DK164483B - Fremgangsmaade til opbevaring af phospholipid liposomer - Google Patents

Description

DK 164483 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til opbevaring af phospholipid liposomer og mere specielt phospholipid liposomer som suspenderes i en polymer gelmatrix.

Anvendelse af micellulære partikler, såsom phos-5 pholipid vesicler (eller liposomer, som de sædvanligvis betegnes) som bærere for farmaceutiske og diagnostiske midler, har været genstand for omfattende forskning,

Ryman, B.E., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 308, 281 (1978); Gregoriadis, G., Ed., "Liposome Technology", 10 CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, Vol. II (1984); Fendler J.H., Acc. Chem. Res., 13, 7 (1980); og

Weinstein J.N., et al., Science, 204, 188 (1979). Som eksempler på potentielle anvendelsesmuligheder for phos-pholipidvesicler kan nævnes bærere af enzymer, lægemid-15 ler (specielt anti-tumor lægemidler), chelatdannende midler, hormoner, radionucleider, cellemodificerende stoffer, antigener, antistoffer, interferon-fremkaldere og virus delpartikler. Imidlertid er liposomer (specielt små ultralydsbehandlede vesicler) thermodynamisk 20 ustabile ved temperaturer under faseovergangstemperaturen og har tendens til at klumpe sammen eller forenes til dannelse af store unilamellare vesicler ved lagring i længere tid, Sheetz M.P., et al., Biochemistry, 11, 4573 (1972); Lawaczeck R.L., et al., Biochem, Biophys.

25 Acta, 443, 313 (1976); Larrabee H.L., Biochemistry, 18, 3321 (1978) og Shullery S.E., et al., Biochemistry, 19, 3919 (1980):

Sammenklumpning eller sammensmeltning af de små partikler til større partikler ændrer egenskaberne af 30 vesiclerne, hvilket atter kan ændre vesiclernes permeabilitet og biofordeling in vivo, Kao Y.J., et al., Biochem. Biophys. Acta., 677, 453 (1981) og Abra R.M., et al., Biochem. Biophys. Acta., 666, 493 (1981). Det er derfor særdeles vigtigt at være i stand til at lagre 35 micellulære partikler, uden at der sker partikelaggrega-tion eller partikelsammensmeltning med tilhørende ændring af vigtige egenskaber.

2

DK 164483 B

Fra Chemical Abstracts nr. 97:188156k kendes en hydrocolloid gel indeholdende liposomer til kosmetisk brug, men der kan ikke uddrages nogen lære for opbevaring af liposomer i en farmaceutisk acceptabel gel.

5 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen undgås den ovennævnte aggregation eller sammensmeltning ved lagring af micellulære partikler i en polymer gelmatrix. Matrixen kan være en naturlig eller syntetisk matrix, der danner gel ved lave temperaturer og er i stand til at 10 blive flydende f.eks. ved smeltning ved stuetemperatur eller ved en højere temperatur. Eksempler på egnede materialer af denne art er polysaccharider og polypepti- der. Ved lagring ved lavere temperaturer størkner gelen og begrænser partiklernes bevægelse. Dette medfører at-15 ter en forsinkelse eller en fuldstændig undgåelse af aggregation eller sammensmeltning.

Derfor forbliver størrelsen og egenskaberne af de micellulære partikler i det væsentlige uændrede ved lagring og så længe gelen forbliver i fast form. Ved stue-20 temperatur eller ved en højere temperatur vil gelen imidlertid smelte, og vesiclen eller andre partikler vil tilbagevende til deres oprindelige tilstand som en suspension i et vandigt medium, som kan anvendes til injektion eller til anden anvendelse på samme måde som 25 friskt fremstillede vesicler uden væsentligt at ændre egenskaberne af biofordelingen in vivo.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til opbevaring af phospholipid liposomer ejendommelig ved, at man suspenderer liposomerne i en farmaceutisk accep-30 tabel polymer gelopløsning til dannelse af en suspension med en beskyttende geloverflade rundt om liposomerne og afkøler suspensionen til dannelse af en gelmatrix som begrænser bevægelsen af liposomerne; opvarmer gelmatrixen til mindst ca. stuetemperatur, hvorved gelmatri-35 xen omdannes- til en vandig suspension egnet til anvendelse.

DK 164483 B

3

Eksempler på vesicler, på hvilke fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes, er phospholipider såsom distearoylphosphatidylcholin (DSPC), dipalmitoylphos-phatidylcholin (DPPC) og dimyristoylphosphatidylcholin 5 (DMPC) samt naturlige phospholipider såsom æggelecithin og sojabønnelecithin. Vesiclerne kan også indeslutte et therapeutisk middel såsom et antibiotikum og, som det vil fremgå af nedenstående udførelseseksempler, kan vesiclerne mærkes efter lagring med et radionuclid såsom 10 111ln.

Definitioner og forkortelser I nærværende beskrivelse og krav betegner "micellulære partikler" og "miceller" partikler, stammende fra 15 aggregationer af amphiphile molekyler, idet foretrukne amphiphiler er biologiske lipider.

"Vesicle" refererer til en micelle i en sædvanligvis sfærisk form, som ofte fås fra et lipid, som danner en tolags membran og betegnes et "liposom". Frem-20 gangsmåder til dannelse af sådanne vesicler er velkendte: Typisk fremstilles vesiclerne ud fra et phospholi pid, f.eks. distearoylphosphatidylcholin eller lecithin og kan omfatte andre materialer såsom neutrale lipider og overfladespændingsændrende midler, såsom positivt el-25 ler negativt ladede forbindelser, antigener, antistoffer, saccharider og lecithiner. Afhængigt af fremstillingsteknikken kan vesiclen være en simpel dobbeltlaget sfærisk skal (en unilamellar vesicel) eller have mange lag (multilamellar vesicler).

30 Følgende forkortelser er anvendt i beskrivelsen: DSPC - distearoylphosphatidylcholin Choi - cholesterol DPPC - dipalmitoylphosphatidylcholin DMPC - dimyristoylphosphatidylcholin 35 DTPA - diethylentriaminpentaeddikesyre EDTA - ethylendimintetraeddikesyre 4

DK 164483 B

SUV - små unilamellare vesicler.

Materialer og fremgangsmåde til fremstilling af miceller L -γ-distearoylphosphatidylcholin (DSPC) fra 5 calbiochem og cholesterol (Chol) fra Sigma blev anvendt uden yderligere rensning. Cholesterol-oleat [Oleat-l-14c](specifik aktivitet 51 Ci/mol) og 14C-ethylendia-min-tetraeddikesyre [eddikesyre 2-14C] (EDTA; specifik aktivitet 4,38 mCi/mmol) blev indkøbt fra New England 10 Nuclear. Natriumsalt af nitril-eddikesyre (NTA) og EDTA blev indkøbt fra Baker Chemical Company. Strålingskemikaliet 1:L1InCl3 (forskningskvalitet) blev indkøbt fra Medi-Physic og anvendt uden rensning. Ionophon A23187 blev indkøbt fra Calbiochem. Agarose (type IX) blev op-15 nået fra Sigma, og gelatine (Knox-gelatine) blev købt kommercielt. Agarose er den naturlige geldannende fraktion af polysaccharid-komplekset agar, som ekstraheres fra agarocyter af algae, hørende til Rhodophycae, medens gelatine er en heterogen blanding af vandopløselige, 20 højmolekylære proteiner afledt fra collagen. BDFlmus blev leveret fra Simonson Laboratories (Gilroy, CA).

Fremstilling og "Loading" af vesicler Små unilamellare vesicler blev fremstillet og 25 loaded efter den metode, som beskrives af Mauk M.R. &

Gamble R.C., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 76, 765 (1979).

Dette vil i korte træk sige, at en lipidblanding blev fremstillet ved at blande DSPC, Chol, og A23187 i molforholdet 2:1:0,004. Lipidblandingen blev tørret i va-30 kuum natten over og derpå behandlet med ultralyd i saltvand med phosphatstødpude (PBS, pH 7,4), indeholdende lmM NTA eller som iøvrigt specificeret. 14C eller 3 H cholesterololeat blev medtaget som markør for lipidfa-sen. Efter ultralydsbehandling, annealing, og centrifu-35 gering ved lav hastighed, blev vesiclerne adskilt fra overskydende NTA ved passage over en Sephadex G-50 kolonne, som var bragt i ligevægt med PBS.

DK 164483 B

5

Vesicler blev loaded med ^-^inClg ved tilsætning af radionuclidet til vesicelpræparatet, og inkubering ved 80°C i 45 minutter. Efter inkubering blev overskydende EDTA sat til komplekset med fri 11^In på overfla-5 den af vesiclen eller i opløsningen. Frit li:LIn-EDTA-kompleks blev derpå adskilt fra loaded vesicler ved søjlekromatografi under anvendelse af Sephadex G-50.

Målinger af dynamisk lysspredninq 10 Vesicelstørrelsen blev målt ved dynamisk lys spredning, som er baseret på den tidsmæssige opførsel af svingningerne med hensyn til spredningsintensitet, Frokjaer S., et al., Alfred Benzon Symp., 17, 384 (1982). Efterhånden som partiklerne undergår fortsat 15 Brownsk bevægelse, vil spredningsintensiteten undergå store variationer fra nul (totalt destruktiv interferens) til en maksimumsværdi (ingen interferens). Diffusionskoefficienten af de diffunderende partikler er relateret til den gennemsnitlige varighed af ændringerne 20 i intensiteten af det spredte lys. Almindeligt gælder, at jo større partiklerne er, jo langsommere vil diffusionen være, og jo længere er gennemsnitstiden for ændringerne. For kugleformede partikler (såsom liposomer) er diffusionskoefficienten (D) knyttet til den hydrody-25 namiske radius (r^) ved Stokes-Einstein-ligningen: D = kB T/6 η0 rh, hvor kB er Boltzman's konstant, T er den absolutte temperatur, og η0 er opløsningsmidlets viskositet.

En fortyndet prøve af vesicelsuspensionen i fil-30 treret PBS blev fremstillet i rene 6 x 50 mm prøverør. Lysspredningsmålinger blev udført med en NiComp partik-kelmålermodel TC-200 med beregnende autocorrelator. Instrumentet er forsynet med en 64 kanals 4-bit autocorrelator og en 5 mW He-Ne laser med lav støj.

6

DK 164483 B

Eksempel I

Små unilamellare vesicler (SUV),som udgjordes af DSPC og Chol i molforholdet 2 til 1, blev fremstillet efter den beskrevne metode. 14C-Cholesterololeat blev 5 inkluderet som lipidmarkør. Efter behandling med ultralyd, annealing, og centrifugering ved lav hastighed, blev vesiclerne blandet med enten gelatine eller agarose i en steriliseret flaske til en slutkoncentration på (1) 10 mg SUV pr. ml 1%'s gelatineopløsning, (2) 35 mg SUV 10 pr. ml 1%‘s gelatineopløsning eller (3) 10 mg SUV pr. ml 1%'s agaroseopløsning. Alle flaskerne blev derpå henstillet i et køleskab ved 4°C. På forskellige tids- ' punkter efter fremstillingen blev prøver af vesicler med forskellig koncentration eller forskelligt polymermedium 15 smeltet ved stuetemperatur. Fortyndede prøver af disse vesicler i PBS blev fremstillet, og størrelsen blev målt ved laserlys-spredning, som beskrevet ovenfor. Som det fremgår af tegningen, forblev størrelsen uændret, når vesiclerne blev opbevaret enten i gelatine- eller agaro-20 sematrixen. I modsætning hertil skete der en sammenklumpning og forening af vesiclerne i PBS i løbet af kort tid efter fremstillingen.

25 Eksempel II

I det foregående eksempel blev det vist, at ve-siclernes størrelse forbliver uændret i lang tid i en polymermatrix. Det er imidlertid også meget vigtigt, set fra et farmakologisk synspunkt, at liposomerne be-30 varer det materiale, de har indesluttet inde i vesiclen under en rimelig lang opbevaringstid. Dette eksempel viser, at der ikke sker nogen udstrømning af indesluttet materiale fra vesicler i et 1%'s gelatinemedium ved 4°C.

1 mM 14C-EDTA i PBS blev ultralydbehandlet med 35 DSPC og Chol (2:1), som var mærket med en spormængde 3H-

DK 164483 B

7 cholesterololeat. Den fri ikke-indkapslede EDTA blev fraskilt fra det indesluttede materiale ved passage gennem en Sephadex G-50 kolonne. SUV, som havde indesluttet 14C-EDTA blev derpå blandet med gelatine til en 5 slutkoncentration på 10 mg/ml i en 1%’s gelatineopløsning, som blev henstillet ved 4°c. Udstrømning af indesluttet EDTA som funktion af tiden, kan bestemmes ud fra formindskelsen af forholdet mellem 14C og 3H. Som vist i tabel I forbliver ikke alene kun størrelsen af vesic-10 lerne uændret, men materialet inde i vesicelstrukturen forbliver indesluttet under opbevaringen.

TABEL I

15 Stabiliseringsvirkning af gelatine på størrel- sen og på indkapslet materiale i vesiclerne Døgn efter

fremstilling Størrelse Å 14C/3H

20 0 867 0,143 3 888 0,154 7 888 0,147 9 880 0,157 43 881 0,157 25

Eksempel III

Til yderligere illustrering af de fysiske egenskaber af vesicler efter lagring, blev vesicler, som 30 havde været opbevaret i gelmatrix forsynet med radioaktivt -’-•^In. Der blev anvendt et γ-strålings"perturbed angular coincidence"-spektrometer (PAC) til måling af i hvor høj grad vesiclerne var intakte efter at være forsynet med det radioaktive stof, Kwang K.J. & Mauk M.R., 35 Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA., 74, 4991 (1977); og Meares C.F. & Westmoreland D.G., Cold Spring Harbor Symp.

8

DK 164483 B

Quart. Biol., 36, 511 (1971). Spektrometret måler rotationskorrelationstiden for 111In, hvilken korrelationstid er relateret til radionucleidets "tumbling rate".

Når li;LIn er indkapslet i vesiclerne, har det en stor 5 "tumbling rate" (G22) som følge af dets binding til den lille chelator inden i vesiclen. Når vesiclen imidlertid er beskadiget (f.eks. ved beskadigelse ved tilsætning af isopropanol) eller det indesluttede materiale siver ud fra vesiclen af andre årsager, bindes det til 10 protein, som måtte være til stede i omgivelserne, hvilket i høj grad nedsætter "tumbling rate". Det fremgår af nedenstånde resultater, at vesicler af DSPC og Chol (2:1), som har været opbevaret i henholdsvis 1 og i 20 døgn i 1% gel ved 4°C, har egenskaber, som kan sammen-15 lignes med friskt fremstillede vesicler efter indførelse af 1;L1ln. G22 forbliver den samme med og uden serum, hvilket indicerer, at langvarig opbevaring ikke har skadelig virkning på vesiclernes membran.

20 TABEL· II (G22) 1 døgn gamle 20 døgn gamle friskt vesicler op- vesicler op- fremstilbevaret i 1% bevaret i 1% let vesic-25 gel ved 4°C gel ved 4°C ler_

Vesicel + PBS 0,44 0,46 0,45

Vesicel + serum 0,48 0,46 0,44

Vesicel + serum 30 + isopropanol 0,1 0,06 0,09

Eksempel IV

For at vise betydningen af opretholdelse af ve-35 sicelstørrelse blev biofordelingen af disse lagrede vesicler undersøgt i mus med tumor. DSPC, Chol (2:1) ve- 9

UK Ib^HRSJ D

sider, indkapslet med et lmM NTA blev opbevaret i en 1%'s gelatineopløsning ved 4°C. På bestemte tidspunkter efter fremstillingen blev gelmatrixen smeltet ved stuetemperatur. Vesiderne, som var suspenderet i denne 5 vandige opløsning blev derpå forsynet med radioaktiv komponent som beskrevet ovenfor. Derefter blev 1 mg af disse vesider injiceret intravenøst i BDFl-mus med en 6-8 døgn gammel Lewis lungecarcinoma. Musene blev derpå aflivet 24 timer efter injektion. Ved γ-tælling blev 10 biofordelingen af de injicerede vesicler beregnet som mængden af radioaktivitet pr. g væv. Biofordelingen af disse lagrede vesicler blev sammenlignet med biofordelingen af friskt fremstillede vesicler i samme stamme af mus. Ingen signifikant forskel (Student t test, p 15 0,001) blev fundet mellem friskt fremstillede vesicler og vesicler i gelatine, som det fremgår af tabel III.

DK 164483 B

10 .Η in ^ cn m co

O) o cn o O

M +1 +[ +1 +1 £ cd r-' co σ> 52 f- 10 co oo * * * « ^ in ro ^

i—li—I i—i i-I

l"* CN f- "tf . vo in in vo in ' o μ m h cm h c Zj +i +i +i +i r j cn cn CO m 5 ‘3 in oo oo ro y ^ ^ S in <T> H ro

£ > -* H CN CN

fU

•H t> k Di

<D

n i2 CO 10 ro CO

•k m in o rW CO

m ,§ «j in co cm' h ® ^ ® +i +i +i +i

> > CO C- CO CN

® ro n- in *ϋ U H VO 'si4 CV3 h <U Φ ro ro ro ro

Η Ή U

w ω -H

(¾ -n

id C

J X -H

Ti WC <Si> *H i—I Ό CM Γ-' w CO ro CO -tf <c .

^ eh Q) cm ro CD "er S Di +i +i +i +i

Eh I C r-i iH VO lO

C 3 O ro co cm H tJ ·. * * * CO ^ Γ-

^k i*) i—I i—I iH

id • Di G ih n- -et* σ> •η m o o H ^ ^ D G "d* cn cm m

Ti O +i +i +i +i k g CN 00 CN Γ"

O 3 co in co H

c« - o σ> H r- ro

•H Γ-f CM CN CN

ffl Φ

G

I -H

I g Cnl G -P

M-l <U C! Φ G

Φ k -H fl H

lu iH DO) G H ^ Dl

Dl k -H

Ό. <U H o r-~ 00 o Q H in cn m

DK 164483 B

11

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der som gelmatrix anvendes et vilkårligt af et antal polymere materialer omfattende naturlige og syntetiske materialer. Som eksempler kan nævnes polysaccharider, såsom 5 gummi arabicum, ethylcellulose, hydrolyseret stivelse og natriumalginat, polypeptider og polyestre syntetiseret ud fra lactid eller syre, poly(β-hydroxybutyrat), poly-(DL-lactid-co-glycolid). I de foregående eksempler eksemplificerer aggarose egnede polysaccharider, medens 10 gelatine eksemplificerer egnede polypeptider. Andre polymere gelmaterialer kan anvendes, når blot det specielle materiale er i stand til at danne den ønskede beskyttende geloverflade rundt om de micellulære partiker ved lave temperaturer og omdannes til en væske, f.eks. ved 15 smeltning ved temperaturer nær stuetemperatur eller ved højere temperaturer til dannelse af en vandig suspension. Selv om anvendelse af en gelmatrix, som er i stand til en sådan transformation ved smeltning foretrækkes, vil det være klart, at sådanne materialer, som 20 er i stand til at undergå den nævnte transformation ved hjælp af andre foranstaltninger, f.eks. ved enzymatisk virkning, også kan anvendes.

Selv om mængden af gel i opløsningen eller matrixen er mindre afgørende for opnåelse af den ønskede 25 stabilisering af partiklerne, er den i høj grad bestemmende for den temperatur, ved hvilken gelmatrixen dannes. således vil f.eks. en gelopløsning med ca. 1% gelindhold størkne ved ca. 4°C, medens en 10%'s gelopløsning størkner ved ca. stuetemperatur. Ud fra sådanne 30 overvejelser vil gelmatrixen typisk være en opløsning af fra ca. 0,5 vægt% til ca. 10 vægt% gel, idet 1-5 vægt% udgør det foretrukne område.

Som nævnt ovenfor kan et vilkårligt blandt flere therapeutiske midler indesluttes i de micellulære par-35 tikler. Som eksempler på therapeutiske midler kan nævnes antibiotika, stofskifteregulatorer, immunmodulato-

Claims (6)

10 Ved at suspendere partiklerne i en polymer gelmatrix til dannelse af en beskyttende geloverflade rundt om partiklerne, undgås sammenklumpning eller sammensmeltning af partiklerne, uden at vesiclernes anvendelsesmuligheder begrænses, eller at der sker udstrømning af indesluttet 15 materiale.

1. Fremgangsmåde til opbevaring af phospholipid 20 liposomer, kendetegnet ved, at man suspenderer liposomerne i en farmaceutisk acceptabel polymer gelopløsning til dannelse af en suspension med en beskyttende geloverflade rundt om liposomerne og afkøler suspensionen til dannelse af en gelmatrix som begrænser 25 bevægelsen af liposomerne; opvarmer gelmatrixen til mindst ca. stuetemperatur, hvorved gelmatrixen omdannes til en vandig suspension egnet til anvendelse.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at gelmatrixen er polysaccarid eller poly- 30 peptid.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegne t ved, at gelmatrixen er gelatine eller agarose.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at et terapeutisk virkende middel er inde- 35 sluttet i phospholipid liposomerne.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at gelmatrixen er en opløsning, indeholdende fra ca. 0,5 til ca. 10 vægt% gel. DK 164483 B

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at gelmatrixen indeholder fra ca. 1 til ca. 5 vægt% gel.