JPH0687895A - 可溶性、低密度リポ蛋白質レセプター及びその調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 遺伝子フラグメント及びＬＤＬに対して親和
性を有しそれを認識し、しかも水性溶液に可溶性である
ＬＤＬレセプターフラグメントを有意の量生産し蓄積す
ることができる蛋白質フラグメント及びその製造方法を
提供する。 【構成】 膜スパンニングドメインを含まない低密度の
リポ蛋白質レセプター遺伝子の端を切り取った形をコー
ドする蛋白質をコードする配列を含んでなるヌクレオチ
ド配列を生成させ、かつホストの細胞中で蛋白質をコー
ドする配列を発現するのに有効な調節配列を隣接させ、
ホストの細胞中にヌクレオチド配列を形質転換し、その
細胞を蛋白質を生産するのに好適な条件下の培地中で培
養し、そしてその中に蛋白質フラグメントを有する培養
した細胞から培地を回収する各工程を含んでなる非相同
の真核ホスト中の低密度のリポ蛋白質への親和性を有す
る水に可溶性の蛋白質フラグメントを調製する方法及び
それにより得られた蛋白質フラグメントを含んでなる組
成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は分子生物学の一般的な分
野に関し、より詳しくは治療及び研究用に有用な蛋白質
フラグメント（断片）を生成する新規な遺伝子フラグメ
ントの分離及び利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】コレステロールは動物細胞の膜中で主要
な機能を有しているから動物体内に豊富にある物質であ
る。コレステロールは水溶液にほぼ完全に溶解しない。
それゆえ膜以外の体内でコレステロールは水性環境に曝
されないよう注意深く分離されねばならない。従って、
多細胞生物体内で、コレステロールはプラズマ（血漿）
リポ蛋白質の疎水性のコア内に包まれて体内を輸送され
る。ヒトの種々のプラズマリポ蛋白質は主として浮遊密
度によって４つの主要なクラスに分類されてきた。その
４つの主要クラスは非常に低密度のリポ蛋白質（ＶＬＤ
Ｌ）、中密度のリポ蛋白質（ＩＤＬ）、低密度のリポ蛋
白質（ＬＤＬ）及び高密度のリポ蛋白質（ＨＤＬ）であ
る。リポ蛋白質の第五のクラスは摂食後にのみ生成する
キロミクロンである。ヒトのプラズマ中で最も豊富なコ
レステロール担体リポ蛋白質はＬＤＬクラスであり、血
液プラズマ中を循環するＬＤＬの高レベルは動脈硬化及
び冠動脈異常に関係している。それゆえ、血液流からＬ
ＤＬを一掃する機構は重要な研究課題であった。

【０００３】高等動物において、ＬＤＬは動物細胞の細
胞膜上に位置したレセプターによって血液流から捕捉さ
れる。そのレセプターはＬＤＬレセプターとして公知で
ある。ＬＤＬレセプターの構造は一般的に記述されてお
り、レセプターを生産するための遺伝子暗号は単離され
ており、配列決定されている。ＬＤＬレセプターの記
述、その構造及び他の細胞プロセスとの相互作用におけ
る一般的な機能性についてはシュナイダー、バイオ．エ
ト．バイオフィジ．アクタ．(Schneider, Bio. Et. Bio
phys. Acta.)，９８８，３０７〜３１７頁（１９８９）
及びホッブスら、アニュアル．レビュー．ジェネテ．(H
obbs, et al. Annu. Rev. Genet.) ，２４，１３３〜１
７０頁（１９９０）に見いだすことができる。ＬＤＬレ
セプター蛋白質はリポ蛋白質のエンドサイトーシス（飲
食作用）を仲介することによってプラズマコレステロー
ルを調節する細胞表面糖蛋白質である。ヒトのＬＤＬレ
セプターは長さ５．３ｋｂのｍＲＮＡの転写を作動させ
る遺伝子によってエンコードされた８６０アミノ酸の蛋
白質である。ヒトのＬＤＬレセプター遺伝子のｍＲＮＡ
は蛋白質のプラズマ膜への輸送を作動させ、その蛋白質
の成熟形から切断されるシグナルのペプチドとともに長
さ３’の未翻訳の領域を含む。

【０００４】ＬＤＬレセプター蛋白質は一般に５つの異
なったドメインないし領域を有することで特徴づけられ
てきた。配位子結合ドメインと呼ばれる１つの領域は一
般に、レセプターによって結合される２つの公知の蛋白
質、ＬＤＬの優位を占める糖蛋白質である５５０ｋｄ糖
蛋白質のＡｐｏＢ−１００及びＩＤＬ中の複数のコピー
（複写）中に見いだされ、ＨＤＬのサブクラスである３
４ｋｄ蛋白質のＡｐｏＥに対するレセプターの親和性に
関係している。成熟ＬＤＬレセプター蛋白質中の他のド
メインは配位子親和性は特に必要でないが、ＬＤＬレセ
プターの細胞外部リポ蛋白質への表示に役割を演じると
考えられるＥＧＦ（表皮成長因子）前駆体同族体領域を
含む。ＬＤＬレセプターの第三のドメインはクラスター
（集塊）化した０−結合糖質鎖を含む領域である。高度
に疎水性の２２アミノ酸の膜スパンニング領域は蛋白質
の膜結合性質に対応する。蛋白質のカルボキシル端には
細胞質中へ伸びる５０アミノ酸のドメインがある。

【０００５】ヒトのＬＤＬレセプター遺伝子及びヒトの
ＬＤＬレセプター蛋白質は広範囲に研究されてきたが、
この研究は困難なものであって、時には至難のプロセス
であった。この研究の困難な理由の１つは大量のＬＤＬ
レセプター蛋白質自体を単離し利用することが研究者に
とって不可能であったことである。その蛋白質は動物細
胞においてはかなりの量生産されるが、それは膜に結合
しており、おそらく水性溶液に不溶性である。したがっ
て、哺乳類動物の組織から何らかの意味がある量のレセ
プター蛋白質を分離することは困難である。加えて、膜
に対する親和性が非常に強いから、ヒトのＬＤＬレセプ
ター蛋白質を非相同ホスト中に発現すること及び蛋白質
の純粋な量を分離することはその発現システム中で膜に
関係する蛋白質の強い傾向により困難である。加えて、
蛋白質は特にシステインが豊富で複数のジスルフィド結
合を含む配位子結合ドメインにおいて複雑な三次元構造
を有している。蛋白質の三次元構造はレセプターのＬＤ
Ｌへの親和性にとってきわめて重要であるから、正しい
三次元構造での結果となるように翻訳後に蛋白質を適切
に処理しないホスト中の蛋白質の生産は機能的なレセプ
ター蛋白質を生じないであろう。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明はヒトのＬＤＬ
レセプター遺伝子の端を切り取った部分が培養中の昆虫
の細胞の中に天然のレセプターが親和性を有するＬＤＬ
と結合し、特異的な親和性を有するＬＤＬレセプター蛋
白質の端を切り取られた水溶性の形を作るよう発現する
ことができるよう同定できたことに要約される。

【０００７】本発明の目的は遺伝子フラグメント及びＬ
ＤＬに対して親和性を有しそれを認識し、しかも水性溶
液に可溶性であるＬＤＬレセプターフラグメントを有意
の量生産し蓄積することができるこのフラグメントから
生産される遺伝子フラグメント及び蛋白質について説明
することである。本発明のもう１つの目的は治療価値の
可能性のある新規な物質、特にヒト系において可能な臨
床的、診断的、及び研究的用途用に非相同ホスト中に生
産されることができる可溶性ＬＤＬレセプター蛋白質フ
ラグメントを提供することである。

【０００８】本発明のさらなる目的はレセプターとその
目標分子間の相互作用をさらに研究するためのさらなる
研究目的に使用可能なよう非相同ホスト中に多量にＬＤ
Ｌレセプターの活性部分を作り出すことができる機構を
明瞭にし、説明することである。本発明のなおもう１つ
の目的はここに記載される水溶性のＬＤＬレセプターフ
ラグメントの発現によって可能にされる可能な実際的応
用を説明することである。本発明のその他の目的、利
点、特徴は添付の図面と関連させて以下の説明により明
らかにされよう。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、ヒトの
低密度リポ蛋白質レセプター（ＬＤＬ−Ｒ）の遺伝子の
端を切り取った部分が天然ＬＤＬレセプターの結合特異
性を保持するＬＤＬレセプターの可溶性形を生産できる
ことが発見された。この端を切り取った遺伝子の培養中
の昆虫細胞中での発現の結果は立体配座的に正しいと考
えられ、かつ水性溶液に可溶性であるけれどもＬＤＬ結
合に用いることができるようにＬＤＬ蛋白質に対して正
常な特異性を示す端を切り取ったＬＤＬレセプター蛋白
質が生産された。

【００１０】本発明の機構は、まず現在最も良く理解さ
れているＬＤＬレセプター及びその蛋白質を構成する種
々のドメインの説明図である図１を参照すれば最上に理
解されよう。ＬＤＬレセプター蛋白質の機能的なドメイ
ンはその他の蛋白質への相同性によって、またブラウン
とゴールドスタイン(Brown and Goldstein) によって広
く研究されたヒト集団中に見出される蛋白質の天然に発
生する突然変異体の発現型によって同定されている。成
熟蛋白質の５つのドメインが特性化されている。その第
一は配位子結合に関係し、図１で配位子結合ドメインと
示されているＮ−末端システイン豊富ドメインである。
蛋白質の次の領域は表皮増殖因子（ＥＧＦ）前駆体に相
同性を有する領域である。ＥＧＦ前駆体相同性ドメイン
はレセプター再循環中にレセプターからリポ蛋白質の酸
依存性分離に必要とされ、またＬＤＬを細胞表面に結合
できるよう配位子結合ドメインを配置する作用がある。
蛋白質の第三のドメインはＯ−結合炭水化物の豊富な領
域である。蛋白質の次の領域は動物細胞膜への結合に原
因となる蛋白質の一部であり極度に疎水性である膜スパ
ンニングドメインである。蛋白質のカルボキシル最末端
にある細胞質ドメインが蛋白質領域群を完了させる。

【００１１】ＬＤＬの不完全な結合に関係するヒトのレ
セプター中の事実上すべての多形性現象は末端のＮ−末
端システイン豊富ドメインに存在することは以前から知
られている。エッセルら(Esser, et al.) （ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Che
m.)２６３：２６，１３２８２−１３２９０頁（１９８
８）及びラッセルら(Russell, et al.) （ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)
２６４：３６，２１６８２−２１６８８頁（１９８９）
により行われたＬＤＬレセプターの変異原性分析による
と、配位子結合ドメインの特徴である７つの不完全反復
すべてがＬＤＬ配位子に最適結合する必要ないし少なく
ともそれに含まれることが明白である。図１でＡ及びＢ
として示される２つの付加的不完全反復もまたＥＧＦ前
駆体相同性ドメイン中に見いだされる。同様の変異原性
分析から反復Ａもまた最適配位子結合を容易にすると考
えられる。

【００１２】この知識に基いて、完全な長さのＬＤＬレ
セプター遺伝子を端を切り取って、配位子結合ドメイン
の１から７までのすべての反復プラスＥＧＦ前駆体相同
性ドメイン領域中の反復Ａの発現を含むであろう蛋白質
のアミノ末端部分をコードする蛋白質をコードする配列
を分離することの試みが決定された。もし、この端を切
り取った遺伝子を発現するホスト細胞が端を切り取った
蛋白質生成物の正しい折りたたみを促進することができ
るならば、その端を切り取った生成物がそのＬＤＬ結合
能力を保持することが可能である。さらに、膜スパンニ
ングドメインを除外することは恐らく生成蛋白質の分泌
をもたらすであろう。この試みより以前は配座的に正し
い配位子結合ドメインが天然の蛋白質の残余の分なしで
製造されるかどうかは不明であった。複合蛋白質の正し
い構造の形成はまだよく知られていない。

【００１３】膜スパンニングと細胞質ドメインの欠けた
ＬＤＬレセプターの天然発生突然変異は膜の上にすべて
の端を切り取ったレセプターを配置せずに端を切り取っ
たレセプターの部分的な分泌をもたらすことは従来知ら
れていた。しかしながら、この細胞外の変異レセプター
の生物学的活性が失われるかどうかは知られていなかっ
た。商品として入手できるＬＤＬレセプターｃＤＮＡク
ローン中に制限エンドヌクレアーゼ酵素切断サイトを利
用することにより、ヒトＬＤＬ−Ｒ蛋白質の成熟形の最
初の３５４アミノ酸をコード化する遺伝子フラグメント
を調製することができた。ここでＬＤＬ−Ｒ³⁵⁴ と呼ぶ
このようにして作られたポリペプチドは異種のホスト中
に製造することができ、ＬＤＬ分子に対する特異性を保
持している。ＬＤＬ−Ｒ³⁵⁴ はまた水性溶液に可溶性で
あり、それゆえＬＤＬ結合の研究に単独の用途を持つて
いる。

【００１４】あとで説明するように、ＬＤＬ−Ｒ³⁵⁴ を
コードする端を切り取ったＬＤＬレセプター遺伝子フラ
グメントは組換えバクロウイルス(vaculovirus) の使用
により培養中に成育した昆虫細胞中に導入された。一般
に真核細胞、特に昆虫の細胞の利用は相当な量のレセプ
ター結合可溶性蛋白質の製造を成功させる重要な因子で
あると考えられている。レセプターの配座構造はそのＬ
ＤＬ蛋白質との結合能力に臨界的であるから、もしポリ
ペプチドが非相同ホスト細胞中で正常に折りたたまれた
生成物を得るような方法で生産され得なかったなら、有
効な結合は不可能であろう。他の真核ホスト細胞システ
ムが同じ蛋白質フラグメントを生産する結果となること
は同様である。しかしながら、正常な配座特性の蛋白質
の生産されることは特に端を切り取った形の蛋白質では
予測できないから、配座的に正常なレセプター、すなわ
ち目標の分子に親和性を有するレセプターがどのホスト
内に生産され得るかは予め知られていなかった。にもか
かわらず、ここに発現する蛋白質フラグメントの構造は
正常と思われる。この特殊な端の切り取りは、ごく最初
の反復配列のアミノ末端の欠損が可能なことを除いて、
恐らく活性な蛋白質を生産する最小限の切り取りである
と考えることにも理由がある。より激しくないその他の
端の切り取りもまた同様に、ここに示した証拠に基づい
て，配座的に正しい蛋白質フラグメントを発現する。配
位子結合に悪影響することなくより大きい端の切り取り
をＥＧＦ前駆体同族体領域に含ませることができるが、
天然の遺伝子から疎水性膜スパンニングドメインを含ま
せるべきではない。

【００１５】ヒトのＬＤＬレセプターのｃＤＮＡは従来
他の人によって分離され、配列決定され、公表されてい
る。５．３ｋｂｃＤＮＡのコピーが他の人によってＡＴ
ＣＣに寄託されており、アクセス番号５７００４で大腸
菌（E. coli ）中にホストされている。そのベクターか
ら、臨界的なアミノ末端３５４アミノ酸ポリペプチドを
エンコードする領域を以下に説明するのと同様の操作に
よって容易に単離することができる。

【００１６】端を切り取ったＬＤＬレセプターの応用 端を切り取ったＬＤＬレセプター蛋白質の用途の１つの
範疇は診断用である。現在用いられているヒトの血清Ｌ
ＤＬレベルの診断用検定は沈降性ポリアニオンを用いＶ
ＬＤＬでＬＤＬを沈殿させることに基く間接評価法で行
われる。ＶＬＤＬ中のコレステロールの量は合計したプ
ラズマトリグリセライドを５で割ることにより評価され
る。この方法は単にＬＤＬコレステロールを評価するも
ので、ＬＤＬ粒子を多数有する患者を識別することがで
きず、適度の高コレステロール血症のみ識別する。何故
ならば、それらのＬＤＬ粒子は単に標準よりも小さく、
粒子当たりのコレステロールが少ないからである。これ
らの患者は、いくつかのデータが暗示するように、より
小さいＬＤＬ粒子が実際により大きい粒子よりもアテロ
ーム形成性（atherogenic ）であってもより危険状態で
あるかも知れない。したがって、ＬＤＬの蛋白質及び脂
質の含有量のどちらかもしくは両方を測定する方法が非
常に強く望まれる。脂質及び蛋白質の両方についての情
報は臨床的に有用な指示となると考えられるＬＤＬ粒子
の平均サイズについてなされる評価を可能にするであろ
う。ここに述べる端を切り取ったＬＤＬレセプターは真
の蛋白質レベル及び／またはＬＤＬ粒子の数を確認する
血液または血清に対する結合検定に使用することができ
た。

【００１７】血液からのａｐｏＢを含有するリポ蛋白質
粒子を特異的に捕捉する方法のもう１つの可能な利点は
リポ蛋白質（Ｌｐ）（ａ）またはＬｐ（ａ）の定量の可
能性である。Ｌｐ（ａ）は主要なＬＤＬ蛋白質（ａｐｏ
Ｂ）に共有結合した蛋白質であり、Ｌｐ（ａ）のプラズ
マレベルは心臓病に強い相関関係を有していることが証
明されている。Ｌｐ（ａ）のプラズマレベルは極度に変
動的であるとともに完全に遺伝的因子によって決まると
考えられ、Ｌｐ（ａ）のレベルはそのサイズが２０倍に
及んで変動することがある蛋白質生成物に影響する。最
近血清Ｌｐ（ａ）の定量に用いられる免疫検定は絶対的
（すなわちサイズに無関係な）定量には価値がない。こ
こに述べるＬＤＬレセプターの使用による結合ＬＤＬ用
のプロトコル(protocol)の開発はＬｐ（ａ）がジスルフ
ィド結合を破壊する還元剤にってａｐｏＢから容易に離
脱するからＬｐ（ａ）を測定可能にするであろう。

【００１８】可溶性ＬＤＬレセプターのもう１つの用途
は研究または臨床目的のプラズマＬＤＬの分離に用いる
ことであろう。現在ＬＤＬは分離用超遠心分離によって
分離されるが、この方法は非常に経費高であり、連続超
遠心分離時間に６日間を要する。この端を切り取ったレ
セプターに基くＬＤＬ分離に商業的に入手できる方法ま
たはキットは、そのレセプターが特にＶＬＤＬ上でなく
ＬＤＬ上のみのａｐｏＢを認識するから、ＬＤＬ研究者
の間で普及するであろう。ａｐｏＢの抗体よりも親和性
選択について端を切り取ったＬＤＬレセプターの使用の
有利な特徴はこのＬＤＬへの選択性とともに、ＬＤＬ−
ＬＤＬレセプター親和力が非常に高いけれども、その親
和力はカルシウム依存性でありＥＤＴＡのようなキレー
ト剤の使用により容易に消散され得るという事実であ
る。ａｐｏＢの抗体は非常に過酷な溶離条件を必要とす
る。

【００１９】このレセプターのよりめざましいもう１つ
の可能な用途は本質的にＬＤＬについての血液ろ過であ
ろう。多量に生産された固定化端切り取りＬＤＬレセプ
ターはカラムまたはカートリッジ中に固定化され、その
中に患者の血液を通過させて血液から特異的にＬＤＬを
除去することができる。カラムまたはカートリッジはＬ
ＤＬを溶離させることにより再生できる。この治療法は
特に、常に高脂血症に悩まされ既にその血液が正規のベ
ースで透析されている腎臓透析患者に適用できると考え
られる。

【００２０】また、発現された蛋白質フラグメントの分
泌を調節するその他代わりのＬＤＬ−Ｒ³⁵⁴ 発現ベクタ
ーを組み立てることも可能である。成熟蛋白質は最初
に、蛋白質を生産する細胞のプラズマ膜へ未成熟形の蛋
白質の輸送をひきおこすシグナルペプチドとともに生産
されるから、同様のシグナルペプチド法をここに述べる
端を切り取った形の蛋白質の分泌を引き起こすのに使用
できることを期待する理由がある。

【００２１】

【実施例】遺伝子の組み立て ＬＤＬ−Ｒ³⁵⁴ ポリペプチドについてのコードする配列
の組み立てはｐＲＧＬＤＬＲ−１３と呼ぶベクターで開
始した。これは他の人によってＡＴＴＣにアクセス番号
５７００４として寄託されたプラスミドｐＬＤＬＲ３か
らの１３１７塩基対ＸｂａＩ、ＲｓａＩフラグメントか
らなる。このようにベクターｐＲＧＬＤＬＲ−１３は、
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＭ１３⁺ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）３’−５’配向のＥｃｏＲＶサイト中へ鈍い端末連
結反応(blunt end ligation)によって挿入されたＬＤＬ
レセプターの最初の４２５アミノ酸をコード化した配列
を含む。１４塩基対オリゴヌクレオチド（ＣＴＡＧＴＣ
ＴＡＧＡＣＴＡＧ，ニューイングランド・バイオラブ
ス）をｐＲＧＬＤＬＲ−１３中の非反復ＥｃｏＲＶサイ
トへ挿入することによってすべての読み枠中の翻訳終止
コドンを導入するのに用いた。ＥｃｏＲＶサイトはＬＤ
Ｌ−Ｒ ｃＤＮＡのヌクレオチド１０７６に相当する。
得られたプラスミドはｐＤＬ−ＬＤＬＲと呼んだ。ｐＤ
Ｌ−ＬＤＬＲからのほぼ１３１７−ｂｐのＬＤＬ−Ｒフ
ラグメントの５’及び３’端末はＤＮＡ配列分析によっ
て確認した。翻訳停止コドンは予測された読み枠中に存
在した。次に、ｐＤＬ−ＬＤＬＲの１１００ｐｂ・Ｂａ
ｍＨＩフラグメントを、ＢａｍＨＩで消化しアルカリフ
ォスファターゼで処理したプラスミドｐＡｃＹＭ１のコ
ピーと結合した。ｐＡｃＹＭ１の詳細はマツウラらジェ
ー・ジェン・ビロル(Matsuura et al. J. Gen. Virol.)
６８：１２３３−１２５０（１９８７）に記載されてい
る。その結果組み立てられたものをｐＡｃＬＤＬ−Ｒ
³⁵⁴ と呼ぶ。このようにこの転移ベクターはオートグラ
ファ・カリフォルニカ(Autographa Californica)多面遺
伝子（polyhedrin gene ）からの５’及び３’配列から
なっている。その多面遺伝子は、ヒトのＬＤＬレセプタ
ーの最初の３５４残基をコード化し、次いでオリゴヌク
レオチド挿入によってペプチドのカルボキシル端末へ導
入された２つのアミノ酸（ロイシン及びバリン）を付加
したヌクレオチドの配列をコ−ード化した蛋白質に隣接
するものである。

【００２２】組換えバクロウイルスの生産 上記のようにして組み立てたプラスミドｐＡｃＬＤＬ−
Ｒ³⁵⁴ のコピーをスポドプテラ・フルキペルダ(Spodopt
era fruqiperda) Ｓｆ−２１細胞中へ野生型のバクロウ
イルスゲノム（ＡｃＮＰＶ）とともに共移入した。端を
切り取ったＬＤＬレセプターの配列をかくまった組換え
ウイルス（ＡｃＮＰＶ−Ｒ³⁵⁴ ）を選択し、プラーク精
製して、サマースら、「バクロウイルスベクター及び昆
虫細胞培養操作方法マニュアル」(Summers et al., A m
anual of Methods for Baculovirus Vectors and Insec
t Cell Culture Procedures, Tex. Agric. Exp. Stn. B
ull. (1987))及びミラーら、ジェネティック・エンジニ
アリング(Miller et al.,in Genetic Engineering, Ple
num, New York, pp. 277-298 (1986)) に記載のように
タイター(titer) した。組換えウイルス（ＡｃＮＰＶ−
Ｒ³⁵⁴ ）をオートグラファ・カリフォルニカ多面遺伝子
の５’及び３’配列にオリゴヌクレオチド同族体を増幅
することを利用するポリメラーゼ鎖反応の鋳型として用
いた。得られた増幅生成物は予測された組換え体(even
t) と一致するサイズであった。

【００２３】培養した昆虫細胞の移入及び蛋白質の回収 組換えバクロウイルスを次に培養中のＳＦ−２１の細胞
を感染させるのに使用した。多量の組換えバクロウイル
スを４ｘ１０⁶ のＳＦ−２１細胞の皿の上へ感染多重度
４で感染させた。ＴＣＡ沈降培地中で組換えバクロウイ
ルスで感染５２時間後の感染細胞から２ミリリットルの
ＳＦ−９００（Ｇｉｂｃｏ）培地を収穫し、６０μｇの
蛋白質を得た。培地試料をドデシルスルホン酸ナトリウ
ム、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）にかけた。その際ベータ−メルカプトエタノールの
存在下または不在下で、６％濃縮度での１３．３％のア
クリルアミド溶解ゲルの非還元性ゲル及び４．５％濃縮
度での１０％のアクリルアミド溶解ゲルの還元性ゲルを
用いた。免疫ブロットは抗−ヒトＬＤＲ−Ｒモノクロナ
ール抗体Ｃ７及びアルカリリン酸塩−共役ヤギ抗−マウ
スＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。

【００２４】結合実験 移入ＳＦ−２１細胞からの培地を感染５２時間後に集
め、ｐＨ７．４でＰＢＳに対して透析した。別に、従来
ヒトＬＤＬレセプターをオーバーエキスプレス (overex
press)することが証明されているＣＨＯ細胞［系統ＴＲ
７１５−１９］をハムス(Hams)栄養素混合物Ｆ−１２
（Ｇｉｂｃｏ）、２０ｍＭヘペス(Hepes) 、ｐＨ７．
２、１％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清、４％（Ｖ／Ｖ）リポ
蛋白質欠乏血清（ＬＤＳ）、２ｍＭグルタミン及び１０
０単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプト
マイシンを含む中で成育した。使用する１２時間前に集
密的細胞をハムスＦ−１２、２０ｍＭのヘペスｐＨ７．
２、５％ＬＤＳ、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌ
のペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシ
ン、１０μｇ／ｍｌのコレステロール及び０．１μｇ／
ｍｌの２５−ヒドロキシコレステロールを含む培地中に
移した。指示濃度の透析組織培養蛋白質（濃度はローリ
イ(Lowry) 検定変法によって求めた）を２ｍｌのハムス
Ｆ−１２、２０ｍＭのヘペス、ｐＨ７．２、及び５ｍｇ
／ｍｌのウシ血清アルブミン中の１．０μｇの［¹²⁵
Ｉ］−ＬＤＬとともに室温で９０分間温置した。試料を
４℃に平衡化し、ＣＨＯ細胞へ添加した。細胞を回転振
とう機上、４℃で３時間温置してから洗浄し、デキスト
リン硫酸塩により結合［¹²⁵ Ｉ］−ＬＤＬを離脱させ
た。ＬＤＬの放射線ヨウ素化は、例えばチェコビッチら
のバイオケミストリー(Checovich etal., Biochem.)，
２７：１９３４（１９８８）に既に記載の方法により行
った。

【００２５】図３に示す結果はＬＤＬレセプターを発現
する細胞の存在下で放射線標識ＬＤＬと温置した培養培
地の濃度上昇に対するＬＤＬ−Ｒ³⁵⁴ のＬＤＬに対する
特異結合能力が実証されている。細胞を発現する端を切
り取ったレセプターの培地からの濃度上昇蛋白質の存在
下における放射線標識ＬＤＬに伴う細胞の減少は、培地
中の蛋白質フラグメントによって結合する競争ＬＤＬ結
合を実証した。同様の厳しさの競争は野生型ウイルス感
染細胞からの同等の蛋白質濃度では観察されなかった。

【００２６】上記のように行われたブロット免疫検定の
これらの結果は、培養から抽出された培地に含有されＬ
ＤＬ−Ｒの特定のモノクロナール抗体Ｃ７によって認識
されたから、上記のように感染された昆虫細胞中で生産
されたペプチドフラグメントが分泌されることを示す。
さらに、競争結合検定は、ＣＨＯ細胞中に生産された天
然の膜−結合ＬＤＬレセプターと少なくとも競争する特
異性でフラグメントが正常にＬＤＬ分子と結合すること
を示す。このように、初めてＬＤＬレセプターの可溶性
体が創造され、そして非膜結合研究、診断及び治療用途
に使用することができるようになった。

【００２７】

【発明の効果】本発明によれば遺伝子フラグメント及び
ＬＤＬに対して親和性を有しそれを認識し、しかも水性
溶液に可溶性であるＬＤＬレセプターフラグメントを有
意の量生産し蓄積することができる遺伝子フラグメント
及び蛋白質が得られる。この蛋白質フラグメントは水性
溶液に可溶性であるため、非膜結合研究、診断及び治療
に好適に用いられる。また前記水性溶液に可溶性のＬＤ
Ｌ−レセプターの蛋白質フラグメントは、本発明方法に
より初めて得られたものである。

【００２８】

【配列表】

（１）一般的情報： （ｉ）出願人（発明者）：アツテイー， アラン デイ
ー． スターリー， ステフエン エル． グレツチ， ダニエル ジー． （ii）発明の名称：可溶性ＬＤＬレセプター及び遺伝子 (iii) 配列の数：２ （iv）通信住所： （Ａ）受信人：ニコラス ジエイ． シーイー， クウ
アレス アンドブラデイ （Ｂ）通り：私書箱２１１３ （Ｃ）市：マデイソン （Ｄ）州：ウイスコンシン （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：５３７０１−２１１３ （ｖ）コンピューター判読形態： （Ａ）ミディウムタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパーチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ
−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース ＃１．
０，バージョン＃１．２５ （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： (viii)弁護士／弁理士情報： （Ａ）氏名：シーイー， ニコラス ジエイ （Ｂ）登録番号：２７，３８６ （Ｃ）参照／名簿番号：９６２９６９２０２６ （ix）電気通信情報： （Ａ）電話：（６０８）２５１−５０００ （Ｂ）テレファックス：（６０８）２５１−９１６６ （２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１３１７ 塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ (iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト (vii) 直接の起源： （Ｂ）クローン：低密度のリポ蛋白質レセプター （ix）配列の特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：１６．．１０８６ （xi）配列

【００２９】

【化１】

【００３０】

【化２】

【００３１】（３）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：
２： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３５６ アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：蛋白質 （xi）配列

【００３２】

【化３】

【００３３】

【化４】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトのＬＤＬレセプター蛋白質について現在通
用しているモデルの模式図である。

【図２】端を切り取ったＬＤＬレセプターＬＤＬ−Ｒ
³⁵⁴ の予測模式構造のモデルである。

【図３】本発明によってＬＤＬで生産されたＬＤＬレセ
プターの結合を立証する競争結合検定を示す図式であ
る。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/86 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ステフエン エル． スターリー アメリカ合衆国 53705 ウイスコンシン マデイソン ノース アレン 214 (72)発明者 ダニエル ジー． グレツチ アメリカ合衆国 53705 ウイスコンシン マデイソン ノース ミツドバル ブー ラバード 655 ＃４

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 低密度のリポ蛋白質（ＬＤＬ）に対する
   低密度のリポ蛋白質レセプター蛋白質の結合特性を有す
   る水可溶性蛋白質フラグメントを含有してなる物質の組
   成物。
2. 【請求項２】 蛋白質フラグメントが主として天然の低
   密度リポ蛋白質レセプター蛋白質をコードする配列の端
   を切り取った部分からなる請求項１の物質組成物。
3. 【請求項３】 蛋白質フラグメントがアミノ酸３５４の
   後の端を切り取った部分からなる請求項２の物質組成
   物。
4. 【請求項４】 蛋白質フラグメントがヒトの低密度のリ
   ポ蛋白質レセプター蛋白質の成熟形の最初の３５４アミ
   ノ酸（ＬＤＬ−Ｒ³⁵⁴ ）である請求項１の物質組成物。
5. 【請求項５】 非相同の真核ホスト中の低密度リポ蛋白
   質への親和性を有する水に可溶性の蛋白質フラグメント
   を調製する方法であって、 膜スパンニングドメインを含まない低密度のリポ蛋白質
   レセプター遺伝子の端を切り取った形をコードする蛋白
   質をコードする配列を含んでなるヌクレオチド配列を生
   成させ、かつホストの細胞中で蛋白質をコードする配列
   を発現するのに有効な調節配列を隣接させ、 ホストの細胞中にヌクレオチド配列を形質転換し、 その細胞を蛋白質を生産するのに好適な条件下の培地中
   で培養し、そしてその中に蛋白質フラグメントを有する
   培養した細胞から培地を回収する各工程を含んでなる方
   法。
6. 【請求項６】 非相同のホストが培養中の昆虫細胞であ
   る請求項５の方法。
7. 【請求項７】 培養中の昆虫細胞がＳｆ−２１細胞であ
   る請求項６の方法。
8. 【請求項８】 ヌクレオチド配列がバクロウイルスの使
   用によってホスト細胞中に導入される請求項６の方法。
9. 【請求項９】 蛋白質をコードする配列がヒトの低密度
   のリポ蛋白質レセプター蛋白質配列のアミノ酸３５４の
   後を切り取った蛋白質フラグメントをコードする請求項
   ５の方法。
10. 【請求項１０】 蛋白質フラグメントがヒトの低密度の
    リポ蛋白質レセプター蛋白質の成熟形の最初の３５４ア
    ミノ酸（ＬＤＬ−Ｒ³⁵⁴ ）である請求項９の方法。