JPH0692955B2

JPH0692955B2 - 酸素濃度測定用容器

Info

Publication number: JPH0692955B2
Application number: JP62153640A
Authority: JP
Inventors: 文二萩原
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-06-23
Filing date: 1987-06-19
Publication date: 1994-11-16
Anticipated expiration: 2009-11-16
Also published as: JPS63106549A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］この発明は、少量の溶液試料中の酸素濃度の変化を連続
的に計測するための酸素濃度測定用容器に関するもので
ある。

［従来の技術］従来より、溶液試料中においてO₂が消費されたり、発生
したりする反応の特徴を知るため、溶液試料に酸素電極
を挿入して、その中の酸素濃度の変化を連続的に計測す
ることが行われている。

酸素電極法はポーラログラフィーの一種で、陰陽両電極
間に一定の電圧を加えてO₂を電解することによってO₂の
濃度を測定する方法である。一般に、陰極（測定電極）
としては、白金、金、Ir等の貴金属をガラスまたはプラ
スチック内に封入して先端を露出させたものを用いる。
陽極（対照電極）にはカロメル電極（Hg/HgCl）または
銀／塩化銀電極を用いる。今この両電極間に約0.6Vの電
圧をかけると次のような電極反応が進行する。

陰極：O₂＋4H⁺＋4e→2H₂O（酸性溶液） O₂＋2H₂O＋4e→4OH^-（アルカリ性溶液）陽極:4Ag＋4Cl→4AgCl＋4e（広pH域）上記の電極反応の結果、陰極に到達するO₂分子の数に比
例した電流が、両電極の間に流れる。陰極に到達するO₂
分子の数は溶液中のO₂濃度に比例するので、この電流を
測定することによりO₂濃度を知ることができる。

酸素電極は電極の配置の仕方から陰陽分離型と陰陽複合
型とに分類できる。前者は、両電極を試料液内に直接分
離して設け、試料内で電極反応を行わせるものである。
後者は、両電極および電極反応用電解液を疎水性でO₂透
過性のプラスチックの薄膜（電極膜）で包み込んで一体
として組み合わせたものである。後者の場合には、被測
定試料は薄膜と接し、O₂は薄膜を透って測定電極に到達
して反応する。

上述のように陰陽両極間に適当な電圧をかけてO₂を測定
するかわりに、対照電極に適当な電位を持つもの（例、
Pb/Pb(OH)₂系）を選んで、電圧をかけずにO₂の測定を可
能にしたもの（ガルバニー電池様式）もあるが、本発明
に関しては、酸素電極と同様に用いられる。

さて、酸素電極法およびガルバニー電池法のいずれの場
合でも、酸素測定用電極ユニットはふつう細長い形をし
ているため反応容器に挿入するには側面または斜め上方
から行なわれ、容器の底面につけることが著しく困難で
あり、また、それを行なった場合には下部に磁気回転器
を置いて容器内の磁気回転子を回すことができない。

［発明が解決しようとする問題点］一般に酸素反応容器は次のような条件を満足しているこ
とが望ましいものである。

第一に、大気中のO₂が測定液中に侵入してこないような
形状でなければならない。大気中のO₂の拡散によって、
測定値に誤差が生じるのを防ぐためである。さらに、試
料の注入や除去が容易で、しかも操作中に入った気泡が
内部にとどまらず、容易に上に抜けるような形状でなけ
ればならない。

第二に、試料がたえず一定速度で攪拌されている必要が
ある。これは反応開始時や反応の途中で試薬を加えた時
に速やかに均一に混合させるためと、電極の感度を一定
に保つために必要だからである。電極感度は液が静止し
ているときと、攪拌されて動いているときとでは著しく
異なり、また攪拌の強さによっても多少異なってくる。

第三に、試料の温度を所定の温度に保てるような構造で
あることが必要である。酸素電極の感度は温度によって
変るものであるし、反応速度も温度によって変るからで
ある。

第四に、容量は小さいものであることが好ましいことが
多い。測定試料（特に生体試料の場合）や反応材料が調
製困難なものであったり、高価なものである場合に、そ
の節約をはかることができるからである。

以上の他に、酸素濃度測定用容器に設置する酸素電極の
感度が安定であり、応答速度が十分に速いものでなけれ
ばならないことはいうまでもない。

分離型酸素電極の場合には、上記の第一から第四の条件
のすべてを満足するような容器が萩原によって考案され
商品化されている（萩原文二：ポーラログラフ方式を応
用した液体中の酸素濃度測定装置、実願昭40−051817、
実公昭42−010978）；（萩原文二：（オランダ国）「生
化学生物理学会」誌（Biochemical et Biophisica Act
a.）第46巻第134頁、1961年）；（B.萩原、F.石橋、K.
佐々木及びY.上河原：「分析的生化学」誌（Analytical
Biochemistry）第86巻第417〜431頁、1978年）。これ
らの場合には微小な形の測定と対照（またはその塩橋）
を別々に離して反応容器の任意の位置に設置することが
できるので、上記の第一、第二の条件を満たして、しか
も容量の小さな反応容器を製作することは困難ではなか
ったのである。

一方、測定精度特に電極感度の安定性は一般に複合型電
極のほうが分離型電極よりも高い。このため、複合型電
極を用いた酸素濃度測定用容器も種々考案されそのうち
２、３のものは市販されている。これらの複合型電極を
用いた酸素濃度測定用容器の代表的な例を第７図に示
す。この例では第二の条件を満たすため磁気攪拌子６が
容器内に置かれている。この磁気攪拌子６は容器４の下
部に設けられた回転磁石８によって回転させられ、試料
12を攪拌する。複合型電極ユニット10は、容器４の側面
部から挿入され、その電極面10aが試料12に接してい
る。容器４の外部は循環する恒温水14で満たされ、試料
12の温度を一定に保つようにしている。

このような従来型装置では、次のような欠点があった。
複合型電極ユニットでは、測定電極と対照電極とが電解
液の薄層で連結されるように一体に組合わされている。
このため、その構造支持体を含めると電極ユニットの直
径が大きくなって必然的に容器の容量が大きくならざる
を得なかった。その上、円筒または球状の容器側壁に、
ほぼ平面である電極面をはめこむことになるので、電極
面やその周辺に気泡が付着し、上に抜けにくい欠点もあ
った。特に複合酸素電極では、電極面の中心部は測定電
極を覆う疎水性プラスチック膜でできていて水にぬれに
くいために気泡が付着しやすい。

一般に酸素濃度測定用容器中の被測定液に溶解している
O₂の濃度は空気中のO₂濃度に比して著しく低い。水溶液
が25℃で空気と平衡した場合の溶存O₂濃度は246μmole/
1であるから、もしも空気（O₂＝20.7％）の気泡が容器
内に止まった場合、気泡中にはその数十倍の容積のO₂が
混入することになる。したがって、小さな気泡でもO₂の
消費または発生反応の測定に対して著しい誤差を与える
ことになる。このため、容器内の気泡除去は完全に行な
われなければならないのである。これと同様に反応液と
空気との接触も大きな誤差を与える原因になる。反応液
の成分（緩衝液、反応気質、生体活性物質、試薬類な
ど）の一部は測定の途中で容器内に注入する必要がある
ので、容器にはその注入口を設ける必要があるが、そこ
から空気中のO₂が侵入すると測定値に誤差を生じる。幸
い、動いていない水の中でのO₂分子の拡散は遅いので、
反応容器の上に細長い管状の開口部を設けるとその管内
の液は攪拌の影響を受けずに静止する。したがって、空
気中のO₂の反応液への侵入を、ほぼ完全に防ぐことがで
きる。なお、この細長い開口部は同時に容器内の気泡の
除去口にもならなければならないので、容器の上部は円
錐状をなし、スムーズにこの細管部と連なっている必要
がある。

この発明は、上記の諸条件を満足する測定精度の高い酸
素濃度測定用容器を提供することを目的とする。

［問題点を解決するための手段］この発明に係る酸素濃度測定用容器は、上部に細管状開口部を設け上部が円錐状でスムーズに開
口部の細管部と連なって気泡が容易に上に抜ける形状の
被測定反応液収納用の容器、電極面が容器の底面を構成するように配された複合型酸
素測定用電極を上面に有し、少なくとも一部が前記容器
内の反応溶液と又は容器側面の外周に熱的に接触する熱
伝導性の材料のブロックよりなり、そのブロックの中
に、定温加熱手段を備えた偏平型の電極ユニット、電極ユニットの下に置かれた磁場回転手段、及び電極ユニットの上の容器に固定されずに置かれ、前記磁
場回転手段によって回転されて容器内の被測定溶液を攪
拌する磁気回転子、を備える。

［作用］複合型酸素電極ユニットを上下方向に薄い偏平型にして
いるので、電極の下部に設けられた磁場回転手段の磁束
が電極を貫いて磁気攪拌体を回転させることができる。
電極ユニットが下部に設けられまた容器上部が気泡を容
易に上に抜ける形状としているので、容器の高さや容器
の直径を電極の直径にかかわらず小さくできるととも
に、電極面またはその周辺に気泡が付着して上部へ抜け
にくくなることがない。

［実施例］この発明の一実施例による酸素濃度測定用容器の構造の
概要を第１図に示す。ガラス容器27の下部側面には金属
製の容器支持体１が接着されている。容器支持体１の下
部には、防水パッキング膜を介してボルトによって電極
ユニット22が固定されている。電極ユニット22の下面
は、磁場回転手段である磁気回転器24の上面に貼りつけ
られている。磁気回転器24の中には、モータ26によって
回転させられる回転磁石25が設けられており、これによ
って容器27内の磁気攪拌子30を回転するようにしてい
る。

電極ユニット22の分解詳細図の例を第２図に示す。図に
おいて、58は測定電極、59は対照電極、56は電極膜、76
は電極膜被覆板、80は定温加熱用の金属ブロックで、電
極膜56と電極膜被覆板の外面76とで電極面を構成してい
る。電極ユニット22は、電極本体51と膜ホルダ55および
電極被覆体54からなっている。本体51には陰極すなわち
測定電極58（金または白金）および陽極すなわち対照電
極59（銀）を備えている。測定電極58の露出端面の形と
しては、ディスク型、一点型、多点型、リング型など用
いることができる。対照電極59は銀円管よりなり測定時
にはAg/AgCl電極となって一定の電位を示す。測定電極5
8と対照電極59は、ガラスなどの絶縁体60によって絶縁
されている。絶縁性プラスチック支持体62（ポリアセタ
ール、硬質塩化ビニール等）は電極58,59をブロック80
に支持している。このブロック80は、熱伝導性の金属
（例えばしんちゅう）からなり、第３図に示すように定
温加熱手段であるヒータ70およびサーミスタ71によって
所定の温度に保たれる。ブロック80の下側にはエポキシ
樹脂63が充填され、プラスチックカバー64で蓋がされて
いる。

膜ホルダ55は、プラスチック円筒75（ポリアセタール、
ポリカーボネート、ポリプロピレン等）に、電極膜56を
張り付けて構成されている。電極膜56としては、厚さ５
〜30μｍの疎水性プラスチックフイルム（ポリプロピレ
ン、テフロン、マイラーなどのフイルム）が用いられ
る。

電極膜被覆体54は、ステンレススチールなどの非反応性
金属で作られており、膜ホルダ収納部76、ネジ穴77を有
している。この電極ユニット22を組み立てる際には、膜
ホルダ55の電極膜56の中央部に約1/3滴の電解液57（た
とえば80％エチレングリコールを含むKCl、0.02Mりん酸
緩衝液）をつけてから、電極部51を挿入し、膜ホルダ55
の上面に、電極膜被覆体54をはめて、これをボルト65に
よって電極本体51に固定する。

電極ユニット22に、反応容器27を固定したものが第１図
に示す装置である。第１図において、反応容器27の上部
28は直径1.5mm程度の細かい管にしてある。これは、大
気中のO₂の反応液への侵入を防ぐためである。容器27
は、防水性接着剤（防水エポキシ等）によって容器支持
体１に固定されている。容器支持体１の下面には、漏水
防止用プラスチック膜53（例えば約100μｍの片面粘着
テフロンフィルム）が張られている。図に示されている
ミクロシリンジ31は被測定反応溶液110中に少量の試薬
を添加するためのものである。またシリンジ32は被測定
反応溶液110を吸出するためのプラスチック細管をつけ
たシリンジであり、容器密栓棒33は長時間の酸素濃度測
定用の反応を行う時に大気よりのO₂の侵入を完全に防止
するために容器27の細管状開口部に挿入するものであ
る。この実施例によれば、電極ユニットがヒータ70およ
びサーミスタ71を備えていて一定温度に保たれるので被
測定反応溶液110を所定の温度に保つことができる。す
なわち、電極ユニット22に設けられたヒータ70の熱が、
電極膜被覆板76および容器支持体１を介して被測定反応
溶液110を暖める。特に、第１図に示すように、容器支
持体１に突出部1aを設けることにより、効率よく容器27
の側壁を暖めることができる。なお、この突出部1aは非
反応性の金属で作って容器27の側壁の内側に設けられて
いる。以上のように、この実施例によれば、従来のよう
に容器全体を恒温水につけたりする必要がなく、装置の
簡略化と小型化とを図ることができる。

尚、他の実施例としては第１図のように電極ユニット内
に温度調節機構をもたせるのではなく、容器支持体１内
にサーミスタ71およびヒータ70を設置してもよい。この
場合には第１図の場合に比して使用するヒーターや測温
体の形や大きさの許容性が大きくなる。しかし第１図の
場合には容器の底面と側壁の両方から反応液が加熱され
ていたが、この場合には側壁よりの加熱のみになる。し
かし、側壁の加熱面積を大きくすることによって被測定
液の温度の維持は十分にできる。

第４図に、電極ユニット22内に定温加熱手段を設けず、
容器支持体１の内部に定温加熱手段を設けた場合の実施
例を示す。70はヒータ、71はサーミスタである。容器支
持体１の突出部1aは、容器27の側面を外周から覆うよう
に設けられている。この実施例の場合には、電極膜被覆
板76を熱伝導性の材料で形成しておけば、電極面からの
加熱も行なわれるので効果的である。

なお、この実施例によるときは次のような効果を得るこ
とができる。

第一に、電極ユニット22自体に定温加熱手段を設けなく
てもよいので、電極の構造が簡素化される。したがっ
て、電極ユニット22が故障しにくく、電極ユニット22の
製造コストを低くすることができる。

第二に、電極ユニット22に定温加熱手段を備えたもので
は電極ユニット22が大きいため、容器27の直径を著しく
小さくすることは困難であった。これに対し、上記実施
例によれば、電極ユニット22を小さくでき、著しく細い
容器27を製作することができる。さらに定温加熱手段は
大きさに制限のない反応容器支持体１内に設けられてい
るので、微小で高価な素子を使う必要がない。

第６図Ａに、第１図の酸素反応容器を用いて、ミトコン
ドリアの25℃における酸素消費反応を測定した結果の一
例を示す。このグラフの左端の直線Ａは、25℃におい
て、空気と平衡させた反応液（10mMリン酸緩衝液を含む
0.25M庶糖水溶液）酸素濃度を示し、曲線Ｂはイの時点
で少量のミトコンドリアをこの反応溶液に入れた時の酸
素濃度の変化の経過を示している。曲線Ｃはロの時点
で、0.1M相当のコハク酸（呼吸基質）を入れた時の酸素
濃度の変化を示している。曲線Ｄは50μＭ相当のADPを
ハの時点で入れた後の酸素濃度の変化の経過を示す。こ
の酸素消費速度は曲線Ｅのように途中で遅くなる。これ
は、ハで加えたADPが全部ATPになって無くなったために
ADP添加前の呼吸に戻ったからである。この測定結果か
ら本発明の酸素反応容器を用いることによってミトコン
ドリアのように条件によって酸素消費速度を変化させる
生体試料の複雑な酸素消費の状況が極めて正確に測定で
きることがわかる。

既述のように、この発明によれば、容器27全体を恒温水
につけたりする必要がないので、ガラスの容器27の側面
部に光ファイバー等を取り付けることが容易である。し
たがって、酸素濃度の測定と同時に光学測定を行うよう
にな装置を提供することができる。

第５図に、酸素濃度の測定と同時に光学測定（分光光学
測定、蛍光光学測定等）を行う場合の実施例を示す。ガ
ラスの容器27は、しゃ光のため円筒状の光しゃ断用ケー
ス94に収納されている。ケース94の下部には外側にネジ
をきった導入管85a,85bが設けられている。導入管85a,8
5bの中には、送光用光導管98aと受光用光導管98bが挿入
され、しゃ光性のＯリング97がはめられて、ネジ管96に
よってしめつけられている。送光用光導管98aと受光用
光導管98bはいずれも光フアイバーを軟質プラスチック
製で弾力性のある結束用チューブ99によって束ねたもの
であるが、その先端部の導入管85a,85bに挿入される部
分は導入管より僅かに細い金属管100a,100bがはめられ
ている。なお、ケース94の上部には蓋90が設けられてお
り、この蓋90には、シリンジ等を通すための小孔91が設
けられている。実際の測定は、容器27に送光される光の
強さ、室内の明るさ、測定する光の波長範囲等によっ
て、遮光ケース94全体を取り外して行なってもよい場
合、上部の蓋90のみを取り外してもよい場合、蓋をして
その小孔から試料を添加する場合などがある。

この装置を用いてこのヘモグロビンと酸素との結合度と
酸素濃度との関係を測定した結果を第６図B,Cに示す。
この実験では、反応溶液110としてはヘモグロビンのヘ
ム鉄を常に２価状態に保つためのヘモグロビン還元酵素
系（NADPH＋フェレドキシン−NADPH還元酵素＋フェレド
キシン）を含む0.05Mリン酸緩衝液（pH7.0）を用い、ヘ
モグロビンの濃度は83μＭ、温度は30℃にした。送光用
光導管98aからは分光した単色光を450nmから650nmの波
長間を５秒間に走査して、被測定溶液に入射した。この
場合反応溶液110の光路長は10mmでこの中を透った透過
光は、受光用光導管98bで受光されて、光電倍増管（図
示せず）に導かれる。実験は最初にヘモグロビンを含ま
ない反応液で行なって、そのときの各波長での透過光の
強さを記憶させ、次にヘモグロビンを含んだ反応液で同
様の測定を行ない各波長の透過光の強さの比をベールの
法則によって処理して、データレコーダ（図示せず）等
に波長と吸光度（Absorbance）差を示すグラフすなわち
吸収スペクトルとして表示した。なお、この実験を行な
っている間、試料溶液は常に攪拌されており、そのO₂濃
度は常に別のレコーダーに記録されスペクトルを測定し
た時点がマークされている。このO₂濃度の記録曲線は第
６図Ｃに示してある。この実験では、まずヘモグロビン
を含まない反応液のスペクトルを描かせたが、これは当
然直線になり、第６図Ｂでは直線Ａで示されている。次
に反応溶液にヘモグロビン（最初濃度83μＭ）を加え、
溶液の少量をミクロシリンジでぬいて容器の細管の下で
溶液を気相と接触させ、この気相にN₂ガスを通気しなが
ら攪拌して溶液中のO₂を除去すると無酸素状態のヘモグ
ロビン溶液ができる。この状態のスペクトルが第６図の
曲線Ｂである。次に前述の気相に４％O₂96％N₂混合気体
を通気して溶液のO₂濃度が少し上昇した点（第６図Ｃの
Ｃのマーク点）で記録したスペクトルが第６図６の曲線
ＣでこのときのO₂濃度は11.3μＭであった。さらにO₂濃
度が上昇した点（第６図ＣのＤのマーク点）で測定した
スペクトルが第６図Ｂの曲線Ｄで、このときのO₂濃度は
26.2μＭであった。次に通気ガスを８％−92％N₂に変え
て溶液のO₂濃度を上げてＥマークの点（O₂＝41.8μＭ）
で得たスペクトルが曲線Ｅであり、更にO₂濃度の上昇し
た点（Ｆマークの点、O₂＝64.1μＭ）で得たスペクトル
が曲線Ｆである。次に通気ガスを20.7％O₂（空気）に切
りかえてからＧマークの点（O₂＝173.3μＭ）で得たス
ペクトルが曲線Ｇであり、これ以上O₂濃度が増加しても
スペクトルの形は変らなかったから、この曲線が100％O
₂飽和ヘモグロビンのスペクトルであることがわかっ
た。このような実験を通じて、ヘモグロビンの酸素化の
程度（酸素飽和度）と酸素濃度との関係が正確に測定で
きた。

この実施例によれば試料溶液の酸素濃度の測定と同時に
光学測定を正確に行うことができる。

［発明の効果］この発明によれば次のような効果を得ることができる。

複合型酸素電極を容器の下部に設けているので、気泡が
上部に抜けやすいような容器の形状とすることができ
る。さらに、容器の直径や高さを電極の直径にかかわら
ず小さくできるので、測定試料の大幅な節約をはかるこ
とができる。このことは特に、医学的生物学的試料であ
って極めて少量した得られない試料を用いる場合や、高
価な試薬類を扱う場合には極めて有効である。

また、薄型の複合型酸素電極を用いているので、電極の
下に設けられた磁場回転手段によって容器内の磁気攪拌
体を回転させることができる。

なお、複合型酸素電極を容器の下部に設けているので、
容器側面に光学的測定のための光導体を設けることが容
易である。

さらに、本発明の配置と形状をとる場合には、電極また
は容器支持体に定温加熱手段を設けると、容器内の試料
溶液を容易に定温に保つことができるので、従来のよう
に恒温槽を使用するという繁雑さを省略することができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の一実施例による酸素濃度測定用容器
を示す図、第２図はその電極ユニットの詳細を示す図、
第３図は電極ユニットの平面断面図、第４図はこの発明
の他の実施例による酸素濃度測定用容器を示す図、第５
図は光学測定を同時に行う他の実施例を示す図、第６図
Ａは第１図の酸素濃度測定用容器を用いてミトコンドリ
アの酸素消費反応を測定した結果を示す図、第６図Ｂは
第５図の酸素濃度測定用容器を用いて測定した赤血球分
散溶液の吸収スペクトルを示す図、第６図Ｃは酸素濃度
の変化を示す図、第７図は従来の酸素濃度測定用容器を
示す図である。 22は電極ユニット、27は容器、30は磁気攪拌体である。なお、各図中同一符号は同一または相当部分を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】上部に細管状開口部を設け上部が円錐状で
スムーズに開口部の細管部と連なって気泡が容易に上に
抜ける形状の被測定反応液収納用の容器、電極面が容器の底面を構成するように配された複合型酸
素測定用電極を上面に有し、少なくとも一部が前記容器
内の反応溶液と熱的に接触する熱伝導性の材料のブロッ
クよりなり、そのブロックの中に、定温加熱手段を備え
た偏平型の電極ユニット、電極ユニットの下に置かれた磁場回転手段、及び電極ユニットの上の容器に固定されずに置かれ、前記磁
場回転手段によって回転されて容器内の被測定溶液を攪
拌する磁気回転子、を備えたことを特徴とする酸素濃度測定用容器。
【請求項２】上部に細管状開口部を設け上部が円錐状で
スムーズに開口部の細管部と連なって気泡が容易に上に
抜ける形状の被測定反応液収納用の容器、電極面が容器の底面を構成するように配された複合型酸
素測定用電極を上面に有する偏平型の電極ユニット、容器と熱的に接触する熱伝導性材料よりなり容器側面の
外周に伝熱的に接触し内部に定温加熱手段を備え、電極
ユニットに固定された容器支持体、電極ユニットの下に置かれた磁場回転手段、及び電極ユニットの上の容器に固定されずに置かれ、前記磁
場回転手段によって回転されて容器内の被測定溶液を撹
拌する磁気回転子、を備えたことを特徴とする酸素濃度測定用容器。
【請求項３】上部に細管状開口部を設け上部が円錐状で
スムーズに開口部の細管部と連なって気泡が容易に上に
抜ける形状のガラス又はプラスチックの光透過性の被測
定反応液収納用の容器、電極面が容器の底面を構成するように配された複合型酸
素測定用電極を上面に有し、少なくとも一部が前記容器
内の反応溶液と熱的に接触する熱伝導性の材料のブロッ
クよりなり、そのブロックの中に、定温加熱手段を備え
た偏平型の電極ユニット、電極ユニットの下に置かれた磁場回転手段、電極ユニットの上の容器に固定されずに置かれ、前記磁
場回転手段によって回転されて容器内の被測定溶液を攪
拌する磁気回転子、前記容器を収納するしゃ光容器、前記容器の側面に光学測定のため設けた送光手段、及び前記送光手段に対向する側面に光学測定のため設けた受
光手段、を備えたことを特徴とする酸素濃度測定用容器。