JPH0692995A - ヒユーマン・マスキングプロテインおよび高分子ユニット - Google Patents
ヒユーマン・マスキングプロテインおよび高分子ユニットInfo
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- JPH0692995A JPH0692995A JP3337508A JP33750891A JPH0692995A JP H0692995 A JPH0692995 A JP H0692995A JP 3337508 A JP3337508 A JP 3337508A JP 33750891 A JP33750891 A JP 33750891A JP H0692995 A JPH0692995 A JP H0692995A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は、トランスフォーミング増殖因子ベー
タ（ＴＧＦ−β）をマスクし、これを不活性化するヒュ
ーマン・マスキングプロテイン、その高分子サブユニッ
トおよびプレカーサーとなるポリペプタイド、これらを
コードするヌクレオチドを提供することを目的とする。 【構成】本発明は、配列番号１ないし４記載のポリペプ
タイド、これらからなるｈＭＰＵ、ｈＭＰ、配列番号５
ないし８記載のポリヌクレオチドの発明である。 【効果】本発明のポリペプタイドおよびＭＰＵ、低分子
サブユニットと結合したｈＭＰＵは、それ自体、また必
要により糖鎖と結合することにより、ＴＧＦ−βと結合
し、腫瘍細胞の増殖抑制等各種生理活性を発揮する。配
列番号１のポリペプタイドおよび本発明のポリヌクレオ
チドは、本発明のポリペプタイドを製造することができ
る。
タ（ＴＧＦ−β）をマスクし、これを不活性化するヒュ
ーマン・マスキングプロテイン、その高分子サブユニッ
トおよびプレカーサーとなるポリペプタイド、これらを
コードするヌクレオチドを提供することを目的とする。 【構成】本発明は、配列番号１ないし４記載のポリペプ
タイド、これらからなるｈＭＰＵ、ｈＭＰ、配列番号５
ないし８記載のポリヌクレオチドの発明である。 【効果】本発明のポリペプタイドおよびＭＰＵ、低分子
サブユニットと結合したｈＭＰＵは、それ自体、また必
要により糖鎖と結合することにより、ＴＧＦ−βと結合
し、腫瘍細胞の増殖抑制等各種生理活性を発揮する。配
列番号１のポリペプタイドおよび本発明のポリヌクレオ
チドは、本発明のポリペプタイドを製造することができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トランスフォーミング
増殖因子ベータ（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒ−β、以下「ＴＧＦ−β」という）を
マスクし、これを不活性化するヒューマン・マスキング
プロテインおよびその高分子サブユニット、プレカーサ
ー（前駆体）となるポリペプタイドならびにこれらをコ
ードするヌクレオチドに関する。
増殖因子ベータ（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒ−β、以下「ＴＧＦ−β」という）を
マスクし、これを不活性化するヒューマン・マスキング
プロテインおよびその高分子サブユニット、プレカーサ
ー（前駆体）となるポリペプタイドならびにこれらをコ
ードするヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】トランスフォーミング増殖因子ベータＴ
ＧＦ−βは、本来軟寒天中では増殖しない正常ラット腎
臓由来ＮＲＫ細胞の軟寒天中での増殖を促進する因子と
して、ＭｕＳＶ（マウスＲＮＡ肉腫ウイルス）で形質転
換した細胞の培養上清中から１９７８年に発見された蛋
白質で、トランスフォーメーション（形質転換）に関連
するという意味からトランスフォーミング増殖因子と名
付けられ、腫瘍細胞に特異的に存在する物質であると考
えられた。その後の研究の成果により、ＴＧＦ−βが正
常組織、特に血小板に多く存在することが解明され、生
体内での多様な生理現象に関与していることが明らかと
なった。
ＧＦ−βは、本来軟寒天中では増殖しない正常ラット腎
臓由来ＮＲＫ細胞の軟寒天中での増殖を促進する因子と
して、ＭｕＳＶ（マウスＲＮＡ肉腫ウイルス）で形質転
換した細胞の培養上清中から１９７８年に発見された蛋
白質で、トランスフォーメーション（形質転換）に関連
するという意味からトランスフォーミング増殖因子と名
付けられ、腫瘍細胞に特異的に存在する物質であると考
えられた。その後の研究の成果により、ＴＧＦ−βが正
常組織、特に血小板に多く存在することが解明され、生
体内での多様な生理現象に関与していることが明らかと
なった。
【０００３】ヒト血小板から最初に純化されたＴＧＦ−
βは現在ＴＧＦ−β１と命名され、ＴＧＦ−β類縁物質
としてこれまでにヒト、ラット、ブタ、ニワトリなどか
らβ１〜β５の５種類が発見されている。以下本発明に
おいては、これらＴＧＦ−β類縁物質を「ＴＧＦ−β」
と総称する。ＴＧＦ−βは哺乳動物のほとんどすべての
細胞に対して何らかの作用を示し、また種々の疾患に対
しての治療的応用が期待されている。ＴＧＦ−βの主な
作用として、正常培養線維芽細胞など間葉系の細胞に対
する増殖促進、肝細胞など上皮系細胞に対する増殖抑
制、細胞分化の制御、Ｔ細胞など免疫系細胞に対する増
殖抑制、造血系細胞に対する増殖抑制などがｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで確認されており、生体中での活性としては、創
傷治癒の促進、骨代謝、肝再生停止などへの関与が見い
出されている。
βは現在ＴＧＦ−β１と命名され、ＴＧＦ−β類縁物質
としてこれまでにヒト、ラット、ブタ、ニワトリなどか
らβ１〜β５の５種類が発見されている。以下本発明に
おいては、これらＴＧＦ−β類縁物質を「ＴＧＦ−β」
と総称する。ＴＧＦ−βは哺乳動物のほとんどすべての
細胞に対して何らかの作用を示し、また種々の疾患に対
しての治療的応用が期待されている。ＴＧＦ−βの主な
作用として、正常培養線維芽細胞など間葉系の細胞に対
する増殖促進、肝細胞など上皮系細胞に対する増殖抑
制、細胞分化の制御、Ｔ細胞など免疫系細胞に対する増
殖抑制、造血系細胞に対する増殖抑制などがｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで確認されており、生体中での活性としては、創
傷治癒の促進、骨代謝、肝再生停止などへの関与が見い
出されている。
【０００４】ＴＧＦ−β１は３９０個のアミノ酸からな
る前駆体（潜在型）として作られ、Ｃ末端側の１１２個
のアミノ酸に切断されてダイマーとなり活性型となるこ
とがこれまでに解明されている。動物細胞からの精製や
遺伝子組換え細胞での発現によってＴＧＦ−βあるいは
その部分ペプタイドを製造することができ、その臨床的
な応用開発、例えば上皮系細胞の増殖促進活性を利用し
た火傷、手術後などの創傷治癒剤、湿疹治療剤、骨形成
への関与から骨粗しょう症治療剤、免疫系細胞の増殖抑
制から臓器移植や免疫疾患における免疫抑制剤などへ利
用が試みられている。
る前駆体（潜在型）として作られ、Ｃ末端側の１１２個
のアミノ酸に切断されてダイマーとなり活性型となるこ
とがこれまでに解明されている。動物細胞からの精製や
遺伝子組換え細胞での発現によってＴＧＦ−βあるいは
その部分ペプタイドを製造することができ、その臨床的
な応用開発、例えば上皮系細胞の増殖促進活性を利用し
た火傷、手術後などの創傷治癒剤、湿疹治療剤、骨形成
への関与から骨粗しょう症治療剤、免疫系細胞の増殖抑
制から臓器移植や免疫疾患における免疫抑制剤などへ利
用が試みられている。
【０００５】ガン細胞は、ＴＧＦ−βを自ら大量に産生
していて、ガン細胞自身の増殖促進とｋｉｌｌｅｒＴ細
胞やｈｅｌｐｅｒＴ細胞など免疫系細胞の増殖抑制を通
じて旺盛な増殖を繰り返すことが知られている。
していて、ガン細胞自身の増殖促進とｋｉｌｌｅｒＴ細
胞やｈｅｌｐｅｒＴ細胞など免疫系細胞の増殖抑制を通
じて旺盛な増殖を繰り返すことが知られている。
【０００６】他方、正常細胞が生産するＴＧＦ−βは、
後記のようにいずれもマスキングプロテインと複合体を
形成した不活性型であることが解明された。一方、ガン
細胞の多くはＴＧＦ−βを活性型で分泌することが知ら
れている。
後記のようにいずれもマスキングプロテインと複合体を
形成した不活性型であることが解明された。一方、ガン
細胞の多くはＴＧＦ−βを活性型で分泌することが知ら
れている。
【０００７】従って、ＴＧＦ−βを不活性化する因子は
制ガン剤として非常に有望である。この因子は本発明者
がラット血小板に発見しＴＧＦ−βマスキングプロテイ
ンと命名したポリペプタイドが、現在までに発見されて
いるＴＧＦ−βと特異的に反応しこれを不活化する唯一
の物質であった（Ｂｉｏｃｈｅｍ ＢｉｏｐｈｙｓＲｅ
ｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１４１，１７６−１８４，１９８
６）。また、ＴＧＦ−βの多様な活性を解析するために
は生体内でこれを調節する機構の解明が重要であり、そ
のためにもヒトのマスキングプロテインの詳細な構造を
解析することと、ヒト組織中から精製蛋白質として入手
することが望まれてきた。
制ガン剤として非常に有望である。この因子は本発明者
がラット血小板に発見しＴＧＦ−βマスキングプロテイ
ンと命名したポリペプタイドが、現在までに発見されて
いるＴＧＦ−βと特異的に反応しこれを不活化する唯一
の物質であった（Ｂｉｏｃｈｅｍ ＢｉｏｐｈｙｓＲｅ
ｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１４１，１７６−１８４，１９８
６）。また、ＴＧＦ−βの多様な活性を解析するために
は生体内でこれを調節する機構の解明が重要であり、そ
のためにもヒトのマスキングプロテインの詳細な構造を
解析することと、ヒト組織中から精製蛋白質として入手
することが望まれてきた。
【０００８】本発明者は、ラット組織中から、ＴＧＦ−
βと特異的に結合する蛋白質の高分子サブユニットＭＰ
Ｕ、そのプレカーサＭＰＵ−Ｐ、そのプレプロ構造体Ｍ
ＰＵ−ＰＰ、これらをコードする遺伝子ＭＰＵ−Ｎおよ
びポリヌクレオチドＭＰＵ−ＰＮ、ＭＰＵ−ＰＰＮを精
製、単離、特定し、これらを特願平２−１７３６７９号
として出願済である。
βと特異的に結合する蛋白質の高分子サブユニットＭＰ
Ｕ、そのプレカーサＭＰＵ−Ｐ、そのプレプロ構造体Ｍ
ＰＵ−ＰＰ、これらをコードする遺伝子ＭＰＵ−Ｎおよ
びポリヌクレオチドＭＰＵ−ＰＮ、ＭＰＵ−ＰＰＮを精
製、単離、特定し、これらを特願平２−１７３６７９号
として出願済である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明者が発見したＴ
ＧＦ−βマスキングプロテインは、ガン細胞の増殖を促
進するＴＧＦ−βと特異的に反応しこれを不活性化する
ことから、これをヒト組織からも精製蛋白質として入手
するとともに、その詳細な構造を解析し、これによりガ
ン細胞の増殖を抑制する物質の製造に寄与することが課
題とされていた。
ＧＦ−βマスキングプロテインは、ガン細胞の増殖を促
進するＴＧＦ−βと特異的に反応しこれを不活性化する
ことから、これをヒト組織からも精製蛋白質として入手
するとともに、その詳細な構造を解析し、これによりガ
ン細胞の増殖を抑制する物質の製造に寄与することが課
題とされていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、トランスフォ
ーミング増殖因子ベータ（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧ
ｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β）（「ＴＧＦ−β」）と
特異的に結合するヒューマン・マスキングプロテインｈ
ＭＰ、その高分子サブユニットｈＭＰＵ、そのプレカー
サーｈＭＰＵ−Ｐならびにこれらをコードする遺伝子ｈ
ＭＰＵ−ＮおよびポリヌクレオチドｈＭＰＵ−ＰＮの発
明である。
ーミング増殖因子ベータ（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧ
ｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β）（「ＴＧＦ−β」）と
特異的に結合するヒューマン・マスキングプロテインｈ
ＭＰ、その高分子サブユニットｈＭＰＵ、そのプレカー
サーｈＭＰＵ−Ｐならびにこれらをコードする遺伝子ｈ
ＭＰＵ−ＮおよびポリヌクレオチドｈＭＰＵ−ＰＮの発
明である。
【００１１】本発明者は、ＴＧＦ−βを不活性化する蛋
白質の存在を次のようにして解明した。すなわち、ＴＧ
Ｆが非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量が２６ｋＤで
あるのに対し、潜在型ＴＧＦ−βは４００〜５００ｋＤ
もの高分子量であることを手がかりに、ＴＧＦ−βを不
活化する高分子蛋白質の存在を予測し研究を重ねた結
果、ＴＧＦ−βに特異的に結合する蛋白質をラット血小
板から部分精製することに成功し、これをＴＧＦ−βマ
スキングプロテイン（ＴＧＦ−β ｍａｓｋｉｎｇｐｒ
ｏｔｅｉｎ）と命名した（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１４１ １７６−１８
４，１９８６）。ＴＧＦ−βマスキングプロテイン（以
下「ＭＰ」という）は、２個の３９ｋＤサブユニットと
１個の１１０ＫＤサブユニットからなる異型三量体であ
り、このうち３９ｋＤサブユニットのＮ末端１５塩基の
アミノ酸配列を決定したところ、ＴＧＦ−β前駆体のシ
グナル配列に続くＮ末端領域のアミノ酸配列と一致した
（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，８３，６４
８９−６４９３，１９８６。ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２４
２，２４０−２４４，１９８９）。これによりＭＰの３
９ｋＤサブユニットはＴＧＦ−βの前駆蛋白質部分にす
ぎないことが解明された。
白質の存在を次のようにして解明した。すなわち、ＴＧ
Ｆが非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量が２６ｋＤで
あるのに対し、潜在型ＴＧＦ−βは４００〜５００ｋＤ
もの高分子量であることを手がかりに、ＴＧＦ−βを不
活化する高分子蛋白質の存在を予測し研究を重ねた結
果、ＴＧＦ−βに特異的に結合する蛋白質をラット血小
板から部分精製することに成功し、これをＴＧＦ−βマ
スキングプロテイン（ＴＧＦ−β ｍａｓｋｉｎｇｐｒ
ｏｔｅｉｎ）と命名した（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１４１ １７６−１８
４，１９８６）。ＴＧＦ−βマスキングプロテイン（以
下「ＭＰ」という）は、２個の３９ｋＤサブユニットと
１個の１１０ＫＤサブユニットからなる異型三量体であ
り、このうち３９ｋＤサブユニットのＮ末端１５塩基の
アミノ酸配列を決定したところ、ＴＧＦ−β前駆体のシ
グナル配列に続くＮ末端領域のアミノ酸配列と一致した
（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，８３，６４
８９−６４９３，１９８６。ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２４
２，２４０−２４４，１９８９）。これによりＭＰの３
９ｋＤサブユニットはＴＧＦ−βの前駆蛋白質部分にす
ぎないことが解明された。
【００１２】他方、本発明者は１１０ｋＤサブユニット
（以下「高分子サブユニット」という）について研究を
進め、これがＴＧＦ−βの不活性化に重要な役割を果た
していることを解明するとともに、ラット血小板より単
離精製した該蛋白質のアミノ酸配列とこれをコードする
遺伝子の塩基配列を解析し、全く新規の蛋白質であるこ
とを明らかにすることができ、この新規の高分子サブユ
ニットをＭＰＵと命名した。これにより、本発明者は、
トランスフォーミング増殖因子ベータ（Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β）と特異
的に結合する蛋白質の高分子サブユニットＭＰＵをラッ
ト血小板から単離・精製・特定して前記特願平２−１７
３６７９号を完成させた。
（以下「高分子サブユニット」という）について研究を
進め、これがＴＧＦ−βの不活性化に重要な役割を果た
していることを解明するとともに、ラット血小板より単
離精製した該蛋白質のアミノ酸配列とこれをコードする
遺伝子の塩基配列を解析し、全く新規の蛋白質であるこ
とを明らかにすることができ、この新規の高分子サブユ
ニットをＭＰＵと命名した。これにより、本発明者は、
トランスフォーミング増殖因子ベータ（Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β）と特異
的に結合する蛋白質の高分子サブユニットＭＰＵをラッ
ト血小板から単離・精製・特定して前記特願平２−１７
３６７９号を完成させた。
【００１３】さらに、本発明者は、ひき続き鋭意研究を
進めた結果、ヒト血小板からＴＧＦ−βヒューマン・マ
スキングプロテインを単離・精製し、これを特定するこ
とによって本発明を完成させた。すなわち、本発明は、
トランスフォーミング増殖因子ベータ（Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β）と
特異的に結合するマスキングプロテインｈＭＰ、蛋白質
の成熟型高分子サブユニットｈＭＰＵ、ならびにこれを
産生する遺伝子の発明である。ｈＭＰＵ−１、２、３な
らびにそのプレカーサーｈＭＰＵ−Ｐを単離精製するこ
とに成功した。さらに、本発明者は、ヒト胎盤由来ｃＤ
ＮＡライブラリーを解析することにより、成熟型ｈＭＰ
Ｕ−１、２、３および前駆体ｈＭＰＵ−Ｐをコードする
遺伝子の塩基配列を解明し、本発明を完成した。
進めた結果、ヒト血小板からＴＧＦ−βヒューマン・マ
スキングプロテインを単離・精製し、これを特定するこ
とによって本発明を完成させた。すなわち、本発明は、
トランスフォーミング増殖因子ベータ（Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β）と
特異的に結合するマスキングプロテインｈＭＰ、蛋白質
の成熟型高分子サブユニットｈＭＰＵ、ならびにこれを
産生する遺伝子の発明である。ｈＭＰＵ−１、２、３な
らびにそのプレカーサーｈＭＰＵ−Ｐを単離精製するこ
とに成功した。さらに、本発明者は、ヒト胎盤由来ｃＤ
ＮＡライブラリーを解析することにより、成熟型ｈＭＰ
Ｕ−１、２、３および前駆体ｈＭＰＵ−Ｐをコードする
遺伝子の塩基配列を解明し、本発明を完成した。
【００１４】すなわち、本発明は、配列番号１記載のア
ミノ酸配列を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−１の発明
である。
ミノ酸配列を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−１の発明
である。
【００１５】本発明は、配列番号２記載のアミノ酸配列
を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−２の発明である。
を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−２の発明である。
【００１６】本発明は、配列番号３記載のアミノ酸配列
を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−３の発明である。
を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−３の発明である。
【００１７】本発明は、配列番号１ないし３記載のアミ
ノ酸配列を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−１、ｈＭＰ
Ｕ−２、ｈＭＰＵ−３の混合ポリペプタイドｈＭＰＵの
発明である。
ノ酸配列を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−１、ｈＭＰ
Ｕ−２、ｈＭＰＵ−３の混合ポリペプタイドｈＭＰＵの
発明である。
【００１８】本発明は、配列番号９記載のアミノ酸配列
を有するポリペプタイドと、前項記載のポリペプタイド
ｈＭＰＵがＳ−Ｓ結合してなるヒューマン・マスキング
プロテインｈＭＰの発明である。
を有するポリペプタイドと、前項記載のポリペプタイド
ｈＭＰＵがＳ−Ｓ結合してなるヒューマン・マスキング
プロテインｈＭＰの発明である。
【００１９】本発明は、配列番号４記載のアミノ酸配列
を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−Ｐの発明である。
を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−Ｐの発明である。
【００２０】本発明は、配列番号５記載の塩基配列を有
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−１Ｎの発明である。
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−１Ｎの発明である。
【００２１】本発明は、配列番号６記載の塩基配列を有
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−２Ｎの発明である。
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−２Ｎの発明である。
【００２２】本発明は、配列番号７記載の塩基配列を有
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−３Ｎの発明である。
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−３Ｎの発明である。
【００２３】本発明は、配列番号８記載の塩基配列を有
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−ＰＮの発明である。
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−ＰＮの発明である。
【００２４】本発明のポリペプタイドおよびポリヌクレ
オチドには、上記のアミノ酸配列および塩基配列を有す
るものが含まれるが、もとより本発明が同一の配列を有
するものだけに限定されるのではなく、部分的な差異を
有するものであっても実質的に同一の配列を有する物質
は本発明の範囲に包含される。
オチドには、上記のアミノ酸配列および塩基配列を有す
るものが含まれるが、もとより本発明が同一の配列を有
するものだけに限定されるのではなく、部分的な差異を
有するものであっても実質的に同一の配列を有する物質
は本発明の範囲に包含される。
【００２５】本発明は、有用なポリペプタイドおよびポ
リヌクレオチド自体の発明であるから、製造方法や用途
がいかなるものであろうとも本発明の範囲に包含され
る。
リヌクレオチド自体の発明であるから、製造方法や用途
がいかなるものであろうとも本発明の範囲に包含され
る。
【００２６】本発明のポリペプタイドおよびポリヌクレ
オチドは、ヒトの胃、肺、腎臓、胸腺等の組織、または
血清、血奨等より、例えば、実施例１に示す手順に従っ
て抽出・精製することができる。
オチドは、ヒトの胃、肺、腎臓、胸腺等の組織、または
血清、血奨等より、例えば、実施例１に示す手順に従っ
て抽出・精製することができる。
【００２７】例えば、ヒト血小板を超音波で粉砕したの
ち、プロテアーゼインヒビターを添加して遠心分離し、
その上清を潜在型ＴＧＦ−β複合体を精製する方法に準
じて各種ゲルカラムにて精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
離したのちに膜に転写することにより、本発明のｈＭＰ
Ｕ−１、２、３、Ｐを単離することができる。
ち、プロテアーゼインヒビターを添加して遠心分離し、
その上清を潜在型ＴＧＦ−β複合体を精製する方法に準
じて各種ゲルカラムにて精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
離したのちに膜に転写することにより、本発明のｈＭＰ
Ｕ−１、２、３、Ｐを単離することができる。
【００２８】本発明のポリペプタイドを製造する別の方
法としては、本発明の塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドをヒト組識から抽出、精製し、あるいはこれらを合成
したうえ、適切な発現ベクターに組み込み、大腸菌等の
培養細胞に遺伝子導入して、その培養上清から得ること
ができる。
法としては、本発明の塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドをヒト組識から抽出、精製し、あるいはこれらを合成
したうえ、適切な発現ベクターに組み込み、大腸菌等の
培養細胞に遺伝子導入して、その培養上清から得ること
ができる。
【００２９】さらに具体的には、通常用いられる遺伝子
工学的な手法、例えば次のような手順に従って製造する
ことができる。 すなわ
ち、 ヒトの組織細胞や血清、血奨から抽出したｍＲＮＡを
鋳型としてＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクシ
ョン）法を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを大
腸菌由来プラスミドｐＢＲ３２２、あるいはバクテリオ
ファージλｇｔ１１などの組換えベクターに組み込み、 大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５１
４などの宿主細胞に組み込んで発現させ、 本発明によって明らかにされた塩基配列に基づいて合
成された部分オリゴヌクレオチド（放射性ラベル）プロ
ーブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法または
プラークハイブリダイゼーション法などによって目的の
ｃＤＮＡを選択する。 さらに、マクサムとギルバートの化学法（Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、７４、５６０，１９７
７）などによりｃＤＮＡの塩基配列を決定し、 ヒトＭＰ高分子サブユニットのアミノ酸配列の全部を
コードするｃＤＮＡを含有するベクターから制限酵素に
よってｃＤＮＡを切り出し、 適切な発現ベクター、例えば大腸菌由来のプラズミド
ｐＢＲ３２２、あるいは腫瘍ウイルスＳＶ４０などに制
限酵素とＤＮＡリガーゼを用いて組み込み、 マウスＣ１２７細胞やサルＣＯＳ細胞に導入して発現
させて得る。
工学的な手法、例えば次のような手順に従って製造する
ことができる。 すなわ
ち、 ヒトの組織細胞や血清、血奨から抽出したｍＲＮＡを
鋳型としてＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクシ
ョン）法を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを大
腸菌由来プラスミドｐＢＲ３２２、あるいはバクテリオ
ファージλｇｔ１１などの組換えベクターに組み込み、 大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５１
４などの宿主細胞に組み込んで発現させ、 本発明によって明らかにされた塩基配列に基づいて合
成された部分オリゴヌクレオチド（放射性ラベル）プロ
ーブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法または
プラークハイブリダイゼーション法などによって目的の
ｃＤＮＡを選択する。 さらに、マクサムとギルバートの化学法（Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、７４、５６０，１９７
７）などによりｃＤＮＡの塩基配列を決定し、 ヒトＭＰ高分子サブユニットのアミノ酸配列の全部を
コードするｃＤＮＡを含有するベクターから制限酵素に
よってｃＤＮＡを切り出し、 適切な発現ベクター、例えば大腸菌由来のプラズミド
ｐＢＲ３２２、あるいは腫瘍ウイルスＳＶ４０などに制
限酵素とＤＮＡリガーゼを用いて組み込み、 マウスＣ１２７細胞やサルＣＯＳ細胞に導入して発現
させて得る。
【００３０】
【作用】本発明の高分子サブユニットｈＭＰＵ−１、
２、３、およびこれらからなるｈＭＰＵは、これとは別
に精製、または発現させて得た低分子サブユニット（そ
のアミノ酸配列の１例を配列番号９に示すが、もとより
これと部分的差異を有するが実質上同一の配列を有し、
同一の活性を有するものも含まれる）と化学的または酵
素的に結合させて本発明のｈＭＰＵを得ることができ
る。ｈＭＰは、それ自体、また、必要により糖鎖と結合
させることによって、ＴＧＦ−βと特異的に結合する活
性を有する。
２、３、およびこれらからなるｈＭＰＵは、これとは別
に精製、または発現させて得た低分子サブユニット（そ
のアミノ酸配列の１例を配列番号９に示すが、もとより
これと部分的差異を有するが実質上同一の配列を有し、
同一の活性を有するものも含まれる）と化学的または酵
素的に結合させて本発明のｈＭＰＵを得ることができ
る。ｈＭＰは、それ自体、また、必要により糖鎖と結合
させることによって、ＴＧＦ−βと特異的に結合する活
性を有する。
【００３１】本発明者の研究によれば、成熟型ラット初
代培養肝細胞のＤＮＡ合成抑制活性およびＮＲＫ４９Ｆ
細胞コロニー形成活性バイオアッセイ系の結果から、本
発明の高分子サブユニットｈＭＰＵ−１、２、３からな
るｈＭＰＵを低分子サブユニットと結合させたｈＭＰ
は、それ自体、また必要により糖鎖と結合させることに
より、ヒト由来ＴＧＦ−βのみならず、ラットＴＧＦ−
βの活性をも完全に抑制することが確認された。このよ
うに、本発明のｈＭＰならびにその高分子サブユニット
ｈＭＰＵ、ｈＭＰＵ−１、２、３は、ヒトをはじめ各種
動物において、ＴＧＦ−β活性を抑制することができ
る。
代培養肝細胞のＤＮＡ合成抑制活性およびＮＲＫ４９Ｆ
細胞コロニー形成活性バイオアッセイ系の結果から、本
発明の高分子サブユニットｈＭＰＵ−１、２、３からな
るｈＭＰＵを低分子サブユニットと結合させたｈＭＰ
は、それ自体、また必要により糖鎖と結合させることに
より、ヒト由来ＴＧＦ−βのみならず、ラットＴＧＦ−
βの活性をも完全に抑制することが確認された。このよ
うに、本発明のｈＭＰならびにその高分子サブユニット
ｈＭＰＵ、ｈＭＰＵ−１、２、３は、ヒトをはじめ各種
動物において、ＴＧＦ−β活性を抑制することができ
る。
【００３２】また、本発明の高分子サブユニットｈＭＰ
Ｕ−Ｐは、ｈＭＰＵ−１、２、３の前駆体であって、こ
れよりｈＭＰＵ−１、２、３を製造することができる。
Ｕ−Ｐは、ｈＭＰＵ−１、２、３の前駆体であって、こ
れよりｈＭＰＵ−１、２、３を製造することができる。
【００３３】また、本発明のｈＭＰＵ−１Ｎ、２Ｎ、３
Ｎ、ＰＮは、公知の遺伝子工学的手法を用いて、本発明
のｈＭＰＵ−１、２、３、Ｐを製造することができる。
Ｎ、ＰＮは、公知の遺伝子工学的手法を用いて、本発明
のｈＭＰＵ−１、２、３、Ｐを製造することができる。
【００３４】
【実施例】以下、本発明を詳細に説明するため実施例を
記載するが、もとより本発明がこれら実施例に限定され
ることはない。
記載するが、もとより本発明がこれら実施例に限定され
ることはない。
【００３５】実施例１ 部分的アミノ酸配列の決定 潜在型ＴＧＦ−β複合体は次の方法にしたがってヒト血
小板から精製した。ヒト血小板を５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液に懸濁し、超音波粉砕したのちアンチパイ
ン、ベスタチンなどのプロテアーゼインヒビターを加え
て遠心分離した。上清をＳセファロースゲルと混合し、
遠心分離した。上清をスターテングマテリアルとして、
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ｓ、フェニルセ
ファロースＣＬ−４Ｂ、キレーティングセファロース、
Ｃｕキレーティングセファロース、セファロース６の各
ゲルカラムを用いて精製した（Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１
０６，３０４，−３１０，１９８９）。
小板から精製した。ヒト血小板を５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液に懸濁し、超音波粉砕したのちアンチパイ
ン、ベスタチンなどのプロテアーゼインヒビターを加え
て遠心分離した。上清をＳセファロースゲルと混合し、
遠心分離した。上清をスターテングマテリアルとして、
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ｓ、フェニルセ
ファロースＣＬ−４Ｂ、キレーティングセファロース、
Ｃｕキレーティングセファロース、セファロース６の各
ゲルカラムを用いて精製した（Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１
０６，３０４，−３１０，１９８９）。
【００３６】マスキングプロテインと遊離成熟型高分
子サブユニットｈＭＰＵの分離 で得た潜在型ＴＧＦ−β複合体画分を、溶出溶媒に濃
度勾配をつけた逆相液体クロマトグラフィーにかけたと
ころ、図１のパターンを示し３ピークに分離された。そ
れぞれのピークを分取し、非還元下および還元下でＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析した結果を図２に示す（ａ：非還元
下、ｂ：還元下）。対照（レーン１）として置いたラッ
ト由来の潜在型ＴＧＦ−β複合体（ラットＭＰを含む）
との比較より、ピーク１は遊離成熟型高分子サブユニッ
トｈＭＰＵ（レーン２）、ピーク２は遊離ＴＧＦ−β
（レーン３）、ピーク３はｈＭＰ（レーン４）と推定さ
れた。ピーク１の画分を還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
けた後、ポリビニリデン−ジフルオライド膜に転写し膜
上にｈＭＰＵを得た。
子サブユニットｈＭＰＵの分離 で得た潜在型ＴＧＦ−β複合体画分を、溶出溶媒に濃
度勾配をつけた逆相液体クロマトグラフィーにかけたと
ころ、図１のパターンを示し３ピークに分離された。そ
れぞれのピークを分取し、非還元下および還元下でＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析した結果を図２に示す（ａ：非還元
下、ｂ：還元下）。対照（レーン１）として置いたラッ
ト由来の潜在型ＴＧＦ−β複合体（ラットＭＰを含む）
との比較より、ピーク１は遊離成熟型高分子サブユニッ
トｈＭＰＵ（レーン２）、ピーク２は遊離ＴＧＦ−β
（レーン３）、ピーク３はｈＭＰ（レーン４）と推定さ
れた。ピーク１の画分を還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
けた後、ポリビニリデン−ジフルオライド膜に転写し膜
上にｈＭＰＵを得た。
【００３７】部分アミノ酸配列の決定 で得られた膜上のｈＭＰＵについて、常法によりＮ末
端アミノ酸配列を決定したところ、Ｎ末端として各々Ｔ
ＩＨＬＨＰＱＦＰＶＶＶＥ、ＨＰＱＦＰＶＶＶＥＫＫ、
ＰＱＦＰＶＶＶＥＫを有する３種のポリペプタイドが存
在することが確認され、それぞれｈＭＰＵ−１、２、３
と命名した。一方、膜上のｈＭＰＵをシアノーゲンブロ
マイド分解にかけ、続いてリジンエンドペプチターゼ処
理し、酵素処理後得られた３つのペプタイドのアミノ酸
配列を決定した（ｓｉｎｇｌｅ−ｌｅｔｔｅｒａｍｉｎ
ｏ−ａｃｉｄ ｃｏｄｅ）；ペプタイド１、ＱＴＥＧＸ
ＥＲＸＴＸＧ；ペプタイド２、ＧＦＶＰＡＧＥＳＳＹ
Ｅ；ペプタイド３、ＥＧＴＹＹＤＰＶ。これらのアミノ
酸配列は特願平２−１７３６７９号に開示したラット血
小板由来ＭＰ高分子サブユニットとホモロジーを有し、
ｈＭＰＵがラットＭＰ高分子サブユニットと類似の蛋白
質であることが示唆された。また、でＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅより得たヒトＭＰ還元物（図２、（ｂ）レーン４）の
うちｈＭＰＵに相当する約１２０ｋＤａのバンドが切り
出し、膜に転写して得たペプタイドを解析した。その結
果、このペプタイドがで得たｈＭＰＵと同一物質であ
ることを確認した。
端アミノ酸配列を決定したところ、Ｎ末端として各々Ｔ
ＩＨＬＨＰＱＦＰＶＶＶＥ、ＨＰＱＦＰＶＶＶＥＫＫ、
ＰＱＦＰＶＶＶＥＫを有する３種のポリペプタイドが存
在することが確認され、それぞれｈＭＰＵ−１、２、３
と命名した。一方、膜上のｈＭＰＵをシアノーゲンブロ
マイド分解にかけ、続いてリジンエンドペプチターゼ処
理し、酵素処理後得られた３つのペプタイドのアミノ酸
配列を決定した（ｓｉｎｇｌｅ−ｌｅｔｔｅｒａｍｉｎ
ｏ−ａｃｉｄ ｃｏｄｅ）；ペプタイド１、ＱＴＥＧＸ
ＥＲＸＴＸＧ；ペプタイド２、ＧＦＶＰＡＧＥＳＳＹ
Ｅ；ペプタイド３、ＥＧＴＹＹＤＰＶ。これらのアミノ
酸配列は特願平２−１７３６７９号に開示したラット血
小板由来ＭＰ高分子サブユニットとホモロジーを有し、
ｈＭＰＵがラットＭＰ高分子サブユニットと類似の蛋白
質であることが示唆された。また、でＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅより得たヒトＭＰ還元物（図２、（ｂ）レーン４）の
うちｈＭＰＵに相当する約１２０ｋＤａのバンドが切り
出し、膜に転写して得たペプタイドを解析した。その結
果、このペプタイドがで得たｈＭＰＵと同一物質であ
ることを確認した。
【００３８】ｃＤＮＡスクリーニング ラット骨髄から精製した巨核球細胞よりｃＤＮＡライブ
ラリーを構築し、得られたラットＭＰ高分子サブユニッ
トの４０５４ｂｐのｃＤＮＡ断片を、ＭＰ高分子サブユ
ニットｃＤＮＡクローンのスクリーニングにプローブと
して供した。ポリヌクレオチドプローブをＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（タカラバイオケミカルズ社）と［γ
３２Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム社）で５′末をリン酸化し
て放射性ラベルした。ｃＤＮＡの合成は、ヒト胎盤から
プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を用いて合成した。ｃ
ＤＮＡライブラリーの構築はλＺＡＰ１１ベクター（ス
トラタジーン社）を用いて行った。組換えファージを大
腸菌にプレーティングし、ニトロセルロースフィルター
（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ、アマシャム社）に転写した。これ
らのレプリカをイノシン含有放射線ラベルプローブによ
り、０．２×ＳＳＣ （０．９Ｍ ＮａＣｌ、９０ｍＭ
クエン酸三ナトリウム）、０．０５％リン酸ナトリウ
ム、１００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、６×デンハート溶液
にて６５℃１５時間、ハイブリダイゼーション反応させ
た。反応後、ニトロセルロースフィルターを０．１％Ｓ
ＤＳを含む０．２×ＳＳＣ緩衝液によって６５℃２０分
洗浄を３回繰り返した。
ラリーを構築し、得られたラットＭＰ高分子サブユニッ
トの４０５４ｂｐのｃＤＮＡ断片を、ＭＰ高分子サブユ
ニットｃＤＮＡクローンのスクリーニングにプローブと
して供した。ポリヌクレオチドプローブをＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（タカラバイオケミカルズ社）と［γ
３２Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム社）で５′末をリン酸化し
て放射性ラベルした。ｃＤＮＡの合成は、ヒト胎盤から
プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を用いて合成した。ｃ
ＤＮＡライブラリーの構築はλＺＡＰ１１ベクター（ス
トラタジーン社）を用いて行った。組換えファージを大
腸菌にプレーティングし、ニトロセルロースフィルター
（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ、アマシャム社）に転写した。これ
らのレプリカをイノシン含有放射線ラベルプローブによ
り、０．２×ＳＳＣ （０．９Ｍ ＮａＣｌ、９０ｍＭ
クエン酸三ナトリウム）、０．０５％リン酸ナトリウ
ム、１００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、６×デンハート溶液
にて６５℃１５時間、ハイブリダイゼーション反応させ
た。反応後、ニトロセルロースフィルターを０．１％Ｓ
ＤＳを含む０．２×ＳＳＣ緩衝液によって６５℃２０分
洗浄を３回繰り返した。
【００３９】ｃＤＮＡ塩基配列の決定 得られた複数のクローンを制限酵素で切り出し、シーケ
ネース（ユナイテッドステート バイオケミカル社）を
用いてジデオキシ法によってｈＭＰＵｃＤＡの塩基配列
を決定した。その結果、得られたｃＤＮＡは、ラットＭ
Ｐにおける成熟型高分子サブユニットに相当するコード
領域を含む２，５３５ヌクレオチドをカバーするもので
あり、遊離成熟型ｈＭＰＵ−１のコード領域は本実施例
の場合第２６８塩基から始まるポリペプタイドであるこ
とが確認された。
ネース（ユナイテッドステート バイオケミカル社）を
用いてジデオキシ法によってｈＭＰＵｃＤＡの塩基配列
を決定した。その結果、得られたｃＤＮＡは、ラットＭ
Ｐにおける成熟型高分子サブユニットに相当するコード
領域を含む２，５３５ヌクレオチドをカバーするもので
あり、遊離成熟型ｈＭＰＵ−１のコード領域は本実施例
の場合第２６８塩基から始まるポリペプタイドであるこ
とが確認された。
【００４０】実施例２．ｈＭＰＵ−１Ｎ、２Ｎ、３Ｎを
得る実施例 実施例１ので得られたクローンのうち３．１ｋｂの
インサートを持つｈＭＰ３−１を用いて、ｈＭＰＵ−Ｐ
Ｎ、１Ｎ、２Ｎ、３Ｎを組み込んだプラズミドを作成し
た。
得る実施例 実施例１ので得られたクローンのうち３．１ｋｂの
インサートを持つｈＭＰ３−１を用いて、ｈＭＰＵ−Ｐ
Ｎ、１Ｎ、２Ｎ、３Ｎを組み込んだプラズミドを作成し
た。
【００４１】プラズミドｈＭＰ３−１を制限酵素Ｓｔｙ
ＩとＳｐｈＩで消化し１０４ｂｐ〜２２６４ｂｐの２．
１ｋｂ断片とした後、５′末側、および３′末側にＤＮ
Ａ合成装置により作成した次のＤＮＡ断片をリンカーし
てＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させた。５′末側リン
カーはｈＭＰＵ−Ｐの構成ヌクレオチドの１０４ｂｐと
スタートコドンＡＴＧ、およびＳａｌＩ消化部位を持
つ。３′末側リンカーはｈＭＰＵ−Ｐの構成ヌクレオチ
ドの７８ｂｐとストップコドンＴＧＡおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩ消化部位を持つ。発現用ベクターｐＫＫ２２３−３
を制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、リ
ンカーを結合させたＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼに
より挿入し、ｈＭＰＵ−Ｐをインサートとして有するプ
ラズミドｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−Ｐ］を得た。
ＩとＳｐｈＩで消化し１０４ｂｐ〜２２６４ｂｐの２．
１ｋｂ断片とした後、５′末側、および３′末側にＤＮ
Ａ合成装置により作成した次のＤＮＡ断片をリンカーし
てＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させた。５′末側リン
カーはｈＭＰＵ−Ｐの構成ヌクレオチドの１０４ｂｐと
スタートコドンＡＴＧ、およびＳａｌＩ消化部位を持
つ。３′末側リンカーはｈＭＰＵ−Ｐの構成ヌクレオチ
ドの７８ｂｐとストップコドンＴＧＡおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩ消化部位を持つ。発現用ベクターｐＫＫ２２３−３
を制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、リ
ンカーを結合させたＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼに
より挿入し、ｈＭＰＵ−Ｐをインサートとして有するプ
ラズミドｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−Ｐ］を得た。
【００４２】ｈＭＰＵ−１Ｎをインサートとして有する
プラズミドは次のようにして得た。プラズミドｈＭＰ３
−１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩで消化し３４
５ｂｐ〜２２６４ｂｐの１．９ｋｂ断片とした後、５′
末側にｈＭＰＵ−１の構成ヌクレオチドの７７ｂｐとス
タートコドンＡＴＧ、およびＳａｌＩ消化部位を持つリ
ンカーを、３′末側にｈＭＰＵ−１の構成ヌクレオチド
の７８ｂｐとストップコドンＴＧＡおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉ消化部位を持つリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼにより
結合した。発現用ベクターｐＫＫ２２３−３を制限酵素
ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、リンカーを結
合させたＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入
し、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−１］を得た。
プラズミドは次のようにして得た。プラズミドｈＭＰ３
−１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩで消化し３４
５ｂｐ〜２２６４ｂｐの１．９ｋｂ断片とした後、５′
末側にｈＭＰＵ−１の構成ヌクレオチドの７７ｂｐとス
タートコドンＡＴＧ、およびＳａｌＩ消化部位を持つリ
ンカーを、３′末側にｈＭＰＵ−１の構成ヌクレオチド
の７８ｂｐとストップコドンＴＧＡおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉ消化部位を持つリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼにより
結合した。発現用ベクターｐＫＫ２２３−３を制限酵素
ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、リンカーを結
合させたＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入
し、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−１］を得た。
【００４３】ｈＭＰＵ−２Ｎ、３Ｎをインサートとして
有するプラズミドも同様に、プラズミドｈＭＰＵ３−１
をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化した後、５′末側に
６５ｂｐ、６２ｂｐのｈＭＰＵ−２、３構成ヌクレオチ
ドを含むリンカーを用いて作成し、それぞれｐＫＫ２２
３−３［ｈＭＰＵ−２］、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ
−３］と名付けた。
有するプラズミドも同様に、プラズミドｈＭＰＵ３−１
をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化した後、５′末側に
６５ｂｐ、６２ｂｐのｈＭＰＵ−２、３構成ヌクレオチ
ドを含むリンカーを用いて作成し、それぞれｐＫＫ２２
３−３［ｈＭＰＵ−２］、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ
−３］と名付けた。
【００４４】実施例３．ｈＭＰＵ−Ｐ、１、２、３を得
る実施例 Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５−α株）をＬ−Ｂｒｏｔｈ培地に
て培養し、集菌後１００ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁した。
カルシウムにより活性化された大腸菌をｐＫＫ２２３−
３［ｈＭＰＵ−Ｐ］で形質転換し、Ｌ−Ｂｒｏｔｈ培地
にて培養した。培養液を精製しＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
け、ポリビニリデン−ジフルオライド膜に転写しｈＭＰ
Ｕを得た。以下同様に、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−
１］、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−２］、ｐＫＫ２２
３−３［ｈＭＰＵ−３］を用いてＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５
−α株）を形質転換し、得られた培養液からｈＭＰＵ−
１、２、３を精製して得た。
る実施例 Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５−α株）をＬ−Ｂｒｏｔｈ培地に
て培養し、集菌後１００ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁した。
カルシウムにより活性化された大腸菌をｐＫＫ２２３−
３［ｈＭＰＵ−Ｐ］で形質転換し、Ｌ−Ｂｒｏｔｈ培地
にて培養した。培養液を精製しＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
け、ポリビニリデン−ジフルオライド膜に転写しｈＭＰ
Ｕを得た。以下同様に、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−
１］、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−２］、ｐＫＫ２２
３−３［ｈＭＰＵ−３］を用いてＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５
−α株）を形質転換し、得られた培養液からｈＭＰＵ−
１、２、３を精製して得た。
【００４５】実施例４．ヒトＭＰのヒトＴＧＦ−β活性
に対する抑制作用 本発明のｈＭＰＵを構成蛋白質とするヒトＭＰがヒトＴ
ＧＦ−β活性を抑制することを次の通り確認した。実施
例１−においてヒト血小板より得て、還元物よりｈＭ
ＰＵ−１、２、３を構成成分として含有することを確認
したヒトＭＰを以下の実施例に供した。ヒトＭＰのＴＧ
Ｆ−β抑制作用はラット初代培養肝実質細胞を用いて測
定した。ウィスター系ラットからコラーゲン還流法によ
り肝実質細胞を分離精製した。得られた肝実質細胞を５
％の仔ウシ血清を含むウィリアムスＥ培地（フローラボ
ラトリー社）に２．５×１０５個／ｍｌの濃度て懸濁
し、２４ウェルマルチプレートに０．５ｍｌ／ウェルづ
つ播いた。５％ＣＯ２、３０％Ｏ２、６５％Ｎ２の条件
下、３７℃で２０時間培養後、１×１０−７Ｍインスリ
ン（シグマ社）、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（組換えヒトＥ
ＧＦ、アース化学社）を含む無血清ウィリアムスＥ培地
に交換すると共に、２．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブ
ミンを含むリン酸食塩緩衝液に所定量のＭＰを添加した
溶液４５μｌと、同緩衝液にＴＧＦ−β１、β２各１．
８ｎｇを添加した溶液５μｌを混合し室温で１時間イン
キュベートした溶液を添加した。１２時間培養後１．２
５μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］デオキシチミジンを１０μｌ
／ウェル加え、コントロール群には［３Ｈ］デオキシチ
ミジン添加１５分前に５μｇ／ｍｌのアフィディコリン
を添加した。さらに２４時間培養してトリチウムラベル
した後、細胞をｐＨ７．４のリン酸食塩緩衡液で２回洗
浄し、冷１０％トリクロロ酢酸水溶液で固定した。細胞
を１ウェル当たり０．５ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水
溶液で可溶化し、その放射能をガンマカウンターにより
測定した。被検試料を添加したとき肝実質細胞に組み込
まれたトリチウムの量をコントロールのカウントの比と
して求め、ＤＮＡ合成活性（％）とした。その結果、図
３（○：ＴＧＦ−β１、●：ＴＧＦ−β２）に示す如
く、本発明のｈＭＰＵを含むヒトＭＰはヒトＴＧＦ−β
の持つ肝実質細胞増殖阻害活性を用量依存的に抑制し、
４０〜１００ｎｇ／ｍｌ（ＴＧＦ−β１重量部に対して
２０〜５５重量部）でＴＧＦ−βの活性をほぼ完全に抑
制することが明らかとなった。
に対する抑制作用 本発明のｈＭＰＵを構成蛋白質とするヒトＭＰがヒトＴ
ＧＦ−β活性を抑制することを次の通り確認した。実施
例１−においてヒト血小板より得て、還元物よりｈＭ
ＰＵ−１、２、３を構成成分として含有することを確認
したヒトＭＰを以下の実施例に供した。ヒトＭＰのＴＧ
Ｆ−β抑制作用はラット初代培養肝実質細胞を用いて測
定した。ウィスター系ラットからコラーゲン還流法によ
り肝実質細胞を分離精製した。得られた肝実質細胞を５
％の仔ウシ血清を含むウィリアムスＥ培地（フローラボ
ラトリー社）に２．５×１０５個／ｍｌの濃度て懸濁
し、２４ウェルマルチプレートに０．５ｍｌ／ウェルづ
つ播いた。５％ＣＯ２、３０％Ｏ２、６５％Ｎ２の条件
下、３７℃で２０時間培養後、１×１０−７Ｍインスリ
ン（シグマ社）、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（組換えヒトＥ
ＧＦ、アース化学社）を含む無血清ウィリアムスＥ培地
に交換すると共に、２．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブ
ミンを含むリン酸食塩緩衝液に所定量のＭＰを添加した
溶液４５μｌと、同緩衝液にＴＧＦ−β１、β２各１．
８ｎｇを添加した溶液５μｌを混合し室温で１時間イン
キュベートした溶液を添加した。１２時間培養後１．２
５μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］デオキシチミジンを１０μｌ
／ウェル加え、コントロール群には［３Ｈ］デオキシチ
ミジン添加１５分前に５μｇ／ｍｌのアフィディコリン
を添加した。さらに２４時間培養してトリチウムラベル
した後、細胞をｐＨ７．４のリン酸食塩緩衡液で２回洗
浄し、冷１０％トリクロロ酢酸水溶液で固定した。細胞
を１ウェル当たり０．５ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水
溶液で可溶化し、その放射能をガンマカウンターにより
測定した。被検試料を添加したとき肝実質細胞に組み込
まれたトリチウムの量をコントロールのカウントの比と
して求め、ＤＮＡ合成活性（％）とした。その結果、図
３（○：ＴＧＦ−β１、●：ＴＧＦ−β２）に示す如
く、本発明のｈＭＰＵを含むヒトＭＰはヒトＴＧＦ−β
の持つ肝実質細胞増殖阻害活性を用量依存的に抑制し、
４０〜１００ｎｇ／ｍｌ（ＴＧＦ−β１重量部に対して
２０〜５５重量部）でＴＧＦ−βの活性をほぼ完全に抑
制することが明らかとなった。
【００４６】
【発明の効果】本発明のポリペプタイドｈＭＰＵ−１、
２、３を構成成分とするｈＭＰＵは、低分子サブユニッ
トと結合させて本発明のｈＭＰを得ることができる。ｈ
ＭＰはそれ自体、また必要により糖鎖と結合させること
により、ヒトおよび各種動物由来のＴＧＦ−βと結合
し、腫瘍細胞の増殖抑制等各種生理活性を発揮する。本
発明のポリペプタイドｈＭＰＵ−Ｐは、これによりｈＭ
ＰＵ−１、２、３を製造することができる。本発明のポ
リヌクレオチドｈＭＰＵ−１Ｎ、２Ｎ、３Ｎ、ＰＮは、
遺伝子工学的手法に供することにより、本発明のポリペ
プタイドを製造することができる。
２、３を構成成分とするｈＭＰＵは、低分子サブユニッ
トと結合させて本発明のｈＭＰを得ることができる。ｈ
ＭＰはそれ自体、また必要により糖鎖と結合させること
により、ヒトおよび各種動物由来のＴＧＦ−βと結合
し、腫瘍細胞の増殖抑制等各種生理活性を発揮する。本
発明のポリペプタイドｈＭＰＵ−Ｐは、これによりｈＭ
ＰＵ−１、２、３を製造することができる。本発明のポ
リヌクレオチドｈＭＰＵ−１Ｎ、２Ｎ、３Ｎ、ＰＮは、
遺伝子工学的手法に供することにより、本発明のポリペ
プタイドを製造することができる。
【００４７】このように本発明のポリペプタイドおよび
ポリヌクレオチドは、ＴＧＦ−βと結合するマスキング
プロテイン製造のために必須不可欠の重要な物質であ
る。
ポリヌクレオチドは、ＴＧＦ−βと結合するマスキング
プロテイン製造のために必須不可欠の重要な物質であ
る。
【００４８】
【図１】潜在型ＴＧＦ−β複合体画分の逆相液体クロマ
トグラフィー分画。実線は２８０ｎｍにおける吸光度、
破線はアセトニル濃度を示す。
トグラフィー分画。実線は２８０ｎｍにおける吸光度、
破線はアセトニル濃度を示す。
【図２】各ピークの非還元下および還元下ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析。
ＧＥ分析。
【図３】ｈＭＰＵのＴＧＦ−β１、β２活性抑制。○は
ＴＧＦ−β１、●はＴＧＦ−β２に対する。
ＴＧＦ−β１、●はＴＧＦ−β２に対する。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トランスフォーミング
増殖因子ベータ（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒ−β、以下「ＴＧＦ−β」という）を
マスクし、これを不活性化するヒューマン・マスキング
プロテインおよびその高分子サブユニット、プレカーサ
ー（前駆体）となるポリペプタイドならびにこれらをコ
ードするヌクレオチドに関する。
増殖因子ベータ（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧｒｏｗｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒ−β、以下「ＴＧＦ−β」という）を
マスクし、これを不活性化するヒューマン・マスキング
プロテインおよびその高分子サブユニット、プレカーサ
ー（前駆体）となるポリペプタイドならびにこれらをコ
ードするヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】トランスフォーミング増殖因子ベータＴ
ＧＦ−βは、本来軟寒天中では増殖しない正常ラット腎
臓由来ＮＲＫ細胞の軟寒天中での増殖を促進する因子と
して、ＭｕＳＶ（マウスＲＮＡ肉腫ウイルス）で形質転
換した細胞の培養上清中から１９７８年に発見された蛋
白質で、トランスフォーメーション（形質転換）に関連
するという意味からトランスフォーミング増殖因子と名
付けられ、腫瘍細胞に特異的に存在する物質であると考
えられた。その後の研究の成果により、ＴＧＦ−βが正
常組織、特に血小板に多く存在することが解明され、生
体内での多様な生理現象に関与していることが明らかと
なった。
ＧＦ−βは、本来軟寒天中では増殖しない正常ラット腎
臓由来ＮＲＫ細胞の軟寒天中での増殖を促進する因子と
して、ＭｕＳＶ（マウスＲＮＡ肉腫ウイルス）で形質転
換した細胞の培養上清中から１９７８年に発見された蛋
白質で、トランスフォーメーション（形質転換）に関連
するという意味からトランスフォーミング増殖因子と名
付けられ、腫瘍細胞に特異的に存在する物質であると考
えられた。その後の研究の成果により、ＴＧＦ−βが正
常組織、特に血小板に多く存在することが解明され、生
体内での多様な生理現象に関与していることが明らかと
なった。
【０００３】ヒト血小板から最初に純化されたＴＧＦ−
βは現在ＴＧＦ−β１と命名され、ＴＧＦ−β類縁物質
としてこれまでにヒト、ラット、ブタ、ニワトリなどか
らβ１〜β５の５種類が発見されている。以下本発明に
おいては、これらＴＧＦ−β類縁物質を「ＴＧＦ−β」
と総称する。ＴＧＦ−βは哺乳動物のほとんどすべての
細胞に対して何らかの作用を示し、また種々の疾患に対
しての治療的応用が期待されている。ＴＧＦ−βの主な
作用として、正常培養線維芽細胞など間葉系の細胞に対
する増殖促進、肝細胞など上皮系細胞に対する増殖抑
制、細胞分化の制御、Ｔ細胞など免疫系細胞に対する増
殖抑制、造血系細胞に対する増殖抑制などがｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで確認されており、生体中での活性としては、創
傷治癒の促進、骨代謝、肝再生停止などへの関与が見い
出されている。
βは現在ＴＧＦ−β１と命名され、ＴＧＦ−β類縁物質
としてこれまでにヒト、ラット、ブタ、ニワトリなどか
らβ１〜β５の５種類が発見されている。以下本発明に
おいては、これらＴＧＦ−β類縁物質を「ＴＧＦ−β」
と総称する。ＴＧＦ−βは哺乳動物のほとんどすべての
細胞に対して何らかの作用を示し、また種々の疾患に対
しての治療的応用が期待されている。ＴＧＦ−βの主な
作用として、正常培養線維芽細胞など間葉系の細胞に対
する増殖促進、肝細胞など上皮系細胞に対する増殖抑
制、細胞分化の制御、Ｔ細胞など免疫系細胞に対する増
殖抑制、造血系細胞に対する増殖抑制などがｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで確認されており、生体中での活性としては、創
傷治癒の促進、骨代謝、肝再生停止などへの関与が見い
出されている。
【０００４】ＴＧＦ−β１は３９０個のアミノ酸からな
る前駆体（潜在型）として作られ、Ｃ末端側の１１２個
のアミノ酸に切断されてダイマーとなり活性型となるこ
とがこれまでに解明されている。動物細胞からの精製や
遺伝子組換え細胞での発現によってＴＧＦ−βあるいは
その部分ペプタイドを製造することができ、その臨床的
な応用開発、例えば上皮系細胞の増殖促進活性を利用し
た火傷、手術後などの創傷治癒剤、湿疹治療剤、骨形成
への関与から骨粗しょう症治療剤、免疫系細胞の増殖抑
制から臓器移植や免疫疾患における免疫抑制剤などへ利
用が試みられている。
る前駆体（潜在型）として作られ、Ｃ末端側の１１２個
のアミノ酸に切断されてダイマーとなり活性型となるこ
とがこれまでに解明されている。動物細胞からの精製や
遺伝子組換え細胞での発現によってＴＧＦ−βあるいは
その部分ペプタイドを製造することができ、その臨床的
な応用開発、例えば上皮系細胞の増殖促進活性を利用し
た火傷、手術後などの創傷治癒剤、湿疹治療剤、骨形成
への関与から骨粗しょう症治療剤、免疫系細胞の増殖抑
制から臓器移植や免疫疾患における免疫抑制剤などへ利
用が試みられている。
【０００５】ガン細胞は、ＴＧＦ−βを自ら大量に産生
していて、ガン細胞自身の増殖促進とｋｉｌｌｅｒＴ細
胞やｈｅｌｐｅｒＴ細胞など免疫系細胞の増殖抑制を通
じて旺盛な増殖を繰り返すことが知られている。
していて、ガン細胞自身の増殖促進とｋｉｌｌｅｒＴ細
胞やｈｅｌｐｅｒＴ細胞など免疫系細胞の増殖抑制を通
じて旺盛な増殖を繰り返すことが知られている。
【０００６】他方、正常細胞が生産するＴＧＦ−βは、
後記のようにいずれもマスキングプロテインと複合体を
形成した不活性型であることが解明された。一方、ガン
細胞の多くはＴＧＦ−βを活性型で分泌することが知ら
れている。
後記のようにいずれもマスキングプロテインと複合体を
形成した不活性型であることが解明された。一方、ガン
細胞の多くはＴＧＦ−βを活性型で分泌することが知ら
れている。
【０００７】従って、ＴＧＦ−βを不活性化する因子は
制ガン剤として非常に有望である。この因子は本発明者
がラット血小板に発見しＴＧＦ−βマスキングプロテイ
ンと命名したポリペプタイドが、現在までに発見されて
いるＴＧＦ−βと特異的に反応しこれを不活化する唯一
の物質であった（Ｂｉｏｃｈｅｍ ＢｉｏｐｈｙｓＲｅ
ｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１４１，１７６−１８４，１９８
６）。また、ＴＧＦ−βの多様な活性を解析するために
は生体内でこれを調節する機構の解明が重要であり、そ
のためにもヒトのマスキングプロテインの詳細な構造を
解析することと、ヒト組織中から精製蛋白質として入手
することが望まれてきた。
制ガン剤として非常に有望である。この因子は本発明者
がラット血小板に発見しＴＧＦ−βマスキングプロテイ
ンと命名したポリペプタイドが、現在までに発見されて
いるＴＧＦ−βと特異的に反応しこれを不活化する唯一
の物質であった（Ｂｉｏｃｈｅｍ ＢｉｏｐｈｙｓＲｅ
ｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１４１，１７６−１８４，１９８
６）。また、ＴＧＦ−βの多様な活性を解析するために
は生体内でこれを調節する機構の解明が重要であり、そ
のためにもヒトのマスキングプロテインの詳細な構造を
解析することと、ヒト組織中から精製蛋白質として入手
することが望まれてきた。
【０００８】本発明者は、ラット組織中から、ＴＧＦ−
βと特異的に結合する蛋白質の高分子サブユニットＭＰ
Ｕ、そのプレカーサＭＰＵ−Ｐ、そのプレプロ構造体Ｍ
ＰＵ−ＰＰ、これらをコードする遺伝子ＭＰＵ−Ｎおよ
びポリヌクレオチドＭＰＵ−ＰＮ、ＭＰＵ−ＰＰＮを精
製、単離、特定し、これらを特願平２−１７３６７９号
として出願済である。
βと特異的に結合する蛋白質の高分子サブユニットＭＰ
Ｕ、そのプレカーサＭＰＵ−Ｐ、そのプレプロ構造体Ｍ
ＰＵ−ＰＰ、これらをコードする遺伝子ＭＰＵ−Ｎおよ
びポリヌクレオチドＭＰＵ−ＰＮ、ＭＰＵ−ＰＰＮを精
製、単離、特定し、これらを特願平２−１７３６７９号
として出願済である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明者が発見したＴ
ＧＦ−βマスキングプロテインは、ガン細胞の増殖を促
進するＴＧＦ−βと特異的に反応しこれを不活性化する
ことから、これをヒト組織からも精製蛋白質として入手
するとともに、その詳細な構造を解析し、これによりガ
ン細胞の増殖を抑制する物質の製造に寄与することが課
題とされていた。
ＧＦ−βマスキングプロテインは、ガン細胞の増殖を促
進するＴＧＦ−βと特異的に反応しこれを不活性化する
ことから、これをヒト組織からも精製蛋白質として入手
するとともに、その詳細な構造を解析し、これによりガ
ン細胞の増殖を抑制する物質の製造に寄与することが課
題とされていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、トランスフォ
ーミング増殖因子ベータ（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧ
ｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β）（「ＴＧＦ−β」）と
特異的に結合するヒューマン・マスキングプロテインｈ
ＭＰ、その高分子サブユニットｈＭＰＵ、そのプレカー
サーｈＭＰＵ−Ｐならびにこれらをコードする遺伝子ｈ
ＭＰＵ−ＮおよびポリヌクレオチドｈＭＰＵ−ＰＮの発
明である。
ーミング増殖因子ベータ（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＧ
ｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β）（「ＴＧＦ−β」）と
特異的に結合するヒューマン・マスキングプロテインｈ
ＭＰ、その高分子サブユニットｈＭＰＵ、そのプレカー
サーｈＭＰＵ−Ｐならびにこれらをコードする遺伝子ｈ
ＭＰＵ−ＮおよびポリヌクレオチドｈＭＰＵ−ＰＮの発
明である。
【００１１】本発明者は、ＴＧＦ−βを不活性化する蛋
白質の存在を次のようにして解明した。すなわち、ＴＧ
Ｆが非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量が２６ｋＤで
あるのに対し、潜在型ＴＧＦ−βは４００〜５００ｋＤ
もの高分子量であることを手がかりに、ＴＧＦ−βを不
活化する高分子蛋白質の存在を予測し研究を重ねた結
果、ＴＧＦ−βに特異的に結合する蛋白質をラット血小
板から部分精製することに成功し、これをＴＧＦ−βマ
スキングプロテイン（ＴＧＦ−β ｍａｓｋｉｎｇｐｒ
ｏｔｅｉｎ）と命名した（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１４１ １７６−１８
４，１９８６）。ＴＧＦ−βマスキングプロテイン（以
下「ＭＰ」という）は、２個の３９ｋＤサブユニットと
１個の１１０ＫＤサブユニットからなる異型三量体であ
り、このうち３９ｋＤサブユニットのＮ末端１５塩基の
アミノ酸配列を決定したところ、ＴＧＦ−β前駆体のシ
グナル配列に続くＮ末端領域のアミノ酸配列と一致した
（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，８３，６４
８９−６４９３，１９８６。ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２４
２，２４０−２４４，１９８９）。これによりＭＰの３
９ｋＤサブユニットはＴＧＦ−βの前駆蛋白質部分にす
ぎないことが解明された。
白質の存在を次のようにして解明した。すなわち、ＴＧ
Ｆが非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量が２６ｋＤで
あるのに対し、潜在型ＴＧＦ−βは４００〜５００ｋＤ
もの高分子量であることを手がかりに、ＴＧＦ−βを不
活化する高分子蛋白質の存在を予測し研究を重ねた結
果、ＴＧＦ−βに特異的に結合する蛋白質をラット血小
板から部分精製することに成功し、これをＴＧＦ−βマ
スキングプロテイン（ＴＧＦ−β ｍａｓｋｉｎｇｐｒ
ｏｔｅｉｎ）と命名した（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，１４１ １７６−１８
４，１９８６）。ＴＧＦ−βマスキングプロテイン（以
下「ＭＰ」という）は、２個の３９ｋＤサブユニットと
１個の１１０ＫＤサブユニットからなる異型三量体であ
り、このうち３９ｋＤサブユニットのＮ末端１５塩基の
アミノ酸配列を決定したところ、ＴＧＦ−β前駆体のシ
グナル配列に続くＮ末端領域のアミノ酸配列と一致した
（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，８３，６４
８９−６４９３，１９８６。ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２４
２，２４０−２４４，１９８９）。これによりＭＰの３
９ｋＤサブユニットはＴＧＦ−βの前駆蛋白質部分にす
ぎないことが解明された。
【００１２】他方、本発明者は１１０ｋＤサブユニット
（以下「高分子サブユニット」という）について研究を
進め、これがＴＧＦ−βの不活性化に重要な役割を果た
していることを解明するとともに、ラット血小板より単
離精製した該蛋白質のアミノ酸配列とこれをコードする
遺伝子の塩基配列を解折し、全く新規の蛋白質であるこ
とを明らかにすることができ、この新規の高分子サブユ
ニットをＭＰＵと命名した。これにより、本発明者は、
トランスフォーミング増殖因子ベータ（Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β）と特異
的に結合する蛋白質の高分子サブユニットＭＰＵをラッ
ト血小板から単離・精製・特定して前記特願平２−１７
３６７９号を完成させた。
（以下「高分子サブユニット」という）について研究を
進め、これがＴＧＦ−βの不活性化に重要な役割を果た
していることを解明するとともに、ラット血小板より単
離精製した該蛋白質のアミノ酸配列とこれをコードする
遺伝子の塩基配列を解折し、全く新規の蛋白質であるこ
とを明らかにすることができ、この新規の高分子サブユ
ニットをＭＰＵと命名した。これにより、本発明者は、
トランスフォーミング増殖因子ベータ（Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β）と特異
的に結合する蛋白質の高分子サブユニットＭＰＵをラッ
ト血小板から単離・精製・特定して前記特願平２−１７
３６７９号を完成させた。
【００１３】さらに、本発明者は、ひき続き鋭意研究を
進めた結果、ヒト血小板からＴＧＦ−βヒューマン・マ
スキングプロテインを単離・精製し、これを特定するこ
とによって本発明を完成させた。すなわち、本発明は、
トランスフォーミング増殖因子ベータ（Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β）と
特異的に結合するマスキングプロテインｈＭＰ、蛋白質
の成熟型高分子サブユニットｈＭＰＵ、ならびにこれを
産生する遺伝子の発明である。ｈＭＰＵ−１、２、３な
らびにそのプレカーサーｈＭＰＵ−Ｐを単離精製するこ
とに成功した。さらに、本発明者は、ヒト胎盤由来ｃＤ
ＮＡライブラリーを解析することにより、成熟型ｈＭＰ
Ｕ−１、２、３および前駆体ｈＭＰＵ−Ｐをコードする
遺伝子の塩基配列を解明し、本発明を完成した。
進めた結果、ヒト血小板からＴＧＦ−βヒューマン・マ
スキングプロテインを単離・精製し、これを特定するこ
とによって本発明を完成させた。すなわち、本発明は、
トランスフォーミング増殖因子ベータ（Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｉｎｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β）と
特異的に結合するマスキングプロテインｈＭＰ、蛋白質
の成熟型高分子サブユニットｈＭＰＵ、ならびにこれを
産生する遺伝子の発明である。ｈＭＰＵ−１、２、３な
らびにそのプレカーサーｈＭＰＵ−Ｐを単離精製するこ
とに成功した。さらに、本発明者は、ヒト胎盤由来ｃＤ
ＮＡライブラリーを解析することにより、成熟型ｈＭＰ
Ｕ−１、２、３および前駆体ｈＭＰＵ−Ｐをコードする
遺伝子の塩基配列を解明し、本発明を完成した。
【００１４】すなわち、本発明は、配列番号１記載のア
ミノ酸配列を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−１の発明
である。
ミノ酸配列を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−１の発明
である。
【００１５】本発明は、配列番号２記載のアミノ酸配列
を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−２の発明である。
を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−２の発明である。
【００１６】本発明は、配列番号３記載のアミノ酸配列
を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−３の発明である。
を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−３の発明である。
【００１７】本発明は、配列番号１ないし３記載のアミ
ノ酸配列を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−１、ｈＭＰ
Ｕ−２、ｈＭＰＵ−３の混合ポリペプタイドｈＭＰＵの
発明である。
ノ酸配列を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−１、ｈＭＰ
Ｕ−２、ｈＭＰＵ−３の混合ポリペプタイドｈＭＰＵの
発明である。
【００１８】本発明は、配列番号９記載のアミノ酸配列
を有するポリペプタイドと、前項記載のポリペプタイド
ｈＭＰＵがＳ−Ｓ結合してなるヒューマン・マスキング
プロテインｈＭＰの発明である。
を有するポリペプタイドと、前項記載のポリペプタイド
ｈＭＰＵがＳ−Ｓ結合してなるヒューマン・マスキング
プロテインｈＭＰの発明である。
【００１９】本発明は、配列番号４記載のアミノ酸配列
を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−Ｐの発明である。
を有するポリペプタイドｈＭＰＵ−Ｐの発明である。
【００２０】本発明は、配列番号５記載の塩基配列を有
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−１Ｎの発明である。
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−１Ｎの発明である。
【００２１】本発明は、配列番号６記載の塩基配列を有
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−２Ｎの発明である。
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−２Ｎの発明である。
【００２２】本発明は、配列番号７記載の塩基配列を有
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−３Ｎの発明である。
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−３Ｎの発明である。
【００２３】本発明は、配列番号８記載の塩基配列を有
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−ＰＮの発明である。
するポリヌクレオチドｈＭＰＵ−ＰＮの発明である。
【００２４】本発明のポリペプタイドおよびポリヌクレ
オチドには、上記のアミノ酸配列および塩基配列を有す
るものが含まれるが、もとより本発明が同一の配列を有
するものだけに限定されるのではなく、部分的な差異を
有するものであっても実質的に同一の配列を有する物質
は本発明の範囲に包含される。
オチドには、上記のアミノ酸配列および塩基配列を有す
るものが含まれるが、もとより本発明が同一の配列を有
するものだけに限定されるのではなく、部分的な差異を
有するものであっても実質的に同一の配列を有する物質
は本発明の範囲に包含される。
【００２５】本発明は、有用なポリペプタイドおよびポ
リヌクレオチド自体の発明であるから、製造方法や用途
がいかなるものであろうとも本発明の範囲に包含され
る。
リヌクレオチド自体の発明であるから、製造方法や用途
がいかなるものであろうとも本発明の範囲に包含され
る。
【００２６】本発明のポリペプタイドおよびポリヌクレ
オチドは、ヒトの胃、肺、腎臓、胸腺等の組織、または
血清、血漿等より、例えば、実施例１に示す手順に従っ
て抽出・精製することができる。
オチドは、ヒトの胃、肺、腎臓、胸腺等の組織、または
血清、血漿等より、例えば、実施例１に示す手順に従っ
て抽出・精製することができる。
【００２７】例えば、ヒト血小板を超音波で粉砕したの
ち、プロテアーゼインヒビターを添加して遠心分離し、
その上清を潜在型ＴＧＦ−β複合体を精製する方法に準
じて各種ゲルカラムにて精製し、ＳＤＳ一ＰＡＧＥで分
離したのちに膜に転写することにより、本発明のｈＭＰ
Ｕ−１、２、３、Ｐを単離することができる。
ち、プロテアーゼインヒビターを添加して遠心分離し、
その上清を潜在型ＴＧＦ−β複合体を精製する方法に準
じて各種ゲルカラムにて精製し、ＳＤＳ一ＰＡＧＥで分
離したのちに膜に転写することにより、本発明のｈＭＰ
Ｕ−１、２、３、Ｐを単離することができる。
【００２８】本発明のポリペプタイドを製造する別の方
法としては、本発明の塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドをヒト組織から抽出、精製し、あるいはこれらを合成
したうえ、適切な発現ベクターに組み込み、大腸菌等の
培養細胞に遺伝子導入して、その培養上清から得ること
ができる。
法としては、本発明の塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドをヒト組織から抽出、精製し、あるいはこれらを合成
したうえ、適切な発現ベクターに組み込み、大腸菌等の
培養細胞に遺伝子導入して、その培養上清から得ること
ができる。
【００２９】さらに具体的には、通常用いられる遺伝子
工学的な手法、例えば次のような手順に従って製造する
ことができる。 すなわ
ち、 ヒトの組織細胞や血清、血漿から抽出したｍＲＮＡを
鋳型としてＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクシ
ョン）法を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを大
腸菌由来プラスミドｐＢＲ３２２、あるいはバクテリオ
ファージλｇｔ１１などの組換えベクターに組み込み、 大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５１
４などの宿主細胞に組み込んで発現させ、 本発明によって明らかにされた塩基配列に基づいて合
成された部分オリゴヌクレオチド（放射性ラベル）プロ
ーブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法または
プラークハイブリダイゼーション法などによって目的の
ｃＤＮＡを選択する。 さらに、マクサムとギルバートの化学法（Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，７４，５６０，１９７
７）などによりｃＤＮＡの塩基配列を決定し、 ヒトＭＰ高分子サブユニットのアミノ酸配列の全部を
コードするｃＤＮＡを含有するベクターから制限酵素に
よってｃＤＮＡを切り出し、 適切な発現ベクター、例えば大腸菌由来のプラズミド
ｐＢＲ３２２、あるいは腫瘍ウイルスＳＶ４０などに制
限酵素とＤＮＡリガーゼを用いて組み込み、 マウスＣ１２７細胞やサルＣＯＳ細胞に導入して発現
させて得る。
工学的な手法、例えば次のような手順に従って製造する
ことができる。 すなわ
ち、 ヒトの組織細胞や血清、血漿から抽出したｍＲＮＡを
鋳型としてＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクシ
ョン）法を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを大
腸菌由来プラスミドｐＢＲ３２２、あるいはバクテリオ
ファージλｇｔ１１などの組換えベクターに組み込み、 大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５１
４などの宿主細胞に組み込んで発現させ、 本発明によって明らかにされた塩基配列に基づいて合
成された部分オリゴヌクレオチド（放射性ラベル）プロ
ーブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法または
プラークハイブリダイゼーション法などによって目的の
ｃＤＮＡを選択する。 さらに、マクサムとギルバートの化学法（Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，７４，５６０，１９７
７）などによりｃＤＮＡの塩基配列を決定し、 ヒトＭＰ高分子サブユニットのアミノ酸配列の全部を
コードするｃＤＮＡを含有するベクターから制限酵素に
よってｃＤＮＡを切り出し、 適切な発現ベクター、例えば大腸菌由来のプラズミド
ｐＢＲ３２２、あるいは腫瘍ウイルスＳＶ４０などに制
限酵素とＤＮＡリガーゼを用いて組み込み、 マウスＣ１２７細胞やサルＣＯＳ細胞に導入して発現
させて得る。
【００３０】
【作用】本発明の高分子サブユニットｈＭＰＵ−１、
２、３、およびこれらからなるｈＭＰＵは、これとは別
に精製、または発現させて得た低分子サブユニット（そ
のアミノ酸配列の１例を配列番号９に示すが、もとより
これと部分的差異を有するが実質上同一の配列を有し、
同一の活性を有するものも含まれる）と化学的または酵
素的に結合させて本発明のｈＭＰＵを得ることができ
る。ｈＭＰは、それ自体、また、必要により糖鎖と結合
させることによって、ＴＧＦ−βと特異的に結合する活
性を有する。
２、３、およびこれらからなるｈＭＰＵは、これとは別
に精製、または発現させて得た低分子サブユニット（そ
のアミノ酸配列の１例を配列番号９に示すが、もとより
これと部分的差異を有するが実質上同一の配列を有し、
同一の活性を有するものも含まれる）と化学的または酵
素的に結合させて本発明のｈＭＰＵを得ることができ
る。ｈＭＰは、それ自体、また、必要により糖鎖と結合
させることによって、ＴＧＦ−βと特異的に結合する活
性を有する。
【００３１】本発明者の研究によれば、成熟型ラット初
代培養肝細胞のＤＮＡ合成仰制活性およびＮＲＫ４９Ｆ
細胞コロニー形成活性バイオアッセイ系の結果から、本
発明の高分子サブユニットｈＭＰＵ−１、２、３からな
るｈＭＰＵを低分子サブユニットと結合させたｈＭＰ
は、それ自体、また必要により糖鎖と結合させることに
より、ヒト由来ＴＧＦ−βのみならず、ラットＴＧＦ−
βの活性をも完全に抑制することが確認された。このよ
うに、本発明のｈＭＰならびにその高分子サブユニット
ｈＭＰＵ、ｈＭＰＵ−１、２、３は、ヒトをはじめ各種
動物において、ＴＧＦ−β活性を抑制することができ
る。
代培養肝細胞のＤＮＡ合成仰制活性およびＮＲＫ４９Ｆ
細胞コロニー形成活性バイオアッセイ系の結果から、本
発明の高分子サブユニットｈＭＰＵ−１、２、３からな
るｈＭＰＵを低分子サブユニットと結合させたｈＭＰ
は、それ自体、また必要により糖鎖と結合させることに
より、ヒト由来ＴＧＦ−βのみならず、ラットＴＧＦ−
βの活性をも完全に抑制することが確認された。このよ
うに、本発明のｈＭＰならびにその高分子サブユニット
ｈＭＰＵ、ｈＭＰＵ−１、２、３は、ヒトをはじめ各種
動物において、ＴＧＦ−β活性を抑制することができ
る。
【００３２】また、本発明の高分子サブユニットｈＭＰ
Ｕ−Ｐは、ｈＭＰＵ−１、２、３の前駆体であって、こ
れよりｈＭＰＵ−１、２、３を製造することができる。
Ｕ−Ｐは、ｈＭＰＵ−１、２、３の前駆体であって、こ
れよりｈＭＰＵ−１、２、３を製造することができる。
【００３３】また、本発明のｈＭＰＵ−１Ｎ、２Ｎ、３
Ｎ、ＰＮは、公知の遺伝子工学的手法を用いて、本発明
のｈＭＰＵ−１、２、３、Ｐを製造することができる。
Ｎ、ＰＮは、公知の遺伝子工学的手法を用いて、本発明
のｈＭＰＵ−１、２、３、Ｐを製造することができる。
【００３４】
【実施例】以下、本発明を詳細に説明するため実施例を
記載するが、もとより本発明がこれら実施例に限定され
ることはない。
記載するが、もとより本発明がこれら実施例に限定され
ることはない。
【００３５】実施例１ 部分的アミノ酸配列の決定 潜在型ＴＧＦ−β複合体は次の方法にしたがってヒト血
小板から精製した。ヒト血小板を５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液に懸濁し、超音波粉砕したのちアンチパイ
ン、ベスタチンなどのプロテアーゼインヒビターを加え
て遠心分離した。上清をＳセファロースゲルと混合し、
遠心分離した。上清をスターテングマテリアルとして、
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ｓ、フェニルセ
ファロースＣＬ−４Ｂ、キレーティングセファロース、
Ｃｕキレーティングセファロース、セファロース６の各
ゲルカラムを用いて精製した（Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１
０６，３０４−３１０，１９８９）。
小板から精製した。ヒト血小板を５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液に懸濁し、超音波粉砕したのちアンチパイ
ン、ベスタチンなどのプロテアーゼインヒビターを加え
て遠心分離した。上清をＳセファロースゲルと混合し、
遠心分離した。上清をスターテングマテリアルとして、
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ｓ、フェニルセ
ファロースＣＬ−４Ｂ、キレーティングセファロース、
Ｃｕキレーティングセファロース、セファロース６の各
ゲルカラムを用いて精製した（Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１
０６，３０４−３１０，１９８９）。
【００３６】マスキングプロテインと遊離成熟型高分
子サブユニットｈＭＰＵの分離 で得た潜在型ＴＧＦ−β複合体画分を、溶出溶媒に濃
度勾配をつけた逆相液体クロマトグラフィーにかけたと
ころ、図１のパターンを示し３ピークに分離された。そ
れぞれのピークを分取し、非還元下および還元下でＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析した結果を図２に示す（ａ：非還元
下、ｂ：還元下）。対照（レーン１）として置いたラッ
ト由来の潜在型ＴＧＦ−β複合体（ラットＭＰを含む）
との比較より、ピーク１は遊離成熟型高分子サブユニッ
トｈＭＰＵ（レーン２）、ピーク２は遊離ＴＧＦ−β
（レーン３）、ピーク３はｈＭＰ（レーン４）と推定さ
れた。ピーク１の画分を還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
けた後、ポリビニリデン−ジフルオライド膜に転写し膜
上にｈＭＰＵを得た。
子サブユニットｈＭＰＵの分離 で得た潜在型ＴＧＦ−β複合体画分を、溶出溶媒に濃
度勾配をつけた逆相液体クロマトグラフィーにかけたと
ころ、図１のパターンを示し３ピークに分離された。そ
れぞれのピークを分取し、非還元下および還元下でＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析した結果を図２に示す（ａ：非還元
下、ｂ：還元下）。対照（レーン１）として置いたラッ
ト由来の潜在型ＴＧＦ−β複合体（ラットＭＰを含む）
との比較より、ピーク１は遊離成熟型高分子サブユニッ
トｈＭＰＵ（レーン２）、ピーク２は遊離ＴＧＦ−β
（レーン３）、ピーク３はｈＭＰ（レーン４）と推定さ
れた。ピーク１の画分を還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
けた後、ポリビニリデン−ジフルオライド膜に転写し膜
上にｈＭＰＵを得た。
【００３７】部分アミノ酸配列の決定 で得られた膜上のｈＭＰＵについて、常法によりＮ末
端アミノ酸配列を決定したところ、Ｎ末端として各々Ｔ
ＩＨＬＨＰＱＦＰＶＶＶＥ、ＨＰＱＦＰＶＶＶＥＫＫ、
ＰＱＦＰＶＶＶＥＫを有する３種のポリペプタイドが存
在することが確認され、それぞれｈＭＰＵ−１、２、３
と命名した。一方、膜上のｈＭＰＵをシアノーゲンブロ
マイド分解にかけ、続いてリジンエンドペプチターゼ処
理し、酵素処理後得られた３つのペプタイドのアミノ酸
配列を決定した（ｓｉｎｇｌｅ−ｌｅｔｔｅｒａｍｉｎ
ｏ−ａｃｉｄ ｃｏｄｅ）；ペプタイド１、ＱＴＥＧＸ
ＥＲＸＴＸＧ；ペプタイド２、ＧＦＶＰＡＧＥＳＳＹ
Ｅ；ペプタイド３、ＥＧＴＹＹＤＰＶ。これらのアミノ
酸配列は特願平２−１７３６７９号に開示したラット血
小板由来ＭＰ高分子サブユニットとホモロジーを有し、
ｈＭＰＵがラットＭＰ高分子サブユニットと類似の蛋白
質であることが示唆された。また、でＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅより得たヒトＭＰ還元物（図２、（ｂ）レーン４）の
うちｈＭＰＵに相当する約１２０ｋＤａのバンドが切り
出し、膜に転写して得たペプタイドを解析した。その結
果、このペプタイドがで得たｈＭＰＵと同一物質であ
ることを確認した。
端アミノ酸配列を決定したところ、Ｎ末端として各々Ｔ
ＩＨＬＨＰＱＦＰＶＶＶＥ、ＨＰＱＦＰＶＶＶＥＫＫ、
ＰＱＦＰＶＶＶＥＫを有する３種のポリペプタイドが存
在することが確認され、それぞれｈＭＰＵ−１、２、３
と命名した。一方、膜上のｈＭＰＵをシアノーゲンブロ
マイド分解にかけ、続いてリジンエンドペプチターゼ処
理し、酵素処理後得られた３つのペプタイドのアミノ酸
配列を決定した（ｓｉｎｇｌｅ−ｌｅｔｔｅｒａｍｉｎ
ｏ−ａｃｉｄ ｃｏｄｅ）；ペプタイド１、ＱＴＥＧＸ
ＥＲＸＴＸＧ；ペプタイド２、ＧＦＶＰＡＧＥＳＳＹ
Ｅ；ペプタイド３、ＥＧＴＹＹＤＰＶ。これらのアミノ
酸配列は特願平２−１７３６７９号に開示したラット血
小板由来ＭＰ高分子サブユニットとホモロジーを有し、
ｈＭＰＵがラットＭＰ高分子サブユニットと類似の蛋白
質であることが示唆された。また、でＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅより得たヒトＭＰ還元物（図２、（ｂ）レーン４）の
うちｈＭＰＵに相当する約１２０ｋＤａのバンドが切り
出し、膜に転写して得たペプタイドを解析した。その結
果、このペプタイドがで得たｈＭＰＵと同一物質であ
ることを確認した。
【００３８】ｃＤＮＡスクリーニング ラット骨髄から精製した巨核球細胞よりｃＤＮＡライブ
ラリーを構築し、得られたラットＭＰ高分子サブユニッ
トの４０５４ｂｐのｃＤＮＡ断片を、ＭＰ高分子サブユ
ニットｃＤＮＡクローンのスクリーニングにプローブと
して供した。ポリヌクレオチドプローブをＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（タカラバイオケミカルズ社）と［γ
３２Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム社）で５′末をリン酸化し
て放射性ラベルした。ｃＤＮＡの合成は、ヒト胎盤から
プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を用いて合成した。ｃ
ＤＮＡライブラリーの構築はλＺＡＰ１１ベクター（ス
トラタジーン社）を用いて行った。組換えファージを大
腸菌にプレーティングし、ニトロセルロースフィルター
（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ、アマシャム社）に転写した。これ
らのレプリカをイノシン含有放射線ラベルプローブによ
り、０．２×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，９０ｍＭ
クエン酸三ナトリウム）、０．０５％リン酸ナトリウ
ム、１００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、６×デンハート溶液
にて６５℃１５時間、ハイブリダイゼーション反応させ
た。反応後、ニトロセルロースフィルターを０．１％Ｓ
ＤＳを含む０．２×ＳＳＣ緩衝液によって６５℃２０分
洗浄を３回繰り返した。
ラリーを構築し、得られたラットＭＰ高分子サブユニッ
トの４０５４ｂｐのｃＤＮＡ断片を、ＭＰ高分子サブユ
ニットｃＤＮＡクローンのスクリーニングにプローブと
して供した。ポリヌクレオチドプローブをＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（タカラバイオケミカルズ社）と［γ
３２Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム社）で５′末をリン酸化し
て放射性ラベルした。ｃＤＮＡの合成は、ヒト胎盤から
プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を用いて合成した。ｃ
ＤＮＡライブラリーの構築はλＺＡＰ１１ベクター（ス
トラタジーン社）を用いて行った。組換えファージを大
腸菌にプレーティングし、ニトロセルロースフィルター
（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ、アマシャム社）に転写した。これ
らのレプリカをイノシン含有放射線ラベルプローブによ
り、０．２×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，９０ｍＭ
クエン酸三ナトリウム）、０．０５％リン酸ナトリウ
ム、１００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、６×デンハート溶液
にて６５℃１５時間、ハイブリダイゼーション反応させ
た。反応後、ニトロセルロースフィルターを０．１％Ｓ
ＤＳを含む０．２×ＳＳＣ緩衝液によって６５℃２０分
洗浄を３回繰り返した。
【００３９】ｃＤＮＡ塩基配列の決定 得られた複数のクローンを制限酵素で切り出し、シーケ
ネース（ユナイテッドステート バイオケミカル社）を
用いてジデオキシ法によってｈＭＰＵｃＤＮＡの塩基配
列を決定した。その結果、得られたｃＤＮＡは、ラット
ＭＰにおける成熟型高分子サブユニットに相当するコー
ド領域を含む２，５３５ヌクレオチドをカバーするもの
であり、遊離成熟型ｈＭＰＵ−１のコード領域は本実施
例の場合第２６８塩基から始まるポリペプタイドである
ことが確認された。
ネース（ユナイテッドステート バイオケミカル社）を
用いてジデオキシ法によってｈＭＰＵｃＤＮＡの塩基配
列を決定した。その結果、得られたｃＤＮＡは、ラット
ＭＰにおける成熟型高分子サブユニットに相当するコー
ド領域を含む２，５３５ヌクレオチドをカバーするもの
であり、遊離成熟型ｈＭＰＵ−１のコード領域は本実施
例の場合第２６８塩基から始まるポリペプタイドである
ことが確認された。
【００４０】実施例２．ｈＭＰＵ−１Ｎ、２Ｎ、３Ｎを
得る実施例 実施例１ので得られたクローンのうち３．１ｋｂの
インサートを持つｈＭＰ３−１を用いて、ｈＭＰＵ−Ｐ
Ｎ、１Ｎ、２Ｎ、３Ｎを組み込んだプラズミドを作成し
た。
得る実施例 実施例１ので得られたクローンのうち３．１ｋｂの
インサートを持つｈＭＰ３−１を用いて、ｈＭＰＵ−Ｐ
Ｎ、１Ｎ、２Ｎ、３Ｎを組み込んだプラズミドを作成し
た。
【００４１】プラズミドｈＭＰ３−１を制限酵素Ｓｔｙ
ＩとＳｐｈＩで消化し１０４ｂｐ〜２２６４ｂｐの２．
１ｋｂ断片とした後、５′末側、および３′末側にＤＮ
Ａ合成装置により作成した次のＤＮＡ断片をリンカーし
てＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させた。５′末側リン
カーはｈＭＰＵ−Ｐの構成ヌクレオチドの１０４ｂｐと
スタートコドンＡＴＧ、およびＳａｌＩ消化部位を持
つ。３′末側リンカーはｈＭＰＵ−Ｐの構成ヌクレオチ
ドの７８ｂｐとストップコドンＴＧＡおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩ消化部位を持つ。発現用ベクターＰＫＫ２２３−３
を制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、リ
ンカーを結合させたＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼに
より挿入し、ｈＭＰＵ−Ｐをインサートとして有するプ
ラズミドｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−Ｐ］を得た。
ＩとＳｐｈＩで消化し１０４ｂｐ〜２２６４ｂｐの２．
１ｋｂ断片とした後、５′末側、および３′末側にＤＮ
Ａ合成装置により作成した次のＤＮＡ断片をリンカーし
てＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させた。５′末側リン
カーはｈＭＰＵ−Ｐの構成ヌクレオチドの１０４ｂｐと
スタートコドンＡＴＧ、およびＳａｌＩ消化部位を持
つ。３′末側リンカーはｈＭＰＵ−Ｐの構成ヌクレオチ
ドの７８ｂｐとストップコドンＴＧＡおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩ消化部位を持つ。発現用ベクターＰＫＫ２２３−３
を制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、リ
ンカーを結合させたＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼに
より挿入し、ｈＭＰＵ−Ｐをインサートとして有するプ
ラズミドｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−Ｐ］を得た。
【００４２】ｈＭＰＵ−１Ｎをインサートとして有する
プラズミドは次のようにして得た。プラズミドｈＭＰ３
−１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩで消化し３４
５ｂｐ〜２２６４ｂｐの１．９ｋｂ断片とした後、５′
末側にｈＭＰＵ−１の構成ヌクレオチドの７７ｂｐとス
タートコドンＡＴＧ、およびＳａｌＩ消化部位を持つリ
ンカーを、３′末側にｈＭＰＵ−１の構成ヌクレオチド
の７８ｂｐとストップコドンＴＧＡおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉ消化部位を持つリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼにより
結合した。発現用ベクターｐＫＫ２２３−３を制限酵素
ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、リンカーを結
合させたＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入
し、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−１］を得た。
プラズミドは次のようにして得た。プラズミドｈＭＰ３
−１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩで消化し３４
５ｂｐ〜２２６４ｂｐの１．９ｋｂ断片とした後、５′
末側にｈＭＰＵ−１の構成ヌクレオチドの７７ｂｐとス
タートコドンＡＴＧ、およびＳａｌＩ消化部位を持つリ
ンカーを、３′末側にｈＭＰＵ−１の構成ヌクレオチド
の７８ｂｐとストップコドンＴＧＡおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉ消化部位を持つリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼにより
結合した。発現用ベクターｐＫＫ２２３−３を制限酵素
ＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、リンカーを結
合させたＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入
し、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−１］を得た。
【００４３】ｈＭＰＵ−２Ｎ、３Ｎをインサートとして
有するプラズミドも同様に、プラズミドｈＭＰＵ３−１
をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化した後、５′末側に
６５ｂｐ、６２ｂｐのｈＭＰＵ−２、３構成ヌクレオチ
ドを含むリンカーを用いて作成し、それぞれｐＫＫ２２
３−３［ｈＭＰＵ−２］、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ
−３］と名付けた。
有するプラズミドも同様に、プラズミドｈＭＰＵ３−１
をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消化した後、５′末側に
６５ｂｐ、６２ｂｐのｈＭＰＵ−２、３構成ヌクレオチ
ドを含むリンカーを用いて作成し、それぞれｐＫＫ２２
３−３［ｈＭＰＵ−２］、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ
−３］と名付けた。
【００４４】実施例３．ｈＭＰＵ−Ｐ、１、２、３を得
る実施例 Ｅ．Ｃｏｌｉ（ＤＨ５−α株）をＬ−Ｂｒｏｔｈ培地に
て培養し、集菌後１００ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁した。
カルシウムにより活性化された大腸菌をｐＫＫ２２３−
３［ｈＭＰＵ−Ｐ］で形質転換し、Ｌ−Ｂｒｏｔｈ培地
にて培養した。培養液を精製しＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
け、ポリビニリデン−ジフルオライド膜に転写しｈＭＰ
Ｕを得た。以下同様に、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−
１］、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−２］、ｐＫＫ２２
３−３［ｈＭＰＵ−３］を用いてＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５
−α株）を形質転換し、得られた培養液からｈＭＰＵ−
１、２、３を精製して得た。
る実施例 Ｅ．Ｃｏｌｉ（ＤＨ５−α株）をＬ−Ｂｒｏｔｈ培地に
て培養し、集菌後１００ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁した。
カルシウムにより活性化された大腸菌をｐＫＫ２２３−
３［ｈＭＰＵ−Ｐ］で形質転換し、Ｌ−Ｂｒｏｔｈ培地
にて培養した。培養液を精製しＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
け、ポリビニリデン−ジフルオライド膜に転写しｈＭＰ
Ｕを得た。以下同様に、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−
１］、ｐＫＫ２２３−３［ｈＭＰＵ−２］、ｐＫＫ２２
３−３［ｈＭＰＵ−３］を用いてＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５
−α株）を形質転換し、得られた培養液からｈＭＰＵ−
１、２、３を精製して得た。
【００４５】実施例４．ヒトＭＰのヒトＴＧＦ−β活性
に対する抑制作用 本発明のｈＭＰＵを構成蛋白質とするヒトＭＰがヒトＴ
ＧＦ−β活性を仰制することを次の通り確認した。実施
例１−においてヒト血小板より得て、還元物よりｈＭ
ＰＵ−１、２、３を構成成分として含有することを確認
したヒトＭＰを以下の実施例に供した。ヒトＭＰのＴＧ
Ｆ−β仰制作用はラット初代培養肝実質細胞を用いて測
定した。ウィスター系ラットからコラーゲン還流法によ
り肝実質細胞を分離精製した。得られた肝実質細胞を５
％の仔ウシ血清を含むウィリアムスＥ培地（フローラボ
ラトリー社）に２．５×１０５個／ｍｌの濃度で懸濁
し、２４ウェルマルチプレートに０．５ｍｌ／ウェルづ
つ播いた。５％ＣＯ２、３０％Ｏ２、６５％Ｎ２の条件
下、３７℃で２０時間培養後、１×１０−７Ｍインスリ
ン（シグマ社）、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（組換えヒトＥ
ＧＦ、アース化学社）を含む無血清ウィリアムスＥ培地
に交換すると共に、２．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブ
ミンを含むリン酸食塩緩衝液に所定量のＭＰを添加した
溶液４５μｌと、同緩衝液にＴＧＦ−β１、β２各１．
８ｎｇを添加した溶液５μｌを混合し室温で１時間イン
キュベートした溶液を添加した。１２時間培養後１．２
５μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］デオキシチミジンを１０μｌ
／ウェル加え、コントロール群には［３Ｈ］デオキシチ
ミジン添加１５分前に５μｇ／ｍｌのアフィディコリン
を添加した。さらに２４時間培養してトリチウムラベル
した後、細胞をｐＨ７．４のリン酸食塩緩衝液で２回洗
浄し、冷１０％トリクロロ酢酸水溶液で固定した。細胞
を１ウェル当たり０．５ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水
溶液で可溶化し、その放射能をガンマカウンターにより
測定した。被検試料を添加したとき肝実質細胞に組み込
まれたトリチウムの量をコントロールのカウント ＴＧＦ−βの持つ肝実質細胞増殖阻害活性を用量依存的
に抑制し、４０〜１００ｎｇ／ｍｌ（ＴＧＦ−β１重量
部に対して２０〜５５重量部）でＴＧＦ−βの活性をほ
ぼ完全に仰制することが明らかとなった。
に対する抑制作用 本発明のｈＭＰＵを構成蛋白質とするヒトＭＰがヒトＴ
ＧＦ−β活性を仰制することを次の通り確認した。実施
例１−においてヒト血小板より得て、還元物よりｈＭ
ＰＵ−１、２、３を構成成分として含有することを確認
したヒトＭＰを以下の実施例に供した。ヒトＭＰのＴＧ
Ｆ−β仰制作用はラット初代培養肝実質細胞を用いて測
定した。ウィスター系ラットからコラーゲン還流法によ
り肝実質細胞を分離精製した。得られた肝実質細胞を５
％の仔ウシ血清を含むウィリアムスＥ培地（フローラボ
ラトリー社）に２．５×１０５個／ｍｌの濃度で懸濁
し、２４ウェルマルチプレートに０．５ｍｌ／ウェルづ
つ播いた。５％ＣＯ２、３０％Ｏ２、６５％Ｎ２の条件
下、３７℃で２０時間培養後、１×１０−７Ｍインスリ
ン（シグマ社）、１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ（組換えヒトＥ
ＧＦ、アース化学社）を含む無血清ウィリアムスＥ培地
に交換すると共に、２．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブ
ミンを含むリン酸食塩緩衝液に所定量のＭＰを添加した
溶液４５μｌと、同緩衝液にＴＧＦ−β１、β２各１．
８ｎｇを添加した溶液５μｌを混合し室温で１時間イン
キュベートした溶液を添加した。１２時間培養後１．２
５μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］デオキシチミジンを１０μｌ
／ウェル加え、コントロール群には［３Ｈ］デオキシチ
ミジン添加１５分前に５μｇ／ｍｌのアフィディコリン
を添加した。さらに２４時間培養してトリチウムラベル
した後、細胞をｐＨ７．４のリン酸食塩緩衝液で２回洗
浄し、冷１０％トリクロロ酢酸水溶液で固定した。細胞
を１ウェル当たり０．５ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水
溶液で可溶化し、その放射能をガンマカウンターにより
測定した。被検試料を添加したとき肝実質細胞に組み込
まれたトリチウムの量をコントロールのカウント ＴＧＦ−βの持つ肝実質細胞増殖阻害活性を用量依存的
に抑制し、４０〜１００ｎｇ／ｍｌ（ＴＧＦ−β１重量
部に対して２０〜５５重量部）でＴＧＦ−βの活性をほ
ぼ完全に仰制することが明らかとなった。
【００４６】
【発明の効果】本発明のポリペプタイドｈＭＰＵ−１、
２、３を構成成分とするｈＭＰＵは、低分子サブユニッ
トと結合させて本発明のｈＭＰを得ることができる。ｈ
ＭＰはそれ自体、また必要により糖鎖と結合させること
により、ヒトおよび各種動物由来のＴＧＦ−βと結合
し、腫瘍細胞の増殖抑制等各種生理活性を発揮する。本
発明のポリペプタイドｈＭＰＵ−Ｐは、これによりｈＭ
ＰＵ−１、２、３を製造することができる。本発明のポ
リヌクレオチドｈＭＰＵ−１Ｎ、２Ｎ、３Ｎ、ＰＮは、
遺伝子工学的手法に供することにより、本発明のポリペ
プタイドを製造することができる。
２、３を構成成分とするｈＭＰＵは、低分子サブユニッ
トと結合させて本発明のｈＭＰを得ることができる。ｈ
ＭＰはそれ自体、また必要により糖鎖と結合させること
により、ヒトおよび各種動物由来のＴＧＦ−βと結合
し、腫瘍細胞の増殖抑制等各種生理活性を発揮する。本
発明のポリペプタイドｈＭＰＵ−Ｐは、これによりｈＭ
ＰＵ−１、２、３を製造することができる。本発明のポ
リヌクレオチドｈＭＰＵ−１Ｎ、２Ｎ、３Ｎ、ＰＮは、
遺伝子工学的手法に供することにより、本発明のポリペ
プタイドを製造することができる。
【００４７】このように本発明のポリペプタイドおよび
ポリヌクレオチドは、ＴＧＦ−βと結合するマスキング
プロテイン製造のために必須不可欠の重要な物質であ
る。
ポリヌクレオチドは、ＴＧＦ−βと結合するマスキング
プロテイン製造のために必須不可欠の重要な物質であ
る。
【００４８】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：７５６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：７５２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：７５１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【００５１】配列番号：４ 配列の長さ：８４５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【００５２】配列番号：５ 配列の長さ：２２６８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００５３】配列番号：６ 配列の長さ：２２５６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００５４】配列番号：７ 配列の長さ：２２５３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００５５】配列番号：８ 配列の長さ：２５３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００５６】配列番号：９ 配列の長さ：２７８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】潜在型ＴＧＦ−β複合体画分の逆相液体クロマ
トグラフィー分画。実線は２８０ｎｍにおける吸光度、
破線はアセトニル濃度を示す。
トグラフィー分画。実線は２８０ｎｍにおける吸光度、
破線はアセトニル濃度を示す。
【図２】各ピークの非還元下および還元下ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析。
ＧＥ分析。
【図３】ｈＭＰＵのＴＧＦ−β１、β２活性抑制。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (10)
- 【請求項１】配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポ
リペプタイドｈＭＰＵ−１。 - 【請求項２】配列番号２記載のアミノ酸配列を有するポ
リペプタイドｈＭＰＵ−２。 - 【請求項３】配列番号３記載のアミノ酸配列を有するポ
リペプタイドｈＭＰＵ−３。 - 【請求項４】配列番号１ないし３記載のアミノ酸配列を
有するポリペプタイドｈＭＰＵ−１、ｈＭＰＵ−２、ｈ
ＭＰＵ−３の混合ポリペプタイドｈＭＰＵ。 - 【請求項５】配列番号９記載のアミノ酸配列を有するポ
リペプタイドと請求項１ないし４記載のポリペプタイド
がＳ−Ｓ結合してなるヒューマン・マスキングプロテイ
ンｈＭＰ。 - 【請求項６】配列番号４記載のアミノ酸配列を有するポ
リペプタイドｈＭＰＵ−Ｐ。 - 【請求項７】配列番号５記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドｈＭＰＵ−１Ｎ。 - 【請求項８】配列番号６記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドｈＭＰＵ−２Ｎ。 - 【請求項９】配列番号７記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドｈＭＰＵ−３Ｎ。 - 【請求項１０】配列番号８記載の塩基配列を有するポリ
ヌクレオチドｈＭＰＵ−ＰＮ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3337508A JPH0692995A (ja) | 1991-10-21 | 1991-10-21 | ヒユーマン・マスキングプロテインおよび高分子ユニット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3337508A JPH0692995A (ja) | 1991-10-21 | 1991-10-21 | ヒユーマン・マスキングプロテインおよび高分子ユニット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0692995A true JPH0692995A (ja) | 1994-04-05 |
Family
ID=18309317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3337508A Pending JPH0692995A (ja) | 1991-10-21 | 1991-10-21 | ヒユーマン・マスキングプロテインおよび高分子ユニット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0692995A (ja) |
-
1991
- 1991-10-21 JP JP3337508A patent/JPH0692995A/ja active Pending
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