JPH0680691A

JPH0680691A - シスチン含有ペプチドの製造方法

Info

Publication number: JPH0680691A
Application number: JP4257617A
Authority: JP
Inventors: Yuko Ishii; 優子石井; Toshio Watanabe; 敏夫渡辺; Masaaki Ueki; 正彬植木
Original assignee: SANKYO KAGAKU KK
Current assignee: SANKYO KAGAKU KK
Priority date: 1992-09-02
Filing date: 1992-09-02
Publication date: 1994-03-22

Abstract

(57)【要約】【目的】シスチン含有ペプチドを特定の位置にＳ−Ｓ
結合を形成でき、高純度でかつ簡便に合成する方法を提
供する。【構成】遊離のＳＨ基を有するシステイン含有保護ペ
プチドと３−ニトロ−２−ピリジルスルフェニル基で保
護されたシステイン含有保護ペプチドとから、まずＳ−
Ｓ結合を、次いでペプチド結合を形成させてシスチン含
有保護ペプチドを得、更に脱保護して得られる下記式
（Ｉ）で示されるシスチン含有ペプチドの製造方法。
〔式（Ｉ）中、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’及びＤ’は無保護ある
いは部分的に保護された各種アミノ酸残基またはペプチ
ドを示し、ｎ、ｍ、ｐ及びｑは０または１の整数を示
し、Ｃｙｓはシステイン残基を示す。〕【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、シスチン含有ペプチド
の合成方法に関し、更に詳しくは、生理活性発現及び活
性の増大に大きな効果が期待されるシスチン含有ペプチ
ドを、特定の位置にＳ−Ｓ結合を形成でき、高純度でか
つ簡便に合成する方法を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、シスチン含有ペプチドの合成方法
として、固相法または液相法により、保護されたシステ
イン残基を含む保護ペプチドシーケンスを合成し、全保
護基を一旦脱離後、遊離のＳＨ基を持つペプチドを得、
空気酸化法あるいはヨウ素酸化法を用いてジスルフィド
結合を形成させる方法が知られている。ここで空気酸化
法はＳ−Ｓ結合の形成に長時間を必要とするほか、水性
溶媒に難溶なペプチドに対しては使用できないという問
題点がある。また、ヨウ素酸化法は反応時にチロシン、
ヒスチジンおよびトリプトファンではヨウ素酸化が起こ
ることが知られており、副反応を抑えるために反応溶媒
の選択が重要である。また、ペプチドの有機溶媒への溶
解性という点からもこれらの方法は適用上の制約が多
い。最近、これらの問題点を解決すべくジスルフィド結
合を化学的に形成させる方法として、タリウム(III）ト
リフルオロアセテート法〔Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃ
ｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６３（１９８７）記載〕、
Ｓ−保護システインスルホキシド法〔Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６７６（１９８
７）記載〕、およびシリルクロライド−スルホキシド法
〔Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕ
ｎ．，１６７（１９９１）記載〕が脱保護と同時にジス
ルフィド結合を形成させる反応として報告されている。
又、システインのチオール基の保護基として３−ニトロ
−２−ピリジルスルフェニル基（Ｎｐｙｓ基）を用い、
遊離のＳＨ基と反応させることにより、容易に分子間ジ
スルフィド結合を形成できることが報告されている〔Ｃ
ｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，９２１（１９８２）記載〕。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらシスチ
ン含有ペプチドの合成方法は、まず規定の保護ペプチド
シーケンスを合成したのちに、Ｓ−Ｓ結合を形成させる
方法であり、しかも保護ペプチドシーケンスを合成した
あとのＳ−Ｓ結合形成方法のみの改善であり、保護ペプ
チドシーケンスの収率、純度の向上や分子間ジスルフィ
ド結合の副生を抑制する解決策にはなっていない。従っ
て、これら従来の合成方法では、保護ペプチドシーケン
スの収率、純度を満足なレベルまで高めることが困難で
あり、その上、Ｓ−Ｓ結合形成の反応条件の設定が難し
く、分子間Ｓ−Ｓ結合の形成を抑制できないので、この
工程における更なる収率、純度の低下を避けられない問
題があった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、通常のペ
プチド合成に使用する縮合剤を用い、ＳＨ基をＮｐｙｓ
基で保護したシステインまたはシステイン含有保護ペプ
チドと遊離のＳＨ基を有するシステインまたはシステイ
ン含有保護ペプチドを用いて反応させると一段反応で、
Ｓ−Ｓ結合形成反応とペプチド結合形成反応が進行し、
特定の位置にＳ−Ｓ結合を形成し、高純度のシスチン含
有保護ペプチドが得られることを見出し、さらに詳細な
検討を加えた結果、本発明を完成させるに到った。

【０００５】すなわち、本発明をさらに詳細に説明する
と、下記一般式（II）または（Ｖ）で示されるシステイ
ン含有保護ペプチドの例えばジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）溶液に、下記一般式(III）または（VI）で示され
るシステイン含有保護ペプチドを加え、まずＳ−Ｓ結合
を形成させ、さらにペプチド縮合剤、例えばジフェニル
ホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）／トリエチルアミン（Ｔ
ＥＡ）を加えて反応させ、一段反応で下記一般式（IV）
で示されるシスチン含有保護ペプチドを得、さらにアミ
ノ保護基（Ｘ）、カルボキシル保護基（Ｙ）、及び各種
アミノ酸の側鎖保護基を常法で脱離することにより、下
記一般式（Ｉ）で示されるシスチン含有ペプチドを合成
する方法である。本発明において、Ｘは通常のペプチド
合成に用いられるアミノ保護基であり、Ｙはカルボキシ
ル保護基である。また、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは各種保護ア
ミノ酸残基または保護ペプチドである。

【０００６】

【化３】

【０００７】

【化４】

【０００８】〔式（II）中、Ｘはアミノ保護基、Ａ及び
Ｂは各種保護アミノ酸残基または保護ペプチド、ｎ及び
ｍは各々０または１の整数を示す。式(III) 中、Ｃ及び
Ｄは各種保護アミノ酸残基または保護ペプチド、Ｙはカ
ルボキシル保護基、ｐ及びｑは各々０または１の整数を
示す。式（IV）中、Ｘ、Ｙ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ｎ、ｍ、
ｐ及びｑはいづれも上記と同様の意味を有する。式
（Ｉ）中、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’及びＤ’は無保護あるいは
部分的に保護されている各種アミノ酸残基またはペプチ
ドを示し、ｎ、ｍ、ｐ及びｑは上記と同様の意味を有す
る。式（Ｖ）中、Ｘ、Ａ、Ｂ、ｎ及びｍは上記と同様の
意味を有する。式（VI）中、Ｙ、Ｃ、Ｄ、ｐ及びｑは上
記と同様の意味を有する。Ｃｙｓは、システイン残基を
示す。〕

【０００９】本発明のシスチン含有ペプチド製造方法の
一例として、１位と４位にシステインを含有するテトラ
ペプチドの合成方法について以下に述べる。テトラペプ
チドの合成方法のうち、ペプチド鎖を遂時延長し、１位
のシステインのカルボキシル基と２位のアミノ酸のアミ
ノ基とで縮合反応を行なう１＋３縮合法と、２位のアミ
ノ酸のカルボキシル基と３位のアミノ酸のアミノ基とで
縮合反応を行なう２＋２縮合法について、それらの合成
スキームを図１と図２に示す。

【００１０】まず、１＋３縮合法（図１）におけるＢｏ
ｃ−Ａ−Ｂ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＢｚｌ（Ｂｏｃ
は、ｔ−ブトキシカルボニル基、Ｂｚｌは、ベンジル基
を表し，Ａ及びＢは前記と同様の意味を表す）の合成法
として、段階的な縮合にはジメチルホスフィノチオイル
クロライド（Ｍｐｔ−Ｃｌ）を用いる混合酸無水物法
を、脱Ｂｏｃ化にはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用
い、また、Ｎｐｙｓ基はメトキシベンジル（ＭＢｚｌ）
基をはじめとするチオール保護基と交換が可能であるこ
とから、Ｂｏｃ−Ａ−Ｂ−Ｃｙｓ（ＭＢｚｌ）−ＯＢｚ
ｌにＮｐｙｓ−Ｃｌを反応させて合成した。ＴＦＡ・Ｈ
−Ａ−Ｂ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＢｚｌは、Ｂｏｃ−
Ａ−Ｂ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＢｚｌをアニソール、
２−メルカプトエタノール、ジメチルスルフィド系でＴ
ＦＡと処理することにより合成することができる。図１
中、ＭＡ（Ｍｐｔ−Ｃｌ）はジメチルホスフィノチオイ
ルクロライドの混合酸無水物を表し、ＴＦＡ・ＭｅＳＭ
ｅはトリフルオロ酢酸ジメチルスルフィドを表す。１＋
３縮合法（図１）による一般式（IV）で示される化合物
は、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨとＴＦＡ・Ｈ−Ａ−Ｂ−Ｃｙ
ｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＢｚｌを反応させることにより得ら
れる。縮合剤としては通常のペプチド合成に用いられる
縮合剤ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、又
は水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）と１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）あるいはＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド（ＯＮＳｕ）の組み合せや混合酸無水物
を経由するリン酸系縮合剤ジフェニルホスホリルアジド
（ＤＰＰＡ）またはジメチルホスフィノチオイルアジド
（ＭＰＴＡ）と塩基の組合せが使用できる。ＭＰＴＡ法
に用いる塩基としては、トリエチルアミン（ＴＥＡ）ま
たはＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）などを用いること
ができる。ＷＳＣ／ＨＯＢｔ系では、反応は通常氷冷
下、１〜３時間攪拌後、室温でさらに１〜３０時間反応
させる。ＭＰＴＡ法では、通常氷冷下２４時間処理する
ことにより反応が完結する。

【００１１】２＋２縮合法（図２）におけるＴＦＡ・Ｈ
−Ｂ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＢｚｌの合成は、Ｂｏｃ
−アミノ酸と、ＴＦＡ・Ｈ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＢ
ｚｌを、Ｍｐｔ−Ｃｌを用いる混合酸無水物法により行
うことができる。２＋２縮合法（図２）におけるＢｏｃ
−Ｃｙｓ−Ａ−ＯＨの合成は、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙ
ｓ）−ＯＨとアミノ酸ベンジルエステルをＭｐｔ−Ｃｌ
を用いる混合酸無水物法により得られるＢｏｃ−Ｃｙｓ
（Ｎｐｙｓ）−Ａ−ＯＢｚｌを水、あるいは２−メルカ
プトエタノール存在下、トリ−ｎ−ブチルホスフィン
（ｎ−Ｂｕ₃Ｐ）と氷冷下、１時間処理することにより
Ｎｐｙｓ基を除去し、これを単離することなしにメタノ
ール−水系で水酸化ナトリウムと通常室温、１〜１０時
間反応させることによってＢｚｌ基を除去する方法で行
うことができる。縮合剤としては通常のペプチド合成に
用いられる縮合剤ＤＣＣまたはＷＳＣとＨＯＢｔあるい
はＯＮＳｕの組み合せや混合酸無水物を経由するリン酸
系縮合剤ＤＰＰＡまたはＭＰＴＡと塩基の組み合せを使
用することができる。２＋２縮合法（図２）による一般
式（IV）で示される化合物は、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ａ−Ｏ
ＨとＴＦＡ・Ｈ−Ｂ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＢｚｌを
反応させることによって得られる。縮合剤としては１＋
３縮合法で用いられる縮合剤はすべて使用することがで
きる。ＷＳＣ／ＨＯＢｔ系では、反応は通常氷冷下、１
〜３時間攪拌後、室温でさらに１〜３０時間反応させ
る。ＭＰＴＡ法では、通常氷冷下、２４時間処理するこ
とによって反応が完結する。縮合剤としてＭＰＴＡを用
いて塩基にトリエチルアミンを用いた時に収率が最も良
い。

【００１２】このようにして得られたシスチン含有保護
ペプチド（IV）のアミノ保護基（Ｘ）、カルボキシル保
護基（Ｙ）および各種アミノ酸の側鎖保護基を常法によ
り脱離することによって、特定の位置にＳ−Ｓ結合を形
成させ、目的とする一般式（Ｉ）で示されるシスチン含
有ペプチド（Ｉ）を高純度で得ることができる。

【００１３】

【発明の効果】従来のシスチン含有ペプチドの合成方法
では、保護ペプチドシーケンスの収率、純度を満足なレ
ベルまで高めることが困難であり、その上、Ｓ−Ｓ結合
形成の反応条件の設定が難しく、分子間Ｓ−Ｓ結合の形
成を抑制できないので、この工程における更なる収率、
純度の低下を避けられない問題があった。これに対し、
本発明はまずジスルフィド結合を形成させ、次いでペプ
チド結合をしかも一段反応で形成させる方法のため、従
来では不可能であったフラグメント縮合法を活用し、特
定の位置にＳ−Ｓ結合を形成させ、シスチン含有ペプチ
ドを簡便に、高純度で合成することができる新規にして
効率的な、かつフラグメント選択幅の広い製造方法であ
る。

【００１４】

【実施例】以下、本発明をさらに詳しく説明するために
実施例を示すが、これは本発明を限定するものではな
い。〔実施例１〕：合成例１Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＨ３７．５ｍｇ
（０．１ミリモル）とＨＣｌ・Ｈ−Ｃｙｓ−ＯＣＨ₃１
７．２ｍｇ（０．１ミリモル）をＤＭＦ１ｍｌに溶解
し、氷冷下にＮＭＭ０．０１１ｍｌ加え、室温で２時間
反応し、さらに、ＤＭＦ１９ｍｌ、Ｍｐｔ−Ｎ₃ ２７
ｍｇ、ＮＭＭ０．０１１ｍｌを加えて、氷冷下、２４時
間反応させた。反応液を濃縮し、残渣に酢酸エチルを加
え、有機層を精製水で洗浄し濃縮後、ＨＰＬＣ分取によ
り、下記目的物１８．１ｍｇを得た。（収率５３．９
％）ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６（クロロホルム：メタノール＝２
０：１）ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ３３７（Ｍ＋Ｈ）⁺

【００１５】

【化５】

【００１６】〔実施例２〕：合成例２（１＋３縮合法）Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＢｚ
ｌ６７．０ｍｇ（０．１ミリモル）を塩化メチレン
０．３９ｍｌに溶解し、氷冷下ＴＦＡ０．３９ｍｌを
添加して室温で３０分間反応し濃縮後、ＤＭＦ１ｍｌ
に溶解した。この溶液を氷冷攪拌下にＴＥＡ０．０１
４ｍｌ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ２２．１ｍｇ（０．１
ミリモル）を加え、室温で２時間反応し、さらにＤＭＦ
１９ｍｌ、Ｍｐｔ−Ｎ₃２７．０ｍｇ、ＴＥＡ０．
０１４ｍｌを氷冷下加えて２４時間反応させた。反応溶
液を濃縮し残渣に酢酸エチルを加え、有機層を精製水で
洗浄し濃縮後、ＨＰＬＣ分取を行い、下記目的物４６．
２ｍｇを得た。（収率７４．９％）ＨＰＬＣ含量：９９．４％ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ６１７（Ｍ＋Ｈ）⁺

【００１７】

【化６】

【００１８】〔実施例３〜６〕：合成例３〜６合成例２におけるグリシン及びフェニルアラニンを下記
表１のＡ及びＢに変えたほかは、合成例２と同様に表１
に示す化合物を得た。

【００１９】

【表１】

【００２０】〔実施例７〜１１〕：合成例７〜１１実施例２と同様な方法で縮合剤として、Ｍｐｔ−Ｎ₃、
ＴＥＡのかわりに、ＨＯＢｔ２０．３ｍｇ、ＷＳＣ・
ＨＣｌ２３．０ｍｇ、ＴＥＡ０．０１７ｍｌを氷冷
下加えて３時間、室温２１時間反応させて、下記表２に
示す化合物を得た。

【００２１】

【表２】

【００２２】〔実施例１２〕：合成例１２（２＋２縮合
法）Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＢｚｌ６
１．３ｍｇ（０．１ミリモル）を塩化メチレン０．３９
ｍｌに溶解し、氷冷下ＴＦＡ０．３９ｍｌを添加し３
０分間攪拌後、室温で３０分間反応し濃縮後、ＤＭＦ
１ｍｌに溶解した。この溶液を氷冷攪拌下にＴＥＡ
０．０１４ｍｌ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ２
７．８ｍｇ（０．１ミリモル）を加え、室温で２時間反
応し、さらにＤＭＦ１９ｍｌ、Ｍｐｔ−Ｎ₃２７．０
ｍｇ、ＴＥＡ０．０１４ｍｌを氷冷下加えて２４時間
反応させた。反応溶液を濃縮し残渣に酢酸エチルを加
え、有機層を精製水で洗浄し濃縮後、ＨＰＬＣ分取を行
い、下記目的物５０．４ｍｇを得た。（収率８１．８
％）ＨＰＬＣ含量：９９．６％ＭＳ（ＦＡＢ）：ｍ／ｚ６１７（Ｍ＋Ｈ）⁺

【００２３】

【化７】

【００２４】〔実施例１３〜１６〕：合成例１３〜１６合成例１２におけるグリシン及びフェニルアラニンを、
下記表３のＡ及びＢに代えたほかは、合成例１２と同様
にして下記表３に示す化合物を得た。

【００２５】

【表３】

【００２６】〔実施例１７〜２１〕：合成例１７〜２１実施例１２と同様な方法で縮合剤として、Ｍｐｔ−
Ｎ₃、ＴＥＡのかわりに、ＨＯＢｔ２０．３ｍｇ、Ｗ
ＳＣ・ＨＣｌ２３．０ｍｇ、ＴＥＡ０．０１７ｍｌ
を氷冷下加えて３時間、室温２１時間反応させて、下記
表４に示す化合物を得た。

【００２７】

【表４】

【００２８】

【図面の簡単な説明】

【図１】１＋３縮合法の合成スキームである。

【図２】２＋２縮合法の合成スキームである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記一般式（II）で示されるシステイン
含有保護ペプチドと、下記一般式(III) で示される３−
ニトロ−２−ピリジルスルフェニル基で保護されたシス
テイン含有保護ペプチドとから、まずＳ−Ｓ結合を、次
いでペプチド結合を形成させて下記一般式（IV）で示さ
れるシスチン含有保護ペプチドを得、これを常法で脱保
護することを特徴とする下記一般式（Ｉ）で示されるシ
スチン含有ペプチドの製造方法。【化１】〔式（II）中、Ｘはアミノ保護基、Ａ及びＢは各種保護
アミノ酸残基または保護ペプチド、ｎ及びｍは各々０ま
たは１の整数を示す。式(III) 中、Ｃ及びＤは各種保護
アミノ酸残基または保護ペプチド、Ｙはカルボキシル保
護基、ｐ及びｑは各々０または１の整数を示し、Ｎｐｙ
ｓは３−ニトロ−２−ピリジルスルフェニル基を示す。
式（IV）中、Ｘ、Ｙ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ｎ、ｍ、ｐ及び
ｑはいづれも前記の意味を有する。式（Ｉ）中、Ａ’、
Ｂ’、Ｃ’及びＤ’は無保護あるいは部分的に保護され
た各種アミノ酸残基またはペプチドを示し、ｎ、ｍ、ｐ
及びｑは前記の意味を有する。Ｃｙｓはシステイン残基
を示す。〕
【請求項２】一般式（II）が下記一般式（Ｖ）で示さ
れる、３−ニトロ−２−ピリジルスルフェニル基で保護
されたシステイン含有保護ペプチドであり、一般式(II
I）が下記一般式（VI）で示されるシステイン含有保護
ペプチドであることを特徴とする請求項１記載の一般式
（Ｉ）で示されるシスチン含有ペプチドの製造方法。【化２】〔式（Ｖ）中、Ｘはアミノ保護基，Ａ及びＢは各種保護
アミノ酸残基または保護ペプチド、ｎ及びｍは各々０ま
たは１の整数を示し、Ｎｐｙｓは３−ニトロ−２−ピリ
ジルスルフェニル基を示す。式（VI）中、Ｃ及びＤは各
種保護アミノ酸残基または保護ペプチド、Ｙはカルボキ
シル保護基、ｐ及びｑは各々０または１の整数を示す。
Ｃｙｓはシステイン残基を示す。〕