JPH0688A - 固定化微生物によるカルボニル化合物の還元方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 カルボニル化合物の還元反応の触媒能を有す
る微生物の固定化増殖菌体を用いて、反応速度と収率の
高い微生物的カルボニル化合物還元方法を提供する。 【構成】 親水性固定化担体にカルボニル基の還元能力
を有し、２級アルコール類を生成し得る微生物を付着固
定化し、該微生物の栄養源を含む水性媒体の存在下に、
カルボニル化合物を含む実質的に水に不溶性ないしは難
溶性の有機溶媒を該担体上の固定化菌体相と接触せしめ
ることからなるカルボニル化合物の還元方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は固定化微生物を用いるカ
ルボニル化合物の還元方法に関する。

【０００２】

【従来の技術とその課題】従来より、カルボニル化合物
の化学的還元によつて、工業上重要な２級アルコール類
が大量に製造されている。これら化学的還元法として
は、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素リチウ
ムなどの触媒による方法や白金等の貴金属触媒を用いた
接触還元法などがあるが、触媒コストの問題や位置選択
性、立体選択性に劣る、製造法の安全性が完全には保て
ない等の問題があり、また、得られる生産物の収率も必
ずしも高くない。

【０００３】一方、特に光学活性なアルコールの合成を
目的として、位置選択性および立体選択性に優れる生体
触媒、例えばパン酵母や各種微生物の酸化還元酵素を用
いたカルボニル化合物の還元反応も広く試みられており
［藤沢有ら、有合化、４４巻５１９（１９８６）参
照］、優れた成績を与える場合も知られている。しかし
ながら、生体触媒による還元反応では、用いる酵素ある
いは微生物菌体量が多量であり、反応後の生体触媒の除
去、生物的還元反応に要求される補酵素の供給等コスト
的な問題点がある。

【０００４】また、基質たるカルボニル化合物及び／又
は生産物たるアルコール類が水に不溶性もしくは難溶性
である場合には、基質を水中に強制分散させるために強
力な撹拌力が要求される。反応速度が低い、反応後の生
体触媒と生産物との分離が困難である、連続生産や繰り
返し生産が不可能である等の問題点がある。

【０００５】また、基質たるカルボニル化合物及び／又
は生産物たるアルコール類が水に不溶性もしくは難溶性
である場合には、基質を水中に強制分散させるために強
力な撹拌力が要求される、反応速度が低い、反応後の生
体触媒と生産物との分離が困難である、連続生産や繰り
返し生産が不可能である等の問題点がある。

【０００６】さらに、基質たるカルボニル化合物や生産
物たるアルコール類は酵素や微生物に対して毒性を発現
する場合が多く、従つて、反応系への基質添加量や生産
物の収量が非常に低くなり、また、生体触媒の長期安定
性が保てない等の問題点がある。

【０００７】したがって、上記の化学的還元法の欠点を
克服し、なおかつ既存の生物的還元法の欠陥を補うよう
な新規なカルボニル化合物の生物的還元方法の開発が強
く望まれている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、微生
物を用いるカルボニル化合物の還元方法において、基質
のカルボニル化合物や還元生成物の２級アルコール類な
どの微生物に対する毒性を回避し、水中強制分散や通気
等の面倒な操作も必要としないカルボニル化合物の微生
物的還元方法について鋭意検討した結果、栄養源および
水を含む親水性固定化担体に微生物を植菌し、これに微
生物に対して毒性を発現しない有機溶媒を接触させる
と、有機溶媒と固定化担体との界面で微生物菌体が旺盛
に増殖して担体上に菌体相を形成し、この菌体相が有機
溶媒中に添加したカルボニル化合物を高い反応速度と収
率で還元することを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００９】かくして、本発明に従えば、親水性固定化
担体に、カルボニル基の還元能を有し、２級アルコール
類を生成し得る微生物を付着固定化し、該微生物の栄養
源を含む水性媒体の存在下に、カルボニル化合物を含む
実質的に水に不溶性ないしは難溶性の有機溶媒を該担体
上の固定化菌体相と接触せしめることを特徴とするカル
ボニル化合物の還元方法が提供される。

【００１０】本発明の１つの特徴は、脂肪族炭化水素に
代表される有機溶媒と親水性固定化担体との界面で微生
物の栄養源を含む水性媒体を供給しつつ微生物を増殖さ
せて形成された菌体相を触媒として利用できる点にあ
る。これにより、カルボニル化合物を実質的に水に不溶
性もしくは難溶性の有機溶媒に溶解した形で該菌体相に
接触させて還元反応を行なわせることが可能になり、そ
の結果、高い反応速度と触媒の長期安定性が達成され、
撹拌動力が事実上不要である等の利点が得られる。

【００１１】本発明のもう１つの特徴は、基質であるカ
ルボニル化合物は微生物に対して強い毒性を示すにもか
かわらず、これを非常に高い濃度で有機溶媒に添加する
ことができ、菌体相に接触し得る点にある。例えば、２
−オクタノンや２−デカノン等の場合には、エマルジヨ
ン系ではわずか０.５％存在するだけで微生物は増殖し
えない。しかしながら、本発明に従つて、例えばシユー
ドモナス・プチダＩＦＯ １３６９６は、有機溶媒中に
２−オクタノンを１２％の濃度で含んでいても死滅せ
ず、また２−デカノンを２４％の濃度で含んでいても死
滅せず、増殖して菌体相を形成する。本発明によれば、
このように微生物菌体相に対して高濃度のカルボニル化
合物を接触することができ、その結果、高い反応速度と
高い収率が達成され、カルボニル化合物を低コストで還
元し得る等の利点が得られる。

【００１２】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。

【００１３】なお、上記固定化菌体相に接触させる有機
溶媒又は基質であるカルボニル化合物の有機溶媒溶液
を、以下、有機液相ということがある。

【００１４】本発明で使用可能な固定化担体は、親水性
のものであれば特に制約はなく、栄養源を含む水溶液を
含浸もしくは接触させて有機溶媒との界面に存在する微
生物にこれを供給することができるものであれば、いか
なる素材であっても使用可能であり、具体的には例え
ば、アルギン酸、カラギーナン、デンプンマトリック
ス、寒天、濾紙のようなセルロース材などの天然高分
子；ポリビニルアルコール、ウレタンポリマー、ポリア
クリルアミド、ポリアクリル酸などの合成高分子；泡ガ
ラス、シリカゲルなどの無機物などが挙げられる。

【００１５】これら固定化用担体の形状には特に制限は
なく、繊維状、膜状、粒状等の任意の形状に成形されて
いることができ、また布、不織布、紙、ボール紙等の形
態に成形されたものであってもよい。

【００１６】一方、上記固定化菌体相に接触する有機液
相における有機溶媒又は基質のカルボニル化合物の有機
溶媒溶液調製用の有機溶媒は、付着微生物菌体に対して
実質的に毒性を示さないものが好ましく、具体的には、
ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン等の炭
素数６〜２０のメタン系炭化水素に代表されるノルマル
バラフイン類又は流動パラフイン類；イソオクタン等の
イソパラフイン類；ペンチルベンゼン、ヘキシルベンゼ
ン、ヘプチルベンゼン、オクチルベンゼン等の脂肪族鎖
の炭素数が５〜１５のノルマルアルキルベンゼン類；キ
ユメン等のイソアルキルベンゼン類；シクロヘキサン等
の脂環式炭化水素類；ジエチルエーテル等のエーテル類
などを例示することができる。

【００１７】上記固定化担体に付着させて、担体と有機
液体との界面で増殖させて使用するカルボニル基の還元
能を有する微生物は、細菌類、カビ類、酵母、放線菌類
等のいずれの微生物であつてもよい。具体的には例え
ば、バチルス（Bacillus）属、キサントモナス（Xantho
monas）属、ラクトバチルス(Lactobacillus）属、ロイ
コノストク(Leuconostoc)属、ストレプトコツカス(Stre
ptococcus)属、シユードモナス(Pseudomonas)属等の細
菌類、ピシア（Pichia）属、カンジダ（Candida）属、
ロドトルラ(Rhodotorula)属、サツカロマイセス(Saccha
romyces)属、シゾサツカロマイセス(Schizosacchromyce
s)属、クロエツケラ(Kloeckera)属、クリプトコツカス
(Cryptococcus)属、デイポダスカス(Dipodascus）属、
ロデロマイセス(Lodderomyces)属等の酵母類、ジオトリ
カム(Geotrichum)属、グレオスポリウム(Gloeosporiu
m）属、オーレオバシデイウム(Aureobasidium)属、アス
ペルギルス(Aspergillus)属、ペニシリウム(Penicilliu
m)属、スポロトリカム(Sporotrichum)属、クルブラリア
(Curuvlaria)属等のカビ類等に属する微生物が挙げられ
る。さらに具体的には、バチルス・スリンギエンシス
（Ba．thuringiensis)、キサントモナス・オリゼー（X
a．Oryzae)、ラクトバチルス・ブレビス(La．brevis)、
ロイコノストク・デクストラニカム(Le. dextranicu
m）、ストレプトコツカス・フエーカリス(St．faecali
s)、ピシア・テリコラ(Pi. tericola)、カンジダ・アル
ビカンス(Ca. albicans）、ロドトルラ・ルブラ(Rh. ru
bra)、サツカロマイセス・セレビシエ（Sa. cerevisia
e）、クロエツケラ・コルテイシス(Kl. corticis)、ク
リプトコツカス・マゼランス(Cr. macerans)、デイポダ
スカス・ユニヌクレアタス(Di. uninucleatus)、ロデロ
ルイセス・エロンギスポラス(Lo. elongisporus)、ジオ
トリカム・キヤンデイダム(Ge. candidum)、オーレオバ
シデイウム・プルランス(Au．pullulans)、アスペルギ
ルス・オクラセウス(As. ochraceus)、ペニシリウム・
デカムベンス(Pe. decumbens)、スポロトリカム・エキ
シル(Sp. exile)、クルブラリア・ルナタ(Cu. lunata)
等を挙げることができる。

【００１８】かかる微生物の担体への付着固定化は、例
えば、菌体懸濁液をあらかじめ栄養源を含む水性媒体を
含ませた担体に塗布または散布するか、担体を菌体培養
液中に浸漬するか、微生物菌体を適当な方法で担体に付
着させた後、担体に栄養源を含む水性媒体を供給する等
の方法で担体上に微生物菌体を付着させた後、その担体
をあらかじめ栄養源を含む水性媒体中で培養することも
できるが、通常、基質としてのカルボニル化合物を含む
かまたは含まない有機溶媒と接触させた状態で培養し、
付着した微生物菌体を担体と有機溶媒と有機溶媒との界
面で増殖させ、担体上に固定化菌体相を形成させること
により行うのが適当できる。この培養により、微生物は
担体表面に強固に付着し、固定化菌体相が担体から剥離
するようなことはほとんどない。

【００１９】上記培養において使用し得る微生物の栄養
源は、使用菌体の種類に応じてその菌体に最適のものを
選択することができ、例えば、グルコース等の炭素源、
尿素等の窒素源、硫酸マグネシウム等の微量金属塩、酵
母エキス等の微量栄養源よりなる一般的なものでよい。

【００２０】固定化菌体への栄養源を含む水性媒体すな
わち培養液の供給は、担体が例えば寒天のように培養液
を充分に含有保持しうるものであれば、担体に予め含ま
せておくことにより行うことができ、及び／又は例え
ば、上記有機液相に培養液を加え、形成される有機液相
と培養液相の界面に微生物固定化担体を介在させること
により行なうこともできる。

【００２１】培養は一般に、恒温槽、インキュベーター
等の培養装置中で行うことができ、あるいは担体を基質
を含むか含まない有機溶媒中に浸漬し、場合によっては
さらに栄養源を含む水性媒体を加えた反応容器中で温度
調節しながら行ってもよい。培養温度、培養時間等の培
養条件は使用微生物の種類に応じて、最適の条件を選択
することができる。

【００２２】培養に酸素を必要とする場合には、有機溶
媒に通気すればよいが、一般に有機溶媒は水に比して数
倍から十数倍の酸素溶解度を有しているため、かならず
しも通気する必要はない。また、酸素が培養または反応
の妨げになる場合には、有機溶媒中の溶存酸素を二酸化
炭素、窒素等により置換すればよい。これら置換気体の
有機溶媒中への溶解性も一般に水の数倍高いため効率的
に置換が行える。一方、培養中の撹拌についても、基質
であるカルボニル化合物は有機溶媒中に溶解して存在し
ているため、エマルジヨン法のような強烈な撹拌は不要
でありまた、撹拌が不要である場合が多い。

【００２３】基質としてのカルボニル化合物は、上記培
養の初期から添加してもよく、または微生物が十分に増
殖して固定化菌体相を形成した後に添加してもよい。あ
るいは培養初期から固定化菌体相形成までの任意の時点
で加えてもよい。上記のように、カルボニル化合物は微
生物に対して毒性を発現する場合が多いため、一般に
は、菌体相が十分に成長してから添加する方が高い成績
が達成される。

【００２４】かくして、担体上の固定化菌体相を、基質
としてのカルボニル化合物の有機溶媒溶液からなる有機
液相との接触状態で培養をつづけることにより、カルボ
ニル化合物の還元反応を行なわせることができる。

【００２５】この固定化微生物によるカルボニル化合物
の還元反応に基質として供しうるカルボルニル化合物は
特に制限されず、固定化微生物のカルボニル基の還元能
に応じて各種のものを使用することができる。

【００２６】基質として供しうるカルボニル化合物とし
ては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチル
ｎ−プロピルケトン、メチルイソプロピルケトン、メチ
ルイソブチルケトン、ジエチルケトン、２−ヘキサノ
ン、３−ヘキサノン、２−オクタノン、２−デカノン等
のアルカノン類；３−ケトブタン酸エチル、４−クロロ
−３−ケトブタン酸エチル等のケトエステル類；アセチ
ルアセトン、アセトニルアセトン、２,４−オクタンジ
オン等のジケトン類；アセトフエノン、ホセンゾフエノ
ン、ベンジル、２−アセトキシ−１−フエニルエタノン
等の芳香族カルボニル化合物；シクロヘキサノン、２−
メチルシクロヘキサノン等の脂環式カルボニル化合物等
が挙げられる。

【００２７】有機溶媒中のカルボニル化合物の濃度は特
に制限されるものではなく、菌体に対する毒性に応じて
決めることができる。カルボニル化合物が実質的に水不
溶性ないしは難溶性の場合には、これらが水相すなわち
親水性固定化担体側へ移行しないため、その菌体に対す
る毒性を大幅に減じることができる。例えば、２−オク
タノンや２−デカノンのような中鎖脂肪族カルボニル化
合物の場合には、サツカロマイセス属、ロデロマイセス
属、ピシア属やカンジダ属等の酵母は、有機液相中の濃
度が３〜５％であつても増殖可能である。一方、アセト
ン、メチルエチルケトン等のような水溶性のカルボニル
化合物の場合には、これらが水相側に移行して菌体に対
して毒性を発現する場合があるので、菌株の耐性に応じ
て濃度を決める必要がある。

【００２８】以上述べた本発明の方法によれば、脂肪
族、芳香族、脂環式等のカルボニル化合物の還元反応を
固定化微生物の増殖菌体を用いて、極めて効率的に行な
うことができる。その際、副反応が生ずる可能性がある
場合には、適当な代謝又は変換阻害剤の添加によつてそ
れを遮断するか又はそのような副反応が生じないように
育種改良した代謝欠損株を用いることができる。

【００２９】本発明の方法によれば、基質のカルボニル
化合物は有機液相側から供給され、生産物のカルボニル
基還元化合物すなわち２級アルコール類は有機液相側に
蓄積される。従つて、有機液相に蓄積される生産物を回
収し、基質のカルボニル化合物を補充する等の方法を行
なうことにより、固定化菌体相と基質との接触頻度を飛
躍的に増加せしめることができ、反応速度と収率、収量
を大幅に向上させることが可能となり、連続操業も可能
となる。

【００３０】かくして、本発明の方法を、例えば工業薬
品、医薬品、化粧品、香料、洗剤、界面活性剤、繊維処
理剤、油脂、染料、塗料、印刷材料等の分野における工
業上重要な２級アルコール類の製造工程に適用すること
により、生産コストの低下、工程の省エネルギー化、省
力化等、工業的に有利な種々の利点を得ることができ
る。

【００３１】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。なお、部及び％は重量基準である。

【００３２】実施例１ ペプトン０.５％、酵母エキス０.３％、麦芽エキス０.
３％、グルコース１.０％、寒天１.５％よりなる寒天平
板をガラスシャーレ（表面積３８.５cm²）に調製し、表
１にある各種微生物の懸濁液１００μｌをコンラージ棒
を用いて塗沫した。乾燥後、１０％２−デカノンのｎ−
ヘキサデカン溶液を１０ｍｌ重層し、３０℃で７日間静
置培養した。培養後、溶媒相１μｌをガスクロマトグラ
フィーによって分析し、生成した２オクチル酸ｎ−ブチ
ルエステル濃度を測定した。その結果を表１に示す

【００３３】

【表１】 実施例２ 実施例１と同様の培地１００ｍｌを内容量４８０ｍｌの
密栓可能なガラス容器に注いで寒天平板を調製した（表
面積４３cm²）。これに表２に示す各種微生物懸濁液１
００μｌをコンラージ棒を用いて塗沫し、３０℃で２日
間培養して菌体相を形成させた。その後、１０％ ２−
オクタンのｎ−ヘキサデカン溶液を１０ml重層し、３０
℃、１００rpmの振盪下で７日間培養した。培養後、溶
媒相１μｌをガスクロマトグラフィーによつて分析し、
生成した２−オクタノール濃度を測定した。その結果を
表２に示す。

【００３４】

【表２】 実施例３ 厚さ３mmの濾過板(東洋アドバンテツク製)を縦にして充
填したガラス容器(内容量５００ml）を調製した（表面
積８００cm²）。これに、ペプトン０.５％、酵母エキス
０.３％、麦芽エキス０.３％、グルコース１.０％、ス
パン−８０ ０.０２％よりなる液体培地２００mlを注
入し、高圧蒸気滅菌した。冷却後、これにロデロマイセ
ス・エロンギスポラスの１日培養液５０mlを注入し、
０.２vvmの通気、３００rpmの撹拌下で２日間培養し
た。培養後、培養液を抜きながら１０％２−デカノンの
ｎ−パラフイン溶液を注入し、培養液５０ml、溶媒相１
５０mlとして、３０℃、３００rpmの撹拌下、無通気で
７日間培養した。培養期間中、溶媒相１μｌをガスクロ
マトグラフイーにより分析し、生成２−デカノール濃度
を測定した。その結果を表３に示す。

【００３５】

【表３】 実施例４ ポリペプトン１.０％、酵母エキス０.２％、硫酸マグネ
シウム０.１％、寒天１.５％よりなる寒天平板をガラス
シャーレに調製し（表面積３８.５cm²）、これにラクト
バチルス・ブレビスＩＡＭ １０８２の１日培養液１０
０μｌをコンラージ棒を用いて植菌し、溶存酸素を窒素
で置換したｎ−パラフイン１０mlを重層した。３０℃で
２日間静置培養して菌体相を形成された後４−メチルシ
クロヘキサノンを２００μｌ添加溶解し、７日間静置培
養した。培養後、溶媒相から１μｌを採取し、ガスクロ
マトグラフィーを用いて生成２−メチルシクロヘキサノ
ール濃度を測定した。その結果、１.２ｇの２−メチル
シクロヘキサノールの蓄積を確認した。

【００３６】比較例１ ペプトン０.５％、酵母エキス０.３％、麦芽エキス０.
３％、グルコース１.０％、スパン−８０ ０.０２％よ
りなる液体培地にロデロマイセス・エロンギスポラスを
植菌して１日間３０℃で振盪培養した。これに２−オク
タノンを０.２、０.４、０.６、０.８、１.０％になるよ
うに添加し７日間振盪培養した。培養後、ジエチルエー
テルで３回抽出し、乾燥、希釈後、ガスクロマトグラフ
イーにより、生成２−オクタノール濃度を測定した。そ
の結果、いずれの濃度においても、生成２−オクタノー
ル濃度は０.１ｇ／ｌ以下であつた。

【００３７】比較例２ 寒天を除き、スパン−８０を０.０２％添加して窒素置
換した実施例１の培地２０mlにラクトバチルス・ブレビ
スＩＡＭ １０８２の１日培養液を１ml添加し、１日間
増殖させた。その後、２−メチルシクロヘキサノンを
０.２、０.４、０.６、０.８、１.０％になるように培
地中に添加し、７日間１５０rpmで振盪培養した。培養
後、ジエチルエーテルで３回抽出し、乾燥、希釈後、ガ
スクロマトグラフイーを用いて生成２−メチルシクロヘ
キサノール濃度を測定した。その結果、いずれの添加濃
度においても、生成２−メチルシクロヘキサノール濃度
は０.１ｇ／ｌ以下であつた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/02 Ｃ１２Ｒ 1:78）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 親水性固定化担体に、カルボニル基の還
   元能を有し２級アルコール類を生成し得る微生物を付着
   固定化し、該微生物の栄養源を含む水性媒体の存在下
   に、カルボニル化合物を含む実質的に水に不溶性ないし
   は難溶性の有機溶媒を該担体上の固定化菌体相と接触せ
   しめることを特徴とするカルボニル化合物の還元方法。