JPH0523752B2 - - Google Patents
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- JPH0523752B2 JPH0523752B2 JP58142804A JP14280483A JPH0523752B2 JP H0523752 B2 JPH0523752 B2 JP H0523752B2 JP 58142804 A JP58142804 A JP 58142804A JP 14280483 A JP14280483 A JP 14280483A JP H0523752 B2 JPH0523752 B2 JP H0523752B2
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- tyrosine
- corynebacterium
- plasmid
- brevibacterium
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子の組換えDNA手法によりチロ
シンを製造する方法に関する。さらに詳細には本
発明は３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソ
ン酸７−ホスフエート合成酵素、コリスミン酸ミ
ユターゼおよびプレフエネート・デヒドロゲナー
ゼのうち少なくとも１つの酵素をコードする遺伝
子を含むDNA断片とベクターDNAとの組換え体
DNAを用いたコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる宿
主菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地
に培養し、培養物中にチロシンを生成蓄積せし
め、該培養物からチロシンを採取することを特徴
とするチロシンの製造法に関する。 Ｌ−チロシンの発酵法による直接的製造法とし
ては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウ
ム属などの細菌のフエニールアラニン要求株、チ
ロシン耐性株などの突然変異株を用いる方法が知
られている。〔農芸化学会誌50(1)R79〜R87，
（1976）〕 本発明者らは先にコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物中で自律複
製し、選択可能な表現型と適当なクローニング部
位を有するプラスミドベクターを造成する一方効
率の高い形質転換系を開発し特許出願を行つた
（特開昭57−183799、同57−186492、同57−
186489）。また本発明者らは該プラスミドベクタ
ーに既に知られているインビトロにおける組換え
DNA技法（U.S.Patent 4237224）を用い、グル
タミン酸、リジン、トリプトフアン、ヒスチジ
ン、フエニルアラニンなどのアミノ酸の生合成に
関与する外来性遺伝子を含むDNA断片を連結し、
開発した形質転換系を用いてコリネバクテリウ
ム・グルタミクムＬ−22株またはその誘導株を形
質転換したところ、該外来性遺伝子が該宿主中で
形質を発現され、該アミノ酸の生産の増大に利用
することができることを見出し特許出願を行つた
（特願昭58−126789、特願昭58−25397、58−
25398および同58−94392）。 さらに研究の結果、チロシンに関しても同様の
方法によつて得られた菌株が著量のチロシンを培
地に蓄積できることを見出し本発明を完成するに
至つた。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明は３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツ
ロソン酸 ７−ホスフエート合成酵素、コリスミ
ン酸ミユターゼおよびプレフエネート・デヒドロ
ゲナーゼのうち少なくとも１つの酵素をコードす
る遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組
換え体DNAを用いコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれ
る宿主菌株を形質転換して得られる形質転換株を
培地に培養し、チロシンを製造する方法を提供す
る。 本発明に用いる遺伝子を含むDNA断片（目的
遺伝子）としては、原核生物、ウイルス、バクテ
リオフアージまたはプラスミドに由来しチロシン
生成に関与する遺伝子を含むDNA断片があげら
れる。 微生物における芳香族アミノ酸の生合成経路な
らびにその調節様式については、大腸菌、枯草
菌、コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム
属などのグルタミン酸生産菌などにおいて詳細に
研究されている〔農芸化学会誌50(1)，R79〜
R87，（1976）およびAnn.Rev.Biochemistry
47，533（1978）参照〕。本発明におけるチロシン
生合成に係る遺伝子は、これら芳香族アミノ酸の
生合成に直接、間接に関与する酵素のうち少なく
とも１つの酵素の遺伝情報を担うDNAである。
とくに生合成系上の調節部位とされる３−デオキ
シ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸 ７−ホスフ
エート（３−deoxy−Ｄ−arabino−
heptulosonate ７−phosphate；以下DAHPとい
う）合成酵素（以下DAHPaseという）、コリス
ミン酸ミユターゼ（以下CMaseという）、プレフ
エネート・デヒドロゲナーゼ（以下PDGaseとい
う）、プレチロシン・アミノトランスフエラーゼ
などの酵素の遺伝情報を担うDNAが好適である。
さらに、これら遺伝子でフイードバツク阻害が外
れているもの（元来無い場合も含む）、レプレシ
ヨンが外れているものも用いることができる。 本発明の目的遺伝子としては、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生
物中で発現され、チロシン生合成系の少なくとも
１つの酵素活性を強化せしめるように働くもので
あればいずれも用いることができる。該遺伝子の
給源としては、アミノ酸の発酵生産、とくに芳香
アミノ酸の発酵生産に用いられる菌種、芳香族ア
ミノ酸の生合成とその調節機構が解明されている
菌種、遺伝学的解明が十分になされている菌種な
どが好適であるが、具体的にはエツシエリヒア
属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、ミクロバクテリウム属、バチルス属、スタフ
イロコツカス属、ストレプトコツカス属またはセ
ラチア属に属する細菌の菌株に由来する遺伝子
で、チロシンの生成ならびにその生成に関与する
代謝系に係る遺伝子が好適にあげられる。本発明
実施例においては、大腸菌JA194株〔Proc.Natl.
Acad.Sci.，74，487〜491（1977）〕を用いた。 本発明に用いるベクターとしては、宿主菌細胞
内で自律増殖できるものでなくてはならない。具
体例としては本発明者らがコリネバクテリウム属
に属する微生物から採取した、または採取したも
のから誘導して造成したpCG1（特開昭57−
134500）、pCG2（特開昭58−35197）、pCG4（特開
昭57−183799）、pCE51，pCE52（特開昭58−
126789），pCE53（特願昭58−25398），pCE54，
pCG11，pCB101などがあげられる。 これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下
記の寄託番号で工業技術院微生物工業技術研究所
ならびに米国アメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨンに寄託されている。 プラスミド FERM−Ｐ ATCC pCG1 5865 31808 pCG2 5954 31832 pCG4 5939 31830 pCE54 − 39019 pCG11 − 39022 pCB101 − 39020 好適にはプラスミドpCE51が用いられる。 pCE51は次のように作成することが出来る。 まず、pCG1をその保有菌コリネバクテリウ
ム・グルタミクム225−57株（FERM−P5865，
ATCC31808）の培養菌体から前記の特許出願明
細書（特開昭57−134500）に開示した方法で、
pGA22をその保有大腸菌の培養菌体から通常用
いられる方法〔An，G.etal.，J.Bacteriol.，140，
400（1979）〕で濃縮単離する。プラスミドpCG1を
制限酵素Bg1で直鎖状化し、これにpGA22を制
限酵素BamHで消化して得たカナマイシン耐
性（KmR）遺伝子を含む方の断片を、両者の同
一接着末端を利用して連結する。このDNA混成
物からのpCE51の選択はpGA22に由来するKmR
のみを有するコリネバクテリウム属あるいはブレ
ビバクテリウム属菌種の形質転換株を分離し、こ
れら形質転換株の保有するプラスミドを解析する
ことによつて達成される。 DNA混成物による形質転換は、本発明者らが
先に特許出願したコリネバクテリウム属およびブ
レビバクテリウム属菌種のプロトプラストを使用
する形質転換法（特開昭57−186492および特開昭
57−186489）により実施することができる。形質
転換株の選択にはカナマイシン（Km）を用い
る。形質転換株はDNA無添加系で受容菌プロト
プラストが正常細胞へ復帰増殖できない濃度の薬
剤〔通常、Km：100−800μg／ml）を含む高張寒
天培地上で形成されるコロニーを分離するか、あ
るいは、一旦非選択的に再生培地上で正常細胞に
復帰増殖させた後にかき集め、この懸濁液を受容
菌正常細胞が生育できない濃度の薬剤（通常、
Km：２−25μg／ml）を含む寒天培地上で生育す
るコロニーを分離することによつて得られる。カ
ナマイシン耐性により選択された形質転換株の中
には、pGA22由来の他の薬剤耐性形質をも同時
に獲得しているものがあるが、これらは目的のプ
ラスミドを含まないと思われるので排除する。 こうして得られる形質転換株の保有するプラス
ミドDNAは、本発明者らが特開昭57−134500お
よび特開昭57−186489に開示した方法で培養菌体
から単離精製でき、さらに各種制限酵素で消化し
て生成するDNA断片をアガロースゲル電気泳動
で解析する常法により構造を知ることができる。
形質転換株の一株から分離されたプラスミドが
pCE51である。 pCE51は大きさ約6Kbのプラスミドで、制限部
位としてHinc，Hind，SmaI，XhoI，EcoR
などを有し、KmRの表現型を与える。 プラスミド保有菌株からのプラスミドの採取
は、たとえば特開昭57−134500、同57−183799お
よび特開昭58−35197に記載の方法に従つて行え
ばよい。 遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組
換え体の作製は、公知の試験管内組換えDNA技
法を駆使することにより実施できる。 試験管内のDNA組換えは、通常、目的の遺伝
子を含む供与体DNAとベクターDNAの切断と結
合（リガーゼ反応）により行われる（特開昭58−
126789号、USP4237224参照）。 リガーゼ反応により目的の組換え体以外に他の
組換え体も生成するが、目的の組換え体を取得す
るにはこのDNA混成液を用いてコリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属菌種を直接形
質転換し、目的の遺伝子の遺伝情報に由来する遺
伝形質を付与された形質転換株を選択分離し、そ
の培養菌体から抽出単離することによつて達成で
きる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸
菌のような他の微生物の宿主ベクター系にて目的
の遺伝子を一旦クローン化し、しかる後にコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種
のベクターとの組換え体を試験管内で作製してか
らコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌種を形質転換し前記と同様に形質転換株を
選択分離しても組換え体を取得できる。 組換え体製造のためには下記文献の記載が広く
応用できる。 S.N.Cohen，et al，U.S.Patent 4237224、遺
伝子操作実験法〔高木康敬編著、講談社サイエン
テイフイツク（1980）〕、Methods in
Enzymology 68，Recombinant DNA，edited
by Ray Wu，Academic Press 1979、特開昭58
−126789. 本発明の宿主微生物としては、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属に属しDNA
取り込み能を有する菌株ならばいかなる菌株を用
いてもよい。好適には次の菌株があげられる。 寄 託 番 号 FERM−Ｐ ATCC コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−15
5946 31834 コリネバクテリウム・グルタミクムＫ−387087 コリネバクテリウム・グルタミクムＫ−437162 コリネバクテリウム・ハーキユリス 13868 コリネバクテリウム・ハーキユリスＬ−103
5947 31866 ブレビバクテリウム・デイバリカツムＬ−204
5948 31867 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
13869 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムＬ
−312 5949 31868 ブレビバクテリウム・フラバム 14067 これら菌株から変異誘導されたチロシン生産性
菌株は、さらに好ましい宿主として用いることが
できる。生産性変異株は前述の如く、アミノ酸要
求性、アミノ酸アナログ耐性或いはこれを併有す
る菌株として取得することができる。 宿主微生物の組換え体DNAによる形質転換は
１）培養細胞からのプロトプラストの調製、２）
プロトプラストの組換え体DNAによる形質転換
処理、３）プロトプラストの正常細胞への復帰再
生と形質転換株の選択、からなる工程にて行われ
る。具体的方法は特開昭57−186492，57−
186489，58−105999などに記載した方法に従えば
よい。 かくして得られた形質転換株を、従来発酵法に
よるチロシン製造に用いられる培養方法により培
養することによつて、チロシンを製造することが
できる。すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素
源、無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する
通常の培地中、好気的条件下、温度，PHなどを調
節しつつ培養を行えば、培養物中にチロシンが生
成蓄積するので、これを採取する。 炭素源としてはグルコース、フラクトース、シ
ユークロース、マルトース、マンノース、ソルビ
トール、マニトールなどの炭水化物、糖アルコー
ル、グリセロール、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜
などが使用でき、またピルビン酸、乳酸、酢酸、
フマール酸、グルコン酸などの各種有機酸、エタ
ノールなど低級アルコールも使用可能である。 窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、
酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アン
モニウム塩類あるいは尿素および他の窒素含有物
質ならびにペプトン、NZ−アミン、肉エキス、
酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイ
ン加水分解物、フイツシユミールあるいはその消
化物、蛹加水分解物などの窒素性有機物など種々
のものが使用可能である。 さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウ
ム、燐酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよ
び炭酸カルシウムなどを使用する。微生物の生育
に必要とするビタミン、アミノ酸源などは、前記
したような他の培地成分に従つて培地に供給され
れば特に加えなくてもよい。 培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好
気的条件下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が
好適である。培養中の培地のPHは中性付近に維持
することが望ましい。培養期間は通常２〜５日間
で培地中に著量のチロシンが蓄積する。 培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオ
ン交換樹脂処理などの公知の方法で培養液からチ
ロシンが回収される。 グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタ
ミン酸生産菌は、主な菌学的性質を同じくしてい
るにもかかわらず、産業上の重要性から各研究者
により、種々の菌名が付されており属名までもコ
リネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム
属などさまざまである。しかしながら、これらの
菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やDNAの塩基組
成が画一的であることから、同一の菌種であるこ
とが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌
種間には、70〜80％以上のDNAの相同性がある
ことが明らかにされ、非常に近縁な微生物である
ことが明白である〔Komatsu，Y.：Report of
the Fermentative Research Institute，No.55，
１（1980）、および、Suzuki，K.，Kaneko，T.，
and Komagata，K.：Int.J.Syst.Bacteriol.，31，
131（1981）参照〕。本発明の有用性はコリネバク
テリウム・グルタミクム誘導株を宿主として示し
たが上記の事実を踏まえれば、グルタミン酸生産
菌全般にそのまま適用できることが容易に類推さ
れる。組換えDNAがこれら菌種において安定に
保持され、発現されるためにはDNAの相同性な
ど宿主菌の性質における若干の相違は問題でな
く、これら菌種が当該プラスミドの自律複製と導
入遺伝子の発現を可能ならしめる機能を有してい
ればよい。しかるに、これらの菌種がこの両機能
を共有していることは、本発明者らが、先に特許
出願（特開昭57−183799）したコリネバクテリウ
ム・グルタミクム225−250から分離され、ストレ
プトマイシンおよび／またはスペクチノマイシン
耐性遺伝子を有するプラスミドpCG4がコリネバ
クテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種な
ど、グルタミン酸生産菌内で同じく複製でき、ま
た、その耐性遺伝子が発現される（特開昭57−
186492）ことからあきらかである。また本発明者
が申請した特許（特開昭58−126789）に示す如
く、ヒスチジン生産性プラスミドは、コリネバク
テリウム・ハーキユリス、ブレビバクテリウム・
フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトフアーメ
ンタムにおいてその機能を発揮した。従つて、本
発明を適用し得る宿主菌としては、コリネバクテ
リウム・グルタミクムに限らず、コリネバクテリ
ウム属およびブレビバクテリウム属菌種を含むグ
ルタミン酸生産菌全てが包括される。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例 １ (1) 染色体DNAとプラスミツドDNAの調製： 大腸菌（以下E.coliという）JA194株（Proc.
Natl.Acad.Sci.，94，487−491（1977）〕 の染色体DNAを以下の方法で調製した。 400mlのＬ−broth（バクト・トリプトトン10g、
バクト・イースト・エキス5g、NaCl 5gを水１
に含み、pH7.0に調整した培地、（以下LBと呼
ぶ）に種培養を接種して、37℃で振盪培養し、対
数後期まで生育させた。培養液から菌体を集菌
し、集菌した菌体から斎藤らの方法〔Sito，H.et
al.Biochim.Biophys.Acta，72 619（1963）〕に
従つて高分子染色体DNAを単離した。 ベクターとして用いるpBR322は、次の方法で
その保有株E.coli JA194株の培養菌体から単離し
た。 アンピシリン100μg／mlを含む400mlLBに種培
養を接種し、37℃で振盪培養し、対数後期まで生
育させた。培養液より集菌後、菌体を、田中らの
方法〔J.Bacteriol.121 354−362（1975）〕に従い
溶菌した。得られた溶菌液を、28000rpm，４℃
で１時間遠心し、上清を採取した。上清に、1/5
容の50％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール
（PEG）6000水溶液を加え、ゆるやかに混合した
後、４℃で一夜放置した。生じた沈澱を、４℃，
3000rpm，５分間の遠心で集め、５mlのTE緩衝
液（10mMTris・HCl，1mM EDTA・Na2 PH
7.5）に溶解し、1.5mg／ml濃度のエチジウムブロ
マイド１mlを加え、さらにTE緩衝液で正確に7.5
mlとした。この溶液に、CsCl7.875gを加え、完全
に溶解した後、105000×ｇ，20℃、40時間遠心し
た。紫外線照射下検出されるプラスミツドバンド
を、注射器でぬき取り、15％のTE（Ｖ／Ｖ）緩衝
液を含むイソプロパノールで、エチジウムブロマ
イドを３回抽出した後、４℃で一夜TE緩衝液に
対して透析し、透析液をプラスミツドDNAとし
て用いた。 (2) DAHPase，CMase，PDGaseをコードする
遺伝子を含むDNA断片のクローン化： 上記で調製したpBR322プラスミドDNA3μg
を含む制限酵素Hind反応液100μlに各々５単
位のEcoR及びHind（宝酒造社製）を、ま
た染色体DNA9μgを含む制限酵素Hind反応
液100μlに各々５単位のEcoR，Hind（宝
酒造社製）を加え、それぞれ37℃で60分間反応
後65℃で10分間加温して反応を停止させた。両
反応液を混合後、この混合物にT4リガーゼ用
緩衝液（トリス660mM，MgCl266mM、ジチ
オスレイトール100mM，Ph7.6）40μl，ATP
（5mM）40μl，T4リガーゼ（宝酒造社製、１
単位／μl）0.4μlおよびH2Ｏ 120μlを加え、12
℃で16時間反応させた。 このリガーゼ反応混合物を形質転換に供した。
形質転換に供する受容菌として、DAHPaseを欠
損した E.coli AB3248株〔J.Bact.93 237〜244
（1967）〕あるいはtyrA遺伝子（CMase）を欠損
した E.coli AT2273株（J.Bact.91 1494
（1966）〕を用いた。種培養を、LBに植菌し、M.
Dagertらの方法〔Gene，６ 23〜28（1979）〕に
従つて、コンピテントな細胞を調整した。 コンピテントな細胞109／mlを含む液0.2mlにリ
ガーゼ反応混合物50μlを加え、氷冷下10分間放置
した。次いで37℃で５分間熱処理した後、LB2ml
を加え、37℃で90〜120分間静置した。その後、
菌体を生理食塩水で２回遠心洗浄後、各々
50μg／mlのヒスチジン、プロリン、アルギニン、
イソロイシン、バリンを含むM9平板培地〔NH4
Cl 1g，Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g，NaCl
5g，MgSO4・7H2Ｏ 0.1g，CaCl2・2H2Ｏ
0.05g、グルコース3g、ビタミンB1４mgを水１
に含み、pH7.0に調整した培地に寒天1.5％を加え
たもの、J.Bact.121 354〜362（1975）〕塗布し
た。M9平板培地に生育したコロニーを各々アン
ピシリン100μg／ml、テトラサイクリン20μg／ml
を含むLB平板培地に塗布し、アンピシリン含有
培地で生育し、テトラサイクリン含有培地で生育
しないコロニーを選択した。 このようにして選択したヒスチジン、プロリ
ン、アルギニン、イソロイシン、バリンを含む
M9平板培地で生育し、アンピシリン耐性、テト
ラサイクリン感受性の形質転換株より前記と同様
にして、プラスミツドDNAを単離した。形質転
換株の一株から得たプラスミツドpEaroF1を各種
制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動で解
析した結果、pBR322の大きい方のEcoR−
Hind切断断片に、約4.2KbのEcoR−Hind
切断DNA断片が挿入されたプラスミツドである
ことが判明した。 得られたpEaroF1を用い、前記と同様の方法で
E.coli AB3248およびE.coli AT2273の両株を形
質転換したところ、両者ともヒスチジン、プロリ
ン、アルギニン、イソロイシン、バリンを含む
M9培地で生育し、同時にアンピシリン耐性とな
り、それらは、pEaroF1と同一のプラスミツドを
有していることが判明した。 以上の結果は、pEaroF1にクローン化された約
4.2KbのDNA断片上には、DAHPase，CMase，
PDGaseをコードする遺伝子が存在することを示
している。 さらに、pEaroF1は、第１図に示す様なEcoR
，BamH，Hindなどの各種制限酵素の切
断点を有し、G.Zurawskiらの報告している
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75 4271（1978）〕プ
ラスミツドpKB45との比較より、pEaroF1に挿
入されている約4.2KbのDNA断片上には、E.coli
のaroF，tyrA，pheA遺伝子が存在することが判
明した。 (3) aroFtyrA遺伝子のサブクローン化： 上記で調製したプラスミツドpEaroF1DNA
より、aroFtyrA遺伝子部分のDNA断片を取得
し、E.coli、コリネバクテリウム・グルタミク
ムの共用ベクターpCE51に連結する。 pCE51は本発明者らが先に特許出願したコリネ
バクテリウム・グルタミクムのプラスミツド
pCG1（特開昭57−134500）とE.coliのプラスミツ
ドpGA22〔An，G.et al：J.Bacterikl.）140，400
（1979）参照〕を和合連結せしめたプラスミツド
である。詳しくはpCG1上に１カ所しかないBgl
切断部位とpGA22のカナマイシン耐性遺伝子
を含むBamH断片とを両制限酵素の同一接着
末端を利用して連結したものである。 実際には、本発明者らが先に特許出願した方法
（特開昭58−1105999、同58−126789）により作成
することができる。 プラスミツドpEaroF1 DNA 3μgを含む制限
酵素Hinc反応液100μlに５単位のHinc（宝酒
造社製）を加え、37℃60分間反応させた。また、
pCE51を保有するE.coli JA194株より前記と同様
にして調製したプラスミツドpCE51 DNA 3μgを
含む制限酵素Hinc反応液100μlに0.3単位の
Hincを加え、37℃で60分間反応させ、pCE51
上に２カ所あるHinc切断部位のうち、一カ所
のみで切断した。反応後、両反応液を混合後、こ
の混合物にT4リガーゼ用緩衝液（トリス
660mM，MgCl266mM，ジチオスレイトール
100mM，PH7.6）40μl、ATP（5mM）40μl，T4リ
ガーゼ（宝酒造社製、１単位／μl）0.4μlおよび
H2Ｏ 120μlを加え、12℃で16時間反応させた。
反応後、65℃で10分間加温して反応を停止させ
た。 このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。
形質転換に供する受容菌として、E.coli AB3248
株を用いる。前記と同様にして形質転換を行い、
ヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシ
ン、バリンを含むM9平板培地で生育するコロニ
ーを得た。得られたコロニーから、カナマイシン
20μg／mlを含有するLB平板培地で生育するコロ
ニーを選択した。 このようにして得た、ヒスチジン、プロリン、
アルギニン、イソロイシン、バリンを含むM9平
板培地で生育し、カナマイシン耐性の形質転換株
より、前記と同様に、プラスミツドDNAを単離
した。形質転換株の１株から得られたプラスミツ
ドpKm1aroF1を各種制限酵素で消化後、アガロ
ースゲル電気泳動で解析した結果、pCE51の一方
のHinc切断部位に、約3.8KbのpEaroF1の
aroF.tyrAを含むHinc切断DNA断片が挿入さ
れたプラスミツドであることが判明した。 以上の様にして得られたプラスミツド
pKm1aroF1は、第２図の様な各種制限酵素の切
断パターンを有する。 (4) pKm1aroF1保有株からのチロシンおよびチ
ロシンアナログ耐性プラスミツドpKm1aroF1
−ｍ−18の取得： pKm1aroF1を保有するAB3248株を、カナマ
イシン20μg／mlを含むLB培地で対数増殖の後期
まで増殖させた。菌体を50mMトリス・マレイン
酸緩衝液（PH6.0）で２回遠心洗浄後、Ｎ−メチ
ル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
400μg／mlを含む50mMトリス・マレイン酸緩衝
液（PH6.0）中で、室温で30分間処理した。処理
菌体を50mMトリス・マレイン酸緩衝液（PH6.0）
で２回遠心洗浄後、洗浄菌体をカナマイシン
20μg／mlを含むLB培地中、30℃で16時間培養
し、前記と同様の方法でプラスミドDNAを単離
した。 単離したプラスミドを用い、E.coli AB3248株
を前記と同様の方法で形質転換した。形質転換株
の選択は、チロシン0.25mg／ml、各々50μg／mlの
ヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシ
ン、バリンを含むM9平板培地上で行つた。出現
したコロニーから、チロシンの0.25mg／ml、ヒス
チジン、プロリン、アルギニン、イソロイシン、
バリン各々50μg／mlを含むM9平板培地およびカ
ナマイシン20μg／mlを含むLB平板培地上で生育
できるコロニーを選択した。 このようして得たコロニーは、また同時にチロ
シンアナログである３−アミノチロシン（3AT）
（Sigma社製）0.2mg／mlおよびヒスチジン、プロ
リン、アルギニン、イソロイシン、バリン各々
50μg／mlを含むM9平板培地上で生育でき、3AT
耐性であることが判明した。 このようにして得た形質転換株から得たプラス
ミツドは、細菌にチロシンまたはチロシンアナロ
グ耐性を与えることができる。このようなプラス
ミツドの１つpKm1aroF−ｍ−18を有するE.coli
AB3248株は、チロシン１mg／mlあるいは3AT0.5
mg／mlと、50μg／mlのヒスチジン、プロリン、
アルギニン、イソロイシン、バリンを含むM9平
板培地で生育が可能である。 (5) pKm1aroF1，pKm1aroF1−ｍ−18によるコ
リネバクテリウム・グルタミクムK43の形質転
換： 50μg／mlのフエニルアラニンを含む半合成培
地SSM〔グルコース20g，（NH4）2SO4 10g、尿
素3g、酵母エキス1g、KH2PO4 1g，MgCl2・
6H2Ｏ 0.4g，FeSO4・7H2Ｏ 10mg，MnSO4・
４〜6H2Ｏ 0.2mg，ZnSO4・7H2Ｏ 0.9mg，
CuSO4・5H2Ｏ 0.4mg，Na2B4O7・10H2O0.09
mg，（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 0.04mg、ビオチン
30μg、サイアミン塩酸塩１mgを水１に含みPH
7.2に調整した培地〕にコリネバクテリウム・グ
ルタミクムK43（FERM Ｐ−7162）種培養を接種
して30℃で振盪培養した。種培養はNB培地（粉
末ブイヨン20g、酵母エキス5gを水１に含みPH
7.2に調整した培地）を用いた。東京光電比色計
で660nmにおける吸光度（OD）を測定し、
OD0.2になつた時点で培養液中0.5単位／mlの濃
度となるようにペニシリンＧを添加した。さらに
培養を継続しOD約0.6になるまで生育させた。 OD0.6になつた時点で集菌し、細胞をRCGP培
地〔グルコース5g、カザミノ酸5g、酵母エキス
2.5g，K2HPO4 3.5g，KH2PO4 1.5g，
MgCl2・6H2Ｏ 0.41g，FeSO4・7H2Ｏ 10mg，
MnSO4・４〜6H2Ｏ ２mg，ZnSO4・7H2Ｏ
0.9mg，（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 0.04mg，ビオチ
ン30μg，サイアミン塩酸塩２mg、コハク酸二ナ
トリウム135g、ポリビニルピロリドン（分子量
10000）30gを水１に含む培地〕に１mg／mlの
リゾチームを含む液（PH7.6）に約109細胞／mlと
なるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して30℃で５
時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化し
た。 このプロトプラスト懸濁液0.5mlを小試験管に
とり2500×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩衝
液（10mM塩化マグネシウム、30mM塩化カルシ
ウム、50mMトリス、400mMシヨ糖、PH7.5）１
mlに再懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1ml
に再懸濁した。この懸濁液に２倍濃度のTSMC
緩衝液と上記プラスミツドDNAの１対１混合液
100μlを加えて混和し、次いでTSMC緩衝液中に
20％PEG6000を含む液0.8mlを添加して混合した。
プラスミツドDNA pKm1aroF1，pKm1aroF1−
ｍ−18は、これらを保有する大腸菌AB3248株よ
り上述の如く調製した。３分後、RCGP培地（PH
7.2）２mlを添加し、2500×ｇで５分間遠心分離
にかけて上清を除去し、沈降したプロトプラスト
を１mlのRCGP培地に懸濁してから0.2mlをカナ
マイシン200μg／mlを含むRCGP寒天培地
（RCGP培地に1.4％寒天を含む培地、PH7.2）に塗
抹し、30℃で７日間培養した。このようにして、
選択プレート上に生育したカナマイシン耐性コロ
ニーを得た。 (6) 形質転換株によるチロシンの生産： 上記のようして得られたpKm1aroF1，
pKm1aroF1−ｍ−18を保有する形質転換株は、
微工研にCorynebacterium glutamicum K44，
FERM Ｐ−7163 FERM BP−458および
Corynebacterium glutamicum K45，FERM Ｐ
−7164 FERM BP−460としてそれぞれ寄託さ
れている。 pKm1aroF1，pKm1aroF1−ｍ−18保有株によ
るＬ−チロシン生産試験を下記のとおり行う。 菌株をNB液体培地中で30℃、16時間振盪培養
した菌液0.5mlを５mlの生産培地P4〔廃糖蜜100g／
ｌ，（NH4）2SO4 20g／ｌ，KH2PO40.5g／，
K2HPO4 0.5g／，MgSO4・7H2Ｏ 0.25g／
，CaCO3 20g／，PH7.2〕に0.25％のNZア
ミンを添加した培地の入つた試験管に植菌し、30
℃で96時間振盪培養した。 培養後、培養液１mlに6N NaOH溶液を50μ
加え、65℃で５分間加熱し、析出しているチロシ
ンを完全に溶解させた後、培養濾液をペーパーク
ロマトグラフイーにかけ、ニンヒドリン発色後、
比色定量して、Ｌ−チロシンの生成量を測定し
た。 対照として、コリネバクテリウム・グルタミク
ムK43株を同様に処理した。 結果を第１表に示す。 第１表 Ｌ−チロシン 菌 株 （mg／ml） コリネバクテリウム・グルタミクムK43 4.8 〃 K44 5.3 〃 K45 7.7
シンを製造する方法に関する。さらに詳細には本
発明は３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソ
ン酸７−ホスフエート合成酵素、コリスミン酸ミ
ユターゼおよびプレフエネート・デヒドロゲナー
ゼのうち少なくとも１つの酵素をコードする遺伝
子を含むDNA断片とベクターDNAとの組換え体
DNAを用いたコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる宿
主菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地
に培養し、培養物中にチロシンを生成蓄積せし
め、該培養物からチロシンを採取することを特徴
とするチロシンの製造法に関する。 Ｌ−チロシンの発酵法による直接的製造法とし
ては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウ
ム属などの細菌のフエニールアラニン要求株、チ
ロシン耐性株などの突然変異株を用いる方法が知
られている。〔農芸化学会誌50(1)R79〜R87，
（1976）〕 本発明者らは先にコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物中で自律複
製し、選択可能な表現型と適当なクローニング部
位を有するプラスミドベクターを造成する一方効
率の高い形質転換系を開発し特許出願を行つた
（特開昭57−183799、同57−186492、同57−
186489）。また本発明者らは該プラスミドベクタ
ーに既に知られているインビトロにおける組換え
DNA技法（U.S.Patent 4237224）を用い、グル
タミン酸、リジン、トリプトフアン、ヒスチジ
ン、フエニルアラニンなどのアミノ酸の生合成に
関与する外来性遺伝子を含むDNA断片を連結し、
開発した形質転換系を用いてコリネバクテリウ
ム・グルタミクムＬ−22株またはその誘導株を形
質転換したところ、該外来性遺伝子が該宿主中で
形質を発現され、該アミノ酸の生産の増大に利用
することができることを見出し特許出願を行つた
（特願昭58−126789、特願昭58−25397、58−
25398および同58−94392）。 さらに研究の結果、チロシンに関しても同様の
方法によつて得られた菌株が著量のチロシンを培
地に蓄積できることを見出し本発明を完成するに
至つた。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明は３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツ
ロソン酸 ７−ホスフエート合成酵素、コリスミ
ン酸ミユターゼおよびプレフエネート・デヒドロ
ゲナーゼのうち少なくとも１つの酵素をコードす
る遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組
換え体DNAを用いコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれ
る宿主菌株を形質転換して得られる形質転換株を
培地に培養し、チロシンを製造する方法を提供す
る。 本発明に用いる遺伝子を含むDNA断片（目的
遺伝子）としては、原核生物、ウイルス、バクテ
リオフアージまたはプラスミドに由来しチロシン
生成に関与する遺伝子を含むDNA断片があげら
れる。 微生物における芳香族アミノ酸の生合成経路な
らびにその調節様式については、大腸菌、枯草
菌、コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム
属などのグルタミン酸生産菌などにおいて詳細に
研究されている〔農芸化学会誌50(1)，R79〜
R87，（1976）およびAnn.Rev.Biochemistry
47，533（1978）参照〕。本発明におけるチロシン
生合成に係る遺伝子は、これら芳香族アミノ酸の
生合成に直接、間接に関与する酵素のうち少なく
とも１つの酵素の遺伝情報を担うDNAである。
とくに生合成系上の調節部位とされる３−デオキ
シ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸 ７−ホスフ
エート（３−deoxy−Ｄ−arabino−
heptulosonate ７−phosphate；以下DAHPとい
う）合成酵素（以下DAHPaseという）、コリス
ミン酸ミユターゼ（以下CMaseという）、プレフ
エネート・デヒドロゲナーゼ（以下PDGaseとい
う）、プレチロシン・アミノトランスフエラーゼ
などの酵素の遺伝情報を担うDNAが好適である。
さらに、これら遺伝子でフイードバツク阻害が外
れているもの（元来無い場合も含む）、レプレシ
ヨンが外れているものも用いることができる。 本発明の目的遺伝子としては、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生
物中で発現され、チロシン生合成系の少なくとも
１つの酵素活性を強化せしめるように働くもので
あればいずれも用いることができる。該遺伝子の
給源としては、アミノ酸の発酵生産、とくに芳香
アミノ酸の発酵生産に用いられる菌種、芳香族ア
ミノ酸の生合成とその調節機構が解明されている
菌種、遺伝学的解明が十分になされている菌種な
どが好適であるが、具体的にはエツシエリヒア
属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、ミクロバクテリウム属、バチルス属、スタフ
イロコツカス属、ストレプトコツカス属またはセ
ラチア属に属する細菌の菌株に由来する遺伝子
で、チロシンの生成ならびにその生成に関与する
代謝系に係る遺伝子が好適にあげられる。本発明
実施例においては、大腸菌JA194株〔Proc.Natl.
Acad.Sci.，74，487〜491（1977）〕を用いた。 本発明に用いるベクターとしては、宿主菌細胞
内で自律増殖できるものでなくてはならない。具
体例としては本発明者らがコリネバクテリウム属
に属する微生物から採取した、または採取したも
のから誘導して造成したpCG1（特開昭57−
134500）、pCG2（特開昭58−35197）、pCG4（特開
昭57−183799）、pCE51，pCE52（特開昭58−
126789），pCE53（特願昭58−25398），pCE54，
pCG11，pCB101などがあげられる。 これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下
記の寄託番号で工業技術院微生物工業技術研究所
ならびに米国アメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨンに寄託されている。 プラスミド FERM−Ｐ ATCC pCG1 5865 31808 pCG2 5954 31832 pCG4 5939 31830 pCE54 − 39019 pCG11 − 39022 pCB101 − 39020 好適にはプラスミドpCE51が用いられる。 pCE51は次のように作成することが出来る。 まず、pCG1をその保有菌コリネバクテリウ
ム・グルタミクム225−57株（FERM−P5865，
ATCC31808）の培養菌体から前記の特許出願明
細書（特開昭57−134500）に開示した方法で、
pGA22をその保有大腸菌の培養菌体から通常用
いられる方法〔An，G.etal.，J.Bacteriol.，140，
400（1979）〕で濃縮単離する。プラスミドpCG1を
制限酵素Bg1で直鎖状化し、これにpGA22を制
限酵素BamHで消化して得たカナマイシン耐
性（KmR）遺伝子を含む方の断片を、両者の同
一接着末端を利用して連結する。このDNA混成
物からのpCE51の選択はpGA22に由来するKmR
のみを有するコリネバクテリウム属あるいはブレ
ビバクテリウム属菌種の形質転換株を分離し、こ
れら形質転換株の保有するプラスミドを解析する
ことによつて達成される。 DNA混成物による形質転換は、本発明者らが
先に特許出願したコリネバクテリウム属およびブ
レビバクテリウム属菌種のプロトプラストを使用
する形質転換法（特開昭57−186492および特開昭
57−186489）により実施することができる。形質
転換株の選択にはカナマイシン（Km）を用い
る。形質転換株はDNA無添加系で受容菌プロト
プラストが正常細胞へ復帰増殖できない濃度の薬
剤〔通常、Km：100−800μg／ml）を含む高張寒
天培地上で形成されるコロニーを分離するか、あ
るいは、一旦非選択的に再生培地上で正常細胞に
復帰増殖させた後にかき集め、この懸濁液を受容
菌正常細胞が生育できない濃度の薬剤（通常、
Km：２−25μg／ml）を含む寒天培地上で生育す
るコロニーを分離することによつて得られる。カ
ナマイシン耐性により選択された形質転換株の中
には、pGA22由来の他の薬剤耐性形質をも同時
に獲得しているものがあるが、これらは目的のプ
ラスミドを含まないと思われるので排除する。 こうして得られる形質転換株の保有するプラス
ミドDNAは、本発明者らが特開昭57−134500お
よび特開昭57−186489に開示した方法で培養菌体
から単離精製でき、さらに各種制限酵素で消化し
て生成するDNA断片をアガロースゲル電気泳動
で解析する常法により構造を知ることができる。
形質転換株の一株から分離されたプラスミドが
pCE51である。 pCE51は大きさ約6Kbのプラスミドで、制限部
位としてHinc，Hind，SmaI，XhoI，EcoR
などを有し、KmRの表現型を与える。 プラスミド保有菌株からのプラスミドの採取
は、たとえば特開昭57−134500、同57−183799お
よび特開昭58−35197に記載の方法に従つて行え
ばよい。 遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組
換え体の作製は、公知の試験管内組換えDNA技
法を駆使することにより実施できる。 試験管内のDNA組換えは、通常、目的の遺伝
子を含む供与体DNAとベクターDNAの切断と結
合（リガーゼ反応）により行われる（特開昭58−
126789号、USP4237224参照）。 リガーゼ反応により目的の組換え体以外に他の
組換え体も生成するが、目的の組換え体を取得す
るにはこのDNA混成液を用いてコリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属菌種を直接形
質転換し、目的の遺伝子の遺伝情報に由来する遺
伝形質を付与された形質転換株を選択分離し、そ
の培養菌体から抽出単離することによつて達成で
きる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸
菌のような他の微生物の宿主ベクター系にて目的
の遺伝子を一旦クローン化し、しかる後にコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種
のベクターとの組換え体を試験管内で作製してか
らコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌種を形質転換し前記と同様に形質転換株を
選択分離しても組換え体を取得できる。 組換え体製造のためには下記文献の記載が広く
応用できる。 S.N.Cohen，et al，U.S.Patent 4237224、遺
伝子操作実験法〔高木康敬編著、講談社サイエン
テイフイツク（1980）〕、Methods in
Enzymology 68，Recombinant DNA，edited
by Ray Wu，Academic Press 1979、特開昭58
−126789. 本発明の宿主微生物としては、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属に属しDNA
取り込み能を有する菌株ならばいかなる菌株を用
いてもよい。好適には次の菌株があげられる。 寄 託 番 号 FERM−Ｐ ATCC コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−15
5946 31834 コリネバクテリウム・グルタミクムＫ−387087 コリネバクテリウム・グルタミクムＫ−437162 コリネバクテリウム・ハーキユリス 13868 コリネバクテリウム・ハーキユリスＬ−103
5947 31866 ブレビバクテリウム・デイバリカツムＬ−204
5948 31867 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
13869 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムＬ
−312 5949 31868 ブレビバクテリウム・フラバム 14067 これら菌株から変異誘導されたチロシン生産性
菌株は、さらに好ましい宿主として用いることが
できる。生産性変異株は前述の如く、アミノ酸要
求性、アミノ酸アナログ耐性或いはこれを併有す
る菌株として取得することができる。 宿主微生物の組換え体DNAによる形質転換は
１）培養細胞からのプロトプラストの調製、２）
プロトプラストの組換え体DNAによる形質転換
処理、３）プロトプラストの正常細胞への復帰再
生と形質転換株の選択、からなる工程にて行われ
る。具体的方法は特開昭57−186492，57−
186489，58−105999などに記載した方法に従えば
よい。 かくして得られた形質転換株を、従来発酵法に
よるチロシン製造に用いられる培養方法により培
養することによつて、チロシンを製造することが
できる。すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素
源、無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する
通常の培地中、好気的条件下、温度，PHなどを調
節しつつ培養を行えば、培養物中にチロシンが生
成蓄積するので、これを採取する。 炭素源としてはグルコース、フラクトース、シ
ユークロース、マルトース、マンノース、ソルビ
トール、マニトールなどの炭水化物、糖アルコー
ル、グリセロール、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜
などが使用でき、またピルビン酸、乳酸、酢酸、
フマール酸、グルコン酸などの各種有機酸、エタ
ノールなど低級アルコールも使用可能である。 窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、
酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アン
モニウム塩類あるいは尿素および他の窒素含有物
質ならびにペプトン、NZ−アミン、肉エキス、
酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイ
ン加水分解物、フイツシユミールあるいはその消
化物、蛹加水分解物などの窒素性有機物など種々
のものが使用可能である。 さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウ
ム、燐酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよ
び炭酸カルシウムなどを使用する。微生物の生育
に必要とするビタミン、アミノ酸源などは、前記
したような他の培地成分に従つて培地に供給され
れば特に加えなくてもよい。 培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好
気的条件下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が
好適である。培養中の培地のPHは中性付近に維持
することが望ましい。培養期間は通常２〜５日間
で培地中に著量のチロシンが蓄積する。 培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオ
ン交換樹脂処理などの公知の方法で培養液からチ
ロシンが回収される。 グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタ
ミン酸生産菌は、主な菌学的性質を同じくしてい
るにもかかわらず、産業上の重要性から各研究者
により、種々の菌名が付されており属名までもコ
リネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム
属などさまざまである。しかしながら、これらの
菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やDNAの塩基組
成が画一的であることから、同一の菌種であるこ
とが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌
種間には、70〜80％以上のDNAの相同性がある
ことが明らかにされ、非常に近縁な微生物である
ことが明白である〔Komatsu，Y.：Report of
the Fermentative Research Institute，No.55，
１（1980）、および、Suzuki，K.，Kaneko，T.，
and Komagata，K.：Int.J.Syst.Bacteriol.，31，
131（1981）参照〕。本発明の有用性はコリネバク
テリウム・グルタミクム誘導株を宿主として示し
たが上記の事実を踏まえれば、グルタミン酸生産
菌全般にそのまま適用できることが容易に類推さ
れる。組換えDNAがこれら菌種において安定に
保持され、発現されるためにはDNAの相同性な
ど宿主菌の性質における若干の相違は問題でな
く、これら菌種が当該プラスミドの自律複製と導
入遺伝子の発現を可能ならしめる機能を有してい
ればよい。しかるに、これらの菌種がこの両機能
を共有していることは、本発明者らが、先に特許
出願（特開昭57−183799）したコリネバクテリウ
ム・グルタミクム225−250から分離され、ストレ
プトマイシンおよび／またはスペクチノマイシン
耐性遺伝子を有するプラスミドpCG4がコリネバ
クテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種な
ど、グルタミン酸生産菌内で同じく複製でき、ま
た、その耐性遺伝子が発現される（特開昭57−
186492）ことからあきらかである。また本発明者
が申請した特許（特開昭58−126789）に示す如
く、ヒスチジン生産性プラスミドは、コリネバク
テリウム・ハーキユリス、ブレビバクテリウム・
フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトフアーメ
ンタムにおいてその機能を発揮した。従つて、本
発明を適用し得る宿主菌としては、コリネバクテ
リウム・グルタミクムに限らず、コリネバクテリ
ウム属およびブレビバクテリウム属菌種を含むグ
ルタミン酸生産菌全てが包括される。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例 １ (1) 染色体DNAとプラスミツドDNAの調製： 大腸菌（以下E.coliという）JA194株（Proc.
Natl.Acad.Sci.，94，487−491（1977）〕 の染色体DNAを以下の方法で調製した。 400mlのＬ−broth（バクト・トリプトトン10g、
バクト・イースト・エキス5g、NaCl 5gを水１
に含み、pH7.0に調整した培地、（以下LBと呼
ぶ）に種培養を接種して、37℃で振盪培養し、対
数後期まで生育させた。培養液から菌体を集菌
し、集菌した菌体から斎藤らの方法〔Sito，H.et
al.Biochim.Biophys.Acta，72 619（1963）〕に
従つて高分子染色体DNAを単離した。 ベクターとして用いるpBR322は、次の方法で
その保有株E.coli JA194株の培養菌体から単離し
た。 アンピシリン100μg／mlを含む400mlLBに種培
養を接種し、37℃で振盪培養し、対数後期まで生
育させた。培養液より集菌後、菌体を、田中らの
方法〔J.Bacteriol.121 354−362（1975）〕に従い
溶菌した。得られた溶菌液を、28000rpm，４℃
で１時間遠心し、上清を採取した。上清に、1/5
容の50％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール
（PEG）6000水溶液を加え、ゆるやかに混合した
後、４℃で一夜放置した。生じた沈澱を、４℃，
3000rpm，５分間の遠心で集め、５mlのTE緩衝
液（10mMTris・HCl，1mM EDTA・Na2 PH
7.5）に溶解し、1.5mg／ml濃度のエチジウムブロ
マイド１mlを加え、さらにTE緩衝液で正確に7.5
mlとした。この溶液に、CsCl7.875gを加え、完全
に溶解した後、105000×ｇ，20℃、40時間遠心し
た。紫外線照射下検出されるプラスミツドバンド
を、注射器でぬき取り、15％のTE（Ｖ／Ｖ）緩衝
液を含むイソプロパノールで、エチジウムブロマ
イドを３回抽出した後、４℃で一夜TE緩衝液に
対して透析し、透析液をプラスミツドDNAとし
て用いた。 (2) DAHPase，CMase，PDGaseをコードする
遺伝子を含むDNA断片のクローン化： 上記で調製したpBR322プラスミドDNA3μg
を含む制限酵素Hind反応液100μlに各々５単
位のEcoR及びHind（宝酒造社製）を、ま
た染色体DNA9μgを含む制限酵素Hind反応
液100μlに各々５単位のEcoR，Hind（宝
酒造社製）を加え、それぞれ37℃で60分間反応
後65℃で10分間加温して反応を停止させた。両
反応液を混合後、この混合物にT4リガーゼ用
緩衝液（トリス660mM，MgCl266mM、ジチ
オスレイトール100mM，Ph7.6）40μl，ATP
（5mM）40μl，T4リガーゼ（宝酒造社製、１
単位／μl）0.4μlおよびH2Ｏ 120μlを加え、12
℃で16時間反応させた。 このリガーゼ反応混合物を形質転換に供した。
形質転換に供する受容菌として、DAHPaseを欠
損した E.coli AB3248株〔J.Bact.93 237〜244
（1967）〕あるいはtyrA遺伝子（CMase）を欠損
した E.coli AT2273株（J.Bact.91 1494
（1966）〕を用いた。種培養を、LBに植菌し、M.
Dagertらの方法〔Gene，６ 23〜28（1979）〕に
従つて、コンピテントな細胞を調整した。 コンピテントな細胞109／mlを含む液0.2mlにリ
ガーゼ反応混合物50μlを加え、氷冷下10分間放置
した。次いで37℃で５分間熱処理した後、LB2ml
を加え、37℃で90〜120分間静置した。その後、
菌体を生理食塩水で２回遠心洗浄後、各々
50μg／mlのヒスチジン、プロリン、アルギニン、
イソロイシン、バリンを含むM9平板培地〔NH4
Cl 1g，Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g，NaCl
5g，MgSO4・7H2Ｏ 0.1g，CaCl2・2H2Ｏ
0.05g、グルコース3g、ビタミンB1４mgを水１
に含み、pH7.0に調整した培地に寒天1.5％を加え
たもの、J.Bact.121 354〜362（1975）〕塗布し
た。M9平板培地に生育したコロニーを各々アン
ピシリン100μg／ml、テトラサイクリン20μg／ml
を含むLB平板培地に塗布し、アンピシリン含有
培地で生育し、テトラサイクリン含有培地で生育
しないコロニーを選択した。 このようにして選択したヒスチジン、プロリ
ン、アルギニン、イソロイシン、バリンを含む
M9平板培地で生育し、アンピシリン耐性、テト
ラサイクリン感受性の形質転換株より前記と同様
にして、プラスミツドDNAを単離した。形質転
換株の一株から得たプラスミツドpEaroF1を各種
制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動で解
析した結果、pBR322の大きい方のEcoR−
Hind切断断片に、約4.2KbのEcoR−Hind
切断DNA断片が挿入されたプラスミツドである
ことが判明した。 得られたpEaroF1を用い、前記と同様の方法で
E.coli AB3248およびE.coli AT2273の両株を形
質転換したところ、両者ともヒスチジン、プロリ
ン、アルギニン、イソロイシン、バリンを含む
M9培地で生育し、同時にアンピシリン耐性とな
り、それらは、pEaroF1と同一のプラスミツドを
有していることが判明した。 以上の結果は、pEaroF1にクローン化された約
4.2KbのDNA断片上には、DAHPase，CMase，
PDGaseをコードする遺伝子が存在することを示
している。 さらに、pEaroF1は、第１図に示す様なEcoR
，BamH，Hindなどの各種制限酵素の切
断点を有し、G.Zurawskiらの報告している
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75 4271（1978）〕プ
ラスミツドpKB45との比較より、pEaroF1に挿
入されている約4.2KbのDNA断片上には、E.coli
のaroF，tyrA，pheA遺伝子が存在することが判
明した。 (3) aroFtyrA遺伝子のサブクローン化： 上記で調製したプラスミツドpEaroF1DNA
より、aroFtyrA遺伝子部分のDNA断片を取得
し、E.coli、コリネバクテリウム・グルタミク
ムの共用ベクターpCE51に連結する。 pCE51は本発明者らが先に特許出願したコリネ
バクテリウム・グルタミクムのプラスミツド
pCG1（特開昭57−134500）とE.coliのプラスミツ
ドpGA22〔An，G.et al：J.Bacterikl.）140，400
（1979）参照〕を和合連結せしめたプラスミツド
である。詳しくはpCG1上に１カ所しかないBgl
切断部位とpGA22のカナマイシン耐性遺伝子
を含むBamH断片とを両制限酵素の同一接着
末端を利用して連結したものである。 実際には、本発明者らが先に特許出願した方法
（特開昭58−1105999、同58−126789）により作成
することができる。 プラスミツドpEaroF1 DNA 3μgを含む制限
酵素Hinc反応液100μlに５単位のHinc（宝酒
造社製）を加え、37℃60分間反応させた。また、
pCE51を保有するE.coli JA194株より前記と同様
にして調製したプラスミツドpCE51 DNA 3μgを
含む制限酵素Hinc反応液100μlに0.3単位の
Hincを加え、37℃で60分間反応させ、pCE51
上に２カ所あるHinc切断部位のうち、一カ所
のみで切断した。反応後、両反応液を混合後、こ
の混合物にT4リガーゼ用緩衝液（トリス
660mM，MgCl266mM，ジチオスレイトール
100mM，PH7.6）40μl、ATP（5mM）40μl，T4リ
ガーゼ（宝酒造社製、１単位／μl）0.4μlおよび
H2Ｏ 120μlを加え、12℃で16時間反応させた。
反応後、65℃で10分間加温して反応を停止させ
た。 このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。
形質転換に供する受容菌として、E.coli AB3248
株を用いる。前記と同様にして形質転換を行い、
ヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシ
ン、バリンを含むM9平板培地で生育するコロニ
ーを得た。得られたコロニーから、カナマイシン
20μg／mlを含有するLB平板培地で生育するコロ
ニーを選択した。 このようにして得た、ヒスチジン、プロリン、
アルギニン、イソロイシン、バリンを含むM9平
板培地で生育し、カナマイシン耐性の形質転換株
より、前記と同様に、プラスミツドDNAを単離
した。形質転換株の１株から得られたプラスミツ
ドpKm1aroF1を各種制限酵素で消化後、アガロ
ースゲル電気泳動で解析した結果、pCE51の一方
のHinc切断部位に、約3.8KbのpEaroF1の
aroF.tyrAを含むHinc切断DNA断片が挿入さ
れたプラスミツドであることが判明した。 以上の様にして得られたプラスミツド
pKm1aroF1は、第２図の様な各種制限酵素の切
断パターンを有する。 (4) pKm1aroF1保有株からのチロシンおよびチ
ロシンアナログ耐性プラスミツドpKm1aroF1
−ｍ−18の取得： pKm1aroF1を保有するAB3248株を、カナマ
イシン20μg／mlを含むLB培地で対数増殖の後期
まで増殖させた。菌体を50mMトリス・マレイン
酸緩衝液（PH6.0）で２回遠心洗浄後、Ｎ−メチ
ル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
400μg／mlを含む50mMトリス・マレイン酸緩衝
液（PH6.0）中で、室温で30分間処理した。処理
菌体を50mMトリス・マレイン酸緩衝液（PH6.0）
で２回遠心洗浄後、洗浄菌体をカナマイシン
20μg／mlを含むLB培地中、30℃で16時間培養
し、前記と同様の方法でプラスミドDNAを単離
した。 単離したプラスミドを用い、E.coli AB3248株
を前記と同様の方法で形質転換した。形質転換株
の選択は、チロシン0.25mg／ml、各々50μg／mlの
ヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシ
ン、バリンを含むM9平板培地上で行つた。出現
したコロニーから、チロシンの0.25mg／ml、ヒス
チジン、プロリン、アルギニン、イソロイシン、
バリン各々50μg／mlを含むM9平板培地およびカ
ナマイシン20μg／mlを含むLB平板培地上で生育
できるコロニーを選択した。 このようして得たコロニーは、また同時にチロ
シンアナログである３−アミノチロシン（3AT）
（Sigma社製）0.2mg／mlおよびヒスチジン、プロ
リン、アルギニン、イソロイシン、バリン各々
50μg／mlを含むM9平板培地上で生育でき、3AT
耐性であることが判明した。 このようにして得た形質転換株から得たプラス
ミツドは、細菌にチロシンまたはチロシンアナロ
グ耐性を与えることができる。このようなプラス
ミツドの１つpKm1aroF−ｍ−18を有するE.coli
AB3248株は、チロシン１mg／mlあるいは3AT0.5
mg／mlと、50μg／mlのヒスチジン、プロリン、
アルギニン、イソロイシン、バリンを含むM9平
板培地で生育が可能である。 (5) pKm1aroF1，pKm1aroF1−ｍ−18によるコ
リネバクテリウム・グルタミクムK43の形質転
換： 50μg／mlのフエニルアラニンを含む半合成培
地SSM〔グルコース20g，（NH4）2SO4 10g、尿
素3g、酵母エキス1g、KH2PO4 1g，MgCl2・
6H2Ｏ 0.4g，FeSO4・7H2Ｏ 10mg，MnSO4・
４〜6H2Ｏ 0.2mg，ZnSO4・7H2Ｏ 0.9mg，
CuSO4・5H2Ｏ 0.4mg，Na2B4O7・10H2O0.09
mg，（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 0.04mg、ビオチン
30μg、サイアミン塩酸塩１mgを水１に含みPH
7.2に調整した培地〕にコリネバクテリウム・グ
ルタミクムK43（FERM Ｐ−7162）種培養を接種
して30℃で振盪培養した。種培養はNB培地（粉
末ブイヨン20g、酵母エキス5gを水１に含みPH
7.2に調整した培地）を用いた。東京光電比色計
で660nmにおける吸光度（OD）を測定し、
OD0.2になつた時点で培養液中0.5単位／mlの濃
度となるようにペニシリンＧを添加した。さらに
培養を継続しOD約0.6になるまで生育させた。 OD0.6になつた時点で集菌し、細胞をRCGP培
地〔グルコース5g、カザミノ酸5g、酵母エキス
2.5g，K2HPO4 3.5g，KH2PO4 1.5g，
MgCl2・6H2Ｏ 0.41g，FeSO4・7H2Ｏ 10mg，
MnSO4・４〜6H2Ｏ ２mg，ZnSO4・7H2Ｏ
0.9mg，（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 0.04mg，ビオチ
ン30μg，サイアミン塩酸塩２mg、コハク酸二ナ
トリウム135g、ポリビニルピロリドン（分子量
10000）30gを水１に含む培地〕に１mg／mlの
リゾチームを含む液（PH7.6）に約109細胞／mlと
なるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して30℃で５
時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化し
た。 このプロトプラスト懸濁液0.5mlを小試験管に
とり2500×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩衝
液（10mM塩化マグネシウム、30mM塩化カルシ
ウム、50mMトリス、400mMシヨ糖、PH7.5）１
mlに再懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1ml
に再懸濁した。この懸濁液に２倍濃度のTSMC
緩衝液と上記プラスミツドDNAの１対１混合液
100μlを加えて混和し、次いでTSMC緩衝液中に
20％PEG6000を含む液0.8mlを添加して混合した。
プラスミツドDNA pKm1aroF1，pKm1aroF1−
ｍ−18は、これらを保有する大腸菌AB3248株よ
り上述の如く調製した。３分後、RCGP培地（PH
7.2）２mlを添加し、2500×ｇで５分間遠心分離
にかけて上清を除去し、沈降したプロトプラスト
を１mlのRCGP培地に懸濁してから0.2mlをカナ
マイシン200μg／mlを含むRCGP寒天培地
（RCGP培地に1.4％寒天を含む培地、PH7.2）に塗
抹し、30℃で７日間培養した。このようにして、
選択プレート上に生育したカナマイシン耐性コロ
ニーを得た。 (6) 形質転換株によるチロシンの生産： 上記のようして得られたpKm1aroF1，
pKm1aroF1−ｍ−18を保有する形質転換株は、
微工研にCorynebacterium glutamicum K44，
FERM Ｐ−7163 FERM BP−458および
Corynebacterium glutamicum K45，FERM Ｐ
−7164 FERM BP−460としてそれぞれ寄託さ
れている。 pKm1aroF1，pKm1aroF1−ｍ−18保有株によ
るＬ−チロシン生産試験を下記のとおり行う。 菌株をNB液体培地中で30℃、16時間振盪培養
した菌液0.5mlを５mlの生産培地P4〔廃糖蜜100g／
ｌ，（NH4）2SO4 20g／ｌ，KH2PO40.5g／，
K2HPO4 0.5g／，MgSO4・7H2Ｏ 0.25g／
，CaCO3 20g／，PH7.2〕に0.25％のNZア
ミンを添加した培地の入つた試験管に植菌し、30
℃で96時間振盪培養した。 培養後、培養液１mlに6N NaOH溶液を50μ
加え、65℃で５分間加熱し、析出しているチロシ
ンを完全に溶解させた後、培養濾液をペーパーク
ロマトグラフイーにかけ、ニンヒドリン発色後、
比色定量して、Ｌ−チロシンの生成量を測定し
た。 対照として、コリネバクテリウム・グルタミク
ムK43株を同様に処理した。 結果を第１表に示す。 第１表 Ｌ−チロシン 菌 株 （mg／ml） コリネバクテリウム・グルタミクムK43 4.8 〃 K44 5.3 〃 K45 7.7
第１図は、プラスミツドpEaroF−１の制限酵
素切断パターンを示す。第２図は、プラスミツド
pKm1aroF1の制限酵素切断パターンを示す。第
１，２図中，横の矢印は遺伝子の転写される方向
を示してある。
素切断パターンを示す。第２図は、プラスミツド
pKm1aroF1の制限酵素切断パターンを示す。第
１，２図中，横の矢印は遺伝子の転写される方向
を示してある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ エツシエリヒア属に属する微生物由来の３−
デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸 ７−
ホスフエート合成酵素、コリスミン酸ミユターゼ
およびプレフエネート・デヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAと
の組換え体DNAを用いコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物から選
ばれる宿主微生物を形質転換して得られる形質転
換株を培地に培養し、培養物中にチロシンを生成
蓄積せしめ、該培養物からチロシンを採取するこ
とを特徴とするチロシンの製造法。 ２ 該DNA断片が微生物にチロシンまたはチロ
シンアナログ耐性を与えることを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 該チロシンアナログが３−アミノチロシンで
あることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載
の方法。 ４ 該ベクターがコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属微生物中で自律複製できる、
微生物由来のプラスミド、フアージまたはその誘
導体であることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ５ 該プラスミドおよびその誘導体がコリネバク
テリウム属に属する微生物由来のpCG1，pCG2，
pCG4，pCE51，pCE52，pCE53，pCE54，
pCG11またはpCB101と名付けたプラスミドであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の
方法。 ６ 該宿主微生物がコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属し、かつリゾチーム感
受性であることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ７ 該宿主微生物がコリネバクテリウム・グルタ
ミクム、コリネバクテリウム・ハーキユリス、ブ
レビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムまたはその誘導体であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ８ 該形質転換株が、コリネバクテリウム・グル
タミクムK44またはコリネバクテリウム・グルタ
ミクムK45である特許請求の範囲第１項記載の方
法。
Priority Applications (24)
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| EP89108172A EP0332234B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing l-tyrosine |
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| DE89108164T DE3486147T2 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin. |
| DE1984900870 DE136359T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Herstellungsverfahren fuer aminosaeuren. |
| EP89108165A EP0336452B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing l-phenylalanine |
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| DE8484900870T DE3484378D1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Herstellungsverfahren fuer l-histidin. |
| EP89108164A EP0334391B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing l-isoleucine |
| DE89108171T DE3486232T2 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur Herstellung von L-Arginin. |
| DE89108172T DE3486188T2 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin. |
| AT89108164T ATE89316T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur herstellung von l-isoleucin. |
| EP89108171A EP0332233B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing L-arginine |
| PCT/JP1984/000047 WO1984003301A1 (fr) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Procede de preparation d'acide amine |
| AT89108172T ATE92103T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur herstellung von l-tyrosin. |
| IL72507A IL72507A (en) | 1983-08-04 | 1984-07-25 | Process for producing l-tyrosine by corynebacterium and brevibacterium |
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| ES534893A ES534893A0 (es) | 1983-08-04 | 1984-08-03 | Un procedimiento para producir tirosina |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6034197A (ja) |
| CA (1) | CA1228038A (ja) |
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| IL (1) | IL72507A (ja) |
| IT (1) | IT1179031B (ja) |
| MX (1) | MX7639E (ja) |
Families Citing this family (6)
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|---|---|---|---|---|
| JPH06102030B2 (ja) * | 1983-09-28 | 1994-12-14 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−チロシンの製造法 |
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