JPH0688825A

JPH0688825A - フルクトサミン分画定量方法とそれを実施する為に構成されたフルクトサミン分画定量キット

Info

Publication number: JPH0688825A
Application number: JP3105254A
Authority: JP
Inventors: Masashi Funayama; 政志船山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-02-12
Filing date: 1991-02-12
Publication date: 1994-03-29

Abstract

(57)【要約】（修正有）【構成】反応性官能基または、アガロースゲルに結合さ
せたｍ−アミノフェニルボロン酸に、フルクトサミンの
アルドースのｃｉｓ−ジオール基を作用させ、可逆的な
五員環を形成、結合させた後、従来法（ＥＩＡ法，蛋白
定量法等）により定量する。【効果】厳しい条件設定の必要はなく、正しい定量値が
容易に得られる。また、測定に要する費用も従来法より
安価に設定が可能で、自動分析機器の利用も可能であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はフルクトサミンの分画定
量方法と、それを実施する為に構成されたフルクトサミ
ンの分画定量方法に関する。

【０００２】

【従来技術】抹梢血中のアルドースは、蛋白アミノ酸側
鎖のリジン末端アミノ基とシッフ結合することにより、
不安定なアルジミンとなる。この反応は可逆反応で、生
成したアルジミンが、元のアルドースと蛋白に分解する
場合と、アルジミンが更にアマドリ転換し、安定なケト
アミン構造物となる場合がある。フルクトサミンは、上
記のケトアミン構造物を総称する便宜的な名称である。

【０００３】フルクトサミンは過去２〜３週間の血糖値
の指標となる。フルクトサミンは食事の影響を受けず、
日内変動も認められないが、幼児や低蛋白の症例では、
低値を示す。フルクトサミンの測定には、以前は、チオ
バルビツール酸法や、フロシン法等が用いられていた
が、測定方法が煩雑であることや、再現性等に問題があ
り、汎用されるには至らなかった。現在、利用されてい
るフルクトサミンの測定法は、蛋白を糖化している糖量
を、その還元能を利用して推定しようとする方法であ
る。従って、共存する糖等による還元を回避し、化学量
論的に糖化蛋白と比例関係がある様に測定条件を設定し
なければならない。即ち、Ｊｏｈｎｓｏｎらの考案した
同法は、各種血清成分の共存下で、アマドリ転換生成物
だけがニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を還元す
る条件を設定したものである。同法は還元糖、尿酸、ビ
リルビン、グルタチオン、アルブミン、アスコルビン
酸、乳ビ等によっても影響を受ける為、極めて特殊な条
件を設定しなければならない。また、同法で使用する、
炭酸イオン−重炭酸イオン系の緩衝液は、保存中にｐＨ
を一定に維持することが困難で、温度の上昇によっても
ｐＨが大きく変動する為、取り扱いが極めて難しい。Ｎ
ＢＴの還元で生ずるホルマザンは、三つの六員環に囲ま
れた五員環が開裂した部分の構造によってｃｌｏｓｅｄ
型にキレート結合を生ずる。従って、ホルマザンは血清
中の金属イオンとキレートを形成する場合がある。検体
が血しょうの場合、ＥＤＴＡ、ヘパリン、シュウ酸塩等
の二価金属キレート剤を抗凝固剤として用いると、これ
らのキレート剤がＮＢＴと競合し、吸収曲線を変化させ
る。即ち、同一血を用いた場合、血清と血しょうとで
は、血清の値が低値を示す。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明の発明者らは、（１）官能基−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）ｎ−ＣＨ＝Ｎ−を
介して、ｍ−アミノフェニルボロン酸を共有結合させた
試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、磁性粒子
等の実験器具を用いる方法。（２）ｍ−アミノメチルボロン酸を固定化したアフィニ
ティークロマトグラフィー担体を用いる方法。（３）ｍ−アミノメチルボロン酸を固定化したアフィニ
ティークロマトグラフィー担体を固相化した試験管、ビ
ーズ、マイクロタイタープレート、磁性粒子等の実験器
具を用いる方法。等がフルクトサミンを直接、分画定量することが可能に
なることを見出した。即ち、本発明は、反応性官能基ま
たは、アガロースゲルに結合させたｍ−アミノフェニル
ボロン酸に、フルクトサミンのアルドースのｃｉｓ−ジ
オール基を作用させ、可逆的な五員環を形成、結合させ
た後、フルクトサミンの定量を行なうものである。

【０００５】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に
説明するが、本案は以下の実施例には何ら限定されるも
のではない。

【０００６】実施例１．Ａ．フルクトサミン定量キットの構成（１）ｍ−フェニルボロン酸を共有結合させたマイクロ
タイタープレート（２）ＢＣＧ試薬（３）標準フルクトサミン（４）洗浄液Ｂ．測定操作（１）検体をマイクロタイタープレートの各穴に２００
μｌづつ分取した。（２）（１）の操作をしたマイクロタイタープレートに
シールをし、室温で３０分インキュベートした。（３）マイクロタイタープレートの各穴の内容液を捨
て、洗浄液３００μｌで３回洗浄した。（４）（３）の操作をしたマイクロタイタープレートの
各穴にキットの（２）の試薬２００μｌを添加、混和
し、３７度で３０分間インキュベートした。（５）（４）の操作をしたマイクロタイタープレートの
６３０ｎｍの吸光度を測定した。（６）標準フルクトサミンを用いて同一操作をして描い
た検量線から検体のフルクトサミン値を求めた。

【０００７】実施例２．Ａ．フルクトサミン定量キットの構成（１）官能基−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）ｎ−ＣＨ＝Ｎ−を
固定化し、その官能基に、ｍ−アミノメチルボロン酸を
共有結合させた、マイクロタイタープレート（２）ＢＣＧ試薬（３）標準フルクトサミン（４）洗浄液Ｂ．測定操作（１）検体をマイクロタイタープレートの各穴に２００
μｌづつ分取した。（２）（１）の操作をしたマイクロタイタープレートに
シールをし、室温で３０分インキュベ−トした。（３）マイクロタイタープレートの各穴の内容液を捨
て、洗浄液３００μｌで３回洗浄した。（４）（３）の操作をしたマイクロタイタープレートの
各穴にキットの（２）の試薬２００μｌを添加、混和
し、３７度で２０分間インキュベートした。（５）（４）の操作をしたマイクロタイタープレーの６
３０ｎｍの吸光度を測定した。（６）標準フルクトサミンを用いて同一操作をして描い
た検量線から検体のフルクトサミン値を求めた。

【０００８】実施例３．Ａ．フルクトサミン定量キットの構成（１）ｍ−フェニルボロン酸を共有結合させた試験管（２）ビウレット試液（３）標準フルクトサミン（４）洗浄液Ｂ．測定操作（１）キットの（１）の試験管に検体１ｍｌづつを分取
した。（２）（１）の操作をした試験管を室温で３０分間イン
キュベートした。（３）（２）の操作をした試験管の内容液を捨て、洗浄
液２ｍｌで３回洗浄した。（４）（３）の操作をした各試験管に（２）のビウレッ
ト試液４ｍｌを添加、混和し、３７℃で３０分間インキ
ュベートした。（５）（４）の操作をした各試験管の５４５ｎｍの吸光
度を測定した。（６）標準フルクトサミンを用いて同一操作をして描い
た検量線から検体のフルクトサミン値を求めた。

【０００９】実施例４．Ａ．フルクトサミン定量キットの内容（１）ｍ−アミノメチルボロン酸を固定化したアフィニ
ティークロマトグラフィー担体を固相化した試験管（２）フェノール試液（３）標準フルクトサミン（４）洗浄液Ｂ．測定操作（１）キット（１）の試験管に検体２ｍｌづつを分取し
た。（２）（１）の操作をした試験管を室温で３０分間イン
キュベートした。（３）（２）の操作をした試験管の内容液を捨て、洗浄
液２ｍｌで３回洗浄した。（４）（３）の操作をした各試験管に（２）のフェノー
ル試液２ｍｌを添加、混和し、３７℃で１０分間インキ
ュベートした。（５）（４）の操作をした各試験管の５４５ｎｍの吸光
度を測定した。（６）標準フルクトサミンを用いて同一操作をして描い
た検量線から検体のフルクトサミン値を求めた。

【００１０】実施例５．Ａ．フルクトサミン定量キットの構成（１）ｍ−アミノメチルボロン酸を固定化したアフィニ
ティークロマトグラフィー担体（懸濁液）（２）Ｂｉｕｒｅｔ試薬（３）標準フルクトサミン（４）緩衝液（５）洗浄液Ｂ．測定操作（１）緩衝液２ｍｌと検体５０μｌを試験管に秤取し、
更に、キットの（１）の担体懸濁液５０μｌを秤取、混
和した。（２）（３）の操作をした試験管を室温で３０分間イン
キュベートした。（３）（２）の操作をした試験管を洗浄液２ｍｌで３回
洗浄した。（４）（３）の操作をした各試験管にキットの（２）の
試薬２ｍｌを添加、混和し、３７℃で１０分間インキュ
ベートした（混和後、３分後、８分後に、更に、混和し
た）。（６）（５）の操作をした各試験管を３，０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離した後、その上清の５４５ｎｍの吸
光度を測定した。（７）標準フルクトサミンを用いて同一操作をして描い
た検量線から検体のフルクトサミン値を求めた。

【００１１】実施例６．Ａ．フルクトサミン定量キットの構成（１）ｍ−フェニルボロン酸を共有結合させたビーズ（２）ＢＣＧ試薬（３）標準フルクトサミン（４）緩衝液（５）洗浄液Ｂ．測定操作（１）緩衝液２ｍｌと検体５０μｌを試験管に秤取し、
更に、キットの（１）ビーズ１個を秤取、混和した。（２）（１）の操作をした試験管に蓋をし、室温で３０
分インキュベートした。（３）各試験管の内容液を捨て、洗浄液２ｍｌで３回洗
浄した。（４）新しく準備した各試験管にキットの（２）の試薬
２ｍｌを添加、混和し、（３）の操作をしたビーズを入
れ、３７度で１０分間インキュベートした。（５）（４）の操作をした各試験管の６３０ｎｍの吸光
度を測定した。（６）標準フルクトサミンを用いて同一操作をして描い
た検量線から検体のフルクトサミン値を求めた。

【００１２】実施例７．Ａ．フルクトサミン定量キットの構成（１）ｍ−フェニルボロン酸を共有結合させたビーズ（２）酵素標識フルクトサミン抗体（３）酵素標識抗体溶解液（４）標準フルクトサミン（５）酵素基質（６）酵素基質溶解液（７）緩衝液（８）洗浄液（９）反応停止液Ｂ．測定操作全自動分析装置を用いて、以下のフローチャートに従
い、フルクトサミンの分画定量を行なった。《フローチャート》（１）スタート（２）検体サンプリング（３）ビーズ投入（４）攪拌（５）インキュベーション（６）ビーズ洗浄（７）酵素標識抗体分注（８）攪拌（９）インキュベーション（１０）ビーズ洗浄（１１）ビーズトランス（１２）酵素基質分注（１３）攪拌（１４）インキュベーション（１５）反応停止液分注（１６）測光、データ処理

【００１３】

【発明の効果】本発明によれば、（１）Ｊｏｈｎｓｏｎらの方法と異なり、フルクトサミ
ン量を推定する方法ではなく、フルクトサミンのみを特
異的に吸着させた後、直接定量する方法である為、極め
て正確な値が得られる。（２）検体中の還元糖、尿酸、ビリルビン、ダルタチオ
ン、アルブミン、アスコルビン酸、乳ビ等による影響を
排除できる。（３）Ｊｏｈｎｓｏｎらの方法で用いる緩衝液のｐＨが
１０．３５に限定され、その緩衝液のｐＨを一定にして
保存することが極めて困難であるのに対して、本発明は
どの様なｐＨの緩衝液を使用することも可能である。（４）検体中の二価金属キレート剤により、測定値が影
響を受けることはない。（５）従来法と比較して測定費用が安価である。（６）アフィニティークロマトグラフィー担体を固相化
した実験器具は、従来の器具と比較と比較して、固相化
できる抗体量を飛躍的に増大することが可能となり、検
体の希釈が不要となる。という利点が生ずる。

【００１４】文献：Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｎ．ｅｔａ
ｌ．：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１２７（１９
８２）以下余白

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【手続補正書】

【提出日】平成５年８月１７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】フルクトサミン分画定量方法
とそれを実施する為に構成されたフルクトサミン分画定
量キット

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ｍ−アミノメチルボロン酸を固定化したア
フィニティークロマトグラフィー担体に、フルクトサミ
ンを吸着、結合させた後、既知の方法（放射イムノアッ
セイ法、非放射イムノアッセイ法、アルブミンの定量方
法、蛋白質の定量方法等）により、フルクトサミンを分
画定量する方法。
【請求項２】官能基−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）ｎ−ＣＨ＝
Ｎ−を固定化し、その官能基に、ｍ−アミノメチルボロ
ン酸を共有結合させた、試験管、ビーズ、マイクロタイ
タープレート、磁性粒子、等の実験器具を用いて既知の
方法（放射イムノアッセイ法、非放射イムノアッセイ
法、アルブミンの定量方法、蛋白質の定量方法等）によ
り、フルクトサミンを分画定量する方法。
【請求項３】ｍ−アミノメチルボロン酸を固定化したア
フィニティークロマトグラフィー担体を固相化した、試
験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、磁性粒子、
等の実験器具を用いて既知の方法（放射イムノアッセイ
法、非放射イムノアッセイ法、アルブミンの定量方法、
蛋白質の定量方法等）により、フルクトサミンを分画定
量する方法。
【請求項４】「請求項１」、「請求項２」及び「請求項
３」の実施の為に構成されたフルクトサミン定量分画キ
ット。
【請求項５】フルクトサミンの定量の目的で、官能基−
Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）ｎ−ＣＨ＝Ｎ−を固定化し、その
官能基に、ｍ−アミノメチルボロン酸を共有結合させ
た、試験管、ビ−ズ、マイクロタイタープレート、磁性
粒子等の実験器具。
【請求項６】フルクトサミンの定量の目的で、ｍ−アミ
ノメチルボロン酸を固定化したアフィニティークロマト
グラフィー担体を固相化した、試験管、ビーズ、マイク
ロタイタープレート、磁性粒子等の実験器具。