JPH0686375B2 - リポソーム製剤 - Google Patents
リポソーム製剤Info
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- JPH0686375B2 JPH0686375B2 JP1279446A JP27944689A JPH0686375B2 JP H0686375 B2 JPH0686375 B2 JP H0686375B2 JP 1279446 A JP1279446 A JP 1279446A JP 27944689 A JP27944689 A JP 27944689A JP H0686375 B2 JPH0686375 B2 JP H0686375B2
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- JP
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- liposome
- liposomes
- encapsulated
- csf
- mdp
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
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- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なリポソーム製剤、より詳しくは単球やマ
クロファージに貧食されやすく、封入された生物学的活
性物質の性質をより効果的に惹起するリポソーム製剤に
関する。
クロファージに貧食されやすく、封入された生物学的活
性物質の性質をより効果的に惹起するリポソーム製剤に
関する。
従来技術とその課題 1960年中期に英国のバンガム（Bangham）が天然物由来
のリン脂質を水中に再分散させたとき、細胞の形質膜と
同じ基本構造の二分子膜が形成され、これが細胞のバル
ク構造と同じ閉鎖型小胞形態を有することを見出して以
来、該小胞は脂質（lipid）からなる小胞（some）とい
う意味からリポソーム（liposome）と呼ばれ、膜モデル
として乃至はマイクロカプセルとして、膜の流動性やバ
リヤー能（膜透過障壁）等の細胞膜構造特性の研究材料
や、また凝集、融合等の細胞の動物機能研究等に広く利
用され盛んな研究が展開されてきている。
のリン脂質を水中に再分散させたとき、細胞の形質膜と
同じ基本構造の二分子膜が形成され、これが細胞のバル
ク構造と同じ閉鎖型小胞形態を有することを見出して以
来、該小胞は脂質（lipid）からなる小胞（some）とい
う意味からリポソーム（liposome）と呼ばれ、膜モデル
として乃至はマイクロカプセルとして、膜の流動性やバ
リヤー能（膜透過障壁）等の細胞膜構造特性の研究材料
や、また凝集、融合等の細胞の動物機能研究等に広く利
用され盛んな研究が展開されてきている。
一方、近年癌による転移形成過程並びに機序に関する研
究が活発に進められており、癌細胞側因子だけでなく宿
主側因子の面からも癌の転移機構の詳細が解明されつつ
ある。その中で、癌免疫学の一つの流れとして、活性化
マクロファージの持つ非特異的殺腫瘍作用が注目されて
いる。活性化されたマクロファージは正常細胞と腫瘍細
胞とを識別することが可能であり、よって選択的に腫瘍
細胞を破壊することも可能である。しかも、その細胞障
害性は、癌治療中しばしば出現する薬剤耐性或は転移癌
の持つ不均一性を克服しうる可能性も示唆されている。
更にムラミルジペプタイド類（MDP）やコロニー刺激因
子、殊にマクロファージ−コロニー刺激因子、（Ｍ−CS
F）等の生物学的活性物質はマクロファージ系の活性化
能を有しており、之等物質は上記の観点から、抗ガン
剤、免疫賦活剤等の医薬品としての臨床応用が期待され
ている。
究が活発に進められており、癌細胞側因子だけでなく宿
主側因子の面からも癌の転移機構の詳細が解明されつつ
ある。その中で、癌免疫学の一つの流れとして、活性化
マクロファージの持つ非特異的殺腫瘍作用が注目されて
いる。活性化されたマクロファージは正常細胞と腫瘍細
胞とを識別することが可能であり、よって選択的に腫瘍
細胞を破壊することも可能である。しかも、その細胞障
害性は、癌治療中しばしば出現する薬剤耐性或は転移癌
の持つ不均一性を克服しうる可能性も示唆されている。
更にムラミルジペプタイド類（MDP）やコロニー刺激因
子、殊にマクロファージ−コロニー刺激因子、（Ｍ−CS
F）等の生物学的活性物質はマクロファージ系の活性化
能を有しており、之等物質は上記の観点から、抗ガン
剤、免疫賦活剤等の医薬品としての臨床応用が期待され
ている。
大多数の生物活的活性化物質が有する生理学的作用ある
いは上記単球−マクロファージ系の活性化物質等は、該
活性化作用を生体内で発揮する一方、之等の生物学的活
性物質を直接生体内に投与すると、その効果が発揮され
ないまま、直ちに分解され、充分な治療効果をあげるこ
とが難しい。
いは上記単球−マクロファージ系の活性化物質等は、該
活性化作用を生体内で発揮する一方、之等の生物学的活
性物質を直接生体内に投与すると、その効果が発揮され
ないまま、直ちに分解され、充分な治療効果をあげるこ
とが難しい。
従来、上記の課題を解決するために血中半減期の長い誘
導体の開発、投与形態等、種々の方法が検討されてお
り、上記であげた生物学的活性物質に対するリポソーム
の適用は、課題を解決するための有力な手段として期待
されている。
導体の開発、投与形態等、種々の方法が検討されてお
り、上記であげた生物学的活性物質に対するリポソーム
の適用は、課題を解決するための有力な手段として期待
されている。
発明が解決しようとする課題 本発明者らは、上記の課題の解決のために、鋭意研究を
重ねた結果、アルキルマンノシドを有するリポソームに
生物学的活性物質、特にMDPやＭ−CSF等の単球−マクロ
ファージ系活性化物質を封入することが、上記課題の解
決に有効であることを見出だし、ここに本発明を完成す
るに至った。
重ねた結果、アルキルマンノシドを有するリポソームに
生物学的活性物質、特にMDPやＭ−CSF等の単球−マクロ
ファージ系活性化物質を封入することが、上記課題の解
決に有効であることを見出だし、ここに本発明を完成す
るに至った。
問題点を解決するための手段 即ち本発明は、アルキルマンノシドを含有するリポソー
ムに生物活性物質を封入させてなることを特徴とするリ
ポソーム製剤に係わる。
ムに生物活性物質を封入させてなることを特徴とするリ
ポソーム製剤に係わる。
本発明のリポソーム製剤は上記のごとく優れたマクロフ
ァージ活性化能等を奏し得るものである。
ァージ活性化能等を奏し得るものである。
本発明はかかる優れた効果を奏し得るリポソーム製剤及
び該製剤の製造のためのマクロファージ活性化剤のキャ
リアーとして有用なリポソーム並びにそれらの製造方法
をも提供するものである。
び該製剤の製造のためのマクロファージ活性化剤のキャ
リアーとして有用なリポソーム並びにそれらの製造方法
をも提供するものである。
以下、本発明リポソーム製剤につき詳述すれば、該製剤
はアルキルマンノシドを含有するリポソームに生物活性
物質を封入させることにより製造できる。
はアルキルマンノシドを含有するリポソームに生物活性
物質を封入させることにより製造できる。
ここで使用されるアルキルマンノシドとしては、例えば
炭素数14〜18のアルキル基、代表的にはテトラデシル、
ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデ
シル基等を有するマンノシド類を例示できる。
炭素数14〜18のアルキル基、代表的にはテトラデシル、
ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデ
シル基等を有するマンノシド類を例示できる。
該アルキルマンノシドを含有するリポソームは、アルキ
ルマンノシドを含有する限り特に限定されるものではな
く、上記リポソームは、通常のリポソーム形成用脂質と
アルキルマンノシドとを利用して、それ自体公知の各種
方法、例えば代表的にはボルテックス法（Vortexing me
thod又はHydration method）〔Bangham,A.D.,Standish,
M.M.＆ Watkins,J.C.J.Mol.Biol.,13,238（1965）〕に
従って製造できる。上記リポソーム形成用脂質（膜成
分）としては、例えばホスファチジルコリン、ホスファ
チジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフ
ィゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン等に代表さ
れるリン脂質を例示できる。尚、之等に膜安定化剤とし
てコレステロール、コレスタノール等のステロール類、
荷電物質としてジセチルホスフェート、ホスファチジン
酸、ステアリルアミン等を、更に酸化防止剤としてα−
トコフェロール等の抗酸化剤等を加えて膜成分物質を形
成させてもよい。
ルマンノシドを含有する限り特に限定されるものではな
く、上記リポソームは、通常のリポソーム形成用脂質と
アルキルマンノシドとを利用して、それ自体公知の各種
方法、例えば代表的にはボルテックス法（Vortexing me
thod又はHydration method）〔Bangham,A.D.,Standish,
M.M.＆ Watkins,J.C.J.Mol.Biol.,13,238（1965）〕に
従って製造できる。上記リポソーム形成用脂質（膜成
分）としては、例えばホスファチジルコリン、ホスファ
チジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、スフ
ィゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン等に代表さ
れるリン脂質を例示できる。尚、之等に膜安定化剤とし
てコレステロール、コレスタノール等のステロール類、
荷電物質としてジセチルホスフェート、ホスファチジン
酸、ステアリルアミン等を、更に酸化防止剤としてα−
トコフェロール等の抗酸化剤等を加えて膜成分物質を形
成させてもよい。
之等リポソームの膜成分物質の比率及び之等とアセチル
マンノシドとの使用割合は、何等限定されるものではな
いが、好ましくは脂質１重量部に対してステロール類を
０〜２重量部程度、荷電物質を０〜0.2重量部程度、ア
ルキルマンノシドを0.1〜10重量部程度とするのが適当
である。
マンノシドとの使用割合は、何等限定されるものではな
いが、好ましくは脂質１重量部に対してステロール類を
０〜２重量部程度、荷電物質を０〜0.2重量部程度、ア
ルキルマンノシドを0.1〜10重量部程度とするのが適当
である。
上記リン脂質とアルキルマンノシドとを用いて製造され
るリポソームは、特に限定される訳ではなく多重層リポ
ソーム（MLV;multilameller vesicle）、多重ラメラ小
胞（SUV;small unilamella vesicle）、単ラメラ小胞
（LUV;larger unilamella vesicle）等の各種のリポソ
ームを包含するが、特に粒子径等の点からは通常多重層
リポソーム（MLV）であるのが好ましく、該リポソーム
は、通常0.2.〜２μｍのサイズであるのが好適である。
るリポソームは、特に限定される訳ではなく多重層リポ
ソーム（MLV;multilameller vesicle）、多重ラメラ小
胞（SUV;small unilamella vesicle）、単ラメラ小胞
（LUV;larger unilamella vesicle）等の各種のリポソ
ームを包含するが、特に粒子径等の点からは通常多重層
リポソーム（MLV）であるのが好ましく、該リポソーム
は、通常0.2.〜２μｍのサイズであるのが好適である。
上記のごとくして得られるリポソームに封入される生物
学的活性物質は、マクロファージの貧食による活性化作
用があれば特に限定されるものではなく、例えばムラミ
ルジペプタイド（MDP）、ムラミルトリペプタイド（MT
P）及びそれらの誘導体、α−インターフエロン、β−
インターフェロン、γ−インターフェロン等のインター
フェロン類（IFN）、マクロファージ−コロニー刺激因
子（Ｍ−CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子（GM−CFS）等のコロニー活性化因子等を例示でき
る。之等生物学的活性化物質の使用量は、その種類、上
記リポソームの膜成分物質の種類、種類等に応じて適宜
決定され特に限定されないが、50μＭの総脂質量に対し
て、例えばMDPでは約0.5〜50μｇ、Ｍ−CSFでは約100単
位〜100万単位、GM−CSFでは約１単位〜10万単位、α−
IFNでは約10単位〜100万単位、β−IFNでは約100単位〜
10万単位、γ−IFNでは約100単位〜10万単位の範囲から
選ばれるのが適当である。
学的活性物質は、マクロファージの貧食による活性化作
用があれば特に限定されるものではなく、例えばムラミ
ルジペプタイド（MDP）、ムラミルトリペプタイド（MT
P）及びそれらの誘導体、α−インターフエロン、β−
インターフェロン、γ−インターフェロン等のインター
フェロン類（IFN）、マクロファージ−コロニー刺激因
子（Ｍ−CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子（GM−CFS）等のコロニー活性化因子等を例示でき
る。之等生物学的活性化物質の使用量は、その種類、上
記リポソームの膜成分物質の種類、種類等に応じて適宜
決定され特に限定されないが、50μＭの総脂質量に対し
て、例えばMDPでは約0.5〜50μｇ、Ｍ−CSFでは約100単
位〜100万単位、GM−CSFでは約１単位〜10万単位、α−
IFNでは約10単位〜100万単位、β−IFNでは約100単位〜
10万単位、γ−IFNでは約100単位〜10万単位の範囲から
選ばれるのが適当である。
上記生物学的活性物質を封入してリポソームの製造は、
例えば所定量のリポソーム膜成分物質及びアルキルマン
ノシドを、例えばクロロホルム等の適当な有機溶媒で可
溶化し、減圧下に溶媒を除去し、膜脂質を作成後、これ
に上記所定量の生物学的活性物質を含む溶液を添加し
て、リポソーム懸濁液を調製することにより実施でき
る。
例えば所定量のリポソーム膜成分物質及びアルキルマン
ノシドを、例えばクロロホルム等の適当な有機溶媒で可
溶化し、減圧下に溶媒を除去し、膜脂質を作成後、これ
に上記所定量の生物学的活性物質を含む溶液を添加し
て、リポソーム懸濁液を調製することにより実施でき
る。
かくして生物活性物質を封入して得られるリポソーム
は、そのまま本発明のリポソーム製剤として利用でき
る。勿論必要に応じて常法に従い滅菌等の操作を施すこ
ともできる。
は、そのまま本発明のリポソーム製剤として利用でき
る。勿論必要に応じて常法に従い滅菌等の操作を施すこ
ともできる。
実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げ
る。
る。
実施例 １ ｉ） セチルマンノシド修飾リポソームの製造 水素を添加した卵ホスファチジルコリン（egg PC、日本
精化製）、セチルマンノシド（Ｃ−Man、東京理大）、
ジセチルリン酸（DCP、半井化学）及びコレステロール
（CH、関東化学工業製）をそれぞれモル比で2:3:1:4の
組成で総脂質量50μmolになるように混合した脂質のク
ロロホルム溶液に、蛍光色素Ｎ−（リサミノローダミン
−β−スルホニル）ジオレオイルホスファチジルエタノ
ールアミン（Avanti社）を３％（モル）添加し、減圧下
溶媒を留去し、脂質の薄膜を作製後、５％仔牛血清（ギ
ブコ社）含有RPMI 1640培地［日水製薬社、以下これを
「５％ CRPMI」という）1mlを加え、攪拌法によりリポ
ソームを調製した。
精化製）、セチルマンノシド（Ｃ−Man、東京理大）、
ジセチルリン酸（DCP、半井化学）及びコレステロール
（CH、関東化学工業製）をそれぞれモル比で2:3:1:4の
組成で総脂質量50μmolになるように混合した脂質のク
ロロホルム溶液に、蛍光色素Ｎ−（リサミノローダミン
−β−スルホニル）ジオレオイルホスファチジルエタノ
ールアミン（Avanti社）を３％（モル）添加し、減圧下
溶媒を留去し、脂質の薄膜を作製後、５％仔牛血清（ギ
ブコ社）含有RPMI 1640培地［日水製薬社、以下これを
「５％ CRPMI」という）1mlを加え、攪拌法によりリポ
ソームを調製した。
更に調製したリポソーム懸濁液を透析することにより、
リポソームに未封入の上記蛍光色素を除去した。
リポソームに未封入の上記蛍光色素を除去した。
ii） セチルマンノシド修飾リポソームの製造 egg PC、Ｃ−Man、DCP及びCHをそれぞれモル比2:3:1:4
の組成で総脂質量250μmolになるように混合した脂質の
クロロホルム溶液を、ナス型フラスコに採り、エバポレ
ーターで減圧下溶媒を留去し、脂質の薄膜を作成した。
これに0.1mMイヌリン−PBS溶液5ml、［3H］−イヌリン
（New England Nuclear（Du Pont Co.,U.S.A.製）10μ
を加え、撹拌法により、MLVリポソームを調製した。
の組成で総脂質量250μmolになるように混合した脂質の
クロロホルム溶液を、ナス型フラスコに採り、エバポレ
ーターで減圧下溶媒を留去し、脂質の薄膜を作成した。
これに0.1mMイヌリン−PBS溶液5ml、［3H］−イヌリン
（New England Nuclear（Du Pont Co.,U.S.A.製）10μ
を加え、撹拌法により、MLVリポソームを調製した。
この調製したMLVリポソームを0.8μｍのフィルター（Nu
clepore、野村マイクロサイエンス株式会社）を用い
て、粒径を一定とした。その後、0.2μｍのフィルター
（Nuclepore、野村マイクロサイエンス株式会社）を用
いて、PBSを１回２、１日２回交換し、２日間透析を
行なった。
clepore、野村マイクロサイエンス株式会社）を用い
て、粒径を一定とした。その後、0.2μｍのフィルター
（Nuclepore、野村マイクロサイエンス株式会社）を用
いて、PBSを１回２、１日２回交換し、２日間透析を
行なった。
セチルマンノシド非修飾リポソームの製造 上記ｉ）の組成の代りに、egg PC、DCP及びCHをそれ
ぞれモル比で5:1:4の組成で用い、同様の方法でセチル
マンノシド非修飾リポソームを調製した。
ぞれモル比で5:1:4の組成で用い、同様の方法でセチル
マンノシド非修飾リポソームを調製した。
実施例 ２ 貧食能の測定 単球及び肺胞マクロファージの分離 健常人静脈血からの白血球遠心分離画分をリンフォサイ
トセパレーションメディウム（Organon teknica社）に
て、単核球に分離後、エルトリエーションローター（日
立製、SRR6Y）を用いたエルトリエーション法〔S.Sone
et al.,I.N.T.J.Cancer,vol.38,p495−500（1986）〕に
より単球を得た。
トセパレーションメディウム（Organon teknica社）に
て、単核球に分離後、エルトリエーションローター（日
立製、SRR6Y）を用いたエルトリエーション法〔S.Sone
et al.,I.N.T.J.Cancer,vol.38,p495−500（1986）〕に
より単球を得た。
ヒト肺胞マクロファージは、気管支肺胞洗浄胞〔T.Naka
yama et al.,J.P.H.Thorac.Dis.,vol.18,p11−19（198
4）により得た。
yama et al.,J.P.H.Thorac.Dis.,vol.18,p11−19（198
4）により得た。
貧食能の測定 単球或は肺胞マクロファージを、８ウェルチャンバース
ライドに１×105個／ウェルの割合でプレーティング
し、１時間培養後、蛍光標識リポソーム（実施例１
ｉ）で調製したもの）を100n mol/ウェル添加し、12時
間培養した。
ライドに１×105個／ウェルの割合でプレーティング
し、１時間培養後、蛍光標識リポソーム（実施例１
ｉ）で調製したもの）を100n mol/ウェル添加し、12時
間培養した。
培養押終了後、PBSにて洗浄し、１％パラホルムアルデ
ヒドにて固定後、洗浄し、グリセリンにて包埋した。
ヒドにて固定後、洗浄し、グリセリンにて包埋した。
各単球及び肺胞マクロファージの蛍光強度は、PHOTOR C
OUNTER（NF社、光子計数装置）にて測定した（臨床検査
33（６）646,1989）。
OUNTER（NF社、光子計数装置）にて測定した（臨床検査
33（６）646,1989）。
結果を対照の貧食率を100％とする相対値にて下記第１
表に示す。
表に示す。
上記表より、実施例１ｉ）で得たセチルマンノシド修
飾リポソームは非修飾リポソームに比して単球及びマク
ロファージのいずれにおいても約２培貧食されやすい性
質を有していることが判る。
飾リポソームは非修飾リポソームに比して単球及びマク
ロファージのいずれにおいても約２培貧食されやすい性
質を有していることが判る。
実施例 ３ ｉ） MDP封入セチルマンノシド修飾リポソームの製造 egg−PC:C−Man:DCP:CH＝2:3:1:4（モル比）の組成で、
総脂質量50μモルになるように混合した脂質のクロロホ
ルム溶液を減圧下で溶媒を留去し、脂質の薄膜を作成
後、これにnor MDP（チバガイギー社、脱メチル化ムラ
ミルジペプタイド）20μｇを含有する５％CRPMIを1ml添
加してボルテックス法によりnor MDP封入セチルマンノ
シド修飾リポソームを調製した。未封入nor MDPは遠心
分離により除去した。
総脂質量50μモルになるように混合した脂質のクロロホ
ルム溶液を減圧下で溶媒を留去し、脂質の薄膜を作成
後、これにnor MDP（チバガイギー社、脱メチル化ムラ
ミルジペプタイド）20μｇを含有する５％CRPMIを1ml添
加してボルテックス法によりnor MDP封入セチルマンノ
シド修飾リポソームを調製した。未封入nor MDPは遠心
分離により除去した。
ii）MDP封入非修飾リポソームの製造 egg PC:DCP:CH＝5:1:4（モル比）の組成とする以外は上
記ｉ）と同様にして、nor MDP封入エチルマンノシド非
修飾リポソームを調製した。
記ｉ）と同様にして、nor MDP封入エチルマンノシド非
修飾リポソームを調製した。
iii）殺腫瘍細胞活性の測定 実施例２で得られた単球をマイクロテストIIIプレート
（ファルコン社製）に１×105個／ウェルの割合でプレ
ーティングし、１時間培養後、単球のモノレイヤーを得
た。
（ファルコン社製）に１×105個／ウェルの割合でプレ
ーティングし、１時間培養後、単球のモノレイヤーを得
た。
モノレイヤー作成後の純度は、洗浄操作により99％以上
であった。
であった。
更に単球のモノレイヤーに、nor MDP単独、上記ｉ）で
得たnor MDP封入セチルマンノシド含有リポソーム及び
同ii）で得たnor MDP封入セチルマンノシド非修飾リポ
ソームのそれぞれを第１図に示すごとく種々の量で添加
し、24時間５％CO2の条件で培養を行なった。
得たnor MDP封入セチルマンノシド含有リポソーム及び
同ii）で得たnor MDP封入セチルマンノシド非修飾リポ
ソームのそれぞれを第１図に示すごとく種々の量で添加
し、24時間５％CO2の条件で培養を行なった。
培養終了後、洗浄し、１×104個／ウェル（単球（Ｅ）
と腫瘍細胞（Ｔ）との比:E/T＝10/1）の125I−IUdR標識
ヒトA375メラノーマ細胞を添加し、72時間37℃にて培養
した。
と腫瘍細胞（Ｔ）との比:E/T＝10/1）の125I−IUdR標識
ヒトA375メラノーマ細胞を添加し、72時間37℃にて培養
した。
上記培養終了後、洗浄し、ウェルの底に生存する腫瘍細
胞の放射能活性を測定し、下記式に従い細胞障害率
（％）を算出した。
胞の放射能活性を測定し、下記式に従い細胞障害率
（％）を算出した。
結果を第１図に示す。第１図は縦軸に細胞障害率（％）
を、横軸にnor MDP濃度（μg/ml）を取り、単球によるA
375細胞殺細胞作用への各活性物質試料の影響を調べた
図であり、図中（１）は本発明リポソーム試料、即ち上
記ｉ）で得たnor MDP封入セチルマンノシド修飾リポソ
ームを、（２）は比較試料、即ち同ii）で得たnor MDP
封入非修飾リポソームを、また（３）は遊離nor MDPを
それぞれ示す。
を、横軸にnor MDP濃度（μg/ml）を取り、単球によるA
375細胞殺細胞作用への各活性物質試料の影響を調べた
図であり、図中（１）は本発明リポソーム試料、即ち上
記ｉ）で得たnor MDP封入セチルマンノシド修飾リポソ
ームを、（２）は比較試料、即ち同ii）で得たnor MDP
封入非修飾リポソームを、また（３）は遊離nor MDPを
それぞれ示す。
上記図より、単球によるA375細胞に対する殺細胞活性
は、本発明リポソーム試料で活性化することにより大幅
に増強されることが判る。これに対して比較リポソーム
試料による単球完成化能は弱く、更に遊離のnor MDPで
は単球の活性化に0.1μg/ml以上の大量の添加が必要で
あることが判る。
は、本発明リポソーム試料で活性化することにより大幅
に増強されることが判る。これに対して比較リポソーム
試料による単球完成化能は弱く、更に遊離のnor MDPで
は単球の活性化に0.1μg/ml以上の大量の添加が必要で
あることが判る。
実施例 ４ ｉ） Ｍ−CSF封入セチルマンノシド修飾リポソームの
製造 実施例３においてnor MDP20μｇに代えてCHO細胞から産
生されたＭ−CSF（特開平１−24663号公報）10000単位
を用い、同様にしてＭ−CSF封入セチルマンノシド修飾
リポソームを調製した。
製造 実施例３においてnor MDP20μｇに代えてCHO細胞から産
生されたＭ−CSF（特開平１−24663号公報）10000単位
を用い、同様にしてＭ−CSF封入セチルマンノシド修飾
リポソームを調製した。
ii）Ｍ−CSF封入非修飾リポソームの製造 Ｍ−CSF10000単位を用いて、実施例5ii）と同様にし
て、Ｍ−CSF封入セチルマンノシド非修飾リポソームを
調製した。
て、Ｍ−CSF封入セチルマンノシド非修飾リポソームを
調製した。
iii）単球の生存率の測定 実施例２で得られた単球を、マイクロテストIIIプレ
ート（ファルコン社製）に１×105個／ウェルの割合で
プレーティングし、１時間培養し、単球モノレーヤーを
得た。
ート（ファルコン社製）に１×105個／ウェルの割合で
プレーティングし、１時間培養し、単球モノレーヤーを
得た。
更に遊離Ｍ−CSF、上記ｉ）で本発明Ｍ−CSF封入セチル
マンノシド修飾リポソーム試料及び同ii）で得た比較Ｍ
−CSF封入非修飾リポソーム試料のそれぞれを経時的に
添加し、単球の生存率を検定した。この生存率はモスマ
ンの方法〔T.Mosmann,Journal of Immunological Metho
ds,15,55−63（1983）〕に従ってMTTアッセイによって
実行された。
マンノシド修飾リポソーム試料及び同ii）で得た比較Ｍ
−CSF封入非修飾リポソーム試料のそれぞれを経時的に
添加し、単球の生存率を検定した。この生存率はモスマ
ンの方法〔T.Mosmann,Journal of Immunological Metho
ds,15,55−63（1983）〕に従ってMTTアッセイによって
実行された。
培養１週間目の結果を第２図に示す。該図は縦軸に生存
率（％）を、横軸にＭ−CSF濃度（単位/ml）を取り、各
試料による単球生存率維持効果を調べた図であり、
（１）は本発明Ｍ−CSF封入セチルマンノシド修飾リポ
ソーム試料を、（２）は比較Ｍ−CSF封入非修飾リポソ
ーム試料を、（３）は遊離Ｍ−CSFをそれぞれ示す。
率（％）を、横軸にＭ−CSF濃度（単位/ml）を取り、各
試料による単球生存率維持効果を調べた図であり、
（１）は本発明Ｍ−CSF封入セチルマンノシド修飾リポ
ソーム試料を、（２）は比較Ｍ−CSF封入非修飾リポソ
ーム試料を、（３）は遊離Ｍ−CSFをそれぞれ示す。
該図より、本発明リポソーム試料は比較試料及び遊離Ｍ
−CSFに比べて単球の生存率を顕著に高め得ることが判
る。
−CSFに比べて単球の生存率を顕著に高め得ることが判
る。
実施例 ５ セチルマノシド修飾リポソーム投与による組織内分布の
検定 組織内分布の検定に供された実験動物としては、ウィス
ター系雄性ラット（体重200±20g）を使用した。該ラッ
トはエーテル麻酔下、大腿動脈及び静脈、膀胱にカニュ
ーレを挿入し、手術後はホールマンケージに固定した。
検定 組織内分布の検定に供された実験動物としては、ウィス
ター系雄性ラット（体重200±20g）を使用した。該ラッ
トはエーテル麻酔下、大腿動脈及び静脈、膀胱にカニュ
ーレを挿入し、手術後はホールマンケージに固定した。
麻酔から覚醒後、大腿静脈から標識リポソームで（実施
例１ii）で得た修飾リポソーム及び同で得た非修飾
リポソーム）を200gのラットに対しそれぞれ0.5mlを投
与し、経時的に採血及び採尿を行ない更に２時間後にお
けるリポソームの組織内分布の検定を行なった。
例１ii）で得た修飾リポソーム及び同で得た非修飾
リポソーム）を200gのラットに対しそれぞれ0.5mlを投
与し、経時的に採血及び採尿を行ない更に２時間後にお
けるリポソームの組織内分布の検定を行なった。
検定を行なった部位は血液、肝臓、脾臓、肺、腎臓、尿
である。
である。
まず血液は0.2mlを採取し、H2O20.5mlで脱色後、２規定
KOH−イソプロパノール溶液0.5mlを、尿は精製水を加
え、全量10mlとした後、1.0mlを計り採りH2O20.2ml、2N
KOH−イソプロパノール溶液0.2mlを加え、室温で一晩
放置した。次に血液サンプルに10％酢酸溶液1ml、更にE
x−Ｈ（シンチレーションカクテル、シンチゾールEx−
Ｈ、同仁化学研究所）10mlを添加した。
KOH−イソプロパノール溶液0.5mlを、尿は精製水を加
え、全量10mlとした後、1.0mlを計り採りH2O20.2ml、2N
KOH−イソプロパノール溶液0.2mlを加え、室温で一晩
放置した。次に血液サンプルに10％酢酸溶液1ml、更にE
x−Ｈ（シンチレーションカクテル、シンチゾールEx−
Ｈ、同仁化学研究所）10mlを添加した。
肝臓はホモジナイズした後、精製水を加え、全量を50ml
とし、その1mlを採り、H2O2 0.2ml、2N KOH−イソプロ
パノール溶液0.5ml、更にEx−H10mlを加えた。
とし、その1mlを採り、H2O2 0.2ml、2N KOH−イソプロ
パノール溶液0.5ml、更にEx−H10mlを加えた。
肺、腎臓はH2O20.1ml、2N KOH−イソプロパノール溶液
2ml、膵臓はH2O22ml、2N KOH−イソプロパノール溶液2
mlを加え、37℃で一晩インキュベートした。
2ml、膵臓はH2O22ml、2N KOH−イソプロパノール溶液2
mlを加え、37℃で一晩インキュベートした。
その後、肺、腎臓、脾臓の各サンプルにそれぞれ10％の
酢酸2.4ml、更に精製水を加え全量を10mlとし、その1.0
mlを分取した後、Ex−H10mlを加えた。
酢酸2.4ml、更に精製水を加え全量を10mlとし、その1.0
mlを分取した後、Ex−H10mlを加えた。
各サンプルは攪拌後、液体シンチレーションカウンター
（LSC−602Aloka社製）により放射活性を測定した。
（LSC−602Aloka社製）により放射活性を測定した。
［3H］−イヌリンを封入したリポソームをラットに静注
投与した後、２時間におけるリポソームの組織内分布に
及ぼす脂質組成の影響を調べた結果を下記第２表に示
す。
投与した後、２時間におけるリポソームの組織内分布に
及ぼす脂質組成の影響を調べた結果を下記第２表に示
す。
上記表より、セチルマンノシド含有リポソームは非修飾
リポソームに比べて肝臓に約２倍多く分布していること
が判る。これは該リポソームが肝臓に存在するマクロフ
ァージの一種であるクッパー細胞に取り込まれるためと
推測される。
リポソームに比べて肝臓に約２倍多く分布していること
が判る。これは該リポソームが肝臓に存在するマクロフ
ァージの一種であるクッパー細胞に取り込まれるためと
推測される。
第１図は実施例３に従って単球によるA375細胞殺細胞作
用への各試料の影響を調べた図であり、第２図は実施例
４に従って各試料による単球生存率維持効果を調べた図
である。
用への各試料の影響を調べた図であり、第２図は実施例
４に従って各試料による単球生存率維持効果を調べた図
である。
Claims (3)
- 【請求項１】アルキルマンノシドを含有するリポソーム
に生物活性物質を封入させてなることを特徴とするリポ
ソーム製剤。 - 【請求項２】生物活性物質がムラミルジペプタイドであ
る請求項記載のリポソーム製剤。 - 【請求項３】生物活性物質がＭ−CSFである請求項記
載のリポソーム製剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1279446A JPH0686375B2 (ja) | 1989-09-25 | 1989-10-25 | リポソーム製剤 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24963389 | 1989-09-25 | ||
| JP1-249633 | 1989-09-25 | ||
| JP1279446A JPH0686375B2 (ja) | 1989-09-25 | 1989-10-25 | リポソーム製剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03173814A JPH03173814A (ja) | 1991-07-29 |
| JPH0686375B2 true JPH0686375B2 (ja) | 1994-11-02 |
Family
ID=26539404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1279446A Expired - Lifetime JPH0686375B2 (ja) | 1989-09-25 | 1989-10-25 | リポソーム製剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0686375B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1441676B (zh) | 2000-03-31 | 2012-08-22 | 普渡研究基金会 | 用配体-免疫原缀合物治疗的方法 |
| EP2168598A1 (en) * | 2001-09-28 | 2010-03-31 | Purdue Research Foundation | Method of Treatment Using Ligand-Immunogen Conjugates |
| US8168164B2 (en) | 2006-02-03 | 2012-05-01 | Purdue Research Foundation | Targeted conjugates and radiation |
-
1989
- 1989-10-25 JP JP1279446A patent/JPH0686375B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03173814A (ja) | 1991-07-29 |
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Legal Events
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