JPH0341096A - インシュリン様成長因子類の結合蛋白 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、ソマトメジン類としても知られる、インシ
ュリン様成長因子（Ｉ　ＧＦ類と略記）に結合するキャ
リヤー蛋白類、その製造法および種々の治療用途におけ
る使用に関するしのである。

［従来の技術］ ＩＣＦ類は、プロインシュリンに構造的相同性を有する
低分子量ポリベプヂドホルモンである。

２種の異なるＩＧＰ、すなわちＩＧＦ−［およびＩＧＦ
−４１が知られているか、これらは組織培養中の広範な
細胞に対しインビトロでマイトジェン作用をもつ。両Ｉ
ＧＦともインビボで種々の組織の成長を刺激し、特にこ
れらはコラーゲン合成を誘導する。ＩＣ；Ｆｌは、軟骨
形成および骨形成における成長ホルモンの成長促進作用
を仲介するので、個体の正常な成長に必要である。この
ことは、ピグミーと愛がん用ブードルがＩＣＦ−１を欠
くが血清中に正常な成長ホルモン感度をもつことによっ
て例証される。ＩＧＦ−ｎは、退治発生および神経成長
に重要な役割を演すると思われる。

骨核組織に対する第１の作用に加えて、これらは他の組
織に対する機能をも有する。傷の線維芽がＩＣＦ類を産
生じ、これが線維芽を刺激して成長させ、傷の癒合に通
常必要な構造蛋白であるコラーゲンを合成させることが
知られている。傷の血管新生ら誘導される。さらに、Ｉ
ＣＦ類は、造血を誘導する点で、エリスロボエチン様活
性を有することが見出された。

［発明の記載コ また、最近の研究は、ある種のかん細胞、例えば乳がん
および腎がん細胞が産生ずるＩＣＦ類かがん細胞と、が
ん組織の成長を支えるに必要な血管および線維組織の増
殖を自己刺激することを明らかにした。

さらに、２種のＩＧＦは、特にグルコースの輸送と代謝
を刺激する点で、インシュリンに類似した代謝活性スペ
クトルをしめず。ＩＣＦ類とインシュリンの生物活性は
、特異的レセプターへの結合によって仲介される。特に
、２種のＩＣＦは、インシュリンより約１００倍低い親
和性でインシュリンレセプターに結合する能力を有する
。

２種のＩＧＦは、インシュリンより約１００倍高い血中
感度を有する。ＩＣＦ類はインシュリン様活性を有する
ため、このことから低血糖がもたらされ得る。これは、
血液中に存在しＩＧＦ類と錯体を形成し得るキャリヤー
蛋白が関与した調節機構により防止される。すなわち、
ＩＣＦ類は、インシュリン様活性をもたない３１）体の
形で血液中を循環する。キャリヤー蛋白（以下、Ｉ　Ｇ
　Ｆ結合蛋白類またはＩＣＦ−Ｂｒ’類と略記）との結
合により、細胞表面レセプターとの結合が妨げられる。

また、ＩＣＦ結合蛋白の別の機能は、血液中に遊離形で
存在する場合に急速な蛋白分解作用を受けることによる
ＩＧＦの短い半減期を増大させることであることを明ら
かにされた。

上記のことから、ＩＣＦ類は、（ａ）成長ホルモン欠損
動物またはひとの成長、（ｂ）赤血球形成および軟骨形
成のような組織再生、（ｅ）傷の癒合および（ｄ）種々
の器官、例えば肝臓および腎臓の機能の刺激のためイン
ビボで用いることができる。

軟骨形成刺激活性をもつため、ＩＣＦ類は骨の形成のた
め、例えば骨粗しよう症の処置に特に適する。上記の処
置のために用いるＩＣＦ類は、少なくとも１種のＩＧＦ
結合蛋白と共に対象に投与するのが有利である。［ＧＦ
単独ではなく上記の組合わせの投与により、低血糖およ
び注射部位のマイトジェン効果の防止とｌＧＦ半減期の
延長を含めて色々な利点が得られる。さらに、結合蛋白
類はＩＧＦ−１のエリスロボエチン様作用の増強に有用
であることが判明した。

単独、すなわちＩＧＦなしで投与した場合、結合蛋白は
ＩＧＦ’類の副作用、例えばある種のかん細胞、例えば
乳がんまたは腎がん細胞のようなホルモン産生がん細胞
が分泌する遊離ｒＧＦのようにＩＧＦ類が過剰産生され
た場合に起こるような副作用の附止のため、治療上使用
することができる。ＩＧＦ結合療法は、糖尿病性増殖性
網膜症の２次的作用による盲目の予防に用い得る。事実
、ＩＧＦ類は糖尿病性網膜症における内皮および繊維芽
性増殖を刺激する因子の１つであり得ることが示された
。

別の治療用途は、高ＩＧＦｉｌＷ度と結合蛋白の異常低
濃度の組合わせが過剰成長の原因であり得るため、ＩＧ
Ｆ’結合蛋白欠乏対象における過剰成長の制御である。

最近、寸法が異なる少なくとも２種のＩＧＦ結合蛋白メ
ジャ一種が、げつ歯類およびひとの血清から検出された
。

大きな結合蛋白は、約１５０ｋｄで数種のサブユニット
から構「戊される糖蛋白である。小さな結合蛋白と異な
って、その生成は成長ホルモン依存性である。

小さな結合蛋白は、ひとおよびラットにおいて、分子量
約３Ｏ−４０ｋｄを有する。ひとの小さな結合蛋白は、
既に羊水［ボボア等、ヨーロピアン・ジャーナル・才ブ
・バイオケミストリー（Ｅ　ｕｒ。

Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｃｍ、　）（１９８４年）１４４巻
１９９頁（そのため羊水結合蛋白ともいう）］、胎ばん
［コイステネン等、エンドクリノロジー（Ｅ　ｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌｏｇｙ）（１９８６年）１１８巻１３７５頁
］およびヘパトーマＧ２細胞順化培地（ボウエル等、ジ
ャーナル・オブ・クロマトグラフィー（、Ｊ　、　Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒ、　）（１９８７年）４２０巻１６３
頁］を含めて種々の原料から精製されている。結合蛋白
類は、アミノ酸含量およびＮ末端アミノ酸配列より特徴
づけられ、同一または少なくとも極めて類似することが
見出されている。ヘパトーマＧ２細胞［り一等、モレキ
ュラー・エンドクリノロジー（Ｍｏｌ　、　Ｅ　ｎｄｃ
ｚｉｎｏｌ、　Ｘｌ　９８８年）２巻５号４０４頁］か
ら分離されたＩＧＰ結合蛋白と胎ばんｃＤＮＡライブラ
リー［ブリンクマン等、ジ・イーエムビーオー・ジャー
ナル（Ｔｈｅ　　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌＸＩ９８８年
）７巻８号２４！７頁］からクローンされた結合蛋白は
、アミノ酸配列を比較すると９９％ホモロジーを示した
。さらに、これら２Ｎのアミノ酸配列は、ひと子宮ｃＤ
ＮＡライブラリーからクローンされたｃＤＮＡが暗号化
するＩＧＦ結合蛋白と９４％相同性を示すしブリュヮー
等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーションズ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ
　１ｏｐｈｙｓＲｅｓ、　Ｃｏｍ、　ＸＩ　９８８年）
１５２巻３号１２８９頁］。

血清中に存在ずろＩＣＦ結合蛋白の２種のメジャー形態
に加えて、他のＩＧＦ結合蛋白が、種々のひと組織抽出
物および細胞培養培地から、ウェスタンブロッティング
法および［１”’］ＩＣＦによる親和性標識により同定
されている。それらの分子量は＋５−１５０ｋｄに分布
し、これら蛋白のいくつかは大きなＩＧＦ結合蛋白の蛋
白分解に生じた乙のであり得る。特に、ひと血清から精
製された５３ｋｄｌＧＦ結合蛋白は、１５０ｋｄｌＣＦ
’蛋白のサブユニットをもつ［バクスター、バイオケミ
カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミユニ
ケーン−３ンズ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙ
ｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍ、　Ｘｌ　９８６年１３９Ｎ３号１２５６頁）］
。

また、ＩＧＦ結合蛋白の別の形態が、ラットＢＲＬ−３
Ａ細胞の順化培地に見出されており、これは分子量約３
３−３６ｋｄを有する。ラットｕｒｔＬ−３Ａ結合蛋白
の部分的アミノ末端蛋白配列が決定されており［モット
ラ等、ジャーナル・才ブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋１１．　ＸＩ　９８６
年）２６１巻１１１８０頁、ライオンズ、スミス、モレ
キュラー・アンド・セルラー・エンドクリノロノー（Ｍ
ｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｔ、　ＸＩ　
９８６年）４５０２６３頁］、第１図に、ひとの小さな
結合蛋白のＮ末端アミノ酸配列（ボボア等およびり一等
）と共に示す。ラットとひとの末端配列が示す３３％程
度の相同性は、各結合蛋白が均等であると考えるに充分
む程高いものではない。

ラットＢＲＬ−３Ａ細胞結合蛋白に均等なひと結合蛋白
が発見され、そのアミノ酸配列が完全に確認されるに至
った。他の小さなひと結合蛋白の配列と比較した結果、
この新らしいひと結合蛋白は特有の形態を示すことが明
示された。

したがって、この発明は、１位（Ｎ末端残基）のグルタ
ミン酸から始まり２８９位（Ｃ末端残基）のグルタミン
で終る第２図に示される２８９個のアミノ酸配列からな
る新規ＩＧＦ結合蛋白を提供し、またこれは成熟ＩＣ；
Ｆ−ＢＰとも呼ばれる。好ましくは、本蛋白は２８９個
の上記アミノ酸配列からなる。蛋白は、−３８位のロイ
シンまたは一３９位のメチオニンから始まり２８９位の
グルタミンで終わる３２７または３２８個のアミノ酸配
列からなることができ、その配列は成熟蛋白の完全な配
列と共にシグナル配列を含むので、２８９個のアミノ酸
成塾蛋白の前駆体形と一致する。本発明の範囲内では少
なくとも機能的特性のひとつが保たれる限り、少なくと
も１つのアミノ酸の欠失、付加または置換により第２図
に示されたものと異なるアミノ酸配列の前駆体または成
熟蛋白のアレル形を含む。例えば、上記変化は蛋白のＩ
ＧＦ結合親和性を増加または減少することができる。欠
失は置換残基の挿入なしでアミノ酸残基が脱離すること
を特徴とする。置換変異は１つのアミノ酸残基が別のア
ミノ酸で置き換えられた変異であり、仲人変異は■つま
たはそれ以上の残基がもとの蛋白のアミノ酸配列の中に
、またはいずれかの端に置かれた変異である。融合は典
型的に挿入変異種であり、その挿入はカルボキシまたは
アミノ末端残基でおこる。

ペプチド間の比較が好都合にアミノ酸配列の相同性の程
度に基づき確立することができるので、本発明の範囲で
は例えばプレーＩＧＦ−ＢＰまたはＩＧＦ−ＢＰ、好ま
しくは第２図に示されるＩＧＦ７−ＢＰまたは２０残基
以上の任意のフラグメントと約８５％、好ましくは９５
％から１００％相同の実質的相同性を示すあらゆる蛋白
を包含する。

インシュリン様成長因子に対する結合能力は、この発明
の蛋白質がもつ生物活性の１つである。

これらの蛋白質は、Ｉ　ＧＦ−１［リンダーネクトおよ
びハンベル、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　ＸＩ　９
７８年）２５３巻２７６９頁］またはＩＣＦ−ｎ［リン
グーネクトおよびハンベル、フェンス（ＦＥＢＳ）（１
９７８年）８９巻２８３頁］、好ましくは【ＧＦ’−Ｉ
Ｉの標識形、例えばヨード化形を用いる結合アッセイで
好便に試験することができる。例えば、このようなアッ
セイは、この発明の蛋白のゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）を行ない、ゲルをウェスターンプロットし、つい
でプロットを［ｌ！５１］Ｉ　ＧＦ−１またはＨの存在
下にインキュベートし、プロットを洗浄して遊離Ｉ　Ｇ
Ｆ−［またはＨを除去し、ブａット上の放射能を検出す
ることを好便に含み得る。

この発明のＩＧＦ−ＢＰ類は元来ひとＩＣＩ？’−ＢＰ
類を指向するものであるが、哺乳類のような原料、例え
ばねずみ、ぶた、うま、またはうしから得たこの発明の
ＩＧＦ−ＢＰ類も、それらが必要度の相同性を充足する
限りＩＧＦ−ＢＰ類の定義に含まれるものとする。

この発明のｒＧＦ−ＢＰ類は、組織抽出物または順化培
地から精製されるものおよび組換え体技術で得られるも
のを包含する。

この発明の範囲には、Ｉ　ＧＦ−ＢＰ類の誘導体も含ま
れる。誘導体には、グリコジル化形、他のＩＣＦ−ＢＰ
分子との会合コンジュゲート形（ａｇｇｒｅｇｅｔｉｖ
ｅ　　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）および無関係な化学的部
分との共有結合コンツユゲートが含まれる。共有結合の
誘導体はＩ　ＧＦ−ＢＰアミノ酸鎖またはＮもしくはＣ
末端残基中にみられろ基に官能性成分（ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎａｌｉｔｉｓ）を既知方法結合させることにより製造
される。

さらに、この発明は、この発明のＩ　ＣＦ　−Ｂ　Ｉ）
類、例えば１位のグルタミン酸で始まり２８９位のグル
タミンで終る第２図の２８９個のアミノ酸配列を含む蛋
白を暗号化している組換え体核酸配列を提供する。核酸
配列は、＝３８位のロイノン、または−３９位のメチオ
ニンで始まり２８９位のグルタミンで終る第２図の前駆
体蛋白を暗号化し得る。この発明の範囲内には、第２図
に示す前駆体または成熟Ｉ　ＧＦ−ＢＰのアレル（ａｌ
ｌｅｌｉｃ）形を暗号化する任意の核酸配列か含まれる
。組換え体核酸配列の語は、種々の原料から得た核酸配
列片を連結して得られるあらゆる核酸配列を指向する。

この語はまた、拡張により、天然原料から分離される配
列をも含む。これらの組換え体核酸配列は、ｃＤＮＡお
よびゲノムｒＤＮＡを含めて、ｍＲＮＡまたはｒＤＮＡ
の何れでもあり得る。好ましくは、これらはｃＤＮＡで
あり、最も好ましくは、ｃＤＮＡ配列は１２０．１２３
、または２３７位で始まり１１０３位で終る第２図の配
列である。

一般的指針として、第２図の前駆または成熟ＩＧＦ−Ｂ
Ｐを暗号化するＤＮＡ配列と、ストリンジェント雑種形
成条件下、例えば４倍食塩くえん酸緩衝液中６５℃で１
６時間以内でハイブリダイズするあらゆる核酸配列が、
この発明の範囲に含まれる。

例示したＩＧＦ−ＢＰ暗号化配列を得る一般的方法は下
記の通りである。

第五図のラットＢＲＬ−３Ａ細胞Ｉ　ＧＦ’−ＢＰの既
知Ｎ−末端配列を、第４図に示すＢＰＳＩおよびＢＰＳ
２と名づけた２種の９２塩基オリゴヌクレオチドプロー
ブのデザインに使用した。放射能標識後、これらのプロ
ーブをラットｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに
用いた。１０６クローンからの３４Ｎの独立交差ハイブ
リダイズ性クローンが検出され、制限酵素およびサザン
プロット分析により分析した。これら３４種のクローン
をｃＤＮＡフラグメントの大きさにより１２のクローン
群に分類した。各群の代表ｃＤＮＡフラグメントをベク
ターＭＩ３ｍｐ８［ビエイラおよびメシング、ノーン（
ＧｅｎｅＸＩ　９８２年）１９巻２５９頁コ中にクロー
ン化し配列決定した。その結果、第３図に示すように１
つの群からラットＢＲＬ−３Ａ・ＩＣＦ−ＢＰの完全ヌ
クレオチド配列が決定された。これは、２９９個のアミ
ノ酸を暗号化する転写解読枠をもつ。成熟結合蛋白のＮ
Ｈ７末端がライオンズ等の決定した配列に対応するなら
、結合蛋白およびシグナルペプチドはそれぞれ２７０お
よび２９個のアミノ酸から構成されている。この蛋白質
はＮ−グリコジル化部位をもたず、１９個のシスティン
残基を含むがこれらの大部分はＮ　Ｈ、末端に近接して
密集している。

３種のひとｃＤＮＡライブラリーを、プローブとしてラ
ットｃＤＮＡ配列を用いスクリーニングした。これらは
、成人肝臓ライブラリー（クロンチクからカタログ番号
ＨＬ１００１３で市販されている）、胎児肝臓ライブラ
リー（クロンチク、Ｉ（Ｌｉ２Ｏ２）およびＨＥＰＧ２
セルラインに由来するｃＤＮＡライブラリー（クロンチ
ク、ＨＬＩＯ１５）である。成人肝臓ｃＤＮＡライブラ
リーからの５Ｘ１０’独立フアーツクローンをスクリー
ニングしたが、ハイブリダイズ可能なりローンは検出さ
れなかった。２．５ｘ１０５（ひと胎児肝臓ライブラリ
ー）および１　、　５　Ｘ　１０５（ＨＥＰＧ　２ライ
ブラリー）Ｎのクローンから、それぞれ１４おょび３種
の交差ハイブリダイズ性クローンが分離され分析された
。３個のＨＥＰＣ；２クローンのＣＤＮＡインサートは
同一で約８００ｂｐの長さであることがわかった。この
ヌクレオチド配列はまた、胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリ
ーから分離された１゜４ｋｂ長のｃＤＮＡクローン上に
コード化されており、この配列を第２図に示すように決
定した。このｃＤＮＡ配列は翻訳コドンＡＴＣで始まる
２８９アミノ酸を暗号化する転写解読枠をもつ。ラフＮ
５ＲＬ３Ａ結合蛋白とのアミノ酸の比較では、相同性８
１％であることがわかる。

このＤＮＡ配列が暗号化する成熟ひと結合蛋白は、もし
シグナルペプチドがラットＢ　ＲＬ　−３Ａ結合蛋白と
同じ位置で切断されるならばラットのむのより１９アミ
ノ酸だけ長い。このひと結合蛋白および他の３０ｋｄひ
と結合蛋白［り一等、ブリンクマン等およびブリュワー
等］は約３７％のアミノ酸を共有にもつ二このような低
度の相同性は、明らかに、これらが異なる結合蛋白であ
ることを示す。配列中の２種の構造が、既知の結合蛋白
、すなわち蛋白のＮ　Ｈ２末端におけるシスティンリッ
チ領域および２６１−２６４位のＡｒｇ−ＧｌｙＡｓｐ
配列と共通である。後者の配列は、この結合蛋白を他の
ひとホルモン結合蛋白類から区別するものであり、その
機能、例えば特異的細胞表面レセプターとの結合に関し
て重要なものであり得る。

本発明の別の態様によると、本発明のＩＧＦＢＰを暗号
化するＤＮＡ配列を含み、適当な真核または原核宿主中
で本Ｉ　ＧＦ−ＢＰの発現を可能とする制御配列を機能
可能に結合する発現ベクターを提供する。上記制御配列
は転写プロモーター転写を制御する所望に上るオペレー
ター、適当なｍＲＮＡリボゾーム結合部位を暗号化する
配列および転写お上び翻訳の終結を制御する配列を含む
。

ベクターはプラスミド、ウィルスおよび合体可能なフラ
グメント、すなわち組換えにより宿主ゲノム中で合体可
能なフラグメン）・を含む。本発明で使用するためプラ
スミドが有利に選択される。それらは原核または真核宿
主中のいずれかでの発現に適するものであり得るが、後
者が好ましい。

本発明の好ましい態様では、第２図に示された前駆体結
合蛋白を暗号化するＥｃｏＲＩ　−Ｅｃｏｌｌ　ＩｃＤ
ＮＡフラグメントはあらかじめＥｃｏＲｆにより消化さ
れたプラスミドｐＸＭＴ中でクローン化される。プラス
ミドｐＸＭＴは第５図に示され、標準的ＤＮＡ操作によ
りｐ９１０２３（ＢＸウォン、Ｇ、Ｇ、等、サイエンス
（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）　２２８巻、８１Ｏ頁）から由来
される。ｐＸＭＴは複製開始点ｐＢＲ３２２およびエシ
ェリヒア・コリ中で繁殖するためのアンビンリン耐性遺
伝子をもち、ＣＯＳさる細胞中のＤＮＡ複製を阻害する
細菌配列を欠失する。これは、さらに、いくつかの異な
る原料からの真核調節要素を含む。（ｉ）プラスミドに
ＣＯ３細胞中での非常に高いコピー数の複製および挿入
ｃＤＮＡ遺伝子を有利に転写することを共に可能とする
ＳＶ４０オリジンおよびＳＶ４　Ｑエンハンザ−・セグ
メント、（ｉｉ）アデノウィルス・トリパータイト・リ
ーダーのｃＤＮＡコピーと供役するアデノウィルス・メ
ジャー・レイト・プロモーター、（ｉｉｉ）トリバータ
イト・リーダーの最初のエキソンからの５′スプライス
部位およびマウス免疫グロブリン遺伝子からの３″スプ
ライス位からなるハイブリッド・イントロン、（ｉｖ）
ＳＶ４０初期ポリアデニル化ングナル、および（ｖ）ア
デノウィルスＶＡ　　Ｉ遺伝子領域。プラスミドＩ）Ｘ
ＭＴはまた３゛スプライス位後にちょうど位置する特有
ＥｃｏＲ１クローン部位から下流にマウスジヒドロ葉酸
還元酵素（Ｄｉ（ＰＲ）コード化配列を含む。

本発明によると、本発明によるＤＮＡ配列またはベクタ
ーで形質転換されたセルラインらまた提供される。適当
な店主細胞並びに形質転換および成長の方法の選択は当
業者に既知である。原核および真核セルラインとも使用
できるが、後者の方が好ましい。真核細胞は例えば、酵
母細胞または哺乳類細胞のような多細胞生物体に由来す
る細胞を含む。好ましい適当な哺乳類セルラインの一到
は、ヂャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＩ（Ｏ）セルラ
インである。別の適当な哺乳類セルラインは、さるＣＯ
５−１またはＣＶ−１セルラインである。

本発明の別の態様によるとｒＧＦ−ＢＰの製造方法が提
供され、これは本発明のＤＮＡフラグメントまたはベク
ターで形質転換したセルラインの培養物から本ＩＧＦ−
ＢＰを採取ずろことからなる。

図面の説明 第１図は、ラットＢＲＬ−３Ａ結合蛋白Ｎ末端配列（（
ａ）リオン、Ｒ，Ｍ、およびスミス、Ｇ、、Ｌ、モルキ
ュラー・アンド・セルラー・エンドクリノロノー（Ｍｏ
１．　Ｃｅ１１．　Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ、　）第４５巻
第２６３頁（１９８６年）、または（ｂ）モットラ、Ｃ
１ら、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）第２６１巻第１
１１８０頁（１９８６゛年）により決定）、とひと小結
合たん白のＮ−末端配列（（Ｃ）いずれもり−、Ｙ、Ｌ
ら、モルキュラー・エンドクリノロジー（Ｍ　ｏ　ｌ　
。

Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ　、　）第２巻（５）第４０４頁（
１９８８年）ニブリンクマン、Ａら、ザ・イー・エム・
ビー・オー・ジャーナル（Ｔ　ｈｅ　　Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｏ
Ｊ　ｏｕｒｎａｌ）第７巻（８）２４１７頁（１９８８
年）；またはボポア、Ｇら、ユーロビアン・ジャーナル
・オン・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　）第１４４巻１１９頁（１９８４年）
により決定）、との比較を示す。ギャップは２種類の蛋
白間の配列相同性を最大化するように導入した。

第２図は、胎児肝臓ライブラリー（クロンチク、ＨＬ１
００５）からクローンしたＥｃｏＲＩ　−Ｅｃ。

１１１ｃＤＮＡフラグメント配列および一３９位で開始
し、２８９位で終了するラットＢＲＬ−３Ａ細胞のもの
と均等な、対応するひと結合蛋白前駆体アミノ酸配列を
示す図である。

第３図は、−２９位で開始する前駆形および１位で開始
する成熟形を暗号化するラットＢＲＬ−３Ａ完全ｃＤＮ
Ａ配列を示す図である。

第４図は、モットラ、Ｃ１らにより報告され、ラットｃ
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用されたラッ
トＢＲＬ−３Ａ結合蛋白プローヅＢＰＳ−１およびＢＰ
！１１．２のＤＮＡ配列を示す図である。

第５図は、単一のＥｃｏｒｉ部位にｃＤＮＡフラグメン
トを挿入後のプラスミドｐＸＭＴおよび誘導体を示す図
である。

第６図は、次のようにして得られたウェスタンプロット
の結果を示す図である：非形質転換（レーン４）、ＰＸ
ＭＴ十（レーンｌ）またはｐＸ、ＭＴ−（レーン２）形
質転換ＣＨＯ細胞を非還元条件下ポリクリルアミド・ゲ
ル電気泳動処理した。レーン３にさい帯（ｕｍｉｂｉｃ
ａｌ　　ｃｏｒｄ）血清５０μｇを使用した。原動後、
たん白をニトロセルロース・フィルムに移し取り［”５
１１−　ＩＣＦ−ｒを作用さけた。

第７図は、ｐＸＭＴ十形質転換ＣＨＯ細胞により順化し
た培地のウェスタンプロットの結果を示す図である。［
”’ｒ］−１ＣＦ−■のＩｎｇは非標識化ＩＣＦ−Ｈの
５ｎｇまたは２５ｎｇ（レーンＤおよびＥ）、冷ＩＣＦ
−１または非標識化インシュリンのｌ　ＯＯｎｇ（レー
ンＦ）と競合する。プロットは第６図と同様に調製した
。

実施例Ｉ ラットＩＧＦ結合たん白ＤＮＡ暗号化の採取２種類の９
２塩基オリゴヌクレオチドプｃ１−ブ、モットラらによ
って決定されたＢＲＬ−３Ａ結合たん白のＮ末端配列に
対応４−るＢＳＰ−１およびＢＳＰ−２を、アプライド
パイオンステム３８０Ａオリゴヌクレオチドンンセサイ
ザーにより合成した。これらのプローブを第４図に示す
。これらはもっともしばしばラット中に見られる対応ア
ミノ酸のコドンを選択してデザインされたものである。

ついで、このプローブはポリヌクレオチドキナーゼを用
いてγ［”Ｐ］ＡＴＰにより標識化する。

出生後ラット肝臓ｃＤＮＡライブラリー（スコデル・ビ
オツェントルム）または、成熟ラット肝臓ＣＤＮＡライ
ブラリー（クロンチク、ＲＬｌｏｏＩ）から１０００個
の組み換え体λｇｔ１１ファーツクローンを２種類のプ
ローブを用いて下記のようにスクリーニングした。

各ライブラリーから５ＸＩＯ’個のλｇｔｌ＋ファージ
を２ｍｌのＩ　０１１ＭＣａＣ１ｙ・ｌ　ＯｍＭＭｇＣ
Ｌ中の４・！０＠個のエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ）Ｋ８０３受容可能細胞に形質転換した。３７℃の
水浴中にて１５分間インキユヘートした後、ルリア・ブ
ロス（ＬＢ）培地１％軟寒天の３０ｍ１を細胞に添加し
、ＬＢ培地１．５％寒天を４００ｍ１含む２３Ｘ２３ｃ
ｍヌンクロンベトリ皿に平板培養した。

プレートを３７℃にて１２時間インキュベートし、つい
で、少なくとも１時間４℃に移した。

２１．５Ｘ２２ｃｍのニトロセルローズ・フィルター（
ンユライアーおよびシュエルＢＡ８５）を各ペトリ皿の
クローン上にかぶせ、ついで、ｏ、５ＭＮａＯＨ，１，
５ＭＮａＣ１中に５分間移し、フィルター上のＤＮＡを
変性させ、中性化溶液（０，２Ｍトリス、２．５ＭＮａ
Ｃ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．０１５Ｋ
Ｈ＊Ｐ０４および０゜００１　ＭＥＤＴＡ（Ｎａ）＊、
ＰＨ７）中にて、２度洗浄する。最後に、フィルターを
１時間風乾し、８０℃にて２時間真空オープン中に移す
。

ついで、フィルターを５０℃にて６時間６ＸＳＳＣＳ　
ｌｘデンハルト、５０５Ｍパイブス（Ｐｉｐｅｓ）およ
び０．１ＭＫＰＯ，緩衝液、１）Ｈ７中に浸す。

（２０ｘＳＳＣ：０．１５ＭＮａＣｌおよび０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム：２０ｘデンハルト：０４％４％
ランアルブミン、０．４％フィコールおよび０．４％ポ
リビニルピロリドン分子ｆｆ１３６０Ｋｄ）。

プローブＢＰＳ−１のＩ　Ｏ”ｃｐｓ／ａ＋１およびプ
ローブＢＰＳ−２のＩＯ”ｃｐｍ／ｍｌの混合物を用イ
テ、熱変性サケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ　ｌ　Ｏｍｇ／ｍｌで補
足した６ＸＳＳＣ，ｌｘデンハルト、１ｍＭトリスート
Ｉｃｔ％ｐ１１７．０．２ｍＭＥＤＴＡＳｐＨ８，，０
，９ＭＫＰＯ，，０，５％ＳＤＳ中でハイブリダイゼー
ションを行う。最後に、５０℃にて、フィルターを各４
ｘＳＳＣ，０，５％ＳＤＳにて３０分間３度洗浄し、コ
ダックＸ−ＯＭＡＴ　　ＸＡＲフィルムに感光させる。

フィルム上の放射性スポットに該当する領域をプレート
上で特定し、取り出す。再スクリーニング後、肝臓ｃＤ
ＮＡライブラリーから３４の独立した交差ハイブリダイ
ズ可能クローンを分離した。

これらのクローンを制限酵素およびサザン・プロットに
より分析し、１２種類のグループに分類した。

各グループを代表するｃＤＮＡインサートをＭ１３ｓｐ
Ｂ中にクローンしくビエラ、Ｊおよびメッンング、Ｊ１
ジャーナル・オブ・ジーン（Ｊ、　Ｇｅｎｅ）第１９巻
第２５９頁（１９８２年））、サンガーの方法によって
配列決定する。出生後肝臓ｃＤＮＡライブラリーから分
離し、さらに配列決定された４クローンのヌクレオチド
配列は同一であり、ラットＢＲＬ−３Ａ結合たん白の部
分的たん白配列と一致した。第３図の完全ＤＮＡ配列は
重複するＣＤＮＡサブフラグメントの配列連結によって
決定した。これらのサブフラグメントをクローンし、超
音波処理によってもとのｃＤＮＡをランダムに切断した
後、配列決定した。

実施例２ ひとＩＧＦ結合たん白暗号化ｃＤＮＡの採取ラッ）１３
ＲＬ−３Ａ結合たん白を暗号化した第３図の完全ｃＤＮ
Ａをランダムプライマー操作を用いて標識化しくベーリ
ンガー・キット）、成人肝臓（クロンチク、ＨＬ　Ｉ　
００１３）、ひと胎児肝臓（クロンチク、ＨＬ　Ｉ　０
０５）およびＨＥＰ　　Ｇ２細胞（クロンチク、ＨＬ　
Ｉ　Ｏｌ　５）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
に使用する。スクリーニング操作はハイブリダイゼーシ
ョンを６５℃にて行うことを除いては実施例１記載の操
作と同様である。しかし、成人肝臓ｃＤＮＡライブラリ
ーからの５ＸｌＯ’の独立ファージクローンをスクリニ
ングしたが、交差ハイブリダイズ可能クローンは検出で
きなかった。２．５ｘｌＯ’（ひと胎児肝臓ライブラリ
ー）および１．５ｘ１０５フアーツクローン（ＨＥＰ　
　Ｇ２）から、１４個および３個の交差−ハイブリダイ
ズ可能クローンをそれぞれ分離した。すべてのＨＥＰ　
　Ｇ２特異的ｃＤＮＡクローンのインサート長はほぼ８
００ｂｐである。

これらの３個のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は同一で、
胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーから分離した１、３ｋｂ
の長さのｃＤＮＡクローンによって暗号化されていた。

この１．３ｋｂのｃＤＮＡフラグメントはオリコゴヌク
レオチド・ブライマーを用いてサンガーの方法によって
配列決定し、第２図に示す。

実施例３ ひとＩＧＦ−結合たん白の発現 第２図に示す前駆体結合たん白を暗号化したＣＤＮＡ配
列を含むＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを、あ
らかじめＥｃｏＲＩで切断したｐ　Ｘ　Ｍ　Ｔ中にクロ
ーンした。組換えプラスミドを適切な方向でＥｃｏＲＩ
　−ＥｃｏＲＩフラグメントと連結後、同定し、さらに
５ｓＰＩで切断し、ベクターを直線化した。

かくして得られたプラスミド標品１０μｇを、環状プラ
スミドｐＳＶ２−ネオ（サザーン、Ｐ、Ｊ。

およびベルブ、Ｐ、Ｊ、、ジャーナル・オン・モルキュ
ラー・アンド・アプライド・ノエネティックス・（Ｊ　
、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎ、）第１＠第３
２７頁（１９８２年））とともに、ＩＯ％胎児子牛血清
（ＦＣＳ）で補足したアルファ＋　ＭＥＭ培地（カタロ
グ番号０４ｍ−０２５７１Ｍのギプコを使用可能）中に
、あらかじめ全面成長の７０％まで威長さ仕た１０＠の
ＣＨＯ細胞中に共形質転換させる。形質転換はスクラッ
プ・ローディング・メソッド（フェヒハイマー３Ｍら、
ＰＮＡＳ第８４巻第８４６３頁（１９８７年））によっ
て行った。形質転換後、細胞をｌＯ％ＦＣ３で補足した
アルファ十ＭＥＭ培地の７５ｃｍの培養フラスコ中に接
種した。

４８時間後、薬剤Ｇ４１８のＩｍｇ／＋ａｌを培地に添
加した。１８日後、成長（薬剤耐性）コロニーを１０％
透ＦｒＦｃ５で補足したアルファーＭＥＭ培地（ギブコ
、０４１−０２５６１８）中に移した。

ついで、薬剤耐性コロニーおよび対照として使用した非
脂質転換ＣＨＯ細胞を、下記のようにＩＧＦ−ＢＰの発
現テストに使用したニブローブとしてラットＢＲＬ−３
Ａ結合たん白のＮＨ，末端配列を暗号化したＤＮＡ配列
を用いてｍＲＮＡ標品を得て、ノザーン・プロット分析
を行った。ハイブリダイゼーションが観察された。正し
い方向のｃＤＮＡインサートを台むｐＸＭＴ（ｐＸＭＴ
１）で形質転換されたＣＨＯ細胞および２０日令ラット
胚芽細胞は、特異的ｃＤＮＡ特異的結合たん白を転写し
たが、非形質転換または誤った方向に仲人したｃＤＮＡ
を含むｐＸＭＴ（ｐＸＭＴ−）で形質転換したＣＨＯ細
胞は転写しなかった。　形質転換および非形質転換ＣＨ
Ｏ（ｐＸＭＴ−）細胞の培養物の上清液をさらに２０分
の１に濃縮し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ウェス
タン・プロット分析を行った。このプロットは最終的に
、第６図に示す［”’ＩＩＩＧＦ−１でハイブリダイズ
した。ｐＸＭＴ＋（レーンりで形質転換したＣＨＯ細胞
順化培地中およびひと血清（レーン３）中に分子ｆｆ１
３６ｋｄのバンドか出現した。非脂質転換ＣＨＯ細胞（
レーン４）またはｐＸＭＴ−で形質転換された細胞（レ
ーン２）順化培地中にはシグナルは検出されなかった。

これは、さらに適当な方向にＣＤＮＡで形質転換された
Ｃ　）（Ｏ細胞のみが結合たん白を発現したことを示す
。

ＣＩ−１０細胞によって発現したＩＢＰ−２のＩＣＰ−
１１への結合能力およびＩＧＦ−１、ＩＧＦ■お上びイ
ンシュリンに対する相対的親和性を測定するために結合
競合性を検討した。ｐＸＭＴ＋で形質転換したＣ　ＨＯ
細胞からの順化培地５０μｌ検体群を、非還元条件下で
５ＤＳ−ＰＡＧＥ処理し、ニトロセルロース上に移した
。フィルターはストライブ状に垂直に切断し、各ストラ
イプを結合競合アッセイで別々に処理した（第７図）。

各フィルターを［”’Ｉ］ＩＧＦ−１１の１　ｎｇ（１
０’ｃｐＨ１５μｇたん白）にハイブリダイズした。つ
いで、レーンＡに非標識化Ｉ　ＣＦ−ｕ、レーンＢに５
ｎｇ、およびレーンＣに２５ｒ＋ｇの非標識化ｒｃｔ−
ｎをさらに添加した。競合体として、ＩＣＦ−１を使用
する場合は、ハイブリダイゼーション溶液に５ｎｇ（レ
ーンＤ）および２５ｎｇ（レーンＥ）を添加した。

インシュリン１１００ｎを競合試験Ｆ中で使用した。

これらの競合実験の結果を第７図に示す。結果は本発明
のＩＧＦ−ＢＰが特異的にＩＧＦ’−１１に結合するこ
とを示している。なぜなら、結合は非標識化ＩＣＦ−ｎ
の５倍過剰によってのみ、阻害され得るからである。結
合はまた非標識化ｆＧＦ−■の過剰によっても阻害され
るが、ＩＧＦ−ｒはＩＧＦ−１１より低い親和性を有す
る。１００倍過剰の冷インンユリンでは［”’Ｉ］ＩＧ
Ｆ−■結合阻害は見られなかった。これは、本発明のひ
とＩＧＦ−ＢＰがＩＣＦ−１に対するより、ｌ　ＣＦ−
■に対してより高い親和性を有しており、インシュリン
には結合しないことを示している。、ｔｉ−：”ｎ観点
から、本発明のＩＧＦ−ＢＰは、Ｉ　ＧＦ−１に対して
より高いか、または同等の親和性を有するひと羊水液か
ら精製されたＩ　ＧＦ−ＢＰとは異なるものである。

実施例４ ひとＩＣＦ結合蛋白の精製 製法４Ａ） 結合蛋白を発現するＣ　ｆ（Ｏクローンを２〜４ｘ１０
＠細胞／７５ＣＩＩ’フラスコの細胞密度で接種し、ア
ルファーＭＥＭ培地で全面の９０％まで成長させた。細
胞を濾過により成長培地から分離し、細胞不含有上清を
ＩＧＦ結合蛋白の精製用として使用した。

上清２００ｍ１２を５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ６，０の等容量で希釈し、最終溶液ｐＨをりん酸で
ｐＨ６，０で調節した。その後、溶液を前もって５０ｍ
Ｍりん酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６゜０で平衡化したＱ
−セファロースＦＦ（ファルマシア）イオン交換カラム
（ＩＯＸ１２０１１）に適用した。カラムは１．３ｘＱ
１分の流速で操作した。

カラムからの流れはＩＧＦ結合蛋白を含み、これを集め
た。結合活性の検出はウェスターン・プロットによりす
なわち分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に付し、ニトロ
セルロースンートに移させ、結合蛋白を放射性ラベル化
したＩＣＦと相互作用するその特性により展開させた。

ＩＧＦ結合活性を含むＱ−セファロースカラムからの流
れに、トリフルオロ酢酸ＣＴＦＡ）を加え最終濃度０．
１％を得た。本酸性溶液を水中Ｏ１％ＴＰＡで平衡化し
たＶｙｄａｃＣ４カラム（４６Ｘ２５０＋ｎ）の逆相ク
ロマトグラフィーでさらに精製した。適用後、蛋白を水
中０．１％Ｔ　Ｆ”　Ａからアセトニトリル中０．１％
ＴＦＡの勾配で勾配溶出により溶出した。ＩＧＦ結合蛋
白を含む分画をウェスターン・プロットで検出したとこ
ろでは約３０％アセトニトリルで溶出した。

製法４Ｂ） ＩＧＦ−ＢＰを含む細胞培捉物上清を２０ｍＭトリス−
ナトリウム酢酸、ｐＨ５，５で１・ｌに希釈した。希釈
後、溶液のｐＨを制御し、もし必要ならば塩酸でｐＨ５
，５に調節した。

この溶液を２０１ＩＭトリスーナトリウム酢酸、ｐＩ４
５５で平衡化したＳ−セファａ−ス（ファルマンア）カ
ラムに適用した。カラムを吸収がベースラインにもどる
まで２０ｇＩＭトリスーナトリウム酢酸、ｐＨ５，５で
洗浄した。Ｉ　ＧＦ−ＢＰをｐＨ５，５２０ａ＋Ｍトリ
スーナトリウム酢酸への１００ｍＭの塩化ナトリウム増
加量で段階的添加により溶出した。ＩＣＦ−ＢＰを溶出
分画のウェスターン・プロットにより検出したところｏ
、！および０．３Ｍの間の塩化ナトリウムで溶出する。

ＩＣＦ結合活性の分画をプールし、ＹＭＩＯメンプラン
を装備したアミコン濃縮器でａ縮した。

濃縮物を２０ｍＭ）リス−ナトリウム酢酸、ｐＨ５，５
ｆＩ！衝岐で平衡化したスーパーロース１２（ファルマ
ノア）でゲル濾過した。活性分画はプールされた。

ゲル濾過からのＩＧＰ−ＵＰを含むプール化した分画は
前もってＯ，１％トリフルオロ酢酸で平衡化したＶｙｄ
ａｃＣＪカラムで逆相クロマトグラフィーした。プール
化したスーパーロース１２溶出肢を適用し、カラムはト
リフルオロ酢酸でベースラインになるまで洗浄した。Ｉ
　Ｇｌ’−ＢＰを次に０．１％トリフルオロ酢酸を含む
アセトニトリルで勾配溶出によるカラムから採取した。

この発明の結合蛋白の治療用途には、単独治療剤として
の使用と、ＩＧＦとの組合わせとしての使用が含まれる
が、後者が好ましい。

ＩＧＦと組合わせて使用する場合、この発明の結合蛋白
は、前述した適応、特に成長指導、組織再生または傷の
癒合剤としての使用に適する。

したがって、この発明は、 ０対象の成長、組織もしくは器官再生、または傷の癒合
を目的とする、自由なまたは固定した組合わせとしての
、この発明の結合蛋白とＩＧＦ’の使用、または ｉ）処置を必要とする患者に、治療有効量のこの発明の
結合蛋白を治療有効量のＩＧＦと共に投与することから
なる、対象の成長、組織もしくは器官再生、または対象
の傷の癒合刺激法、またはｉｉｉ　）この発明の結合蛋
白を、ＩＣＦおよび医薬として許容される担体または希
釈剤と共に含有してなる、対象の成長、組織もしくは器
官の再生、または対象の傷の癒合刺激用医薬組成物、ま
たはｉｖ）この発明の結合蛋白およびＩＧＦの別個の単
位用量形態を、混合または併行投与のための指示書と共
に含有してなる、ツインパック を提供する。

ＩＧＦと組合わせると、この発明の結合蛋白は軟骨形成
または造血の仲介に特に利益をもたらす。

これは、下記試験Ａ−Ｃにより示される。

（Ａ）例えば胎児ラット頭蓋冠におけるコラーゲンおよ
び非コラーゲン蛋白への［３Ｈ］プロリン取込み増加に
より示されるように、ＩＧＦは骨形成を増加させる。驚
くべきことに、ｚＧＦをこの発明の結合蛋白の存在下に
用いると相乗効果が得られる。ラット頭蓋冠の器官培養
は、２１日令ラットから前部および頂部骨を切除し、矢
状縫合に沿って分離し、クレーム等［エンドクリノロジ
ー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）（１９８５年）＋１
６ａ２９６頁〕の方法にしたがって培養することにより
調製する。結合蛋白またはＩＣＦを、Ｉ　Ｏ−２００ａ
ａｇ／培地村培地量で加える。これらを組合わせとして
加える場合、モル比はＩ：ｌとする。培養は２４−４８
時間行なう。コラゲナーゼ消化性蛋白および非コラーゲ
ン蛋白への［３Ｈ］プロリンとり込みを定量するため、
骨ホモジネートを細菌コラゲナーゼを用いてジーゼルマ
ンおよびベテルコフスキ−［デベロプメンタル・バイオ
ロジー（Ｄｅｖ、　Ｂ　ｉｏｌ、　）（１９７２年）２
８巻４４３頁］およびクレーム等修正［エンドクリノロ
ノー（ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙＸ　ｌ　９８５年）
１１６巻２９６頁］の方法により硝化する。

（Ｂ）骨からの［４５］Ｃａ放出減少により示されるよ
うに、ＩＧＦは骨の吸収を減少させる。驚くべきことに
、ＩＧＦをこの発明の結合蛋白の存在下に用いると相乗
効果が得られる。試験は、ライズ［ツヤ−ナル・オブ・
クリニカル・インベステイゲーション（Ｊ　、　Ｃｌ１
ｎ、　　Ｉ　ｎｖｅｓｔ、　）（１９６５年）４４巻＋
０３頁］の原理にしたがって実施する。

妊娠ラットに、妊娠１８日日日［４５］Ｃａを皮下注射
する。ＩＧＦを、単独またはこの発明の結合蛋白の存在
下、動物当りｌＯｒ＋ｙ−２００ｎ９の用量で注射する
。結合蛋白はＩＧＦとのモル比がｌ：ｌになるように加
える。第１９日に動物を殺し、胎児を除去する。とう骨
お上び尺骨の鉱化した骨幹を切除し、培地中に入れる。

再吸収は、骨外植片からの［４５］Ｃａ放出に基づいて
定量する。

（Ｃ）また、この発明のＩＧＦ結合蛋白および他のＩＣ
Ｆ結合蛋白は、ＩＧＦ’−１のエリスロボエチン様作用
を増強することが見出された。これは、特に、ファッグ
、ロイチ［セルラー・フィンオロジー（Ｃｅ１１．　Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ、　ＸＩ　９８６年）１２６巻１頁］が報
告したＣＦ’Ｕ−Ｅアッセイにおいて、ＩＧＦ−１例え
ばｔｏｎ９／屑Ｑを単独または第２図の成熟ＩＧＦ結合
蛋白、例えば第２図の成熟ＩＣＦ結合蛋白を発現するＣ
ＨＯセルラインの培養物由来上清５０μＱアリコートと
組合わせて試験することにより示される。ＩＧＦ結合蛋
白単独で得られる結果は対象と有意差がないが、ＩＧＦ
−１単独と比較すると組合わせの相乗効果が認められる
。

さらに、この発明の結果蛋白と組合わせたＩＧＦのマイ
トジェン活性は次の上うに試験することかできる。培養
物中のＣＣＬ３９細胞（チャイニーズハムスターの肺繊
維芽）への［３Ｈ］メチルチミジンとり込みは、プルー
ト等［セルラー・アンド・モレキュラー・バイオロジー
（Ｃｅ１１．　Ｍｏ１Ｂｉｏ１．　ＸＩ　９８４年）３
０巻１０５頁］が報告した方法により測定される。この
アッセイにおいて、セルラインＣＣＬ３９を、１０％う
し胎子血清、０．１％ペニシリン、０．４％ストレプシ
マインンおよび０．５％フンギシン含有ＭＥＭ培地（ギ
ブコ社）０．５＋Ｃ中、ウェル当り４０，０００細胞の
割合でプレートに接種する。５％ＣＯを負荷大気中３７
℃で７２時間インキュベート後、細胞をうし胎子血清不
存在ＭＥＭ培地で洗浄し、ついでこの培地中で２０時間
培養する。この段階で、細胞培養物は全面成長であり、
ＩＣＦまたは結合蛋白または両者をそれぞれＩ　０１１
９−２００ｎｇの用量で培地に接種する。両者添加の場
合、モル比はｌ：ｌとする。試験試料を３７℃で２４時
間インキュベートし、ついで１０μｒｌＰＢＳ中のｌμ
Ｃｉ［３Ｈ］メチルチミジンを加える。４時間インキュ
ベーション後、メチルチミジンとり退みをＰＢＳによる
細胞洗浄で停止する。細胞を０．５ｘＱトリクロル酢酸
（５％）で３０分間固定し、水沈し、最後にＯＩＭ−Ｎ
ａＯＨ０，５ｘＱで３７℃、２時間処理して溶解する。

溶解物０．５ｘＱをシンチレーションフラスコに移し、
β放射能測定用シンチレーション液３村と混合する。結
合蛋白を単独使用して測定した放射能レベルは対照試料
と実質的に異ならないが、結合蛋白はＩＣＩ？のマイト
ジェン活性を増強する。

さらに詳述すると、ＩＣＦと組合わせたこの発明の結合
蛋白は、（ａ）下垂体機能低下症、ラロン型小人症、骨
粗しよう症、貧血時に慢性腎不全後の合併症および肝ま
たは腎障害の処置、並びに（ｂ）潰瘍および熱傷のよう
な傷または事故によるもしくは手術による傷の癒合促進
に有用である。

この発明の結合蛋白と配合して使用するに際しては、Ｉ
ＧＦを、リンダーネクトおよびハンベル、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリ（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｗ、　）（１９７８年）２５３巻２７６９頁
に報告されているＩＣＦ−１，リンダーネクトおよびハ
ンベル、フエブス（ＦＥＢＳＸＩ９７８年）８９巻２８
３頁に報告されているＩＧＦ−■、およびインンユリン
様成長因子活性を有する任意のＩＣＦ−１または■誘導
体またはフラクションから選ぶのが好ましい。最も好ま
しいのはＩＧｒ’−１１である。

ＩＧＩ？と配合して使用するに際し、この発明の結合蛋
白は第２図に示すブレＩＧＦ−ＢＰまたは１にＦ−ＢＰ
に８５−１００％相同性を示す蛋白であることが好まし
い。

［ＧＦ’Ｗ４と配合しない場合、この発明の結合蛋白は
、遊＠ＩＧＦ類の過剰産生に基づくあらゆる生理学的障
害、例えば乳がんまたは腎がんのようなＩＣＦ産生がん
、糖尿病性増殖性網膜症または高遊離ＩＧＦ血清濃度を
もつ長身児異常成長に対する治療用途をもつ。

したかって、この発明はまた、 ｉ）は乳類たとえばひとの体の遊離ｌＧＦの過剰産生に
基づく対象の生理学的障害、例えば［ＧＦ産生がん、糖
尿病性網膜症または長身対象の異常成長の処置のための
この発明の結合蛋白の使用、または ｉｉ）遊離ＩＧＦの過剰産生に基づく対象の生理学的障
害、例えばＩＧＦ産生がん、糖尿病性網膜症または異常
成長の処置法であって、処置を必要とする対象に治療有
効量のこの発明の結合蛋白を段毎することからなる方法
、または １１１）遊離ＩＧＦの過剰産生に基づく障害、例えばＩ
ＧＦ産生がん、糖尿病性網膜症または異常成長の処置用
医薬であって、この発明の結合蛋白を医薬として許容さ
れる担体または希釈剤と配合してなる医薬 を提供するものである。

第２図に示すプレＩＧＰ−ＢＰまたはＩＧＦＢＰの変異
形態は、ひとの体の遊離ＩＣＣ濾過圧産生ら起る生理学
的障害の処置に特別な価値を有する。

単独またはＩＧＦと配合したこの発明の結合蛋白は、ペ
プチドに適する任意の常用経路、特に経腸経路で、例え
ば錠剤もしくはカプセルとして、または好ましくは非経
腸的に、例えば注射もしくは注入により皮下もしくは静
脈内投与することができる。さらに、局所的に、例えば
軟骨またはけんだく剤の形で（例えば傷の癒合剤として
使用する場合）用いることができる。

上記のすべての適応において、適当な用量は勿論例えば
処置すべき障害の性質と重さおよび投与法により異なる
。例えば、骨粗しよう症または貧血の処置の場合、約０
．１μ９／＆９（体重）−４０μ？／＆９（体重）、好
ましくは約Ｏ１５μ９７ｋｇ（体重）−約２０μｙ／ｋ
ｇｃ体重）のこの発明の結合蛋白の日用量で満足すべき
結果が得られ得る。大形は乳類例えばひとの場合、指示
日用量は約５μ９約５００μ９、好ましくは１０−１０
０μ？であり、好便には非経口的に、例えば１日１回投
与する。

傷の癒合の場合、傷領域の平方センチ当りこの発明の蛋
白０．１−１０μ９の日用量が、大形は乳類例えばひと
に適当として指示される。これは、１８１回投与するの
が好都合である。ＩＣＰと組合わせる場合、結合蛋白対
ＩＣＦのモル比は０゜ｌ・ｌ−５：Ｉが好ましく、０，
５：Ｉ−２：ｌがさらに好ましく、ｌ：１が最も好まし
い。

この発明の医薬組成物は常広により製造することができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ラットＢＲＬ−３Ａ結合蛋白Ｎ末端配列とひ
と小結合蛋白の各配列を比較して示す図である。 第２図は、ＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ　ｃＤ　Ｎ　Ａフ
ラグメント配列と対応するひと結合蛋白前駆体アミノ酸
配列を示す図である。 第３図は、前駆体を暗号化するラットＢＲＬ３Ａ完全ｃ
ＤＮＡ配列を示す図である。 第４図は、プローブＢＰＳ−１およびＢＰＳ−２のＤＮ
Ａ配列を示す図である。 第５図は、ｃＤＮＡフラグメント挿入後のプラスミドＩ
）ＸＭＴおよび誘導体を示す図である。 第６図は、実施例３におけるウェスタンプロットの結果
を示す図である。 第７図は、実施例３におけるウェスタンプロットの結果
を示す図である。 図面の浄書（内容に変更なし） ５１２−ユ （ａ）　Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌ＠ｕ−Ｐｈｅ−＾ｒｇ−Ｃ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−（ｂ　）　　
　　　　　？ｈ＊−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ａｒｇ−Ｌ＠ｕ−＾
１ａ−Ａｌａ−ｂｙｓ （ｃ）　　　ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ
−＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−５＠ｒ−＾１ａ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｌ魔普｜Ｃｙｓ ＧｌｙＪｒｏ−ＰｒｏＪｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ｃｙｓ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−＾ｒｇ−
Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−５＠ｒ−Ａｌａ−５
ｅｒ−Ｃｙｓ−５＠ｒ−Ｇｌｕ−Ｖｉｌ−τｈｒ−Ａｒ
ｇ−５＠ｒ−Ｐｒｏ−ＩＪｙ−Ｃｙｓ。 Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ。 ５ｇ Ｕ　Ｃ 乏２ ｊ１− ！２ユ く− く＼ ｊＯ 〜＜ｖＩ ＋〇（ ０（５ｅ　　　Ｃ３＋：）＞ ま３−＋Ｑｓ−１ ３ユ　し じ二　　１２ 乏；　　已こ 律　　乏５ よし５　＝じ； ＩＧ　　６ ｒ １ｒ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）１位で始まり２８９位で終る第２図のアミノ酸配
   列またはその２０アミノ酸を越えるフラグメントに対し
   て少なくとも８５％の相同性をもつアミノ酸配列を含む
   、インシュリン様成長因子結合蛋白。
2. （２）−３９位、−３８位または１位で始まり２８９位
   で終る第２図のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のＩ
   ＧＦ結合蛋白。
3. （３）請求項１または２記載のＩＧＦ結合蛋白を暗号化
   しているヌクレオチド配列を含む、組換え体ＤＮＡ。
4. （４）請求項３記載のｃＤＮＡフラグメント。
5. （５）１２０位、１２３位または２３７位で始まり１１
   ０３位で終る第２図のＤＮＡ配列を含む、請求項４記載
   のｃＤＮＡフラグメント。
6. （６）−３９位、−３８位または１位で始まり２８９位
   で終る第２図のアミノ酸配列を暗号化しているＤＮＡ配
   列にストリジェント交雑条件下でハイブリダイズするＤ
   ＮＡフラグメント。
7. （７）１２０位、１２３位または２３７位で始まり１１
   ０３位で終る第２図のｃＤＮＡ配列にストリジェント交
   雑条件下でハイブリダイズする、請求項６記載のＤＮＡ
   フラグメント。
8. （８）請求項３−７の何れか１項記載のＤＮＡフラグメ
   ントにより暗号化されたＩＧＦ結合蛋白を原核または真
   核宿主中で発現させるに有効な、上記ＤＮＡフラグメン
   トを含むベクター。
9. （９）請求項３−７の何れか１項記載のＤＮＡフラグメ
   ントまたは請求項８記載のベクターにより形質転換され
   た原核または真核セルライン。
10. （１０）請求項９記載のセルラインを培養し、培養物か
    らＩＧＦ結合蛋白を採集することからなる、ＩＧＦ結合
    蛋白の製造法。
11. （１１）請求項１または２記載の結合蛋白をＩＧＦおよ
    び医薬として許容される担体または希釈剤と共に含有し
    てなる、対象の成長、組織もしくは器官の再生、または
    傷の癒合刺激用医薬組成物。
12. （１２）請求項１または２記載の結合蛋白を医薬として
    許容される担体または希釈剤と配合してなる、遊離ＩＧ
    Ｆの退剰産生による生理学的障害処置用医薬組成物。