JPH0683678B2 - 胆汁酸測定用試験紙 - Google Patents
胆汁酸測定用試験紙Info
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- JPH0683678B2 JPH0683678B2 JP27643187A JP27643187A JPH0683678B2 JP H0683678 B2 JPH0683678 B2 JP H0683678B2 JP 27643187 A JP27643187 A JP 27643187A JP 27643187 A JP27643187 A JP 27643187A JP H0683678 B2 JPH0683678 B2 JP H0683678B2
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- acid
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は体液中の胆汁酸の量を測定する試験紙に関す
る。
る。
（従来の技術） 胆汁に含有される胆汁酸は血液、尿などの体液中にも微
量含有される。このような体液中の胆汁酸は肝胆道系疾
患によりその量が変化し、特に血液中の胆汁酸量はこの
ような疾患の鋭敏なマーカーとなることが知られてい
る。例えば、乳児の胆道閉塞症においては血液中もしく
は尿中の胆汁酸量が増加することが知られている。胆道
閉塞症は乳児約１万人あたり１人という高率で発生して
おり、患者は迅速な手術が必要とされる。疾病の認知が
遅れた場合には死亡率も高い。このような疾患を早期発
見するためにも体液中、特に、血液中の胆汁酸を集団検
診時などに精度良く測定することが望まれる。
量含有される。このような体液中の胆汁酸は肝胆道系疾
患によりその量が変化し、特に血液中の胆汁酸量はこの
ような疾患の鋭敏なマーカーとなることが知られてい
る。例えば、乳児の胆道閉塞症においては血液中もしく
は尿中の胆汁酸量が増加することが知られている。胆道
閉塞症は乳児約１万人あたり１人という高率で発生して
おり、患者は迅速な手術が必要とされる。疾病の認知が
遅れた場合には死亡率も高い。このような疾患を早期発
見するためにも体液中、特に、血液中の胆汁酸を集団検
診時などに精度良く測定することが望まれる。
胆汁酸を含有する試料溶液中の胆汁酸量を測定する方法
は、例えば、特公昭59−13197号、特開昭56−144096号
および特開昭56−151499号公報に開示されている。それ
によれば、まず、胆汁酸を含む試料を酸性下で熱処理し
（特公昭59−13197号公報）、あるいは、オキサミド
酸、ピルビン酸などを添加して（特開昭56−144096号公
報、特開昭56−151499号公報）乳酸脱水素酵素（LDH）
などの、測定を妨害する酵素を失活させる。次いで、こ
れに３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３
α−HSD）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（N
AD+）、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩を含有す
る反応用溶液をpH8〜９のアルカリ条件下で反応させ
る。胆汁酸の水酸基は３α−HSDの存在下でNAD+と反応
してカルボニル基となり次のようにケト型の胆汁酸を生
じる。
は、例えば、特公昭59−13197号、特開昭56−144096号
および特開昭56−151499号公報に開示されている。それ
によれば、まず、胆汁酸を含む試料を酸性下で熱処理し
（特公昭59−13197号公報）、あるいは、オキサミド
酸、ピルビン酸などを添加して（特開昭56−144096号公
報、特開昭56−151499号公報）乳酸脱水素酵素（LDH）
などの、測定を妨害する酵素を失活させる。次いで、こ
れに３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３
α−HSD）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（N
AD+）、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩を含有す
る反応用溶液をpH8〜９のアルカリ条件下で反応させ
る。胆汁酸の水酸基は３α−HSDの存在下でNAD+と反応
してカルボニル基となり次のようにケト型の胆汁酸を生
じる。
NADHはジアホラーゼの存在下で電子受容性の色原体であ
るテトラゾリウム塩と反応して次のようにホルマザンを
生じる。NADHは再び酸化されてNAD+となる。テトラゾリ
ウム塩の代わりにレザズリンを用いてもよく、この場合
はレゾルフィンが生成する。
るテトラゾリウム塩と反応して次のようにホルマザンを
生じる。NADHは再び酸化されてNAD+となる。テトラゾリ
ウム塩の代わりにレザズリンを用いてもよく、この場合
はレゾルフィンが生成する。
生じたホルマザン（レゾルフィン）のモル数はNADHのモ
ル数（つまり、胆汁酸のモル数）に相当する。そのた
め、このホルマザンの吸光度（レゾルフィンの蛍光強
度）を測定することにより胆汁酸を定量することが可能
である。
ル数（つまり、胆汁酸のモル数）に相当する。そのた
め、このホルマザンの吸光度（レゾルフィンの蛍光強
度）を測定することにより胆汁酸を定量することが可能
である。
このような方法により試料中の胆汁酸を感度良く測定す
ることができるが、溶液系での反応を利用した測定法で
あるため煩雑な操作を必要とする。そのため、マススク
リーニングや簡便に胆汁酸を検出するためには不適当で
ある。
ることができるが、溶液系での反応を利用した測定法で
あるため煩雑な操作を必要とする。そのため、マススク
リーニングや簡便に胆汁酸を検出するためには不適当で
ある。
このような欠点を解決するため、特開昭61−268199号公
報では、高分子素材からなる担体に３α−HSD、NAD+、
ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩からなる試薬系組
成物が担持された胆汁酸測定用試験紙が開示された。こ
の試験紙と体液中の胆汁酸が接触すると、溶液法の場合
と同様に胆汁酸の水酸基が３α−HSDの存在下でNAD+と
反応してカルボニル基となりケト型胆汁酸を生じる。NA
DHはジアホラーゼの存在下でテトラゾリウム塩と反応し
てホルマザンを生じる。NADHは再び酸化されてNAD+とな
る。生じたホルマザンのモル数はNADHのモル数即ち胆汁
酸のモル数に相当する。そのため、このホルマザンによ
る呈色を肉眼または光学機器を用いて測定し胆汁酸の量
を測定する。
報では、高分子素材からなる担体に３α−HSD、NAD+、
ジアホラーゼおよびテトラゾリウム塩からなる試薬系組
成物が担持された胆汁酸測定用試験紙が開示された。こ
の試験紙と体液中の胆汁酸が接触すると、溶液法の場合
と同様に胆汁酸の水酸基が３α−HSDの存在下でNAD+と
反応してカルボニル基となりケト型胆汁酸を生じる。NA
DHはジアホラーゼの存在下でテトラゾリウム塩と反応し
てホルマザンを生じる。NADHは再び酸化されてNAD+とな
る。生じたホルマザンのモル数はNADHのモル数即ち胆汁
酸のモル数に相当する。そのため、このホルマザンによ
る呈色を肉眼または光学機器を用いて測定し胆汁酸の量
を測定する。
この場合、体液中に胆汁酸以外に試験紙の試薬系組成物
と反応することができる成分が存在し、その結果測定を
不正確なものにすることがある。特に重症患者由来の体
液の場合に、真の胆汁酸値からのズレが大きくなる例が
多い。そのような悪影響を与える成分としては、乳酸と
乳酸脱水素酵素（LDH）、アルコールとアルコール脱水
素酵素、グルタミン酸とグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ、アルデヒド類とアルデヒド脱水素酵素および／また
はホルムアミドとホルムアミドデヒドロゲナーゼ等があ
る。
と反応することができる成分が存在し、その結果測定を
不正確なものにすることがある。特に重症患者由来の体
液の場合に、真の胆汁酸値からのズレが大きくなる例が
多い。そのような悪影響を与える成分としては、乳酸と
乳酸脱水素酵素（LDH）、アルコールとアルコール脱水
素酵素、グルタミン酸とグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ、アルデヒド類とアルデヒド脱水素酵素および／また
はホルムアミドとホルムアミドデヒドロゲナーゼ等があ
る。
例えば、乳酸と乳酸脱水素酵素（LDH）が存在すると、
試験紙の試薬系組成物中のNAD+と反応して、乳酸はピル
ビン酸を生じ、生成したNADHは、ジアホラーゼの存在下
でテトラゾリウム塩をホルマザンとし該試験紙を呈色せ
しめる。
試験紙の試薬系組成物中のNAD+と反応して、乳酸はピル
ビン酸を生じ、生成したNADHは、ジアホラーゼの存在下
でテトラゾリウム塩をホルマザンとし該試験紙を呈色せ
しめる。
この例のように、胆汁酸を測定すべき体液中に乳酸と乳
酸脱水素酵素が存在する場合には、試験紙の呈色には胆
汁酸による呈色に乳酸が乳酸脱水素酵素によって脱水素
反応したことによる呈色が加わるため、真の胆汁酸量を
測定することができない。
酸脱水素酵素が存在する場合には、試験紙の呈色には胆
汁酸による呈色に乳酸が乳酸脱水素酵素によって脱水素
反応したことによる呈色が加わるため、真の胆汁酸量を
測定することができない。
このような欠点を除くため、特公昭59−13197号公報で
は、検体である体液を酸性（PH0.1〜6.0）にし次いで熱
処理（温度20〜45℃、時間１〜30分間）することによ
り、体液中の酵素を予め失活させておくこと、特開昭61
−268199号公報の明細書中では、検体である体液に予め
オキサミド酸、ピルビン酸などを加えLDH反応などを阻
害させることが提案されている。
は、検体である体液を酸性（PH0.1〜6.0）にし次いで熱
処理（温度20〜45℃、時間１〜30分間）することによ
り、体液中の酵素を予め失活させておくこと、特開昭61
−268199号公報の明細書中では、検体である体液に予め
オキサミド酸、ピルビン酸などを加えLDH反応などを阻
害させることが提案されている。
しかしながら、このような処理は検査技師にとって煩雑
で面倒なことであり、余分な時間を要するという問題点
があった。
で面倒なことであり、余分な時間を要するという問題点
があった。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の問題点を解決するものであり、その
目的は体液中の胆汁酸を共存生体成分の影響を受けるこ
となく、正確かつ簡便に測定できる方法を提供すること
にある。
目的は体液中の胆汁酸を共存生体成分の影響を受けるこ
となく、正確かつ簡便に測定できる方法を提供すること
にある。
（問題点を解決するための手段） 高分子素材からなる担体の同一個所に３α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム
塩からなる試薬系組成物とエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）、エチレングリコールビス（β−アミノエチル
エーテル）N,N,N′,N′四酢酸（EGTA）、EDTAないしはE
GTAのアルカリ金属塩から成る群の中から選ばれる一つ
以上の添加剤とが、担持されたことを特徴とする胆汁酸
測定用試験紙、により上記目的が達成される。
システロイドデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド、ジアホラーゼおよびテトラゾリウム
塩からなる試薬系組成物とエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）、エチレングリコールビス（β−アミノエチル
エーテル）N,N,N′,N′四酢酸（EGTA）、EDTAないしはE
GTAのアルカリ金属塩から成る群の中から選ばれる一つ
以上の添加剤とが、担持されたことを特徴とする胆汁酸
測定用試験紙、により上記目的が達成される。
本発明の試験紙に用いられる担体は公知のすべての担体
が用いられうる。すなわち、それらは高分子素材からな
り、具体的には、天然もしくは合成繊維からなる抄紙や
不織布のほかメンブレンフィルターなどである。試料が
尿または血清である場合には、市販の濾紙など天然もし
くは合成繊維からなる抄紙や不織布が好適に用いられ
る。試料が全血である場合には、合成繊維からなる抄紙
や不織布、メンブレンフィルターなどが好適に用いられ
る。メンブレンフィルターとしては、穴径が0.1〜0.4μ
ｍの酢酸セルロース系の膜が好ましい。合成紙として
は、例えば、積水化学工業(株)製のセルポア（親水性タ
イプ）が好適である。
が用いられうる。すなわち、それらは高分子素材からな
り、具体的には、天然もしくは合成繊維からなる抄紙や
不織布のほかメンブレンフィルターなどである。試料が
尿または血清である場合には、市販の濾紙など天然もし
くは合成繊維からなる抄紙や不織布が好適に用いられ
る。試料が全血である場合には、合成繊維からなる抄紙
や不織布、メンブレンフィルターなどが好適に用いられ
る。メンブレンフィルターとしては、穴径が0.1〜0.4μ
ｍの酢酸セルロース系の膜が好ましい。合成紙として
は、例えば、積水化学工業(株)製のセルポア（親水性タ
イプ）が好適である。
本発明に使用される試薬系組成物は、胆汁酸を基質とす
る３α−HSDおよびNAD+、更にNAD+の反応生成物であるN
ADHを基質とするジアホラーゼおよび発色基質であるテ
トラゾリウム塩から構成される。
る３α−HSDおよびNAD+、更にNAD+の反応生成物であるN
ADHを基質とするジアホラーゼおよび発色基質であるテ
トラゾリウム塩から構成される。
これらの試薬系組成物のうち、NAD+、ジアホラーゼおよ
び発色基質は、３α−HSDの働きで体液中の胆汁酸と反
応して試験紙を呈色せしめるばかりでなく、体液中に含
まれる乳酸脱水素酵素などの酸化還元系の酵素とその基
質（例えば乳酸）と反応して試験紙を呈色せしめる。
び発色基質は、３α−HSDの働きで体液中の胆汁酸と反
応して試験紙を呈色せしめるばかりでなく、体液中に含
まれる乳酸脱水素酵素などの酸化還元系の酵素とその基
質（例えば乳酸）と反応して試験紙を呈色せしめる。
そこで本発明者らは、該試験紙の同一個所に前記試薬系
組成物と共に、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチ
レングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）N,N,
N′,N′四酢酸（EGTA）、EDTAないしはEGTAのアルカリ
金属塩から成る群の中から選ばれる一つ以上の添加剤が
担持された試験紙を調製し、体液中の胆汁酸を測定した
ところ、共存生体成分の影響を殆どうけることなく、胆
汁酸量を正確に測定できることが分かり、本発明を完成
した。添加剤の使用量は、担体100cm2あたり1mg〜10,00
0mgの範囲で充分にその効果を発揮できる。
組成物と共に、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチ
レングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）N,N,
N′,N′四酢酸（EGTA）、EDTAないしはEGTAのアルカリ
金属塩から成る群の中から選ばれる一つ以上の添加剤が
担持された試験紙を調製し、体液中の胆汁酸を測定した
ところ、共存生体成分の影響を殆どうけることなく、胆
汁酸量を正確に測定できることが分かり、本発明を完成
した。添加剤の使用量は、担体100cm2あたり1mg〜10,00
0mgの範囲で充分にその効果を発揮できる。
添加剤の担体への担持に際しては、EDTAおよびEGTAはPH
が７以下の時、水に溶解しにくいので、これらのアルカ
リ金属塩、例えば、EDTAモノナトリウム、EDTAジナトリ
ウム、EDTAジカリウム塩等の形で添加する方が水に溶解
し易く、使用しやすい。
が７以下の時、水に溶解しにくいので、これらのアルカ
リ金属塩、例えば、EDTAモノナトリウム、EDTAジナトリ
ウム、EDTAジカリウム塩等の形で添加する方が水に溶解
し易く、使用しやすい。
また、添加剤を担体へ担持する時期は、試験紙製造のど
の工程と限定するわけではないが、担体に３α−HSD、N
AD+、ジアホラーゼなどを溶解した水溶液を含浸させる
時と同時に行なう方が、工程数が増えないので好まし
い。
の工程と限定するわけではないが、担体に３α−HSD、N
AD+、ジアホラーゼなどを溶解した水溶液を含浸させる
時と同時に行なう方が、工程数が増えないので好まし
い。
次に試験紙の調製方法および使用方法について詳しく説
明する。
明する。
NAD+、３α−HSD、ジアホラーゼおよび添加剤を蒸溜水
に溶解した水溶液を調製する。これを前記のような担体
に含浸させた後、凍結乾燥を行う。ここで用いられる酵
素の由来は特に限定されないが、耐有機溶剤性、経時安
定性などに優れた酵素が好ましい。このような酵素とし
て、３α−HSDとしてはシュードモナステストステロー
ニ（Pseudomonas testosteroni）由来のものが、そして
ジアホラーゼとしてはバチルス ステアロサーモフィル
ス（Bacillus stearothermophilus）由来のものが好適
に用いられる。NAD+の代わりにニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドフォスフェイト（NADP+）が用いられて
もよい。NADP+もNAD+と同様に補酵素として働き、還元
されると還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
フォスフェイト（NADPH）を生じる。３α−HSDおよびジ
アホラーゼは担体100cm2あたりそれぞれ0.1〜10000IUの
割合で、NAD+（以下、NAD+はNADP+であってもよく、NAD
HはNADPHであってもよい）は0.1〜100mgの割合で担持さ
れる。過少であると胆汁酸による発色が充分におこら
ず、過剰であるとその分解生成物により酵素反応が阻害
される。
に溶解した水溶液を調製する。これを前記のような担体
に含浸させた後、凍結乾燥を行う。ここで用いられる酵
素の由来は特に限定されないが、耐有機溶剤性、経時安
定性などに優れた酵素が好ましい。このような酵素とし
て、３α−HSDとしてはシュードモナステストステロー
ニ（Pseudomonas testosteroni）由来のものが、そして
ジアホラーゼとしてはバチルス ステアロサーモフィル
ス（Bacillus stearothermophilus）由来のものが好適
に用いられる。NAD+の代わりにニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドフォスフェイト（NADP+）が用いられて
もよい。NADP+もNAD+と同様に補酵素として働き、還元
されると還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
フォスフェイト（NADPH）を生じる。３α−HSDおよびジ
アホラーゼは担体100cm2あたりそれぞれ0.1〜10000IUの
割合で、NAD+（以下、NAD+はNADP+であってもよく、NAD
HはNADPHであってもよい）は0.1〜100mgの割合で担持さ
れる。過少であると胆汁酸による発色が充分におこら
ず、過剰であるとその分解生成物により酵素反応が阻害
される。
上記水溶液中に酵素や補酵素の活性化剤や安定化剤が含
有されていてもよい。酵素活性化剤としては、例えばト
リトンＸ−100（商品名）などの界面活性剤が好適に用
いられる。そして酵素安定化剤としては、例えばウシ血
清アルブミン（BSA）などの蛋白質が好適に用いられ
る。上記界面活性剤や蛋白質が添加されていると、NAD+
や酵素（３α−HSDおよびジアホラーゼ）がこれら化合
物に包含される。
有されていてもよい。酵素活性化剤としては、例えばト
リトンＸ−100（商品名）などの界面活性剤が好適に用
いられる。そして酵素安定化剤としては、例えばウシ血
清アルブミン（BSA）などの蛋白質が好適に用いられ
る。上記界面活性剤や蛋白質が添加されていると、NAD+
や酵素（３α−HSDおよびジアホラーゼ）がこれら化合
物に包含される。
このような界面活性剤や蛋白質は、後述のテトラゾリウ
ム塩を担持させる工程で使用される非水溶媒に溶解しな
いため、非水溶液中の色原体であるテトラゾリウム塩と
上記酵素や補酵素が直接接触するのが避けられる。その
結果、保存中における下地の発色が抑制される。
ム塩を担持させる工程で使用される非水溶媒に溶解しな
いため、非水溶液中の色原体であるテトラゾリウム塩と
上記酵素や補酵素が直接接触するのが避けられる。その
結果、保存中における下地の発色が抑制される。
さらに、増粘剤が含有されていてもよい。増粘剤によ
り、いわゆる窓枠現象が抑制される。窓枠現象とは、例
えば、上記水溶液を担体に含浸させて乾燥させるときに
水溶液中の溶質が担体周辺部に移動して濃縮されたり、
得られた試験紙に検体溶液を滴下したときに試験紙に含
有されているNAD+、３α−HSDなどの試薬が試験紙周辺
部に移行して濃縮される現象をいう。このような窓枠現
象が起こると胆汁酸の測定が正確になされない。上記増
粘剤としては、メチルセルロース、ポリエチレングリコ
ール（PEG）などが挙げられる。増粘剤が含まれると担
体（試験紙）に含浸された液相の粘度が増大するため溶
質の移動が抑制され、その結果、窓枠現象が抑制され
る。上記酵素活性化剤、酵素安定化剤、増粘剤などはそ
れぞれ担体100cm2あたり200mg以下、好ましくは１〜100
mgの割合で担持される。
り、いわゆる窓枠現象が抑制される。窓枠現象とは、例
えば、上記水溶液を担体に含浸させて乾燥させるときに
水溶液中の溶質が担体周辺部に移動して濃縮されたり、
得られた試験紙に検体溶液を滴下したときに試験紙に含
有されているNAD+、３α−HSDなどの試薬が試験紙周辺
部に移行して濃縮される現象をいう。このような窓枠現
象が起こると胆汁酸の測定が正確になされない。上記増
粘剤としては、メチルセルロース、ポリエチレングリコ
ール（PEG）などが挙げられる。増粘剤が含まれると担
体（試験紙）に含浸された液相の粘度が増大するため溶
質の移動が抑制され、その結果、窓枠現象が抑制され
る。上記酵素活性化剤、酵素安定化剤、増粘剤などはそ
れぞれ担体100cm2あたり200mg以下、好ましくは１〜100
mgの割合で担持される。
このように酵素などを含む水溶液が含浸された担体の凍
結乾燥工程では、充分に水分を除去することが重要であ
る。担体に水分が残留していると次工程で担持されるテ
トラゾリウム塩の安定性が極端に低下する。
結乾燥工程では、充分に水分を除去することが重要であ
る。担体に水分が残留していると次工程で担持されるテ
トラゾリウム塩の安定性が極端に低下する。
次に、上記凍結乾燥後の担体にテトラゾリウム塩を非水
溶媒に溶解させた溶液を含浸させる。テトラゾリウム塩
としては、ニトロテトラゾリウムブルー（NTB）もしく
はニトロブルーテトラゾリウム（NBT）と呼ばれる３・
３′−（３・３′−ジメトキシ−４・４′−ビフェニレ
ン）−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニ
ル−2H−テトラゾリウムクロライド〕が好適に用いられ
る。
溶媒に溶解させた溶液を含浸させる。テトラゾリウム塩
としては、ニトロテトラゾリウムブルー（NTB）もしく
はニトロブルーテトラゾリウム（NBT）と呼ばれる３・
３′−（３・３′−ジメトキシ−４・４′−ビフェニレ
ン）−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニ
ル−2H−テトラゾリウムクロライド〕が好適に用いられ
る。
非水溶媒は、テトラゾリウム塩を溶解させることが可能
であればよく、メタノール、エタノールなどのアルコー
ル類；酢酸エチルなどが用いられる。
であればよく、メタノール、エタノールなどのアルコー
ル類；酢酸エチルなどが用いられる。
テトラゾリウム塩は担体100cm2あたり0.1〜500mgの割合
で担持される。過少であると胆汁酸による発色が充分に
おこらず、過剰であると溶媒に溶けにくくなり、また下
地の色が濃くなるので色調の変色の判別が難しくなる。
テトラゾリウム塩溶液を含浸させた担体は速やかに、好
ましくは凍結乾燥により、乾燥される。
で担持される。過少であると胆汁酸による発色が充分に
おこらず、過剰であると溶媒に溶けにくくなり、また下
地の色が濃くなるので色調の変色の判別が難しくなる。
テトラゾリウム塩溶液を含浸させた担体は速やかに、好
ましくは凍結乾燥により、乾燥される。
このようにして得られた試験紙を、適当な大きさの細片
に裁断しプラスチックフィルム製のスティックの端に貼
着させて試験紙が作製される。
に裁断しプラスチックフィルム製のスティックの端に貼
着させて試験紙が作製される。
この試験紙を用いて体液などの検体中の胆汁酸の測定が
行われる。
行われる。
試験紙に検体を滴下させると、従来の技術の項で述べた
反応機構による反応が生じ、ホルマザンが生成し試験紙
が呈色される。この反応は、通常１〜300秒で起る。
反応機構による反応が生じ、ホルマザンが生成し試験紙
が呈色される。この反応は、通常１〜300秒で起る。
検体中の胆汁酸濃度は次の手順で測定される。
イ 適当な反射光測定装置を使用して、検体が滴下され
た試験紙部分に一定波長の光を照射しその反射光強度を
求める。
た試験紙部分に一定波長の光を照射しその反射光強度を
求める。
ロ 検体滴下からの経過時間を変えて（例えば、検体滴
下から10秒後と120秒後）この測定を２回行う。
下から10秒後と120秒後）この測定を２回行う。
反射光強度は反応が進み呈色が進むと減少する。
ハ ２回の測定値の差、すなわち、この経過時間内の反
射光強度の減少度を求める。
射光強度の減少度を求める。
ニ この反射光強度の差を、予め濃度既知の標準胆汁酸
溶液を検体として作成された、反射光強度の差と胆汁酸
濃度との関係を示す検量線と比較することにより、検体
中の胆汁酸濃度を決定する。
溶液を検体として作成された、反射光強度の差と胆汁酸
濃度との関係を示す検量線と比較することにより、検体
中の胆汁酸濃度を決定する。
（作用） 本発明によると、従来の胆汁酸測定用試験紙の試薬系組
成物にEDTA、EGTAまたはこれらのアルカリ金属の１種以
上の添加物を加えたところ、胆汁酸の測定には何ら影響
を与えることなく、胆汁酸以外によって呈色する反応を
ほぼ完全に抑制することができた。
成物にEDTA、EGTAまたはこれらのアルカリ金属の１種以
上の添加物を加えたところ、胆汁酸の測定には何ら影響
を与えることなく、胆汁酸以外によって呈色する反応を
ほぼ完全に抑制することができた。
胆汁酸以外でこの試験紙の呈色を起こす原因物質は、イ
前述のLDHやアルコール脱水素酵素（ADH）などの各種の
酵素とその基質、ロ発色基質（テトラゾリウム塩）に対
する還元物質（例えばアスコルビン酸）、などが考えら
れる。
前述のLDHやアルコール脱水素酵素（ADH）などの各種の
酵素とその基質、ロ発色基質（テトラゾリウム塩）に対
する還元物質（例えばアスコルビン酸）、などが考えら
れる。
そして、これらの呈色原因物質の反応には、以下に示す
ように金属が微妙に関与している。すなわち、イに関し
ては、これらの酵素類は二価の金属イオンを含有し、こ
れらの金属イオンの存在で酵素活性を発現する場合が多
い。例えば、アルコール脱水素酵素やアルカリホスファ
ターゼは亜鉛、アミラーゼはカルシウム、エノラーゼは
マグネシウムをその活性発現に必要とする。ロに関して
は、例えば、アスコルビン酸の還元作用の発現には、金
属の酸化作用が関与していると考えられている。
ように金属が微妙に関与している。すなわち、イに関し
ては、これらの酵素類は二価の金属イオンを含有し、こ
れらの金属イオンの存在で酵素活性を発現する場合が多
い。例えば、アルコール脱水素酵素やアルカリホスファ
ターゼは亜鉛、アミラーゼはカルシウム、エノラーゼは
マグネシウムをその活性発現に必要とする。ロに関して
は、例えば、アスコルビン酸の還元作用の発現には、金
属の酸化作用が関与していると考えられている。
一方、EDTA、EGTAまたはこれらのアルカリ金属塩は、ア
ルカリ土類金属、希土類、遷移金属ときわめて安定な水
溶性の錯塩を形成して、金属を捕捉する。また、微量の
金属またはイオンを錯イオンにすることにより、その触
媒としての作用を妨げる性質がある（下記に示すアスコ
ルビン酸が酸化されることの抑制は、この性質によ
る）。
ルカリ土類金属、希土類、遷移金属ときわめて安定な水
溶性の錯塩を形成して、金属を捕捉する。また、微量の
金属またはイオンを錯イオンにすることにより、その触
媒としての作用を妨げる性質がある（下記に示すアスコ
ルビン酸が酸化されることの抑制は、この性質によ
る）。
そこで、EDTA、EGTAまたはこれらのアルカリ金属塩が試
験紙に添加されると、EDTAなどの金属イオン捕捉作用に
よって、LDH、ADHなどの脱水素酵素、その他この試薬系
に影響を与える体液中の諸酵素類の酵素活性の抑制、お
よび体液中のアスコルビン酸などの還元性を有する物質
が酸化されなくなるため、アスコルビン酸などによる発
色基質の還元反応の抑制などが起こると推定される。
尚、この時、３α−HSDおよびジアホラーゼの活性発現
には、金属イオンは関係していないように思われる。従
って、胆汁酸の測定に影響を与えることなく、胆汁酸以
外の物質による呈色反応が抑制できたものと考えられ
る。
験紙に添加されると、EDTAなどの金属イオン捕捉作用に
よって、LDH、ADHなどの脱水素酵素、その他この試薬系
に影響を与える体液中の諸酵素類の酵素活性の抑制、お
よび体液中のアスコルビン酸などの還元性を有する物質
が酸化されなくなるため、アスコルビン酸などによる発
色基質の還元反応の抑制などが起こると推定される。
尚、この時、３α−HSDおよびジアホラーゼの活性発現
には、金属イオンは関係していないように思われる。従
って、胆汁酸の測定に影響を与えることなく、胆汁酸以
外の物質による呈色反応が抑制できたものと考えられ
る。
（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。
実施例１ （Ａ） 胆汁酸測定用試験紙の調整:3α−HSD33IU、ジ
アホラーゼ6800IU、β−NAD+10.2mg、EDTA−2Na（同仁
化学製）50mg、PEG16mg、BSA100mgおよびTritonX（商品
名）10μを蒸留水10mlに溶解した。この水溶液を300c
m2の濾紙（Whatmann No.3）に含浸させ、凍結乾燥し
た。次に、ニトロブルーテトラゾリウム（和光純薬製、
NTB）の0.034W/W％エタノール溶液を調整し、これを上
記凍結乾燥後の濾紙に含浸させた後、速やかに乾燥させ
た。このようにして得られた試験紙を6mm×10mmの小片
に切断し、試験紙部分を得た。これらの試験紙部分を６
×60mmのポリスチレンフイルム製のスティックの端に両
面テープで貼着して胆汁酸測定用試験紙を得た。
アホラーゼ6800IU、β−NAD+10.2mg、EDTA−2Na（同仁
化学製）50mg、PEG16mg、BSA100mgおよびTritonX（商品
名）10μを蒸留水10mlに溶解した。この水溶液を300c
m2の濾紙（Whatmann No.3）に含浸させ、凍結乾燥し
た。次に、ニトロブルーテトラゾリウム（和光純薬製、
NTB）の0.034W/W％エタノール溶液を調整し、これを上
記凍結乾燥後の濾紙に含浸させた後、速やかに乾燥させ
た。このようにして得られた試験紙を6mm×10mmの小片
に切断し、試験紙部分を得た。これらの試験紙部分を６
×60mmのポリスチレンフイルム製のスティックの端に両
面テープで貼着して胆汁酸測定用試験紙を得た。
（Ｂ） 反射光測定装置 反射光強度は第１図に示す装置を使用して測定した。
この測定装置１は、試薬を含浸させた胆汁酸測定用試験
紙部分２を載置する透明板３と、この透明板３の下方に
配置された発光素子４と、迷光防止板５を介してこの発
光素子４の近傍に配置された受光素子６と、この受光素
子６で検知された試験紙２からの反射光の強度を数値表
示する表示手段８とを有する。
紙部分２を載置する透明板３と、この透明板３の下方に
配置された発光素子４と、迷光防止板５を介してこの発
光素子４の近傍に配置された受光素子６と、この受光素
子６で検知された試験紙２からの反射光の強度を数値表
示する表示手段８とを有する。
表示手段８は増巾・測定回路・Ａ−Ｄ変換器７を介して
受光素子６に電気的に接続される。発光素子４と増巾・
測定回路・Ａ−Ｄ変換器７とは測定用スイッチ９にて接
続されている。発光素子４としては、500〜600nm付近に
発光スペクトルの極大を有する発光ダイオード（スタン
レー社製のEBG5504S）が用いられる。受光素子６として
は、500〜600nm付近の波長の光に感度を有する光検出素
子、シリコンホトダイオード（浜松ホトニクス社製のS1
226−5BQ）が用いられる。反射光の強度を数値表示する
手段８にはマイクロプロセッサーが内臓されている。
受光素子６に電気的に接続される。発光素子４と増巾・
測定回路・Ａ−Ｄ変換器７とは測定用スイッチ９にて接
続されている。発光素子４としては、500〜600nm付近に
発光スペクトルの極大を有する発光ダイオード（スタン
レー社製のEBG5504S）が用いられる。受光素子６として
は、500〜600nm付近の波長の光に感度を有する光検出素
子、シリコンホトダイオード（浜松ホトニクス社製のS1
226−5BQ）が用いられる。反射光の強度を数値表示する
手段８にはマイクロプロセッサーが内臓されている。
測定装置１を用い、胆汁酸は次のようにして測定され
る。ポリスチレンフイルム製のスティック21の先端に、
胆汁酸測定用試験紙部分２を貼着し、この試験紙部分２
に検体（尿、血清、検量線作成用標準液など）を滴下す
る。検体の滴下と同時に図外のタイマーをオンとし、同
時にこの試験紙部分２側を透明体３に対向させるかたち
で透明板３上に載置する。遮光カバー22を閉じる。そし
て、経時的に測定用スイッチ９をオンにし発光素子４を
発光させる。試験紙部分２にて反射された光を受光素子
６にて受け、増巾・測定回路・Ａ−Ｄ変換器７を経て表
示手段８にて反射光強度を数値表示させる。
る。ポリスチレンフイルム製のスティック21の先端に、
胆汁酸測定用試験紙部分２を貼着し、この試験紙部分２
に検体（尿、血清、検量線作成用標準液など）を滴下す
る。検体の滴下と同時に図外のタイマーをオンとし、同
時にこの試験紙部分２側を透明体３に対向させるかたち
で透明板３上に載置する。遮光カバー22を閉じる。そし
て、経時的に測定用スイッチ９をオンにし発光素子４を
発光させる。試験紙部分２にて反射された光を受光素子
６にて受け、増巾・測定回路・Ａ−Ｄ変換器７を経て表
示手段８にて反射光強度を数値表示させる。
（Ｃ） 検量線の作成 正常人プール血清に胆汁酸（コール酸ナトリウム）を加
えて、胆汁酸濃度０、10、25、50、100μmol/の標準
胆汁酸溶液を調製した。
えて、胆汁酸濃度０、10、25、50、100μmol/の標準
胆汁酸溶液を調製した。
実施例１（Ａ）で調製した試験紙部分に標準胆汁酸溶液
を20μ滴下させた。滴下10秒後と120秒後に555nmにお
ける反射光強度を実施例１（Ｂ）の反射光測定装置を使
用して測定し、それらの測定値から10秒と120秒後の反
射光強度の差を求めた。第１表にその結果を示す。
を20μ滴下させた。滴下10秒後と120秒後に555nmにお
ける反射光強度を実施例１（Ｂ）の反射光測定装置を使
用して測定し、それらの測定値から10秒と120秒後の反
射光強度の差を求めた。第１表にその結果を示す。
第１表の反射光強度の差と胆汁酸濃度から第２図に示す
検量線が得られた。
検量線が得られた。
（Ｄ） 患者血清中の胆汁酸濃度測定 検体を標準胆汁酸溶液の代わりに、肝炎患者血清とした
以外は実施例１（Ｃ）と全く同様にして、肝炎患者血清
の胆汁酸濃度測定した。
以外は実施例１（Ｃ）と全く同様にして、肝炎患者血清
の胆汁酸濃度測定した。
反射光測定装置より10秒〜120秒の反射光強度の差は95
となり、 この値を第２図の検量線と比較することにより胆汁酸濃
度を求めると胆汁酸濃度は41μmol/となった。
となり、 この値を第２図の検量線と比較することにより胆汁酸濃
度を求めると胆汁酸濃度は41μmol/となった。
また、この患者血清中の胆汁酸の濃度を溶液法の胆汁酸
測定キット「エンザバイル」（第一化学薬品製）を用い
て測定すると40μmol/と求まり、本発明の試験紙で求
めた41μmol/と良く一致した。
測定キット「エンザバイル」（第一化学薬品製）を用い
て測定すると40μmol/と求まり、本発明の試験紙で求
めた41μmol/と良く一致した。
比較例１ 実施例１（Ａ）に記述した試験紙の調製法において、ED
TA−2Naを除いた以外は、全く同様にして調製した試験
紙を用いて、実施例Ｉと同様にして実施例１と同じ検体
の胆汁酸濃度を測定した。
TA−2Naを除いた以外は、全く同様にして調製した試験
紙を用いて、実施例Ｉと同様にして実施例１と同じ検体
の胆汁酸濃度を測定した。
標準胆汁酸濃度と反射光強度の差の関係は第２表のよう
になり、これから第３図に示した検量線が得られた。
になり、これから第３図に示した検量線が得られた。
実施例１と同じ検体の胆汁酸濃度を測定すると、反射光
強度の差は205となり、検量線から胆汁酸濃度は78μmol
/と求まった。
強度の差は205となり、検量線から胆汁酸濃度は78μmol
/と求まった。
実施例２ 実施例１（Ａ）に記述した試験紙の調製法において、ED
TA−2Na 50mgの代わりに、EGTA−2Na 50mg（シグマ社
製）を加えた以外は、全く同様にして調製した試験紙を
用いて、実施例１と同様にして検量線を作成した。標準
胆汁酸濃度と反射光強度の差の関係は第３表のようにな
った。
TA−2Na 50mgの代わりに、EGTA−2Na 50mg（シグマ社
製）を加えた以外は、全く同様にして調製した試験紙を
用いて、実施例１と同様にして検量線を作成した。標準
胆汁酸濃度と反射光強度の差の関係は第３表のようにな
った。
この試験紙を用いて、肝炎患者血清の胆汁酸濃度を測定
すると、反射光強度の差は104となり、検量線より42μm
ol/と求まった。
すると、反射光強度の差は104となり、検量線より42μm
ol/と求まった。
また、この患者血清中の胆汁酸の濃度を溶液法の胆汁酸
測定キット「エンザバイル」（第一化学薬品製）を用い
て測定すると40μmol/と求まり、本発明の試験紙で求
めた42μmol/と良く一致した。
測定キット「エンザバイル」（第一化学薬品製）を用い
て測定すると40μmol/と求まり、本発明の試験紙で求
めた42μmol/と良く一致した。
比較例２ 比較例１の試験紙を使用して、実施例２と同じ検体の胆
汁酸濃度を測定すると、80μmol/と求まった。
汁酸濃度を測定すると、80μmol/と求まった。
以上の実施例および比較例より、本発明の試験紙により
測定された値と溶液法の胆汁酸測定キット「エンザバイ
ル」で測定された値が、ほぼ等しい。
測定された値と溶液法の胆汁酸測定キット「エンザバイ
ル」で測定された値が、ほぼ等しい。
一方、EDTA−2Naなどを含まない従来の試験紙で測定し
たものは、本発明のものよりはるかに大きい測定値を示
しており、この場合には胆汁酸の反応による呈色に、検
体中の胆汁酸以外の共存成分の反応による呈色が加わっ
ていることを示している。すなわち、試験紙にEDTA−2N
aなどを添加することにより、胆汁酸の濃度を正確に測
定できることが分った。
たものは、本発明のものよりはるかに大きい測定値を示
しており、この場合には胆汁酸の反応による呈色に、検
体中の胆汁酸以外の共存成分の反応による呈色が加わっ
ていることを示している。すなわち、試験紙にEDTA−2N
aなどを添加することにより、胆汁酸の濃度を正確に測
定できることが分った。
（発明の効果） 本発明によれば、高分子素材からなる担体の同一個所に
３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド、ジアホラーゼおよび
テトラゾリウム塩からなる試薬系組成物とエチレンジ
アミン四酢酸（EDTA）、エチレングリコールビス（β−
アミノエチルエーテル）N,N,N′,N′四酢酸（EGTA）、E
DTAないしはEGTAのアルカリ金属塩から成る群の中から
選ばれる一つ以上の添加剤とが、担持されたことを特徴
とする胆汁酸測定用試験紙、によるのでこのように、体
液中の共存成分の影響を除いて、胆汁酸の量を測定し得
るので、胆汁酸量を正確に測定し得る。
３αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド、ジアホラーゼおよび
テトラゾリウム塩からなる試薬系組成物とエチレンジ
アミン四酢酸（EDTA）、エチレングリコールビス（β−
アミノエチルエーテル）N,N,N′,N′四酢酸（EGTA）、E
DTAないしはEGTAのアルカリ金属塩から成る群の中から
選ばれる一つ以上の添加剤とが、担持されたことを特徴
とする胆汁酸測定用試験紙、によるのでこのように、体
液中の共存成分の影響を除いて、胆汁酸の量を測定し得
るので、胆汁酸量を正確に測定し得る。
従って、試験紙という簡便な方法で、しかも短時間のう
ちに、溶液法のような煩雑な方法で得られる値に匹敵す
る正確さで胆汁酸の量を測定し得、本発明法は、集団検
診での病気の早期発見や、ベッドサイドでの緊急時の検
査などに利用価値が高い。
ちに、溶液法のような煩雑な方法で得られる値に匹敵す
る正確さで胆汁酸の量を測定し得、本発明法は、集団検
診での病気の早期発見や、ベッドサイドでの緊急時の検
査などに利用価値が高い。
第１図は、本発明で使用した反射光測定装置を示す概略
図、 第２図は、標準胆汁酸容液を本発明の試験紙で測定した
時の標準胆汁酸濃度と反射光強度の関係を示す検量線、 第３図は、標準胆汁酸溶液を従来法の試験紙で測定した
時の標準胆汁酸濃度と反射光強度の関係を示す検量線で
ある。 １……胆汁酸測定装置、２……胆汁酸測定用試験紙部
分、３……透明板、４……発光素子、５……迷光防止
板、６……受光素子、７……増巾・測定回路・Ａ−Ｄ変
換器、８……表示手段、９……測定用スイッチ、21……
プラスチック製スティック、22……遮光カバー。
図、 第２図は、標準胆汁酸容液を本発明の試験紙で測定した
時の標準胆汁酸濃度と反射光強度の関係を示す検量線、 第３図は、標準胆汁酸溶液を従来法の試験紙で測定した
時の標準胆汁酸濃度と反射光強度の関係を示す検量線で
ある。 １……胆汁酸測定装置、２……胆汁酸測定用試験紙部
分、３……透明板、４……発光素子、５……迷光防止
板、６……受光素子、７……増巾・測定回路・Ａ−Ｄ変
換器、８……表示手段、９……測定用スイッチ、21……
プラスチック製スティック、22……遮光カバー。
Claims (1)
- 【請求項１】高分子素材からなる担体の同一個所に３
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド、ジアホラーゼおよびテ
トラゾリウム塩からなる試薬系組成物とＢエチレンジ
アミン四酢酸（EDTA）、エチレングリコールビス（β−
アミノエチルエーテル）N,N,N′,N′四酢酸（EGTA）、E
DTAないしはEGTAのアルカリ金属塩から成る群の中から
選ばれる一つ以上の添加剤とが、担持されたことを特徴
とする胆汁酸測定用試験紙。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27643187A JPH0683678B2 (ja) | 1987-10-30 | 1987-10-30 | 胆汁酸測定用試験紙 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27643187A JPH0683678B2 (ja) | 1987-10-30 | 1987-10-30 | 胆汁酸測定用試験紙 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01117798A JPH01117798A (ja) | 1989-05-10 |
| JPH0683678B2 true JPH0683678B2 (ja) | 1994-10-26 |
Family
ID=17569320
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27643187A Expired - Lifetime JPH0683678B2 (ja) | 1987-10-30 | 1987-10-30 | 胆汁酸測定用試験紙 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0683678B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5152339A (en) * | 1990-04-03 | 1992-10-06 | Thermal Components, Inc. | Manifold assembly for a parallel flow heat exchanger |
-
1987
- 1987-10-30 JP JP27643187A patent/JPH0683678B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01117798A (ja) | 1989-05-10 |
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