JPH09103295A - 形質転換酵母によるヒルジンの発現及び抗凝血剤組成物 - Google Patents
形質転換酵母によるヒルジンの発現及び抗凝血剤組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】抗凝血剤組成物及びヒルジンまたはヒルジン類
縁体をコードするＤＮＡ配列を発現するためのベクター
により形質転換された酵母を提供する。 【解決手段】 酵母における複製開始点を含むプラス
ミドに組み込まれるか又は酵母の染色体に組み込まれた
機能性ＤＮＡブロックにより形質転換された酵母であっ
て、前記ブロックが少なくともヒルジン、その変種の一
つ又はその前駆体をコードするＤＮＡ配列、リーダー配
列、転写シグナルを含むＤＮＡ配列を含むことを特徴と
する酵母；並びに抗凝血剤組成物である。
縁体をコードするＤＮＡ配列を発現するためのベクター
により形質転換された酵母を提供する。 【解決手段】 酵母における複製開始点を含むプラス
ミドに組み込まれるか又は酵母の染色体に組み込まれた
機能性ＤＮＡブロックにより形質転換された酵母であっ
て、前記ブロックが少なくともヒルジン、その変種の一
つ又はその前駆体をコードするＤＮＡ配列、リーダー配
列、転写シグナルを含むＤＮＡ配列を含むことを特徴と
する酵母；並びに抗凝血剤組成物である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒルジンまたはヒ
ルジン類縁体をコードするＤＮＡ配列を発現するための
ベクター、これらのベクターにより形質転換された酵母
の培養培地中へのヒルジンの分泌、および醗酵により活
性なヒルジンを得ることのできるプロセス並びに得られ
たヒルジンに関するものである。
ルジン類縁体をコードするＤＮＡ配列を発現するための
ベクター、これらのベクターにより形質転換された酵母
の培養培地中へのヒルジンの分泌、および醗酵により活
性なヒルジンを得ることのできるプロセス並びに得られ
たヒルジンに関するものである。
【０００２】
【発明の開示】医用ヒル（Ｈirudo medicinalis ）の
唾液腺中に存在する抗凝血活性の原因物質は、ヒルジン
として知られる小型ポリペプチドである（１）。この極
めて特異的な、極めて有効なトロンビン阻害剤は、極め
て有用な治療剤を提供する可能性があるため、最近で
は、広く研究されている。しかしながら、それの単離及
び精製が極めて困難であり、費用がかさむため、あまり
広く用いられるに至つておらず、更には、臨床の立場か
ら研究する可能性さえ排除されてきた。
唾液腺中に存在する抗凝血活性の原因物質は、ヒルジン
として知られる小型ポリペプチドである（１）。この極
めて特異的な、極めて有効なトロンビン阻害剤は、極め
て有用な治療剤を提供する可能性があるため、最近で
は、広く研究されている。しかしながら、それの単離及
び精製が極めて困難であり、費用がかさむため、あまり
広く用いられるに至つておらず、更には、臨床の立場か
ら研究する可能性さえ排除されてきた。
【０００３】組換えＤＮＡ技法を用いて遺伝子をクロー
ニングし、発現させてヒルジンを製造することの可能な
ことは、既に、ヒルジンをコードする天然のヒル遺伝子
の微生物Ｅ．coliでのクローニング及び発現（１９８４
年３月２７日出願の本出願人名義のフランス特許出願第
８４／０４，７５５号）により証明されている。Ｅ．co
li中で生物学的活性をもつペプチドを産生させることは
可能となつていても、他のタイプの微生物中でヒルジン
を産生させることは極めて重要である。実際、ヒルジン
を臨床的に使用するには、製品が極めて高い純度をもつ
ことが要求され、発熱性汚染物の除去が、大腸菌抽出物
からのヒルジンの精製に当つての問題となりうる。
ニングし、発現させてヒルジンを製造することの可能な
ことは、既に、ヒルジンをコードする天然のヒル遺伝子
の微生物Ｅ．coliでのクローニング及び発現（１９８４
年３月２７日出願の本出願人名義のフランス特許出願第
８４／０４，７５５号）により証明されている。Ｅ．co
li中で生物学的活性をもつペプチドを産生させることは
可能となつていても、他のタイプの微生物中でヒルジン
を産生させることは極めて重要である。実際、ヒルジン
を臨床的に使用するには、製品が極めて高い純度をもつ
ことが要求され、発熱性汚染物の除去が、大腸菌抽出物
からのヒルジンの精製に当つての問題となりうる。
【０００４】さらに、Ｅ．coliにより合成されたヒルジ
ンは、細胞内に残り、従つて極めて多数のＥ．coliペプ
チドから分離、精製しなければならない。こうした理由
で、ヒトに対し発熱性又は毒性を示す物質を生産せず、
かつ培地中へ蛋白質を分泌できる酵母内で、ヒルジン遺
伝子を発現させることは有用である。
ンは、細胞内に残り、従つて極めて多数のＥ．coliペプ
チドから分離、精製しなければならない。こうした理由
で、ヒトに対し発熱性又は毒性を示す物質を生産せず、
かつ培地中へ蛋白質を分泌できる酵母内で、ヒルジン遺
伝子を発現させることは有用である。
【０００５】抗凝血剤としてのヒルジンの作用機構は、
解明されはじめたばかりである。ヒルジンが結合する基
質は、トロンビンであり、このトロンビンは、酵母前駆
体（チモーゲン）であるプロトロンビンから活性化（活
性化された第Ｘ因子による）されると、循環血中のフイ
ブリノーゲンを切断して、これを血液凝塊（クロツト）
の形成に必要なフイブリンに変換する蛋白質分解酵母で
ある。１：１トロンビン−ヒルジン複合体の解離定数
（０．８×１０-10）は、これらの分子間の会合が極め
て強いことを示している（２）。実際上、これら２分子
間の非共有結合による複合体は、生体内で解離不可能と
考えうる。
解明されはじめたばかりである。ヒルジンが結合する基
質は、トロンビンであり、このトロンビンは、酵母前駆
体（チモーゲン）であるプロトロンビンから活性化（活
性化された第Ｘ因子による）されると、循環血中のフイ
ブリノーゲンを切断して、これを血液凝塊（クロツト）
の形成に必要なフイブリンに変換する蛋白質分解酵母で
ある。１：１トロンビン−ヒルジン複合体の解離定数
（０．８×１０-10）は、これらの分子間の会合が極め
て強いことを示している（２）。実際上、これら２分子
間の非共有結合による複合体は、生体内で解離不可能と
考えうる。
【０００６】ヒルジンは、非常に特異的なトロンビン阻
害物質で、天然の基質であるフイブリノーゲンよりもず
っと高い親和性をもつ。しかも、他の凝固因子又は他の
血漿成分が存在することは必要でない。ヒルジンの抗ト
ロンビン作用が特異的でかつ極めて強力であるため、こ
れを抗凝血剤として臨床的に使用できることは明かであ
る。
害物質で、天然の基質であるフイブリノーゲンよりもず
っと高い親和性をもつ。しかも、他の凝固因子又は他の
血漿成分が存在することは必要でない。ヒルジンの抗ト
ロンビン作用が特異的でかつ極めて強力であるため、こ
れを抗凝血剤として臨床的に使用できることは明かであ
る。
【０００７】ヒルジンは、その抗凝血性のため、動物で
はかなりの程度まで研究されている。最も詳細な研究
（３）は、ラツトでの静脈血栓症、血管閉塞及び播種性
血管内凝固（ＤＩＣ）の予防におけるヒルジンの作用を
記述している。ヒルジンは、極めて精製された形で静脈
内投与されたときには、ラツト、イヌ、ウサギ及びマウ
スによく忍容される。マウスでのＬＤ50は、体重１ｋｇ
当り５０万単位（即ち６０ｍｇ／ｋｇ）以上である。他
の研究（４）は、静脈内投与、皮下投与とも、マウスは
１ｇ／ｋｇまでの用量に耐え、ウサギは１０ｍｇ／ｋｇ
まで忍容することを示している。マウスでは、２週間の
反復注射では感作反応に至らない。
はかなりの程度まで研究されている。最も詳細な研究
（３）は、ラツトでの静脈血栓症、血管閉塞及び播種性
血管内凝固（ＤＩＣ）の予防におけるヒルジンの作用を
記述している。ヒルジンは、極めて精製された形で静脈
内投与されたときには、ラツト、イヌ、ウサギ及びマウ
スによく忍容される。マウスでのＬＤ50は、体重１ｋｇ
当り５０万単位（即ち６０ｍｇ／ｋｇ）以上である。他
の研究（４）は、静脈内投与、皮下投与とも、マウスは
１ｇ／ｋｇまでの用量に耐え、ウサギは１０ｍｇ／ｋｇ
まで忍容することを示している。マウスでは、２週間の
反復注射では感作反応に至らない。
【０００８】また、実験動物では、ヒルジンは、腎を介
して、未だ活性のある形で速やかに排泄される（半減期
は１時間のオーダーである）（３）。
して、未だ活性のある形で速やかに排泄される（半減期
は１時間のオーダーである）（３）。
【０００９】別の２つの研究、一つはイヌを用いたもの
（５）、他はラツトでのＤＩＣの予防におけるヒルジン
の活性を示したもの（６）は、マルクヴアルト（Ｍarkw
ardt）らの正の結果と一致している。これらの研究者
は、ヒトの止血系に対する天然ヒルジンの作用の初めて
の生体内解析を最近発表している（７）。何らの毒性副
作用の徴候もなく、期待通りの生物学的効果を被験者は
示した。
（５）、他はラツトでのＤＩＣの予防におけるヒルジン
の活性を示したもの（６）は、マルクヴアルト（Ｍarkw
ardt）らの正の結果と一致している。これらの研究者
は、ヒトの止血系に対する天然ヒルジンの作用の初めて
の生体内解析を最近発表している（７）。何らの毒性副
作用の徴候もなく、期待通りの生物学的効果を被験者は
示した。
【００１０】ヒルジンがブタでの内毒素誘発ＤＩＣを防
止し（８）、かくしてブタで高い致死率をもたらす内毒
素血症が惹起する極めて重大な問題を解決しうるものと
なることを証明することもできた。
止し（８）、かくしてブタで高い致死率をもたらす内毒
素血症が惹起する極めて重大な問題を解決しうるものと
なることを証明することもできた。
【００１１】ごく最近の一つの発表（７）は、ヒトへの
ヒルジンの静脈内投与及び皮下投与を記述している。６
名の志願者を用いて、ヒルジンの１回投与（１０００Ａ
Ｔ−Ｕ／ｋｇ）の薬物動態と止血系への影響が評価され
た。静脈内投与時、ヒルジンの半減期は５０分であり、
注射から２４時間のうちにヒルジンの５０％が活性な形
で尿中に表われる。血漿中ヒルジン濃度に応じて凝固時
間（インビトロでトロンビン、トロンボプラスチン及び
プロトロンビンについて測定）の延長が観察され、これ
は、ヒルジン分子が被験者の循環血中で生物学的活性を
保持していることを示す。血小板数、フイブリノーゲン
濃度あるいはフイブリン分解系について変化は認められ
ない。静脈内注射の場合と同様に、ヒルジンの皮下投与
もよく忍容され、何らの副作用も起こさない。アレルギ
ー反応発現の可能性を試験するため、同じ被験者らに４
週間の間隔をおいて２回の皮内注射が行なわれたが、感
作の徴候は認められなかつた。さらに血清中に抗ヒルジ
ン抗体も検出されなかつた。
ヒルジンの静脈内投与及び皮下投与を記述している。６
名の志願者を用いて、ヒルジンの１回投与（１０００Ａ
Ｔ−Ｕ／ｋｇ）の薬物動態と止血系への影響が評価され
た。静脈内投与時、ヒルジンの半減期は５０分であり、
注射から２４時間のうちにヒルジンの５０％が活性な形
で尿中に表われる。血漿中ヒルジン濃度に応じて凝固時
間（インビトロでトロンビン、トロンボプラスチン及び
プロトロンビンについて測定）の延長が観察され、これ
は、ヒルジン分子が被験者の循環血中で生物学的活性を
保持していることを示す。血小板数、フイブリノーゲン
濃度あるいはフイブリン分解系について変化は認められ
ない。静脈内注射の場合と同様に、ヒルジンの皮下投与
もよく忍容され、何らの副作用も起こさない。アレルギ
ー反応発現の可能性を試験するため、同じ被験者らに４
週間の間隔をおいて２回の皮内注射が行なわれたが、感
作の徴候は認められなかつた。さらに血清中に抗ヒルジ
ン抗体も検出されなかつた。
【００１２】これらの研究者は、ヒルジンが抗凝血剤と
して有用な臨床薬剤となりうることを示唆している。ヒ
ルジンの作用の特異性が高いため、血液凝固の前段階は
影響されない。その抗トロンビン活性は、用量依存性で
あり、ヒルジンの作用は、その速かな腎排泄の結果、速
かな可逆性を示す。ＤＩＣには抗トロンビンIII（ヘパ
リンの作用に必要な補足因子）の減少と非常に有効な抗
ヘパリン剤である血小板因子４の放出とが伴うという事
実からみて予測できた通り、ヒルジンはＤＩＣの処置に
ついてはヘパリンよりずつと優れていることが証明され
ている（３，６）。
して有用な臨床薬剤となりうることを示唆している。ヒ
ルジンの作用の特異性が高いため、血液凝固の前段階は
影響されない。その抗トロンビン活性は、用量依存性で
あり、ヒルジンの作用は、その速かな腎排泄の結果、速
かな可逆性を示す。ＤＩＣには抗トロンビンIII（ヘパ
リンの作用に必要な補足因子）の減少と非常に有効な抗
ヘパリン剤である血小板因子４の放出とが伴うという事
実からみて予測できた通り、ヒルジンはＤＩＣの処置に
ついてはヘパリンよりずつと優れていることが証明され
ている（３，６）。
【００１３】一つの研究は、ヒトの皮膚によるヒルジン
吸収の可能性を証明している（９）。もつとも、得られ
た結果には若干理解しがたいところもある。
吸収の可能性を証明している（９）。もつとも、得られ
た結果には若干理解しがたいところもある。
【００１４】細胞を含まない粗製ヒル抽出物の市販製剤
が、軟膏として入手可能である（フランスのニコラス社
のヒルクリーム、西ドイツのプラントルガン ヴエルケ
社のエクスヒルドーブルートゲル）。しかし、これが有
利な投与経路であるかどうかを確かめるためには、高度
に精製された材料をより高用量でさらに試験することが
必要である。一般的にいつて、好ましい投与経路は、静
脈内、筋肉内及び経皮経路である。他のヒルジン投与経
路、特に経口も報告されている［ＢＳＭ（フランス医薬
特許）３７９２Ｍ］。
が、軟膏として入手可能である（フランスのニコラス社
のヒルクリーム、西ドイツのプラントルガン ヴエルケ
社のエクスヒルドーブルートゲル）。しかし、これが有
利な投与経路であるかどうかを確かめるためには、高度
に精製された材料をより高用量でさらに試験することが
必要である。一般的にいつて、好ましい投与経路は、静
脈内、筋肉内及び経皮経路である。他のヒルジン投与経
路、特に経口も報告されている［ＢＳＭ（フランス医薬
特許）３７９２Ｍ］。
【００１５】他の成分と組合わせる時、この製品は、西
ドイツ特許出願公開２１０１３９３号に記載されている
ように、乾癬及び同じタイプの他の皮膚障害の処置にも
使用できる。
ドイツ特許出願公開２１０１３９３号に記載されている
ように、乾癬及び同じタイプの他の皮膚障害の処置にも
使用できる。
【００１６】さらに、ヒルジンは、臨床検査室試験にお
ける抗凝固剤として、また研究のツールとして利用する
ことができる。この場合、血液凝固の一つの段階のみに
対する高い特異性のため、作用特異性のずっと低い、最
も多用されている凝固剤に比してかなり有利となりう
る。
ける抗凝固剤として、また研究のツールとして利用する
ことができる。この場合、血液凝固の一つの段階のみに
対する高い特異性のため、作用特異性のずっと低い、最
も多用されている凝固剤に比してかなり有利となりう
る。
【００１７】また、ヒルジンは、体外循環系及び透析系
での抗凝固剤としても、極めて有用でありうる。これら
の系では、特にそれら人工循環系の表面に活性な形で固
定されたならば、他の抗凝固剤よりもかなり有利となり
うる。
での抗凝固剤としても、極めて有用でありうる。これら
の系では、特にそれら人工循環系の表面に活性な形で固
定されたならば、他の抗凝固剤よりもかなり有利となり
うる。
【００１８】しかも、ヒルジンのトロンビンへの結合活
性は、第VIII因子などの凝固因子をその精製時に間接的
に保護することを可能にしうる。
性は、第VIII因子などの凝固因子をその精製時に間接的
に保護することを可能にしうる。
【００１９】最後に、標識ヒルジンの使用は、トロンビ
ン及びプロトロンビンの濃度を測定するための簡単で有
効な方法となりうる。特に、標識ヒルジンは、クロツト
形成過程でクロツトを可視化する目的で使用できる。何
故ならば、凝固現象は、形成部位での循環血中プロトロ
ンビンのトロンビンの転化を包含し、標識ヒルジンは、
トロンビンに結合され、可視化されうるからである。
ン及びプロトロンビンの濃度を測定するための簡単で有
効な方法となりうる。特に、標識ヒルジンは、クロツト
形成過程でクロツトを可視化する目的で使用できる。何
故ならば、凝固現象は、形成部位での循環血中プロトロ
ンビンのトロンビンの転化を包含し、標識ヒルジンは、
トロンビンに結合され、可視化されうるからである。
【００２０】また、形質転換酵母をヒルジン放出薬とし
て、例えばヒルジンを皮膚上に分泌する該酵母を含有す
るクリームを塗付することにより、直接利用することも
考えられる。
て、例えばヒルジンを皮膚上に分泌する該酵母を含有す
るクリームを塗付することにより、直接利用することも
考えられる。
【００２１】要約すると、本発明のヒルジンには、下記
に例示する可能性ある用途が数多くある。： １）現にある血栓の拡大の阻止及び予防のための、臨床
的血栓症状態での抗凝固剤として； ２）顕微鏡外科手術後の血腫及び腫脹を減じるための抗
凝固剤として（この状況下では、現在生きたヒルがかな
り用いられている）； ３）体外循環系での抗凝固剤として、また合成生体材料
被覆のための抗凝固剤として； ４）検査室実験での血液サンプルの臨床検査に際しての
抗凝固剤として； ５）凝固に関する臨床研究に際しての抗凝固剤として、
また実験ツールとして； ６）痔、静脈瘤及び浮腫の処置における皮膚適用の可能
性ある局所用薬剤として； ７）乾癬症及び関連疾患の処置における一成分として； ８）最後に、ヒルジンは、血液の保存中及び血液由来物
の（血小板、第VIII因子、第IX因子）調製中のトロンビ
ン結合用に利用できる。
に例示する可能性ある用途が数多くある。： １）現にある血栓の拡大の阻止及び予防のための、臨床
的血栓症状態での抗凝固剤として； ２）顕微鏡外科手術後の血腫及び腫脹を減じるための抗
凝固剤として（この状況下では、現在生きたヒルがかな
り用いられている）； ３）体外循環系での抗凝固剤として、また合成生体材料
被覆のための抗凝固剤として； ４）検査室実験での血液サンプルの臨床検査に際しての
抗凝固剤として； ５）凝固に関する臨床研究に際しての抗凝固剤として、
また実験ツールとして； ６）痔、静脈瘤及び浮腫の処置における皮膚適用の可能
性ある局所用薬剤として； ７）乾癬症及び関連疾患の処置における一成分として； ８）最後に、ヒルジンは、血液の保存中及び血液由来物
の（血小板、第VIII因子、第IX因子）調製中のトロンビ
ン結合用に利用できる。
【００２２】目安として、ヒルジンは治療用組成物中で
１００〜５００００抗トロンビンＵ／ｋｇ／日に相当す
る濃度で使用することができる。
１００〜５００００抗トロンビンＵ／ｋｇ／日に相当す
る濃度で使用することができる。
【００２３】ヒルジンは水溶性であるので、薬理学上許
容される担体及び賦形剤を用いて注射用又はその他の経
路で適用可能な医薬組成物を得るのは容易である。
容される担体及び賦形剤を用いて注射用又はその他の経
路で適用可能な医薬組成物を得るのは容易である。
【００２４】最後に、インビトロ検定或いはインビボイ
メージングのために、特にクロツト形成の可視化のため
に、既知の手段により放射性標識又は任意のタイプの酵
素又は螢光性標識で標識化したヒルジンを使用すること
ができる。
メージングのために、特にクロツト形成の可視化のため
に、既知の手段により放射性標識又は任意のタイプの酵
素又は螢光性標識で標識化したヒルジンを使用すること
ができる。
【００２５】全ヒルジン体からのヒルジン製剤が、該当
蛋白質のアミノ酸配列の決定に使用されている（１０、
１１）。以下の実験では、絶食ヒルの頭部でメツセンジ
ヤーＲＮＡとして発現される遺伝子のクローニングがな
された。この遺伝子は、ヒルの全身中に見出される蛋白
質（ＨＶ−１として知られる蛋白質）とはかなり配列の
異なる蛋白質（ヒルジン変種２、即ちＨＶ−２）に関す
る情報を担持している。ＨＶ−１とＨＶ−２との間には
アミノ酸残基で９ケ所の相違があり、両者のＮＨ2末端
残基の差（Ｖａｌ−Ｖａｌ又はＩｌｅ−Ｔｈｒ）によ
り、ヒルジンＮＨ2末端に関する文献上の一見しての矛
盾を説明できるかもしれない（１２）。
蛋白質のアミノ酸配列の決定に使用されている（１０、
１１）。以下の実験では、絶食ヒルの頭部でメツセンジ
ヤーＲＮＡとして発現される遺伝子のクローニングがな
された。この遺伝子は、ヒルの全身中に見出される蛋白
質（ＨＶ−１として知られる蛋白質）とはかなり配列の
異なる蛋白質（ヒルジン変種２、即ちＨＶ−２）に関す
る情報を担持している。ＨＶ−１とＨＶ−２との間には
アミノ酸残基で９ケ所の相違があり、両者のＮＨ2末端
残基の差（Ｖａｌ−Ｖａｌ又はＩｌｅ−Ｔｈｒ）によ
り、ヒルジンＮＨ2末端に関する文献上の一見しての矛
盾を説明できるかもしれない（１２）。
【００２６】図１は、ＨＶ−２ｍＲＮＡに相当するｃＤ
ＮＡのコピーを含有する組換えプラスミドｐＴＧ７１７
のＤＮＡ配列を、ｂ）のところではそのＤＮＡ配列から
推論されるアミノ酸配列を、ｃ）のところではこの配列
とＨＶ−１のアミノ酸配列との差を示している。
ＮＡのコピーを含有する組換えプラスミドｐＴＧ７１７
のＤＮＡ配列を、ｂ）のところではそのＤＮＡ配列から
推論されるアミノ酸配列を、ｃ）のところではこの配列
とＨＶ−１のアミノ酸配列との差を示している。
【００２７】このｃＤＮＡ配列は恐らく不完全であり、
成熟型蛋白質の始端よりも上流にシグナル配列があるの
でないかと考えるのが妥当である。
成熟型蛋白質の始端よりも上流にシグナル配列があるの
でないかと考えるのが妥当である。
【００２８】微生物におけるＨＶ−２ｃＤＮＡの発現
は、相当する蛋白質が抗トロンビン活性をもつことを示
す。
は、相当する蛋白質が抗トロンビン活性をもつことを示
す。
【００２９】下記の実験は変種ＨＶ−２について行なわ
れたものであるが、以下に「ヒルジン」、「ヒルジンを
コードする遺伝子」とは、特に断らない限り、いずれか
の変種、即ちＨＶ−１又はＨＶ−２、また他の可能な変
種、及び対応する配列を表わすものとする。
れたものであるが、以下に「ヒルジン」、「ヒルジンを
コードする遺伝子」とは、特に断らない限り、いずれか
の変種、即ちＨＶ−１又はＨＶ−２、また他の可能な変
種、及び対応する配列を表わすものとする。
【００３０】本発明の主題の一つは、酵母によりヒルジ
ンを調製することである。
ンを調製することである。
【００３１】酵母は、単細胞真核生物である。サツカロ
マイセス属の酵母は、実験室で生化学的、遺伝学的に徹
底的に研究されている株を包含している；それはまた、
食品工業（パン、アルコール性飲料、その他）で用いら
れており、従つて大量に生産されている株を包含してい
る。
マイセス属の酵母は、実験室で生化学的、遺伝学的に徹
底的に研究されている株を包含している；それはまた、
食品工業（パン、アルコール性飲料、その他）で用いら
れており、従つて大量に生産されている株を包含してい
る。
【００３２】古典的手法により又は遺伝子工学から導か
れる手法により、さらにはこれら両タイプの手法の組合
わせによりサツカロマイセス・セレヴイシアエ（Ｓacch
aromyces cerevisiae）の細胞を容易に操作できるた
め、かつこの酵母種の産業上の歴史が長いため、この種
が異種ポリペプチド製造のための優れた宿主となる。
れる手法により、さらにはこれら両タイプの手法の組合
わせによりサツカロマイセス・セレヴイシアエ（Ｓacch
aromyces cerevisiae）の細胞を容易に操作できるた
め、かつこの酵母種の産業上の歴史が長いため、この種
が異種ポリペプチド製造のための優れた宿主となる。
【００３３】それゆえ、本発明は、より詳しくは、少く
とも ・ヒルジン又はその変種のひとつをコードする遺伝子
（以下Ｈ遺伝子）、 ・酵母によるＨ遺伝子の転写のためのシグナルを含有す
るＤＮＡ配列（Ｓtr）を含むことを特徴とする、酵母か
らのヒルジンの調製を可能ならしめる機能性ＤＮＡブロ
ツクに関するものである。
とも ・ヒルジン又はその変種のひとつをコードする遺伝子
（以下Ｈ遺伝子）、 ・酵母によるＨ遺伝子の転写のためのシグナルを含有す
るＤＮＡ配列（Ｓtr）を含むことを特徴とする、酵母か
らのヒルジンの調製を可能ならしめる機能性ＤＮＡブロ
ツクに関するものである。
【００３４】プラスミド又は酵母、好ましくはサツカロ
マイセス属酵母の染色体に組込まれたとき、この機能性
ブロツクは、該酵母の形質転換後に、ヒルジンを活性型
又は活性化によりヒルジンを再生しうる不活性前駆体型
で発現させうる。
マイセス属酵母の染色体に組込まれたとき、この機能性
ブロツクは、該酵母の形質転換後に、ヒルジンを活性型
又は活性化によりヒルジンを再生しうる不活性前駆体型
で発現させうる。
【００３５】サツカロマイセス・セレヴイシアエの価値
は、この酵母が培地中に或る種の蛋白質を分泌できるの
で、この分泌をもたらす機構の研究の上で大きな進歩が
なされつつあることにあり、適切な操作を加えれば、ヒ
ト血清中に見出されるものに全ての点で類似の、正確な
プロセツシングを受けたヒトホルモンをこの酵母に分泌
させることができることが示されている（１３、１
４）。
は、この酵母が培地中に或る種の蛋白質を分泌できるの
で、この分泌をもたらす機構の研究の上で大きな進歩が
なされつつあることにあり、適切な操作を加えれば、ヒ
ト血清中に見出されるものに全ての点で類似の、正確な
プロセツシングを受けたヒトホルモンをこの酵母に分泌
させることができることが示されている（１３、１
４）。
【００３６】本発明に関して言えば、この性質を活用し
て、ヒルジンの分泌を達成しようとするものであり、こ
れには多くの利点があるからである。
て、ヒルジンの分泌を達成しようとするものであり、こ
れには多くの利点があるからである。
【００３７】まず第一に、酵母はごく僅かの種類の蛋白
質しか分泌しないが、このため、若しある異種の蛋白質
の分泌の誘導を高度に達成することができれば、総分泌
蛋白質で高い比率を占める或る生成物を培地中に得るこ
と、従つて求める蛋白質の精製作業を容易にすることが
可能となるという利点がある。
質しか分泌しないが、このため、若しある異種の蛋白質
の分泌の誘導を高度に達成することができれば、総分泌
蛋白質で高い比率を占める或る生成物を培地中に得るこ
と、従つて求める蛋白質の精製作業を容易にすることが
可能となるという利点がある。
【００３８】数種の蛋白質またはポリペプチドが酵母に
より分泌される。既知の全ての場合に、これらの蛋白質
はより長い前駆体の形で合成され、それらのＮＨ2末端
配列が分泌に至る代謝過程へ入るのに極めて重要であ
る。
より分泌される。既知の全ての場合に、これらの蛋白質
はより長い前駆体の形で合成され、それらのＮＨ2末端
配列が分泌に至る代謝過程へ入るのに極めて重要であ
る。
【００３９】異種蛋白質の配列を伴うこれら前駆体の一
つのＮＨ2末端配列を含む混成（ハイブリツド）蛋白質
の酵母内での合成が、その異種蛋白質の分泌につながる
場合がある。この異種蛋白質が前駆体の形で、従つて一
般には不活性な形で、合成されるという事実が、求める
分子が有するかもしれない毒性作用から細胞を保護する
ことを可能にし、活性蛋白質を遊離させるその切断は、
該蛋白質を細胞質から隔離するゴルジ体由来の小胞中で
行なわれるだけである。
つのＮＨ2末端配列を含む混成（ハイブリツド）蛋白質
の酵母内での合成が、その異種蛋白質の分泌につながる
場合がある。この異種蛋白質が前駆体の形で、従つて一
般には不活性な形で、合成されるという事実が、求める
分子が有するかもしれない毒性作用から細胞を保護する
ことを可能にし、活性蛋白質を遊離させるその切断は、
該蛋白質を細胞質から隔離するゴルジ体由来の小胞中で
行なわれるだけである。
【００４０】従つて、異種蛋白質を酵母に生産させるた
めに分泌に至る代謝経路を利用することにはいくつかの
利点がある： １）培養上澄中で十分に純粋な生成物を回収できる； ２）成熟型蛋白質が有するかもしれない毒性作用から細
胞を保護できる； ３）更に、分泌された蛋白質が修飾（グリコシル化、硫
酸化など）を受けうる場合がある。
めに分泌に至る代謝経路を利用することにはいくつかの
利点がある： １）培養上澄中で十分に純粋な生成物を回収できる； ２）成熟型蛋白質が有するかもしれない毒性作用から細
胞を保護できる； ３）更に、分泌された蛋白質が修飾（グリコシル化、硫
酸化など）を受けうる場合がある。
【００４１】このため、本発明の発現ブロツクは、より
詳しくは次の構造をもつであろう： −−Ｓtr−−Ｌex−−Ｓcl−−Ｈ遺伝子 ＬexはＨ遺伝子に相当する蛋白質の分泌に必要なリーダ
ー配列をコードする；Ｓclは切断部位をコードするＤＮ
Ａ配列である；また、Ｓcl−Ｈ遺伝子という要素は数回
繰返されていてもよい。
詳しくは次の構造をもつであろう： −−Ｓtr−−Ｌex−−Ｓcl−−Ｈ遺伝子 ＬexはＨ遺伝子に相当する蛋白質の分泌に必要なリーダ
ー配列をコードする；Ｓclは切断部位をコードするＤＮ
Ａ配列である；また、Ｓcl−Ｈ遺伝子という要素は数回
繰返されていてもよい。
【００４２】分泌系の一例として、アルフアフエロモン
のそれを選んだ。即ち、上記配列において、配列Ｌex
は、酵母のα性フエロモンをコードする遺伝子に由来す
るものを選んだ。しかし、他の系を利用できる（たとえ
ばキラー蛋白質の系）（１３）。
のそれを選んだ。即ち、上記配列において、配列Ｌex
は、酵母のα性フエロモンをコードする遺伝子に由来す
るものを選んだ。しかし、他の系を利用できる（たとえ
ばキラー蛋白質の系）（１３）。
【００４３】酵母のα性フエロモンは、性タイプＭＡＴ
αの酵母 Ｓ．cerevisiaeによつて培地中へ分泌される
１３個のアミノ酸からなるペプチドである（図２におい
て囲んである）。α因子はＧ１期に性タイプが反対（Ｍ
ＡＴａ）の細胞をとらえて、両タイプの細胞の交配に必
要な生化学的及び形態学的変化を誘発する。クリヤン
（Ｋurjan ）とヘルスコヴイツ（Ｈerskowitz ）（１
６）は、α因子の構造遺伝子をクローン化し、この遺伝
子の配列から、この１３個のアミノ酸からなるα因子
は、１６５個のアミノ酸からなる前駆体プレプロ蛋白質
の形で合成されると推論した（図２）。この前駆体は、
２２残基（破線のアンダーライン）からなる疎水性アミ
ノ末端配列を含み、これに３ケ所のグリコシル化部位を
包含する６１個のアミノ酸からなる配列が続き、最後に
α因子の４コピーが続く。それら４つのコピーは、「ス
ペーサー」配列により隔てられていて、下記の酵母活性
の結果として成熟型蛋白質が前駆体から遊離される： １）Ｌｙｓ−ＡｒｇジペプチドのＣＯＯＨ側で切断する
カテプシンＢ型エンドペプチダーゼ（切断部位を太い矢
印で示す）； ２）切り出されたペプチドのＣＯＯＨ末端に存在する塩
基性残基を切り取るカルボキシペプチダーゼＢ型エキソ
ペプチダーゼ： ３）Ｇlu−Ａla及びＡsp−Ａlaの残基を除去するジペプ
チジルアミノペプチダーゼ（Ａとして知られる）。
αの酵母 Ｓ．cerevisiaeによつて培地中へ分泌される
１３個のアミノ酸からなるペプチドである（図２におい
て囲んである）。α因子はＧ１期に性タイプが反対（Ｍ
ＡＴａ）の細胞をとらえて、両タイプの細胞の交配に必
要な生化学的及び形態学的変化を誘発する。クリヤン
（Ｋurjan ）とヘルスコヴイツ（Ｈerskowitz ）（１
６）は、α因子の構造遺伝子をクローン化し、この遺伝
子の配列から、この１３個のアミノ酸からなるα因子
は、１６５個のアミノ酸からなる前駆体プレプロ蛋白質
の形で合成されると推論した（図２）。この前駆体は、
２２残基（破線のアンダーライン）からなる疎水性アミ
ノ末端配列を含み、これに３ケ所のグリコシル化部位を
包含する６１個のアミノ酸からなる配列が続き、最後に
α因子の４コピーが続く。それら４つのコピーは、「ス
ペーサー」配列により隔てられていて、下記の酵母活性
の結果として成熟型蛋白質が前駆体から遊離される： １）Ｌｙｓ−ＡｒｇジペプチドのＣＯＯＨ側で切断する
カテプシンＢ型エンドペプチダーゼ（切断部位を太い矢
印で示す）； ２）切り出されたペプチドのＣＯＯＨ末端に存在する塩
基性残基を切り取るカルボキシペプチダーゼＢ型エキソ
ペプチダーゼ： ３）Ｇlu−Ａla及びＡsp−Ａlaの残基を除去するジペプ
チジルアミノペプチダーゼ（Ａとして知られる）。
【００４４】この前駆体のヌクオレチド配列は、更に、
４ケ所のＨind III制限部位（矢印Ｈで示す）を含む。
４ケ所のＨind III制限部位（矢印Ｈで示す）を含む。
【００４５】αフエロモン遺伝子と成熟型ヒルジン配列
との融合を何回か行なつた。ＭＡＴα型酵母細胞は、こ
れらの融合遺伝子を発現できる。相当するハイブリツド
蛋白質は、つぎに、それらが含有し、αフエロモン前駆
体のプレプロ配列に由来するシグナルの結果としてプロ
セツシングを受けることができる。従つて、ヒルジン配
列を有するポリペプチトが培養上澄み中に回収されるで
あろうと期待される。
との融合を何回か行なつた。ＭＡＴα型酵母細胞は、こ
れらの融合遺伝子を発現できる。相当するハイブリツド
蛋白質は、つぎに、それらが含有し、αフエロモン前駆
体のプレプロ配列に由来するシグナルの結果としてプロ
セツシングを受けることができる。従つて、ヒルジン配
列を有するポリペプチトが培養上澄み中に回収されるで
あろうと期待される。
【００４６】これらの構成の一つにおいては、Ｓcl配列
が、Ｈ遺伝子に先行する３′末端にＡＴＧコドンを含有
する；従つて、融合蛋白質は、成熟型ヒルジン配列の最
初のアミノ酸のすぐ上流にメチオニンを含有する。臭化
シアンで切断すると、このポリペプチドはヒルジン分子
を生じ、これは復元段階で活性とすることができる。
が、Ｈ遺伝子に先行する３′末端にＡＴＧコドンを含有
する；従つて、融合蛋白質は、成熟型ヒルジン配列の最
初のアミノ酸のすぐ上流にメチオニンを含有する。臭化
シアンで切断すると、このポリペプチドはヒルジン分子
を生じ、これは復元段階で活性とすることができる。
【００４７】他の構成では、αフエロモン産生のために
普通用いられる切断シグナルが、培養上澄み中に抗トロ
ンビン活性をもつポリペプチドを産生するのに役立つ。
配列ＳclがＬys−Ａrgをコードする２つのコドン、即
ち、ＡＡＡ又はＡＡＧとＡＧＡ又はＡＧＧを３′末端に
含む場合がそうである；ポリペプチドは、ＣＯＯＨ側の
Ｌys−Ａrgジペプチドを切り離すエンドペプチダーゼに
よつて切断され、ヒルジンを遊離する。
普通用いられる切断シグナルが、培養上澄み中に抗トロ
ンビン活性をもつポリペプチドを産生するのに役立つ。
配列ＳclがＬys−Ａrgをコードする２つのコドン、即
ち、ＡＡＡ又はＡＡＧとＡＧＡ又はＡＧＧを３′末端に
含む場合がそうである；ポリペプチドは、ＣＯＯＨ側の
Ｌys−Ａrgジペプチドを切り離すエンドペプチダーゼに
よつて切断され、ヒルジンを遊離する。
【００４８】本発明はとりわけ、ヒルジン遺伝子に先行
する配列が次のアミノ酸配列のいずれかをコードする構
成に関する： １）Ｌys Ａrg Ｇlu Ａla Ｇlu Ａla Ｔrp Ｌeu
Ｇln Ｖal Ａsp Ｇly Ｓer Ｍet ヒルジン−−
−、 ２）Ｌys Ａrg Ｇlu Ａla Ｇlu Ａla ヒルジン−
−−、 ３）Ｌys Ａrg Ｇlu Ａla Ｇlu Ａla Ｌys Ａrg
ヒルジン−−−、 ４）Ｌys Ａrg Ｇlu Ａla Ｇlu Ｓer Ｌeu Ａsp
Ｔyr Ｌys Ａrg ヒルジンまたは ５）Ｌys Ａrg ヒルジン−−−。
する配列が次のアミノ酸配列のいずれかをコードする構
成に関する： １）Ｌys Ａrg Ｇlu Ａla Ｇlu Ａla Ｔrp Ｌeu
Ｇln Ｖal Ａsp Ｇly Ｓer Ｍet ヒルジン−−
−、 ２）Ｌys Ａrg Ｇlu Ａla Ｇlu Ａla ヒルジン−
−−、 ３）Ｌys Ａrg Ｇlu Ａla Ｇlu Ａla Ｌys Ａrg
ヒルジン−−−、 ４）Ｌys Ａrg Ｇlu Ａla Ｇlu Ｓer Ｌeu Ａsp
Ｔyr Ｌys Ａrg ヒルジンまたは ５）Ｌys Ａrg ヒルジン−−−。
【００４９】アミノ酸レベルで酵素により選択的に切断
される他の配列を用いることももちろん考えうる。ただ
し、この切断部位がヒルジン自体の中にも存在していて
はならない。
される他の配列を用いることももちろん考えうる。ただ
し、この切断部位がヒルジン自体の中にも存在していて
はならない。
【００５０】最後に、発現ブロツクはＨ遺伝子の後方
に、酵母のターミネーター配列、例えばＰＧＫ遺伝子の
それを有していてもよい。
に、酵母のターミネーター配列、例えばＰＧＫ遺伝子の
それを有していてもよい。
【００５１】一般に、本発明の発現ブロツクは、独自的
に複製するプラスミド或いは酵母染色体の中へ組込んで
酵母、特にサツカロマイセス内に導入しても良い。
に複製するプラスミド或いは酵母染色体の中へ組込んで
酵母、特にサツカロマイセス内に導入しても良い。
【００５２】プラスミドが独立存在性である場合、それ
はその複製に備えての要素、すなわち２μプラスミドの
それの如き複製開始点を含むであろう。更に、該プラス
ミドは、ｕｒａ３-又はｌｅｕ２-酵母の相補性を与える
選択要素、例えばＵＲＡ３又はＬＥＵ２遺伝子を含んで
いてもよい。これらのプラスミドは、プラスミドを「シ
ヤトル」プラスミドとしなければならないときに細菌中
でのそれらの複製を行なう要素、例えばｐＢＲ３２２の
それの如き複製開始点、Ａｍｐrの如きマーカー遺伝子
及び／又は当業者に既知の他の要素をも含みうる。
はその複製に備えての要素、すなわち２μプラスミドの
それの如き複製開始点を含むであろう。更に、該プラス
ミドは、ｕｒａ３-又はｌｅｕ２-酵母の相補性を与える
選択要素、例えばＵＲＡ３又はＬＥＵ２遺伝子を含んで
いてもよい。これらのプラスミドは、プラスミドを「シ
ヤトル」プラスミドとしなければならないときに細菌中
でのそれらの複製を行なう要素、例えばｐＢＲ３２２の
それの如き複製開始点、Ａｍｐrの如きマーカー遺伝子
及び／又は当業者に既知の他の要素をも含みうる。
【００５３】本発明はまた、本発明の発現ブロツクによ
り形質転換された酵母株に関し、該ブロツクはプラスミ
ドに担持されていても或いはその染色体に組込まれてい
てもよい。これらの酵母の中でも、サツカロマイセス属
の酵母、特にＳ．セレヴイシアエに特に言及しなければ
ならない。
り形質転換された酵母株に関し、該ブロツクはプラスミ
ドに担持されていても或いはその染色体に組込まれてい
てもよい。これらの酵母の中でも、サツカロマイセス属
の酵母、特にＳ．セレヴイシアエに特に言及しなければ
ならない。
【００５４】プロモーターがαフエロモン遺伝子のそれ
である場合、酵母は性タイプがＭＡＴαのものであるこ
とが好ましい。例えば、遺伝子型がｕｒａ３-又はｌｅ
ｕ２-等で、適切な淘汰圧を加えて酵母中でプラスミド
が維持されるようにプラスミドを導入された酵母株を用
いる。
である場合、酵母は性タイプがＭＡＴαのものであるこ
とが好ましい。例えば、遺伝子型がｕｒａ３-又はｌｅ
ｕ２-等で、適切な淘汰圧を加えて酵母中でプラスミド
が維持されるようにプラスミドを導入された酵母株を用
いる。
【００５５】適当な培地中で上記形質転換株を培養し、
細胞内にヒルジンを蓄積させることにより、ヒルジンを
調製することも可能であるが、上記説明からわかるよう
に、ヒルジンを、成熟型で又はインビトロでプロセツシ
ングに付されるべ前駆体の形で、培地中に分泌させるこ
とがより好ましい。
細胞内にヒルジンを蓄積させることにより、ヒルジンを
調製することも可能であるが、上記説明からわかるよう
に、ヒルジンを、成熟型で又はインビトロでプロセツシ
ングに付されるべ前駆体の形で、培地中に分泌させるこ
とがより好ましい。
【００５６】この成熟化は、幾つかの段階で実施でき
る。まず、Ｌex配列の翻訳で生じた或る種の要素を切断
する必要があるかもしれない。この切断をＳclに相当す
る配列についても行なう。上に述べたように、成熟型ヒ
ルジンには臭化シアンにより選択的に切断されるメチオ
ニンが先行していてよい。ヒルジンをコードする配列
は、メチオニンを含んでいないので、この方法を利用で
きる。
る。まず、Ｌex配列の翻訳で生じた或る種の要素を切断
する必要があるかもしれない。この切断をＳclに相当す
る配列についても行なう。上に述べたように、成熟型ヒ
ルジンには臭化シアンにより選択的に切断されるメチオ
ニンが先行していてよい。ヒルジンをコードする配列
は、メチオニンを含んでいないので、この方法を利用で
きる。
【００５７】特定のエンドペプチダーゼによりＣＯＯＨ
側で切断されるＬys−ＡrgジペプチドをＮ末端に配置す
ることも可能である；この酵素は分泌過程においても活
性であるので、このようにして成熟型蛋白質を直接培地
中に得ることが可能である。しかしながら、場合によつ
ては、特定の酵素を添加して分泌後に酵素的切断を行な
うことも必要である。
側で切断されるＬys−ＡrgジペプチドをＮ末端に配置す
ることも可能である；この酵素は分泌過程においても活
性であるので、このようにして成熟型蛋白質を直接培地
中に得ることが可能である。しかしながら、場合によつ
ては、特定の酵素を添加して分泌後に酵素的切断を行な
うことも必要である。
【００５８】場合によつては、特に臭化シアン処理の後
に、ジスルフイド橋を再形成することによる復元が必要
であるかも知れない。このためには、ペプチドを例えば
塩酸グアニジンを用いて変性し、次に還元型及び酸化型
グルタチオンの存在下に復元する。
に、ジスルフイド橋を再形成することによる復元が必要
であるかも知れない。このためには、ペプチドを例えば
塩酸グアニジンを用いて変性し、次に還元型及び酸化型
グルタチオンの存在下に復元する。
【００５９】最後に、本発明は、本発明のプロセスによ
つて得られたヒルジンに関する。
つて得られたヒルジンに関する。
【００６０】本発明のその他の特質及び長所は以下の実
施例を読めば明かになるであろう。
施例を読めば明かになるであろう。
【００６１】本明細書をわずらわしくないよう、本明細
書ではアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を反復させて
いないが、それらも本明細書の明かな一部となるもので
ある。
書ではアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を反復させて
いないが、それらも本明細書の明かな一部となるもので
ある。
【００６２】実施例１−ｐＴＧ８２２の構築 ヒルジンＨＶ−２のｃＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴＧ
７１７のＰｓｔＩ消化後のゲルから抽出し、次に、酵素
Ｈinf Ｉ及びＡhaIIIで同時に消化した。酵素Ｈinf Ｉ
は成熟型ヒルジン配列の最初のコドンの下流で切断す
る。酵素ＡhaIIIはヒルジン配列の停止コドンを
（３’）の後方約３０塩基対のところで切断する。こう
して得たＨinf Ｉ−ＡhaIII断片をアガロースゲル上で
単離し、このゲルから溶出した。
７１７のＰｓｔＩ消化後のゲルから抽出し、次に、酵素
Ｈinf Ｉ及びＡhaIIIで同時に消化した。酵素Ｈinf Ｉ
は成熟型ヒルジン配列の最初のコドンの下流で切断す
る。酵素ＡhaIIIはヒルジン配列の停止コドンを
（３’）の後方約３０塩基対のところで切断する。こう
して得たＨinf Ｉ−ＡhaIII断片をアガロースゲル上で
単離し、このゲルから溶出した。
【００６３】成熟型蛋白質をコードする配列をベクター
ｐＴＧ８８０に導入した。ベクターｐＴＧ８８０は、ベ
クターｐＴＧ８３８の誘導体である（図３）。プラスミ
ドｐＴＧ８３８は、ＰＧＫ転写ターミネーター近傍にあ
るＢｇl II切断部位に関する以外はｐＴＧ８３３と同じ
である。この部位をクレノウポリメラーゼの埋め込み
（filling-in）作用によつて除去したものがｐＴＧ８３
８である。
ｐＴＧ８８０に導入した。ベクターｐＴＧ８８０は、ベ
クターｐＴＧ８３８の誘導体である（図３）。プラスミ
ドｐＴＧ８３８は、ＰＧＫ転写ターミネーター近傍にあ
るＢｇl II切断部位に関する以外はｐＴＧ８３３と同じ
である。この部位をクレノウポリメラーゼの埋め込み
（filling-in）作用によつて除去したものがｐＴＧ８３
８である。
【００６４】プラスミドｐＴＧ８３３は、酵母／Ｅ．co
liシヤトルプラスミドである。このプラスミドは、酵母
中での異種遺伝子発現用に設計した。このベクター（図
３）の基本的要素は次のものである：酵母中での選択マ
ーカーとしてのＵＲＡ３遺伝子、酵母２μプラスミドの
複製開始点、Ｅ．coliプラスミドｐＢＲ３２２のアンピ
シリン耐性遺伝子と複製開始点（これらの２要素はこの
プラスミドの大腸菌中での増殖と選択を可能にする）、
酵母ＰＧＫ遺伝子のＳalＩ部位までをコードする配列を
もったこの遺伝子の５’フランキング（側面を接する）
領域、ｐＢＲ３２２のＳalＩ−ＰvuII断片及びＰＧＫ遺
伝子ターミネーター（１９）。このプラスミドは、既に
本出願人の１９８４年５月９日に提出のフランス特許出
願第８４／０７１２５号中に記載されている。
liシヤトルプラスミドである。このプラスミドは、酵母
中での異種遺伝子発現用に設計した。このベクター（図
３）の基本的要素は次のものである：酵母中での選択マ
ーカーとしてのＵＲＡ３遺伝子、酵母２μプラスミドの
複製開始点、Ｅ．coliプラスミドｐＢＲ３２２のアンピ
シリン耐性遺伝子と複製開始点（これらの２要素はこの
プラスミドの大腸菌中での増殖と選択を可能にする）、
酵母ＰＧＫ遺伝子のＳalＩ部位までをコードする配列を
もったこの遺伝子の５’フランキング（側面を接する）
領域、ｐＢＲ３２２のＳalＩ−ＰvuII断片及びＰＧＫ遺
伝子ターミネーター（１９）。このプラスミドは、既に
本出願人の１９８４年５月９日に提出のフランス特許出
願第８４／０７１２５号中に記載されている。
【００６５】ＥcoＲＩ及びＢglIIで切断したｐＴＧ８３
８に短いポリリンカー領域（バクテリオフアージＭ１３
由来）を挿入することによりｐＴＧ８３８（図４）から
プラスミドｐＴＧ８８０を構築した。それは、酵母ＰＧ
Ｋ遺伝子に接する５’領域のすぐ後方に一連のクローニ
ング部位をＢglII、ＰstＩ、Ｈind III、ＢamＨＩ、Ｓm
aＩ及びＥcoＲＩの順序で配置することを可能にする。
プラスミドｐＴＧ８８０のＤＮＡをＢglII及びＳmaＩで
消化し、この消化で生じた大きい断片を単離し、ゲルか
ら溶出した。ヒルジンＨＶ−２をコードする配列の大部
分を含有するｐＴＧ７１７のＨinf Ｉ−ＡhaIII断片
を、消化ｐＴＧ８８０並びにヒルジン配列のＮＨ2末端
領域の再構成を意図した３種の合成オリゴヌクレオチド
（図５）と混合した。それらヌクレオチドは、ベクター
のＢglII部位をヒルジン含有断片のＨinf Ｉ部位に再連
結するものである。この混合物をライゲーシヨン処理に
付し、ついでＥ．coli細胞の形質転換に用いた。形質転
換体中にプラスミドｐＴＧ８２２が回収された。
８に短いポリリンカー領域（バクテリオフアージＭ１３
由来）を挿入することによりｐＴＧ８３８（図４）から
プラスミドｐＴＧ８８０を構築した。それは、酵母ＰＧ
Ｋ遺伝子に接する５’領域のすぐ後方に一連のクローニ
ング部位をＢglII、ＰstＩ、Ｈind III、ＢamＨＩ、Ｓm
aＩ及びＥcoＲＩの順序で配置することを可能にする。
プラスミドｐＴＧ８８０のＤＮＡをＢglII及びＳmaＩで
消化し、この消化で生じた大きい断片を単離し、ゲルか
ら溶出した。ヒルジンＨＶ−２をコードする配列の大部
分を含有するｐＴＧ７１７のＨinf Ｉ−ＡhaIII断片
を、消化ｐＴＧ８８０並びにヒルジン配列のＮＨ2末端
領域の再構成を意図した３種の合成オリゴヌクレオチド
（図５）と混合した。それらヌクレオチドは、ベクター
のＢglII部位をヒルジン含有断片のＨinf Ｉ部位に再連
結するものである。この混合物をライゲーシヨン処理に
付し、ついでＥ．coli細胞の形質転換に用いた。形質転
換体中にプラスミドｐＴＧ８２２が回収された。
【００６６】このプラスミドは、ＰＧＫプロモーターの
支配下にヒルジンを生産する目的で酵母細胞の形質転換
にも用いた。しかしながら、このベクターで形質転換し
た細胞の粗抽出物中にはヒルジン活性が検出されなかつ
た。活性ヒルジンの産生が見られなかつた理由は未だ不
明である。しかし、構築したｐＴＧ８８２は、下記酵母
分泌ベクター用のヒルジンをコードする配列の供給源と
して役立った。
支配下にヒルジンを生産する目的で酵母細胞の形質転換
にも用いた。しかしながら、このベクターで形質転換し
た細胞の粗抽出物中にはヒルジン活性が検出されなかつ
た。活性ヒルジンの産生が見られなかつた理由は未だ不
明である。しかし、構築したｐＴＧ８８２は、下記酵母
分泌ベクター用のヒルジンをコードする配列の供給源と
して役立った。
【００６７】実施例２−ｐＴＧ８８６及びｐＴＧ８９７
の構築 まず、ヒルジン配列を含むｐＴＧ８８２のＢglII−Ｅco
ＲＩ断片（２３０ｂｐ）をバクテリオフアージＭ１３ｍ
ｐ８（図６）のＢamＨＩ部位とＥcoＲＩ部位との間へ移
した。これによりフアージＭ１３ＴＧ８８２が得られ、
これよりＥcoＲＩ−Ｈind III断片（約２４５ｂｐ）を
単離することができた。この断片はヒルジンＨＶ−２全
体をコードする配列、ＢamHＩ／ＢglII融合部位及び酵
母分泌ベクターｐＴＧ８８１（図９）へのクローニング
を可能にする付着性末端（ＨindIII−ＥcoＲＩ）を含
む。
の構築 まず、ヒルジン配列を含むｐＴＧ８８２のＢglII−Ｅco
ＲＩ断片（２３０ｂｐ）をバクテリオフアージＭ１３ｍ
ｐ８（図６）のＢamＨＩ部位とＥcoＲＩ部位との間へ移
した。これによりフアージＭ１３ＴＧ８８２が得られ、
これよりＥcoＲＩ−Ｈind III断片（約２４５ｂｐ）を
単離することができた。この断片はヒルジンＨＶ−２全
体をコードする配列、ＢamHＩ／ＢglII融合部位及び酵
母分泌ベクターｐＴＧ８８１（図９）へのクローニング
を可能にする付着性末端（ＨindIII−ＥcoＲＩ）を含
む。
【００６８】プラスミドｐＴＧ８８１（１０ｋｂ）は、
Ｅ．coli中及びサツカロイマイセス・セルヴイシアエの
ウヴアルム（uvarum）株及びカルルベルゲンシス（carl
bergensis ）株中で独立して複製するＥ．coli／酵母シ
ヤトルプラスミドである。
Ｅ．coli中及びサツカロイマイセス・セルヴイシアエの
ウヴアルム（uvarum）株及びカルルベルゲンシス（carl
bergensis ）株中で独立して複製するＥ．coli／酵母シ
ヤトルプラスミドである。
【００６９】このプラスミドのＥ．coliへの導入により
アンピシリン（及び他のβ−ラクタム抗生物質）への抵
抗性を得ることができる。更に、このプラスミドは、
Ｅ．coli及びサツカロマイセスの諸株中で発現される酵
母遺伝子ＬＥＵ２及びＵＲＡ３を担持している。従つ
て、Ｅ．coli又はサツカロマイセス中にこのプラスミド
が存在すれば、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ又はＯＭＰデカルボキシラーゼ欠損株の相補性を得
ることができる。
アンピシリン（及び他のβ−ラクタム抗生物質）への抵
抗性を得ることができる。更に、このプラスミドは、
Ｅ．coli及びサツカロマイセスの諸株中で発現される酵
母遺伝子ＬＥＵ２及びＵＲＡ３を担持している。従つ
て、Ｅ．coli又はサツカロマイセス中にこのプラスミド
が存在すれば、β−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナ
ーゼ又はＯＭＰデカルボキシラーゼ欠損株の相補性を得
ることができる。
【００７０】プラスミドｐＴＧ８８１は次のようにして
構築する：出発プラスミドはｐＴＧ８４８（ｕｒａ３遺
伝子の向きが逆になつている以外はフランス特許第８３
／１５７１６号に記載されているｐＴＧ８４９と同一で
ある）であり、それは次のＤＮＡ断片からなる（図
７）。
構築する：出発プラスミドはｐＴＧ８４８（ｕｒａ３遺
伝子の向きが逆になつている以外はフランス特許第８３
／１５７１６号に記載されているｐＴＧ８４９と同一で
ある）であり、それは次のＤＮＡ断片からなる（図
７）。
【００７１】１）プラスミドｐＪＤＢ２０７（１７）由
来の約３．３ｋｂのＥcoＲＩ−ＨindIII断片。Ｈind II
I部位は２μプラスミドＢ型の座標１０５に相当し、Ｅc
oＲＩ部位は座標２２４３に相当する。この断片には、
Ｂ型２μ断片のＰstＩ部位でのポリデオキシアデニレー
ト／ポリデオキシチミジレートによつてＬＥＵ２遺伝子
が挿入されている（１７）； ２）ＵＲＡ３遺伝子のＨind III断片（１８）； ３）ｐＢＲ３２２の大きいＥcoＲＩ（座標０）−ＳalＩ
（座標６５０）断片。この断片のＰvuII部位には、ＰＧ
Ｋ遺伝子の末端に相当する５１０塩基対のＥcoＲＩ−Ｈ
ind III断片（その両端は４種のヌクレオチドの存在下
にクレノウ酵素の作用により前もつて平滑にされてい
る）が挿入されている（１９）。ｐＢＲ３２２のＰvuII
末端にＰＧＫ遺伝子の削られたＥcoＲＩ末端を結合する
と、ＥcoＲＩ部位が再生される； ４）ＰＧＫ遺伝子（１９）のＨind III−ＳalＩ断片
（２．１５ｋｂ）。
来の約３．３ｋｂのＥcoＲＩ−ＨindIII断片。Ｈind II
I部位は２μプラスミドＢ型の座標１０５に相当し、Ｅc
oＲＩ部位は座標２２４３に相当する。この断片には、
Ｂ型２μ断片のＰstＩ部位でのポリデオキシアデニレー
ト／ポリデオキシチミジレートによつてＬＥＵ２遺伝子
が挿入されている（１７）； ２）ＵＲＡ３遺伝子のＨind III断片（１８）； ３）ｐＢＲ３２２の大きいＥcoＲＩ（座標０）−ＳalＩ
（座標６５０）断片。この断片のＰvuII部位には、ＰＧ
Ｋ遺伝子の末端に相当する５１０塩基対のＥcoＲＩ−Ｈ
ind III断片（その両端は４種のヌクレオチドの存在下
にクレノウ酵素の作用により前もつて平滑にされてい
る）が挿入されている（１９）。ｐＢＲ３２２のＰvuII
末端にＰＧＫ遺伝子の削られたＥcoＲＩ末端を結合する
と、ＥcoＲＩ部位が再生される； ４）ＰＧＫ遺伝子（１９）のＨind III−ＳalＩ断片
（２．１５ｋｂ）。
【００７２】プラスミドｐＴＧ８４８をＨind IIIで切
断し、それにより遊離された２断片の両端を４種のデオ
キシリボヌクレオチドの存在下にクレノウ酵素で処理し
て平滑化する。２断片のライゲーシヨンを行ない。形質
転換前に、このライゲーシヨン混合物にＨind IIIを作
用させる。これによりＨind III部位（１ヶ所又は２ヶ
所）を保持してきたあらゆるプラスミド形態を除去でき
る。Ｅ．coliのＢＪ５１８３（pyr Ｆ）株を形質転換
し、形質転換体をアンピシリン抵抗性及びpyr+性で選択
する。かくしてプラスミドｐＴＧ８７４が得られる（図
７）。そこでは、２ヶ所のＨind III部位が除去され、
ＵＲＡ３遺伝子の配置がホスホグリセリン酸キナーゼ
（ＰＧＫ）遺伝子のそれとと同じ方向の転写を起こさせ
るようになつている。 プラスミドｐＴＧ８７４をＳma
Ｉ及びＳalＩで切断し、８．６ｋｂの断片をアガロース
ゲルから単離する。ｐＢＲ３２２の同じ部位にクローニ
ングされたＭＦα１遺伝子のＥcoＲＩ−ＳalＩ断片（約
１．４ｋｂ）を含むプラスミドｐＴＧ８６４をＥcoＲＩ
で切断する。この様にして線状としたプラスミドの両端
を４種のヌクレオチドの存在下にクレノウ酵素の作用に
より平滑化する。次に酵素ＳalＩで消化を行ない、ＭＦ
α１遺伝子に相当するＥcoＲＩ（平滑端）−ＳalＩ断片
を単離する。後者の断片をｐＴＧ８７４のＳmaＩ−Ｓal
Ｉ片（８．６ｋｂ）とライゲートすることにより、プラ
スミドｐＴＧ８７６を得る（図８）。
断し、それにより遊離された２断片の両端を４種のデオ
キシリボヌクレオチドの存在下にクレノウ酵素で処理し
て平滑化する。２断片のライゲーシヨンを行ない。形質
転換前に、このライゲーシヨン混合物にＨind IIIを作
用させる。これによりＨind III部位（１ヶ所又は２ヶ
所）を保持してきたあらゆるプラスミド形態を除去でき
る。Ｅ．coliのＢＪ５１８３（pyr Ｆ）株を形質転換
し、形質転換体をアンピシリン抵抗性及びpyr+性で選択
する。かくしてプラスミドｐＴＧ８７４が得られる（図
７）。そこでは、２ヶ所のＨind III部位が除去され、
ＵＲＡ３遺伝子の配置がホスホグリセリン酸キナーゼ
（ＰＧＫ）遺伝子のそれとと同じ方向の転写を起こさせ
るようになつている。 プラスミドｐＴＧ８７４をＳma
Ｉ及びＳalＩで切断し、８．６ｋｂの断片をアガロース
ゲルから単離する。ｐＢＲ３２２の同じ部位にクローニ
ングされたＭＦα１遺伝子のＥcoＲＩ−ＳalＩ断片（約
１．４ｋｂ）を含むプラスミドｐＴＧ８６４をＥcoＲＩ
で切断する。この様にして線状としたプラスミドの両端
を４種のヌクレオチドの存在下にクレノウ酵素の作用に
より平滑化する。次に酵素ＳalＩで消化を行ない、ＭＦ
α１遺伝子に相当するＥcoＲＩ（平滑端）−ＳalＩ断片
を単離する。後者の断片をｐＴＧ８７４のＳmaＩ−Ｓal
Ｉ片（８．６ｋｂ）とライゲートすることにより、プラ
スミドｐＴＧ８７６を得る（図８）。
【００７３】ＭＦα１プロモーター配列の近位のＢglII
部位を無くすべく、プラスミドｐＴＧ８７６のＢglII部
位による部分消化に引続いて、４種のデオキシリボヌク
レオチドの存在下にクレノウ酵素を作用させる。得られ
た新しいプラスミドｐＴＧ８８１（図９）は、ＭＦα１
遺伝子の最初のＨind III部位とＰＧＫ遺伝子の末端の
ＢglII部位との間に異種コーデイング配列を挿入するこ
とができる。
部位を無くすべく、プラスミドｐＴＧ８７６のＢglII部
位による部分消化に引続いて、４種のデオキシリボヌク
レオチドの存在下にクレノウ酵素を作用させる。得られ
た新しいプラスミドｐＴＧ８８１（図９）は、ＭＦα１
遺伝子の最初のＨind III部位とＰＧＫ遺伝子の末端の
ＢglII部位との間に異種コーデイング配列を挿入するこ
とができる。
【００７４】異種コーデイングＤＮＡのＨind III部位
での融合により同じ読取り位相で翻訳が行なわれうるよ
うになると、得られたハイブリツド蛋白質はαフエロモ
ンのプレプロ部分を含むことになる。
での融合により同じ読取り位相で翻訳が行なわれうるよ
うになると、得られたハイブリツド蛋白質はαフエロモ
ンのプレプロ部分を含むことになる。
【００７５】ヒルジン遺伝子を有するＨind III−Ｅco
ＲＩ断片を ｐＴＧ８８１にクローニングすると、プラ
スミドｐＴＧ８８６が得られる（図１０）。クローニン
グを行なつた後では、この断片から下流にＢglII部位が
あり、これによりその断片をＨinf Ｉ−ＢglII形で再抽
出することができる。Ｈinf Ｉ部位は上で用いたものと
同じである。ｐＴＧ８８１にはＢglII部位が１ヶ所しか
ないので、ヒルジンの５’配列を再構成する３種のオリ
ゴヌクレオチドを用いて、ヒルジンをコードする配列の
５’末端を再構成し、α−フエロモンのプレプロ配列と
それに続く成熟ヒルジン配列とが読取り枠をそろえて読
み取られるようにすることは極めて容易である。
ＲＩ断片を ｐＴＧ８８１にクローニングすると、プラ
スミドｐＴＧ８８６が得られる（図１０）。クローニン
グを行なつた後では、この断片から下流にＢglII部位が
あり、これによりその断片をＨinf Ｉ−ＢglII形で再抽
出することができる。Ｈinf Ｉ部位は上で用いたものと
同じである。ｐＴＧ８８１にはＢglII部位が１ヶ所しか
ないので、ヒルジンの５’配列を再構成する３種のオリ
ゴヌクレオチドを用いて、ヒルジンをコードする配列の
５’末端を再構成し、α−フエロモンのプレプロ配列と
それに続く成熟ヒルジン配列とが読取り枠をそろえて読
み取られるようにすることは極めて容易である。
【００７６】この新しいプラスミドはｐＴＧ８９７とし
て知られる（図１１）。
て知られる（図１１）。
【００７７】実施例３−酵母によるヒルジンの発現 ｐＴＧ８９７のＤＮＡを用いて、既に記載されている手
法（２０）に従つて、ＴＧＹ１ｓｐ４（ＭＡＴα、ｕｒ
ａ３−２５１−３７３−３２８、ｈｉｓ３−１１−１
５）酵母をｕｒａ+に形質転換した。
法（２０）に従つて、ＴＧＹ１ｓｐ４（ＭＡＴα、ｕｒ
ａ３−２５１−３７３−３２８、ｈｉｓ３−１１−１
５）酵母をｕｒａ+に形質転換した。
【００７８】形質転換コロニーを継代培養し、１０mlの
最小培地 プラス カザミノ酸（０．５％）への播種に
用いた。２０時間培養後、細胞を遠心分離し、上澄みを
蒸留水に対して透析し、蒸発（真空下の遠心）により濃
縮した。
最小培地 プラス カザミノ酸（０．５％）への播種に
用いた。２０時間培養後、細胞を遠心分離し、上澄みを
蒸留水に対して透析し、蒸発（真空下の遠心）により濃
縮した。
【００７９】並行して、ｐＴＧ８８６により形質転換し
たＴＧＹ１ｓｐ４の培養及びヒルジンをコードする配列
をもたないプラスミドで形質転換したＴＧＹＴ１ｓｐ４
の培養（ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８５６）を同様に処理
した。乾いたペレツトを５０μｌの水にとり、２０μｌ
を２．８％ＳＤＳと１００ｍＭメルカプトエタノールと
の存在下に煮沸し、次いでアクリルアミド−ＳＤＳ（１
５％アクリルアミド；０．１％ＳＤＳ）ゲル上にのせた
（２１）。固定し、クーマシーブルーで染色すると、Ｔ
ＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８８６及びＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴ
Ｇ８９７の培養上澄み中に蓄積したポリペプチドを検出
できるが、対照培養の上澄み中にはそれらが存在しない
（図１２）。更に、これら一連の付加ペプチドを ［35
Ｓ］システインで重く標識すると、ヒルジンペプチドに
ついて予測できるように、分子はシステインに極めて富
んでいる（図１０）。
たＴＧＹ１ｓｐ４の培養及びヒルジンをコードする配列
をもたないプラスミドで形質転換したＴＧＹＴ１ｓｐ４
の培養（ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８５６）を同様に処理
した。乾いたペレツトを５０μｌの水にとり、２０μｌ
を２．８％ＳＤＳと１００ｍＭメルカプトエタノールと
の存在下に煮沸し、次いでアクリルアミド−ＳＤＳ（１
５％アクリルアミド；０．１％ＳＤＳ）ゲル上にのせた
（２１）。固定し、クーマシーブルーで染色すると、Ｔ
ＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８８６及びＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴ
Ｇ８９７の培養上澄み中に蓄積したポリペプチドを検出
できるが、対照培養の上澄み中にはそれらが存在しない
（図１２）。更に、これら一連の付加ペプチドを ［35
Ｓ］システインで重く標識すると、ヒルジンペプチドに
ついて予測できるように、分子はシステインに極めて富
んでいる（図１０）。
【００８０】図１２及び図１３に示した電気泳動パター
ンは次のようにして製出した：図１２の場合は、抽出物
質を次のようにして調製した：１０mlの最小培地［アミ
ノ酸なしのイーストナイトロジエンベースデイフコ
（６．７ｇ／ｌ）及びグルコース（１０ｇ／ｌ）］にカ
ザミノ酸を０．５％加え、種々の株を植え、２０時間培
養した（定常期）。細胞を遠心分離し、上澄みを水に対
して透析し（最小滞留分子量１０００）、真空下の遠心
により乾燥した。次に試料を負荷（ローデイング）用緩
衝液５０μｌに取り、その２０μｌを上述の通り処置
し、アクリルアミド−ＳＤＳ（１５％アクリルアミド、
０．１％ＳＤＳ）（２１）にのせた。
ンは次のようにして製出した：図１２の場合は、抽出物
質を次のようにして調製した：１０mlの最小培地［アミ
ノ酸なしのイーストナイトロジエンベースデイフコ
（６．７ｇ／ｌ）及びグルコース（１０ｇ／ｌ）］にカ
ザミノ酸を０．５％加え、種々の株を植え、２０時間培
養した（定常期）。細胞を遠心分離し、上澄みを水に対
して透析し（最小滞留分子量１０００）、真空下の遠心
により乾燥した。次に試料を負荷（ローデイング）用緩
衝液５０μｌに取り、その２０μｌを上述の通り処置
し、アクリルアミド−ＳＤＳ（１５％アクリルアミド、
０．１％ＳＤＳ）（２１）にのせた。
【００８１】用いた株は次の通りである： ウエル２：ヒルジン配列を含まないプラスミドで形質転
換したＴＧＹ１ｓｐ４（対照）； ウエル３：ｐＴＧ８８６で形質転換したＴＧＹ１ｓｐ４ ウエル４：ｐＴＧ８９７で形質転換したＴＧＹ１ｓｐ４ ウエル１：ウエル１には標準マーカーを入れた（フアル
マシアＬＭＷキツト；上から下へ：94000 、67000 、43
000 、30000 、20100 、14000 ）。
換したＴＧＹ１ｓｐ４（対照）； ウエル３：ｐＴＧ８８６で形質転換したＴＧＹ１ｓｐ４ ウエル４：ｐＴＧ８９７で形質転換したＴＧＹ１ｓｐ４ ウエル１：ウエル１には標準マーカーを入れた（フアル
マシアＬＭＷキツト；上から下へ：94000 、67000 、43
000 、30000 、20100 、14000 ）。
【００８２】バンドはクーマシーブルーＲ−２５０によ
り染色して可視化した。
り染色して可視化した。
【００８３】図１３の場合には、抽出物質を次の通りに
調製した：１００mlの最小培地＋４０μｌ／mlのヒスチ
ジンに種々の株をうえ、一夜培養した。細胞密度が約５
×１６6（対数増殖期）に達したとき、35Ｓシステイン
（９．８ｍＣｉ／ml；１．０１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）４０
μｌを各培養に加えた。１０分後に細胞を遠心分離し、
完全培地（３０℃）１０mlにとり、撹拌下に３０℃でイ
ンキユベートした。３時間後に上澄み１０mlを水に対し
て透析し、図１２の場合について記載したようにして体
積０．５mlまで濃縮した。約３５０００ｃｐｍ（４０μ
ｌ）をアクリルアミド−ＳＤＳ（１５％アクリルアミ
ド、０．１％ＳＤＳ）ゲルにのせた。蛋白質バンドはフ
ルオログラフイー後に可視化した。
調製した：１００mlの最小培地＋４０μｌ／mlのヒスチ
ジンに種々の株をうえ、一夜培養した。細胞密度が約５
×１６6（対数増殖期）に達したとき、35Ｓシステイン
（９．８ｍＣｉ／ml；１．０１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）４０
μｌを各培養に加えた。１０分後に細胞を遠心分離し、
完全培地（３０℃）１０mlにとり、撹拌下に３０℃でイ
ンキユベートした。３時間後に上澄み１０mlを水に対し
て透析し、図１２の場合について記載したようにして体
積０．５mlまで濃縮した。約３５０００ｃｐｍ（４０μ
ｌ）をアクリルアミド−ＳＤＳ（１５％アクリルアミ
ド、０．１％ＳＤＳ）ゲルにのせた。蛋白質バンドはフ
ルオログラフイー後に可視化した。
【００８４】用いた株は次の通りである： ウエル２：ヒルジン配列を含まないプラスミドにより形
質転換したＴＧＹ１ｓｐ４； ウエル３：ｐＴＧ８８６により形質転換したＴＧＹ１ｓ
ｐ４ ウエル４：ｐＴＧ８９７により形質転換したＴＧＹ１ｓ
ｐ４ ウエル１：ウエル１には表示の分子量（×１０3）を有
するマーカーを入れた。
質転換したＴＧＹ１ｓｐ４； ウエル３：ｐＴＧ８８６により形質転換したＴＧＹ１ｓ
ｐ４ ウエル４：ｐＴＧ８９７により形質転換したＴＧＹ１ｓ
ｐ４ ウエル１：ウエル１には表示の分子量（×１０3）を有
するマーカーを入れた。
【００８５】しかし、これらのポリペプチドを含有する
上澄みを抗トロンビン活性について試験したところ、活
性を検出できなかつた。
上澄みを抗トロンビン活性について試験したところ、活
性を検出できなかつた。
【００８６】ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８８６により分泌
されたポリペプチドの場合、これは、αフエロモン前駆
体の正常な段階の切断を受けると予期され、そのためＮ
Ｈ2末端に８個のアミノ酸の延長されたヒルジンが得ら
れるであろう。従つて、ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８８６
細胞により分泌されたポリペプチドが活性でないのは驚
くには当たらない。
されたポリペプチドの場合、これは、αフエロモン前駆
体の正常な段階の切断を受けると予期され、そのためＮ
Ｈ2末端に８個のアミノ酸の延長されたヒルジンが得ら
れるであろう。従つて、ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８８６
細胞により分泌されたポリペプチドが活性でないのは驚
くには当たらない。
【００８７】これに対し、ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８９
７により分泌されたポリペプチドの場合には、このポリ
ペプチドは天然の蛋白質と同一で、従つて活性であると
予想される。幾つかの仮説により活性欠如を説明でき
る： １）蛋白質の成熟が不完全で、ＥＧＦについて記載され
ている（１４）のように、Ｇlu−Ａla残基がＮＨ2末端
に残つている可能性がある。
７により分泌されたポリペプチドの場合には、このポリ
ペプチドは天然の蛋白質と同一で、従つて活性であると
予想される。幾つかの仮説により活性欠如を説明でき
る： １）蛋白質の成熟が不完全で、ＥＧＦについて記載され
ている（１４）のように、Ｇlu−Ａla残基がＮＨ2末端
に残つている可能性がある。
【００８８】２）蛋白質が正しいコンホメーシヨンをも
つていないため、或いは培養上澄み中に活性を阻害する
分子量１０００の蛋白質又は分子が存在するため、蛋白
質が不活性である。
つていないため、或いは培養上澄み中に活性を阻害する
分子量１０００の蛋白質又は分子が存在するため、蛋白
質が不活性である。
【００８９】３）細胞内及び／又は細胞外で蛋白質分解
を受けたため蛋白質が不完全である。
を受けたため蛋白質が不完全である。
【００９０】実施例４−臭化シアンでの切断による活性
化 活性欠如の原因がＮＨ2末端に付加的なアミノ酸が存在
していることに関係があるのであれば、ＴＧＹ１ｓｐ４
／ｐＴＧ８８６が分泌したペプチドを臭化シアンによる
切断に付すことによつて活性を回復することが可能であ
ろう。この試剤は、実際、メチオニン残基に対して特異
性をもち、ｐＴＧ８８６がコードする融合蛋白質はメチ
オニンを１個しか含まない。この反応は次のようにして
行なつた：プラスミドｐＴＧ８８６を含む酵母又はヒル
ジン挿入部を含まない対照プラスミドを含む酵母を１０
mlの培地中で２４時間培養する。この時点で培養は７〜
１０×１０7細胞／mlの濃度に達する。上澄みを細胞か
ら分離し、蒸留水に対して強度に透析し、次いで凍結乾
燥する。乾燥粉末を７０％蟻酸１mlに溶かし、１アリコ
ートを用いて総蛋白質含量を測定する（クーマシーブル
ー染色法、バイオライド社市販試薬による染色法）；調
製液の残部を新鮮な臭化シアンの７０％蟻酸溶液（３０
ｎｇ／ml）１mlで処理する。
化 活性欠如の原因がＮＨ2末端に付加的なアミノ酸が存在
していることに関係があるのであれば、ＴＧＹ１ｓｐ４
／ｐＴＧ８８６が分泌したペプチドを臭化シアンによる
切断に付すことによつて活性を回復することが可能であ
ろう。この試剤は、実際、メチオニン残基に対して特異
性をもち、ｐＴＧ８８６がコードする融合蛋白質はメチ
オニンを１個しか含まない。この反応は次のようにして
行なつた：プラスミドｐＴＧ８８６を含む酵母又はヒル
ジン挿入部を含まない対照プラスミドを含む酵母を１０
mlの培地中で２４時間培養する。この時点で培養は７〜
１０×１０7細胞／mlの濃度に達する。上澄みを細胞か
ら分離し、蒸留水に対して強度に透析し、次いで凍結乾
燥する。乾燥粉末を７０％蟻酸１mlに溶かし、１アリコ
ートを用いて総蛋白質含量を測定する（クーマシーブル
ー染色法、バイオライド社市販試薬による染色法）；調
製液の残部を新鮮な臭化シアンの７０％蟻酸溶液（３０
ｎｇ／ml）１mlで処理する。
【００９１】窒素気流により酸素を除去した後、チユー
ブを暗所で室温にて４時間インキユベートする。臭化シ
アン存在下の操作は全て適切な注意を払い、ドラフト内
で行なう。臭化シアンにより切断反応を１０倍量の蒸留
水の添加によつて停止しついで溶液を凍結乾燥する。
ブを暗所で室温にて４時間インキユベートする。臭化シ
アン存在下の操作は全て適切な注意を払い、ドラフト内
で行なう。臭化シアンにより切断反応を１０倍量の蒸留
水の添加によつて停止しついで溶液を凍結乾燥する。
【００９２】切断ペブチドを蒸留水１０mlに再溶解し、
再凍結乾燥し、これをもう一度繰返す。最後に、ペプチ
ドを少量の蒸留水に溶解し、１アリコートを抗トロンビ
ン活性の測定に用いる。試料の残部を凍結乾燥し、下記
の復元工程に付す。
再凍結乾燥し、これをもう一度繰返す。最後に、ペプチ
ドを少量の蒸留水に溶解し、１アリコートを抗トロンビ
ン活性の測定に用いる。試料の残部を凍結乾燥し、下記
の復元工程に付す。
【００９３】ヒルジン活性は分子中のジスルフイド結合
の存在に依存している（１）ので、臭化シアンで切断し
たペプチドを正確に復元して生物活性を示すようにしな
ければならないように思われる。従つて、切断したペプ
チドを５Ｍ ＧｕＨＣｌ中で変成した後、当業者に既知
の方法に従つて復元した。
の存在に依存している（１）ので、臭化シアンで切断し
たペプチドを正確に復元して生物活性を示すようにしな
ければならないように思われる。従つて、切断したペプ
チドを５Ｍ ＧｕＨＣｌ中で変成した後、当業者に既知
の方法に従つて復元した。
【００９４】要約して言えば、凍結乾燥したペプチドを
５Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）の２５０ｍＭトリス
ＨＣｌ溶液（ｐＨ９．０）４００μｌに溶かす；次いで
溶液を還元型グルタチオン中で２ｍＭ、酸化型グルタチ
オン中で ０．２ｍＭとし最終体積２．０mlとする（最
終濃度は １．０ｍＭ ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭトリ
ス）。
５Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）の２５０ｍＭトリス
ＨＣｌ溶液（ｐＨ９．０）４００μｌに溶かす；次いで
溶液を還元型グルタチオン中で２ｍＭ、酸化型グルタチ
オン中で ０．２ｍＭとし最終体積２．０mlとする（最
終濃度は １．０ｍＭ ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭトリ
ス）。
【００９５】暗所にて２３℃で１６時間のインキユベー
シヨンの後、試料を５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２Ｌに対して３回２３
℃で２４時間透析し、最終透析物を遠心分離により澄明
化する。
シヨンの後、試料を５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２Ｌに対して３回２３
℃で２４時間透析し、最終透析物を遠心分離により澄明
化する。
【００９６】ついで上澄みの抗トロンビン活性を測定す
る。表１に示したこの実験の結果、プラスミドｐＴＧ８
８６に感染させた細胞の上澄み中に抗トロンビン活性が
回復していることを明瞭に示している。対照プラスミド
の場合には活性ない。
る。表１に示したこの実験の結果、プラスミドｐＴＧ８
８６に感染させた細胞の上澄み中に抗トロンビン活性が
回復していることを明瞭に示している。対照プラスミド
の場合には活性ない。
【００９７】
【表１】 酵母培養上澄みの抗トロンビン活性 プラスミド 上澄みの処理 活 性 比活性 U/ml U/mg初期蛋白質 pTG886 a)切断後復元前 ＜0.3 b)切断復元後 2.46 102.5 対 照 a)切断後復元前 ＜0.3 − b)切断後復元後 ＜0.15 ＜5.6 結論として、組換えプラスミドを担持する酵母細胞は、
切断反応と復元反応との後にヒルジンの生物活性をもつ
ペプチドを、分泌できると言える。これにより、ＴＧＹ
１ｓｐ４／ｐＴＧ８８６培養物中に存在するポリペプチ
ドに活性がないのはＮＨ2末端に余分なアミノ酸が存在
することで充分に説明できることが示される。ＴＧＹ１
ｓｐ４／ｐＴＧ８９７培養物の場合（Ｇlu−Ａlaテイ
ル）も多分そうであろう。
切断反応と復元反応との後にヒルジンの生物活性をもつ
ペプチドを、分泌できると言える。これにより、ＴＧＹ
１ｓｐ４／ｐＴＧ８８６培養物中に存在するポリペプチ
ドに活性がないのはＮＨ2末端に余分なアミノ酸が存在
することで充分に説明できることが示される。ＴＧＹ１
ｓｐ４／ｐＴＧ８９７培養物の場合（Ｇlu−Ａlaテイ
ル）も多分そうであろう。
【００９８】実施例５ ヒルジンＨＶ−２をコードする
配列の最初のアミノ酸の直前への新しい切断部位の導入
−プラスミドｐＴＧ１８０５ ｐＴＧ８９７の構築では、分泌されたペプチドがＮＨ2
末端にＧlu−Ａlaテイルを保持しているおそれ（それに
よりこの物質に抗トロンビン活性が欠けていることを説
明できよう）がある。この仮説が当たつているならば、
Ｇlu−Ａla残基とヒルジンＨＶ−２の最初のアミノ酸
（イソロイシン）との間に切断部位を作り出すことによ
り、上澄み中で直接活性を回復できるであろう。これ
を、フエロモン前駆物質（図２）の成熟に係わるエンド
ペプチダーゼの認識部位であるＬys−Ａrgダブレツトを
コードする配列を付加することにより実行した。構築
は、２種の合成オリゴヌクレオド（図１４）の配列に関
する以外は、正確にプラスミドｐＴＧ８９７について記
載したと同様にして得た。得られたプラスミドをｐＴＧ
１８０５と呼ぶ。このプラスミドを用いてＴＧＹ１ｓｐ
４株をｕｒａ+に形質転換した。上澄み中へ分泌された
物質を上記と同様のゲル電気泳動法により分析し、ＴＧ
Ｙ１ｓｐ４／ｐＴＧ８９７を用いて得た物質と比較した
（図１５）。
配列の最初のアミノ酸の直前への新しい切断部位の導入
−プラスミドｐＴＧ１８０５ ｐＴＧ８９７の構築では、分泌されたペプチドがＮＨ2
末端にＧlu−Ａlaテイルを保持しているおそれ（それに
よりこの物質に抗トロンビン活性が欠けていることを説
明できよう）がある。この仮説が当たつているならば、
Ｇlu−Ａla残基とヒルジンＨＶ−２の最初のアミノ酸
（イソロイシン）との間に切断部位を作り出すことによ
り、上澄み中で直接活性を回復できるであろう。これ
を、フエロモン前駆物質（図２）の成熟に係わるエンド
ペプチダーゼの認識部位であるＬys−Ａrgダブレツトを
コードする配列を付加することにより実行した。構築
は、２種の合成オリゴヌクレオド（図１４）の配列に関
する以外は、正確にプラスミドｐＴＧ８９７について記
載したと同様にして得た。得られたプラスミドをｐＴＧ
１８０５と呼ぶ。このプラスミドを用いてＴＧＹ１ｓｐ
４株をｕｒａ+に形質転換した。上澄み中へ分泌された
物質を上記と同様のゲル電気泳動法により分析し、ＴＧ
Ｙ１ｓｐ４／ｐＴＧ８９７を用いて得た物質と比較した
（図１５）。
【００９９】使用した株は次の通りである： ウエル１：図１２のものと同じマーカー； ウエル２：ｐＴＧ８９７で形質転換したＴＧＹ１ｓｐ
４； ウエル３：ｐＴＧ１８０５で形質転換したＴＧＹ１ｓｐ
４； ウエル４：ヒルジンを産生しない対照。
４； ウエル３：ｐＴＧ１８０５で形質転換したＴＧＹ１ｓｐ
４； ウエル４：ヒルジンを産生しない対照。
【０１００】ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ１８０５株に特異
的なポリペプチドは、ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８９７株
に特異的なそれらよりもゆっくりと移動する。この結果
は、新しい切断部位が相当するエンドペプチダーゼによ
って有効に利用されていないことを示唆する。しかし、
上澄み中のヒルジンをその生物活性に基いて定量する
と、この物質のわずかな部分が、物質が明瞭に不活性な
ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８９７の培養で得られるところ
とは対照的に、活性であることがわかる（表２）。
的なポリペプチドは、ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８９７株
に特異的なそれらよりもゆっくりと移動する。この結果
は、新しい切断部位が相当するエンドペプチダーゼによ
って有効に利用されていないことを示唆する。しかし、
上澄み中のヒルジンをその生物活性に基いて定量する
と、この物質のわずかな部分が、物質が明瞭に不活性な
ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８９７の培養で得られるところ
とは対照的に、活性であることがわかる（表２）。
【０１０１】
【表２】酵母培養上澄み（１０ml）中の抗トロンビン活性 プラスミド 比活性Ｕ／mg 総活性Ｕ（１０ml） ｐＴＧ８５６ 検出できず − ｐＴＧ８９７ 検出できずｐＴＧ１８０５ ２１ ２．０ 実施例６ 成熟型ヒルジンの遊離を可能にする新しいよ
り有効な切断部位を包含する新構築物 上記構築（ｐＴＧ８９７）では、上澄み中に少量のヒル
ジン活性しか得られなかつたが、これは多分、成熟型ヒ
ルジンの遊離のため設計した第二の切断部位の認識が効
率的でないからであろう。従つて、この付加切断部位の
上流に、天然には最初のＬys−Ａrgダブレツトの上流に
存在する３つのアミノ酸の配列Ｓer−Ｌeu−Ａspを付加
することにより、該切断部位をエンドペプチダーゼに対
しより感受性とするようデザインして、新しい構築を行
なつた（図２及び図１６）。
り有効な切断部位を包含する新構築物 上記構築（ｐＴＧ８９７）では、上澄み中に少量のヒル
ジン活性しか得られなかつたが、これは多分、成熟型ヒ
ルジンの遊離のため設計した第二の切断部位の認識が効
率的でないからであろう。従つて、この付加切断部位の
上流に、天然には最初のＬys−Ａrgダブレツトの上流に
存在する３つのアミノ酸の配列Ｓer−Ｌeu−Ａspを付加
することにより、該切断部位をエンドペプチダーゼに対
しより感受性とするようデザインして、新しい構築を行
なつた（図２及び図１６）。
【０１０２】用いた手法は、オリゴヌクレオチドの配列
が次の通りであること以外は上に記載したものと同じで
ある：
が次の通りであること以外は上に記載したものと同じで
ある：
【０１０３】
【化１】
【０１０４】切断領域のアミノ酸配列は図１６に示され
ている。相当するプラスミドをｐＴＧ１８１８と呼ぶ
が、これは、Ｓer−Ｌeu−Ａspのコドンに相当するヌク
レオチド５’−ＴＴＧ ＧＡＴ ＡＡＡが挿入されてい
る点でのみｐＴＧ１８０５と異なる。
ている。相当するプラスミドをｐＴＧ１８１８と呼ぶ
が、これは、Ｓer−Ｌeu−Ａspのコドンに相当するヌク
レオチド５’−ＴＴＧ ＧＡＴ ＡＡＡが挿入されてい
る点でのみｐＴＧ１８０５と異なる。
【０１０５】既に記載されている標準的条件に従つて、
ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ１８１８の培養上澄み中で測定
された活性は、培養液１０ml当り約２００単位で、前の
実施例で見出された活性の約１００倍に相当する。未濃
縮培養液１０mlを用いてアッセイを実施できることは注
目すべきことである。
ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ１８１８の培養上澄み中で測定
された活性は、培養液１０ml当り約２００単位で、前の
実施例で見出された活性の約１００倍に相当する。未濃
縮培養液１０mlを用いてアッセイを実施できることは注
目すべきことである。
【０１０６】実施例７ Ｇlu−Ａla−Ｇlu−Ａla配列を
欠く前駆体の合成に導く構成 上記２つの実施例で、成熟ヒルジン配列の冒頭のすぐ上
流に新しいＬys−Ａrg部位を付加することが、上澄み中
への活性物質の遊離を可能ならしめることが示された。
しかし、それらの実施例では、前駆体の切断が最初のＬ
ys−Ａrg部位（成熟型配列の冒頭からみて遠位）で起る
一方、ＮＨ2末端で延長されたヒルジン鎖に相当するよ
り重い不活性不純物が培養液中に得られうる。これは、
不活性不純物が多くを占めるＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ１
８０５の場合にとくに明瞭である。ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐ
ＴＧ１８１８の培養の場合にも依然同様で、不活性不純
物が多くを占めはしないが、ＥＧＦの場合について他の
研究者が記載している（１４）ように存在しうるであろ
う。不活性物質の合成で表わされるこの収率上のロスを
避けるべく、Ｌys−Ａrg切断部位と成熟型ヒルジン配列
の最初のアミノ酸との間にＧlu−Ａla−Ｇlu−Ａla配列
がない点でのみＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８９７細胞が合
成するものと相違するだけの前駆体の合成に導く新しい
構成を取り上げることとした。
欠く前駆体の合成に導く構成 上記２つの実施例で、成熟ヒルジン配列の冒頭のすぐ上
流に新しいＬys−Ａrg部位を付加することが、上澄み中
への活性物質の遊離を可能ならしめることが示された。
しかし、それらの実施例では、前駆体の切断が最初のＬ
ys−Ａrg部位（成熟型配列の冒頭からみて遠位）で起る
一方、ＮＨ2末端で延長されたヒルジン鎖に相当するよ
り重い不活性不純物が培養液中に得られうる。これは、
不活性不純物が多くを占めるＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ１
８０５の場合にとくに明瞭である。ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐ
ＴＧ１８１８の培養の場合にも依然同様で、不活性不純
物が多くを占めはしないが、ＥＧＦの場合について他の
研究者が記載している（１４）ように存在しうるであろ
う。不活性物質の合成で表わされるこの収率上のロスを
避けるべく、Ｌys−Ａrg切断部位と成熟型ヒルジン配列
の最初のアミノ酸との間にＧlu−Ａla−Ｇlu−Ａla配列
がない点でのみＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８９７細胞が合
成するものと相違するだけの前駆体の合成に導く新しい
構成を取り上げることとした。
【０１０７】次の酵母株を、１９８５年４月３０日に、
パリ市１５区ドクテユール−ル−通り２８番地のパスツ
ール研究所付属国立微生物培養コレクシヨン（ＣＮＣ
Ｍ）に寄託ずみである： ・ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ１８１８：プラスミドｐＴＧ
１８１８によりｕｒａ+に形質転換されたサツカロマイ
セス・セレヴイシアエＴＧＹ１ｓｐ４／（ＭＡＴαｕｒ
ａ３−２５１−３７３−３２８−ｈｉｓ３−１１−１
５）株；寄託番号Ｉ４４１。
パリ市１５区ドクテユール−ル−通り２８番地のパスツ
ール研究所付属国立微生物培養コレクシヨン（ＣＮＣ
Ｍ）に寄託ずみである： ・ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ１８１８：プラスミドｐＴＧ
１８１８によりｕｒａ+に形質転換されたサツカロマイ
セス・セレヴイシアエＴＧＹ１ｓｐ４／（ＭＡＴαｕｒ
ａ３−２５１−３７３−３２８−ｈｉｓ３−１１−１
５）株；寄託番号Ｉ４４１。
【０１０８】・ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ８８６：プラス
ミドｐＴＧ８８６によりｕｒａ+に形質転換されたサツ
カロマイセス・セレヴイシアセＴＧＹ１ｓｐ４（ＭＡＴ
αｕｒａ３−２５１−３７３−３２８−ｈｉｓ３−１１
−１５）株；寄託番号Ｉ４４２参考文献 １．デイー．バジー（Ｄ．ＢＡＤＧＹ）、イー．バラバ
ス（Ｅ．ＢＡＢＲＢＡＳ）、エル．グラフ（Ｌ．ＧＲＡ
Ｆ）、テイー．イー．ペーターセン（Ｔ．Ｅ．ＰＥＴＥ
ＲＳＥＮ）及びエス．マグナソン（Ｓ．ＭＡＧＮＵＳＳ
ＯＮ）（１９７６）“メソツズ イン エンザイモロジ
ー パートＢ”（Ｍethods in Ｅnzymology partＢ）、
vol.４５，ｐｐ．６６９〜６７８ ２．エフ．マークワート（Ｆ．ＭＡＲＫＷＡＲＤＴ）
（１９７０）“メソツズイン エンザイロモジー”（Ｍ
ethods in Ｅnzymology vol.１９，ｐｐ．９２４〜９３
２ ３．エフ．マークワート（Ｆ．ＭＡＲＫＷＡＲＤＴ）、
ジエー．ハウプトマン（Ｊ．ＨＡＵＰＴＭＡＮＮ）、ジ
ー．ノバク（Ｇ．ＮＯＷＡＫ）、シーエイチ．クレツセ
ン（Ｃｈ．ＫＬＥＳＳＥＮ）及びピー．ワルスマン
（Ｐ．ＷＡＬＳＭＡＮＮ）（１９８２）“トロンボ．ヘ
モスタシス”（Ｔhromb.Ｈemostasis）シユトツトガル
ト（Ｓtuttgart）４７，２２６〜２２９ ４．ピー．ワルスマン（Ｐ．ＷＡＬＳＭＡＮＮ）及びエ
フ．マークワート（Ｆ．ＭＡＲＫＷＡＲＤＴ）（１９８
１）“デイー フアルマツイー”（Ｄie Ｐharmazie）
１０，６５３〜６６０ ５．テイーエイチ．クロス（Ｔｈ．ＫＬＯＳＳ）及びユ
ー．ミツトマン（Ｕ．ＭＩＴＴＭＡＮＮ）“ロンゲンベ
ツクス アルヒ．チルールク”（ＬongenbecksＡrch.
Ｃhirurg．）３５８，５４８ ６．エイ．イシカワ（Ａ．ＩＳＨＩＫＡＷＡ）、アー
ル．ハフター（Ｒ．ＨＡＦＴＥＲ）、ユー．ゼーミユラ
ー（Ｕ．ＳＥＥＭＵＬＬＥＲ）、ジエイ．エム．ゴーケ
ル（Ｊ．Ｍ．ＧＯＫＥＬ）及びエム．グレーフ（Ｍ．Ｇ
ＲＡＥＦＦ）（１９８０）“トロンボシス リサーチ”
（Ｔhrombosis Ｒesearch ）１９，３５１〜３５８ ７．エフ．マルクワート（Ｆ．ＭＡＲＫＷＡＲＤＴ）、
ジー．ノバク（Ｇ．ＮＯＷＡＫ）、ジエー．シユトウル
ツエベルガー（Ｊ．ＳＴＵＲＺＥＢＥＲＧＥＲ）、ユ
ー．グライスバデイ（Ｕ．ＧＲＥＩＳＢＡＤＩ）、ピ
ー．ワルスマン（Ｐ．ＷＡＬＳＭＡＮＮ）及びジー．フ
オーゲル（Ｇ．ＶＯＧＥＬ）“トロンボ ヘモスタシ
ス”（Ｔhomb．Ｈemostasis ）シユトツトガルト（Ｓtu
ttgart）５２，１６０〜１６３ ８．シー．ノバク（Ｃ．ＮＯＷＡＫ）及びエフ．マーク
ワート（Ｆ．ＭＡＰＫＷＡＲＤＴ）（１９８０）“エク
スペリメンタル パソロジー”（Ｅxpt ．Ｐath．）１
８，４３８〜４４３ ９．エー．エイチ．スーター（Ａ．Ｈ．ＳＵＴＯＲ）、
エス．クノツプ（Ｓ．ＫＮＯＰ）及びデイー．アドラー
（Ｄ．ＡＤＬＥＲ）“コントローレ アンテイトロンボ
チカ”（Ｋontrolle Ａntithrombotica）２３回シンポ
ジウム ブルートゲリンヌング（Ｂlutgerinnung）ハン
ブルク（Ｈamburk）、ｐｐ．１１７〜１２３ 10．テイー．イー．ペーターセン（Ｔ．Ｅ．ＰＥＴＥＲ
ＳＥＮ）、エル．ソトラツプ−イエンセン（Ｌ．ＳＯＴ
ＴＲＵＰ−ＪＥＮＳＥＮ）、エス．マグナソン（Ｓ．Ｍ
ＡＧＮＵＳＳＯＮ）及びデイー．バジー（Ｄ．ＢＡＤＧ
Ｙ）（１９７６）“プロタイズ ビオロ．フルイズ，プ
ロク．コロク．”（Ｐrotides Ｂiol.Ｆluides，Ｐroc
．Ｃolloq ．）ｖｏｌ．２３，ｐｐ１４５〜１４９ 11．ジエイ−ワイ．チヤン（Ｊ−Ｙ．ＣＨＡＮＧ）（１
９８３）フエブス．レツト．（Ｆebs ．Ｌett ．）１６
４，３０７〜３１３ 12．アイ．ピー．バスコバ（Ｉ．Ｐ．ＢＡＳＫＯＶ
Ａ）、デイー．ユー．チエルケソーバ（Ｄ．Ｕ．ＣＨＥ
ＲＫＥＳＯＶＡ）及びヴイ．ヴイ．モソーロフ（Ｖ．
Ｖ．ＭＯＳＯＬＯＶ）（１９８３）“トロンボシス リ
サーチ”（Ｔhromb ．Ｒes．）３０，４５９〜４６７ 13．エイチ．バツセイ（Ｈ．ＢＵＳＳＹ）、デイー．サ
ビール（Ｄ．ＳＡＶＩＬＬＥ）、デイー．グリーン
（Ｄ．ＧＲＥＥＮＥ）他（１９８３）“モル．セル．ビ
オル”（Ｍol. Ｃell.Ｂiol ）３，１３６２〜１３７０ 14．エー．ジエイ．ブレーク（Ａ．Ｊ．ＢＲＡＫＥ）、
デイー．ジー．コイト（Ｄ．Ｇ．ＣＯＩＴ）、ユー．エ
ー．ヘーバーライン（Ｕ．Ａ．ＨＥＢＥＲＬＥＩＮ）、
エフ．アール．マリアーツ（Ｆ．Ｒ．ＭＡＲＩＡＲ
Ｚ）、ジー．テイー．マレンバハ（Ｇ．Ｔ．ＭＵＬＬＥ
ＮＢＡＣＨ）、エム．エス．ウーデア（Ｍ．Ｓ．ＵＲＤ
ＥＡ）、ピー．バレンスエラ（Ｐ．ＶＡＬＥＮＺＵＥＬ
Ａ）及びピー．ジエイ．バー（Ｐ．Ｊ．ＢＡＲＲ）（１
９８４）“プロシーデイングス オブザ ナシヨナル
アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユー．エ
ス．エイ”（Ｐroc ．Ｎatl ．Ａcad ．Ｓci．ＵＳＡ）
８１，４６４２〜４６４６ 15．ジー．エイ．ビター（Ｇ．Ａ．ＢＩＴＴＥＲ）、ケ
イ．ケイ．チエン（Ｋ．Ｋ．ＣＨＥＮ）、エイ．アー
ル．バンクス（Ａ．Ｒ．ＢＡＮＫＳ）及びピー．エイ
チ．ライ（Ｐ．Ｈ．ＬＡＩ）（１９８４）“プロシーデ
イングス オブ ザナシヨナル アカデミー オブ サ
イエンス オブ ザ ユー．エス．エイ”（Ｐroc ．Ｎ
atl ．Ａcad ．Ｓci．ＵＳＡ）８１，５３３０〜５３３ 16．ジエイ．カージヤン（Ｊ．ＫＵＲＪＡＮ）及びア
イ．ハースユウイツツ（Ｉ．ＨＥＲＳＫＯＷＩＴＺ）
（１９８２）“セル”（Ｃell ）３０，９３３〜９４３ 17．ジエイ．ベグス（Ｊ．ＢＥＧＧＳ）（１９８１）
“ジエネテイツク エンジニアリング”（Ｇenetic Ｅ
ngineering）２，１７５〜２０３ 18．エム．エル．バツク（Ｍ．Ｌ．ＢＡＣＨ）、エフ．
ラクルート（Ｆ．ＬＡＣＲＯＵＴＥ）及びデイー．ボツ
トスタイン（Ｄ．ＢＯＴＳＴＥＩＮ）（１９７９）“プ
ロシーデイングス オブ ザ ナシヨナル アカデミー
オブ サイエンス オブ ザ ユー．エス．エイ”
（Ｐroc ．Ｎatl ．Ａcad ．Ｓci．ＵＳＡ）７６，３８
６〜３９０ 19．アール．エイ．ヒツツマン（Ｒ．Ａ．ＨＩＴＺＥＭ
ＡＮ）、イー．エフ．ハギー（Ｅ．Ｆ．ＨＡＧＩＥ）、
ジエイ．エス．ハイフリツク（Ｊ．Ｓ．ＨＡＹＦＥＬＩ
ＣＫ）その他（１９８２）“ヌクレイツク アシッズ
リサーチ”（Ｎucleic Ａcids Ｒes．）１０，７７９
１〜７８０７ 20．エイチ．イトー（Ｈ．ＩＴＯ）、ワイ．フクダ
（Ｙ．ＦＵＫＵＤＡ）、ケイ．ムラタ（Ｋ．ＭＵＲＡＴ
Ａ）及びエイ．キムラ（Ａ．ＫＩＭＵＲＡ）（１９８
３）“ジヤーナル オブ バクテリオロジー”（Ｊ．Ｂ
acteriol．）１５３，１６３〜１６８ 21．ヴイ．ケイ．シー．レムリ（．Ｋ．Ｃ．ＬＡＥＭＭ
Ｉ）（１９７０）“ネイチヤー”（Ｎatur）２２７，６
８０〜６８５ 22．ダブリユー．クラマー（Ｗ．ＫＲＡＭＥＲ）、ヴ
イ．ドラツツア（Ｖ．ＤＲＵＴＳＡ）、エイチ．ダブリ
ユー．ヤンセン（Ｈ．Ｗ．ＪＡＮＳＥＮ）その他（１９
８４）“ヌクレイツク アシツズ リサーチ”（Ｎucle
is Ａcds Ｒes．）１２，９４４１〜９５５６
ミドｐＴＧ８８６によりｕｒａ+に形質転換されたサツ
カロマイセス・セレヴイシアセＴＧＹ１ｓｐ４（ＭＡＴ
αｕｒａ３−２５１−３７３−３２８−ｈｉｓ３−１１
−１５）株；寄託番号Ｉ４４２参考文献 １．デイー．バジー（Ｄ．ＢＡＤＧＹ）、イー．バラバ
ス（Ｅ．ＢＡＢＲＢＡＳ）、エル．グラフ（Ｌ．ＧＲＡ
Ｆ）、テイー．イー．ペーターセン（Ｔ．Ｅ．ＰＥＴＥ
ＲＳＥＮ）及びエス．マグナソン（Ｓ．ＭＡＧＮＵＳＳ
ＯＮ）（１９７６）“メソツズ イン エンザイモロジ
ー パートＢ”（Ｍethods in Ｅnzymology partＢ）、
vol.４５，ｐｐ．６６９〜６７８ ２．エフ．マークワート（Ｆ．ＭＡＲＫＷＡＲＤＴ）
（１９７０）“メソツズイン エンザイロモジー”（Ｍ
ethods in Ｅnzymology vol.１９，ｐｐ．９２４〜９３
２ ３．エフ．マークワート（Ｆ．ＭＡＲＫＷＡＲＤＴ）、
ジエー．ハウプトマン（Ｊ．ＨＡＵＰＴＭＡＮＮ）、ジ
ー．ノバク（Ｇ．ＮＯＷＡＫ）、シーエイチ．クレツセ
ン（Ｃｈ．ＫＬＥＳＳＥＮ）及びピー．ワルスマン
（Ｐ．ＷＡＬＳＭＡＮＮ）（１９８２）“トロンボ．ヘ
モスタシス”（Ｔhromb.Ｈemostasis）シユトツトガル
ト（Ｓtuttgart）４７，２２６〜２２９ ４．ピー．ワルスマン（Ｐ．ＷＡＬＳＭＡＮＮ）及びエ
フ．マークワート（Ｆ．ＭＡＲＫＷＡＲＤＴ）（１９８
１）“デイー フアルマツイー”（Ｄie Ｐharmazie）
１０，６５３〜６６０ ５．テイーエイチ．クロス（Ｔｈ．ＫＬＯＳＳ）及びユ
ー．ミツトマン（Ｕ．ＭＩＴＴＭＡＮＮ）“ロンゲンベ
ツクス アルヒ．チルールク”（ＬongenbecksＡrch.
Ｃhirurg．）３５８，５４８ ６．エイ．イシカワ（Ａ．ＩＳＨＩＫＡＷＡ）、アー
ル．ハフター（Ｒ．ＨＡＦＴＥＲ）、ユー．ゼーミユラ
ー（Ｕ．ＳＥＥＭＵＬＬＥＲ）、ジエイ．エム．ゴーケ
ル（Ｊ．Ｍ．ＧＯＫＥＬ）及びエム．グレーフ（Ｍ．Ｇ
ＲＡＥＦＦ）（１９８０）“トロンボシス リサーチ”
（Ｔhrombosis Ｒesearch ）１９，３５１〜３５８ ７．エフ．マルクワート（Ｆ．ＭＡＲＫＷＡＲＤＴ）、
ジー．ノバク（Ｇ．ＮＯＷＡＫ）、ジエー．シユトウル
ツエベルガー（Ｊ．ＳＴＵＲＺＥＢＥＲＧＥＲ）、ユ
ー．グライスバデイ（Ｕ．ＧＲＥＩＳＢＡＤＩ）、ピ
ー．ワルスマン（Ｐ．ＷＡＬＳＭＡＮＮ）及びジー．フ
オーゲル（Ｇ．ＶＯＧＥＬ）“トロンボ ヘモスタシ
ス”（Ｔhomb．Ｈemostasis ）シユトツトガルト（Ｓtu
ttgart）５２，１６０〜１６３ ８．シー．ノバク（Ｃ．ＮＯＷＡＫ）及びエフ．マーク
ワート（Ｆ．ＭＡＰＫＷＡＲＤＴ）（１９８０）“エク
スペリメンタル パソロジー”（Ｅxpt ．Ｐath．）１
８，４３８〜４４３ ９．エー．エイチ．スーター（Ａ．Ｈ．ＳＵＴＯＲ）、
エス．クノツプ（Ｓ．ＫＮＯＰ）及びデイー．アドラー
（Ｄ．ＡＤＬＥＲ）“コントローレ アンテイトロンボ
チカ”（Ｋontrolle Ａntithrombotica）２３回シンポ
ジウム ブルートゲリンヌング（Ｂlutgerinnung）ハン
ブルク（Ｈamburk）、ｐｐ．１１７〜１２３ 10．テイー．イー．ペーターセン（Ｔ．Ｅ．ＰＥＴＥＲ
ＳＥＮ）、エル．ソトラツプ−イエンセン（Ｌ．ＳＯＴ
ＴＲＵＰ−ＪＥＮＳＥＮ）、エス．マグナソン（Ｓ．Ｍ
ＡＧＮＵＳＳＯＮ）及びデイー．バジー（Ｄ．ＢＡＤＧ
Ｙ）（１９７６）“プロタイズ ビオロ．フルイズ，プ
ロク．コロク．”（Ｐrotides Ｂiol.Ｆluides，Ｐroc
．Ｃolloq ．）ｖｏｌ．２３，ｐｐ１４５〜１４９ 11．ジエイ−ワイ．チヤン（Ｊ−Ｙ．ＣＨＡＮＧ）（１
９８３）フエブス．レツト．（Ｆebs ．Ｌett ．）１６
４，３０７〜３１３ 12．アイ．ピー．バスコバ（Ｉ．Ｐ．ＢＡＳＫＯＶ
Ａ）、デイー．ユー．チエルケソーバ（Ｄ．Ｕ．ＣＨＥ
ＲＫＥＳＯＶＡ）及びヴイ．ヴイ．モソーロフ（Ｖ．
Ｖ．ＭＯＳＯＬＯＶ）（１９８３）“トロンボシス リ
サーチ”（Ｔhromb ．Ｒes．）３０，４５９〜４６７ 13．エイチ．バツセイ（Ｈ．ＢＵＳＳＹ）、デイー．サ
ビール（Ｄ．ＳＡＶＩＬＬＥ）、デイー．グリーン
（Ｄ．ＧＲＥＥＮＥ）他（１９８３）“モル．セル．ビ
オル”（Ｍol. Ｃell.Ｂiol ）３，１３６２〜１３７０ 14．エー．ジエイ．ブレーク（Ａ．Ｊ．ＢＲＡＫＥ）、
デイー．ジー．コイト（Ｄ．Ｇ．ＣＯＩＴ）、ユー．エ
ー．ヘーバーライン（Ｕ．Ａ．ＨＥＢＥＲＬＥＩＮ）、
エフ．アール．マリアーツ（Ｆ．Ｒ．ＭＡＲＩＡＲ
Ｚ）、ジー．テイー．マレンバハ（Ｇ．Ｔ．ＭＵＬＬＥ
ＮＢＡＣＨ）、エム．エス．ウーデア（Ｍ．Ｓ．ＵＲＤ
ＥＡ）、ピー．バレンスエラ（Ｐ．ＶＡＬＥＮＺＵＥＬ
Ａ）及びピー．ジエイ．バー（Ｐ．Ｊ．ＢＡＲＲ）（１
９８４）“プロシーデイングス オブザ ナシヨナル
アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユー．エ
ス．エイ”（Ｐroc ．Ｎatl ．Ａcad ．Ｓci．ＵＳＡ）
８１，４６４２〜４６４６ 15．ジー．エイ．ビター（Ｇ．Ａ．ＢＩＴＴＥＲ）、ケ
イ．ケイ．チエン（Ｋ．Ｋ．ＣＨＥＮ）、エイ．アー
ル．バンクス（Ａ．Ｒ．ＢＡＮＫＳ）及びピー．エイ
チ．ライ（Ｐ．Ｈ．ＬＡＩ）（１９８４）“プロシーデ
イングス オブ ザナシヨナル アカデミー オブ サ
イエンス オブ ザ ユー．エス．エイ”（Ｐroc ．Ｎ
atl ．Ａcad ．Ｓci．ＵＳＡ）８１，５３３０〜５３３ 16．ジエイ．カージヤン（Ｊ．ＫＵＲＪＡＮ）及びア
イ．ハースユウイツツ（Ｉ．ＨＥＲＳＫＯＷＩＴＺ）
（１９８２）“セル”（Ｃell ）３０，９３３〜９４３ 17．ジエイ．ベグス（Ｊ．ＢＥＧＧＳ）（１９８１）
“ジエネテイツク エンジニアリング”（Ｇenetic Ｅ
ngineering）２，１７５〜２０３ 18．エム．エル．バツク（Ｍ．Ｌ．ＢＡＣＨ）、エフ．
ラクルート（Ｆ．ＬＡＣＲＯＵＴＥ）及びデイー．ボツ
トスタイン（Ｄ．ＢＯＴＳＴＥＩＮ）（１９７９）“プ
ロシーデイングス オブ ザ ナシヨナル アカデミー
オブ サイエンス オブ ザ ユー．エス．エイ”
（Ｐroc ．Ｎatl ．Ａcad ．Ｓci．ＵＳＡ）７６，３８
６〜３９０ 19．アール．エイ．ヒツツマン（Ｒ．Ａ．ＨＩＴＺＥＭ
ＡＮ）、イー．エフ．ハギー（Ｅ．Ｆ．ＨＡＧＩＥ）、
ジエイ．エス．ハイフリツク（Ｊ．Ｓ．ＨＡＹＦＥＬＩ
ＣＫ）その他（１９８２）“ヌクレイツク アシッズ
リサーチ”（Ｎucleic Ａcids Ｒes．）１０，７７９
１〜７８０７ 20．エイチ．イトー（Ｈ．ＩＴＯ）、ワイ．フクダ
（Ｙ．ＦＵＫＵＤＡ）、ケイ．ムラタ（Ｋ．ＭＵＲＡＴ
Ａ）及びエイ．キムラ（Ａ．ＫＩＭＵＲＡ）（１９８
３）“ジヤーナル オブ バクテリオロジー”（Ｊ．Ｂ
acteriol．）１５３，１６３〜１６８ 21．ヴイ．ケイ．シー．レムリ（．Ｋ．Ｃ．ＬＡＥＭＭ
Ｉ）（１９７０）“ネイチヤー”（Ｎatur）２２７，６
８０〜６８５ 22．ダブリユー．クラマー（Ｗ．ＫＲＡＭＥＲ）、ヴ
イ．ドラツツア（Ｖ．ＤＲＵＴＳＡ）、エイチ．ダブリ
ユー．ヤンセン（Ｈ．Ｗ．ＪＡＮＳＥＮ）その他（１９
８４）“ヌクレイツク アシツズ リサーチ”（Ｎucle
is Ａcds Ｒes．）１２，９４４１〜９５５６
【図１】ｐＴＧ７１７中にクローンされたヒルジンｃＤ
ＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。
ＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。
【図２】α性フエロモン前駆体のヌクレオチド配列を示
す。
す。
【図３】ｐＴＧ８３４の構築法を模式的に示す。
【図４】ｐＴＧ８８０の構築法を模式的に示す。
【図５】ｐＴＧ８８２の構築法を模式的に示す。
【図６】Ｍ１３ＴＧ８８２の構築法を模式的に示す。
【図７】ｐＴＧ８７４の構築法を模式的に示す。
【図８】ｐＴＧ８７６の構築法を模式的に示す。
【図９】ｐＴＧ８８１の構築法を模式的に示す。
【図１０】ｐＴＧ８８６の構築法を模式的に示す。
【図１１】ｐＴＧ８９７の構築法を模式的に示す。
【図１２】ｐＴＧ８８６及びｐＴＧ８９７によつて形質
転換された酵母を培養した後の培地中に得られたＭＷ＞
１０００の蛋白質のアクリルアミドゲル電気泳動図を示
す。
転換された酵母を培養した後の培地中に得られたＭＷ＞
１０００の蛋白質のアクリルアミドゲル電気泳動図を示
す。
【図１３】ｐＴＧ８８６及びｐＴＧ８９７によつて形質
転換された酵母を培養した後の培地中に得られたＭＷ＞
１０００の蛋白質のアクリルアミドゲル電気泳動図を示
す。
転換された酵母を培養した後の培地中に得られたＭＷ＞
１０００の蛋白質のアクリルアミドゲル電気泳動図を示
す。
【図１４】ｐＴＧ１８０５の構築法を模式的に示す。
【図１５】ｐＴＧ８４７及びｐＴＧ１８０５によつて形
質転換された酵母を培養した後の培地中に得られたＭＷ
＞１０００の蛋白質のアクリルアミドゲル電気泳動図を
示す。
質転換された酵母を培養した後の培地中に得られたＭＷ
＞１０００の蛋白質のアクリルアミドゲル電気泳動図を
示す。
【図１６】種々の構成物質中の最初の切断位置（Ｌys−
Ａrg）から下流のアミノ酸配列の比較を示す図である。
Ａrg）から下流のアミノ酸配列の比較を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ポール トルストシェフ オーストラリア国 ニューサウスウェール ズ シドニー イーストローズビル バー クー ストリート 28 バイオテクノロジ ー オーストラリア プロプライエタリー リミテッド内 (72)発明者 イヴ ルモワン フランス国 67100 ストラスブール リ ュ デザリジエール ４ (72)発明者 ジャン−ピエール ルコック フランス国 67116 ライヒステート リ ュ デュ シャン・デュ・フォ ６
Claims (30)
- 【請求項１】 酵母における複製開始点を含むプラス
ミドに組み込まれるか又は酵母の染色体に組み込まれた
機能性ＤＮＡブロックにより形質転換された酵母であっ
て、前記ブロックが少なくとも − ヒルジン、その変種の一つ又はその前駆体をコード
するＤＮＡ配列（Ｈ遺伝子） − 遺伝子産物の分泌を達成するのに必要な要素を含む
リーダー配列(Ｌex） − 酵母によるＨ遺伝子の転写のためのシグナルを含む
ＤＮＡ配列（Ｓtr）を含むことを特徴とする酵母。 - 【請求項２】 前記機能性ブロックが、５’末端〜３’
末端に、少なくとも以下の配列を含むことを特徴とする
請求項１に記載の形質転換された酵母： − 酵母によるＨ遺伝子の転写のためのシグナルを含む
配列（Ｓtr）， − 遺伝子産物の分泌を達成するのに必要な要素を含む
リーダー配列(Ｌex） − ヒルジン、その変種の一つ又はその前駆体をコード
する遺伝子， − 切断部位Ｓclにより先導されるヒルジン又はその変
種の一つ又はその前駆体をコードする遺伝子。 - 【請求項３】 配列Ｌexが酵母のα性フェロモンのそれ
であることを特徴とする請求項１又は２に記載の酵母。 - 【請求項４】 リーダー配列が、酵母のα性フェロモン
のプレフラグメントを含むことを特徴とする請求項１〜
３のいずれかに記載の酵母。 - 【請求項５】 前記ブロックが、Ｈ遺伝子の５’末端に
酵母のα性フェロモンのプレプロ配列を含むことを特徴
とする請求項１〜４のいずれかに記載の酵母。 - 【請求項６】 Ｈ遺伝子の後に酵母のターミネーター配
列が続くことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記
載の酵母。 - 【請求項７】 酵母のターミネーター配列がＰＧＫ遺伝
子のそれであることを特徴とする請求項６に記載の酵
母。 - 【請求項８】 前記切断部位が、ジペプチドＬｙｓ−Ａ
ｒｇであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに
記載の酵母。 - 【請求項９】 前記機能性ブロックが、少なくとも１つ
の酵母における複製開始点を含むプラスミドに組み込ま
れることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の
酵母。 - 【請求項１０】 前記複製開始点が、２μプラスミドの
それであることを特徴とする請求項９に記載の酵母。 - 【請求項１１】 前記プラスミドがさらに選択性を有す
ることを特徴とする請求項９又は１０に記載の酵母。 - 【請求項１２】 前記選択性が、ＵＲＡ３遺伝子により
与えられることを特徴とする請求項１１に記載の酵母。 - 【請求項１３】 サッカロマイセス属の酵母であること
を特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の酵母。 - 【請求項１４】 性のタイプがＭａｔαであることを特
徴とする請求項１３に記載の酵母。 - 【請求項１５】 サッカロマイセス・セレヴイシアエの
一菌株であることを特徴とする請求項１２〜１４のいず
れかに記載の酵母。 - 【請求項１６】 酵母における複製開始点を含むプラス
ミドに組み込まれるか又は酵母の染色体に組み込まれた
機能性ＤＮＡブロックにより形質転換された酵母であっ
て、前記ブロックが少なくとも − ヒルジン、その変種の一つ又はその前駆体をコード
するＤＮＡ配列（Ｈ遺伝子） − 遺伝子産物の分泌を達成するのに必要な要素を含む
リーダー配列(Ｌex） − 酵母によるＨ遺伝子の転写のためのシグナルを含む
ＤＮＡ配列（Ｓtr）を含むことを特徴とする酵母をヒル
ジン放出剤として包含することを特徴とする抗凝血剤組
成物。 - 【請求項１７】 前記機能性ブロックが、５’末端〜
３’末端に、少なくとも以下の配列を含むことを特徴と
する請求項１６に記載の組成物： − 酵母によるＨ遺伝子の転写のためのシグナルを含む
配列（Ｓtr）， − 遺伝子産物の分泌を達成するのに必要な要素を含む
リーダー配列(Ｌex） − ヒルジン、その変種の一つ又はその前駆体をコード
する遺伝子， − 切断部位Ｓclにより先導されるヒルジン又はその変
種の一つ又はその前駆体をコードする遺伝子。 - 【請求項１８】 配列Ｌexが酵母のα性フェロモンのそ
れであることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の
組成物。 - 【請求項１９】 リーダー配列が、酵母のα性フェロモ
ンのプレフラグメントを含むことを特徴とする請求項１
６〜１８のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項２０】 前記ブロックが、Ｈ遺伝子の５’末端
に酵母のα性フェロモンのプレプロ配列を含むことを特
徴とする請求項１６〜１９のいずれかに記載の組成物。 - 【請求項２１】 Ｈ遺伝子の後に酵母のターミネーター
配列が続くことを特徴とする請求項１６〜２０のいずれ
かに記載の組成物。 - 【請求項２２】 酵母のターミネーター配列がＰＧＫ遺
伝子のそれであることを特徴とする請求項２１に記載の
組成物。 - 【請求項２３】 前記切断部位が、ジペプチドＬｙｓ−
Ａｒｇであることを特徴とする請求項１６〜２２のいず
れかに記載の組成物。 - 【請求項２４】 前記機能性ブロックが、少なくとも１
つの酵母における複製開始点を含むプラスミドに組み込
まれることを特徴とする請求項１６〜２２のいずれかに
記載の組成物。 - 【請求項２５】 前記複製開始点が、２μプラスミドの
それであることを特徴とする請求項２４に記載の組成
物。 - 【請求項２６】 前記プラスミドがさらに選択性を有す
ることを特徴とする請求項２４又は２５に記載の組成
物。 - 【請求項２７】 前記選択性が、ＵＲＡ３遺伝子により
与えられることを特徴とする請求項２６に記載の組成
物。 - 【請求項２８】 サッカロマイセス属の酵母であること
を特徴とする請求項１６〜２７のいずれかに記載の組成
物。 - 【請求項２９】 性のタイプがＭａｔαであることを特
徴とする請求項２８に記載の組成物。 - 【請求項３０】 サッカロマイセス・セレヴイシアエの
一菌株であることを特徴とする請求項２７〜２９のいず
れかに記載の組成物。
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| DE3819079A1 (de) * | 1988-06-04 | 1989-12-07 | Hoechst Ag | Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung |
| KR100195632B1 (ko) * | 1988-07-23 | 1999-06-15 | 스티븐 조지 가랜드 | 펩티드 및 dna 배열 |
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
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| DE69329540T2 (de) * | 1992-09-04 | 2001-06-07 | Novartis Ag, Basel | Verfahren zur Herstellung von Proteaseinhibitoren |
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| ZA954983B (en) * | 1994-06-17 | 1996-02-14 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
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| DE19543737A1 (de) * | 1995-11-24 | 1997-05-28 | Hoechst Ag | Verfahren zur Ultrafiltration von Peptide oder Proteine enthaltender biologischer Matrices |
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| ZA9610456B (en) * | 1995-12-20 | 1997-06-20 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
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