７℃にて１日振盪培養後、インドールアクリル酸を１０
０μｇ／ｍｌの濃度で含有するＬ培地の５００ｍｌに実
施例１と同様、前培養物の１０ｍｌを接種し、３７℃に
て５時間振盪培養した。遠心分離にて菌体を回収したの
ち、実施例１と同様の操作にて反応を行い、生成したＬ
−トリプトフアンの分析を行なったところ、４０ｍｇ／
ｍｌの生成が認められた。
【００４４】反応終了液５００ｍｌから実施例１と同様
の操作にてＬ−トリプトフアンを精製回収したところ、
結晶として１３．６ｇのＬ−トリプトフアンを得た。
の操作にてＬ−トリプトフアンを精製回収したところ、
結晶として１３．６ｇのＬ−トリプトフアンを得た。
【図１】図１は本発明に用いるプラスミドｐＭＴＹ−２
の制限酵素地図である。
の制限酵素地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/70 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/11 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/60 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- 【請求項１】 トリプトフアンオペロンに由来するトリ
プトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片と、Ｆ因子プラスミドに由来する増殖制御分配系
を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片と、ＣｏｌＥ１系プラス
ミドの自律増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を有す
るプラスミドで形質転換されたエシエリヒア・コリの培
養物又はその処理物の存在下に、インドールとＬ−又は
ＤＬ−セリンとを反応せしめることを特徴とするＬ−ト
リプトフアンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5124781A JPH0673463B2 (ja) | 1993-04-30 | 1993-04-30 | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5124781A JPH0673463B2 (ja) | 1993-04-30 | 1993-04-30 | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59225906A Division JPS61104789A (ja) | 1984-10-29 | 1984-10-29 | 新規プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06133781A JPH06133781A (ja) | 1994-05-17 |
| JPH0673463B2 true JPH0673463B2 (ja) | 1994-09-21 |
Family
ID=14893962
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5124781A Expired - Lifetime JPH0673463B2 (ja) | 1993-04-30 | 1993-04-30 | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0673463B2 (ja) |
-
1993
- 1993-04-30 JP JP5124781A patent/JPH0673463B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06133781A (ja) | 1994-05-17 |
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