JPH069516B2 - β−ウロガストロンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、β−ウロガストロンの製造方法、詳しくは遺
伝子工学的手法により構築された形質転換微生物を培養
して、菌体外に排出されるβ−ウロガストロンを採取す
る方法に関する。

従来の技術 大腸菌は、遺伝子、生化学的に最もよく研究されている
ことから、所謂遺伝子工学的手法により、産業上有用な
ポリペプチドを生産する目的で種々用いられてきてい
る。しかしながら、従来上記遺伝子工学的手法で構築さ
れた大腸菌の生産するポリペプチドは、通常菌体内に留
まり、一部の低分子ポリペプチドを除いては、これを菌
体外に排出させることはできなかった。即ち、大腸菌を
始めとする各種グラム陰性菌は、内膜と外膜との二重の
膜構造を有することで特徴付けられ、該大腸菌における
分泌とは、内膜の内側の細胞質にて生産されるポリペプ
チドの前駆体が、内膜を通過し、その最通過のために必
要なシグナルペプチドが前駆体から切り離され、内膜と
外膜とに挾まれた空間であるペリプラズム空間に、シグ
ナルペプチドを含まないポリペプチドが生産、蓄積され
ることを意味している。従来、このペリプラズム空間に
蓄積されたポリペプチドが、外膜を経て菌体外に排出さ
れることは、一部の特殊な例外を除いて、一般には知ら
れておらず、ポリペプチドはペリプラズム空間に留まっ
たままであるか又はここで代謝されるかのいずれであっ
た。

従って、従来大腸菌の培養によるポリペプチドの製造に
おいては、菌体乃至菌の外膜を物理的もしくは化学的に
破壊して目的とするポリペプチドを採取してきた。しか
しながら、菌体等を物理的に破壊する場合、菌体中のす
べての可溶性成分が同時に抽出されることは回避でき
ず、そのため以後の精製操作が煩雑となる欠点があつ
た。また外膜のみに物理化学的な力を加えて、ペリプラ
ズム空間に蓄積された成分を取り出す方法としては、例
えば浸透圧シヨツク法〔Ｈ．Ｃ．Ｎeu andＡ．Ｈeppe
l，Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２４０，３６８５−３６９２（１９
６５）〕が知られているが、この方法でも目的物の抽出
操作が煩雑となることは回避できない。

一方、本発明者らは、先にシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡ塩基配列とβ−ウロガストロンをコードするＤ
ＮＡ塩基配列とが直接連結された融合ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ塩基配列を含むベクター及び該ベクター
で形質転換された大腸菌の構築に成功し、この知見に基
づく発明を完成し特許出願した（特願昭５９−２７１２
０６号）が、この形質転換された大腸菌からの目的ポリ
ペプチドの採取は、従来のこの種方法と同様に、ペリプ
ラズム空間に分泌されるものを採取するものであった。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、従来法の如く菌体内乃至ペリプラズム
空間に蓄積される目的ポリペプチドを採取する方法に代
って、目的ポリペプチドを菌体外に排出させて採取する
新しい方法を提供することにある。

本発明者らは、先に構築したβ−ウロガストロンの分泌
発現型ベクター、該ベクターで形質転換させた微生物、
該微生物の培養条件等につき、鋭意研究を重ねる過程に
おいて、実に驚くべきことに、上記β−ウロガストロン
分泌発現型ベクターで形質転換させた大腸菌の培養によ
れば、β−ウロガストロンの分泌量、即ちペリプラズム
空間に蓄積されるβ−ウロガストロン量は経時的に減少
していく反面、これに代って菌のグロースとほぼ平行し
て菌体外に目的とするβ−ウロガストロンが排出される
という事実を発見した。

本発明は、この新しい知見に基づいて完成されたもので
ある。

問題点を解決するための手段 即ち、本発明は、大腸菌由来のβ−ラクタマーゼシグナ
ルペプチド（以下単に「シグナルペプチド」という）を
コードするＤＮＡ塩基配列とβ−ウロガストロンをコー
ドするＤＮＡ塩基配列とが直接連結された融合ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ塩基廃を含むベクターで形質転
換された大腸菌を培養し、菌体外に排出されるβ−ウロ
ガストロンを採取することを特徴とするβ−ウロガスト
ロンの製造方法に係わる。

本発明方法によれば、目的とするβ−ウロガストロン
は、菌体外に排出されるため、その採取が非常に容易で
あり、しかも目的物は菌体由来の可溶性成分等の不純物
を実質的に含まず、容易に単離精製できる利点がある。

以下、本発明方法をより詳しく説明する。

本発明方法においてベクターとしては、シグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ塩基配列とβウロガストロンをコ
ードするＤＮＡ塩基配列とが直接連続された融合ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含むベクターを用
いる。該ベクターの具体例としてはプラスミドｐＵＧ２
０１を例示できる。該プラスミドｐＵＧ２０１は、ｐＢ
Ｒ３２２を起源ベクターとして構築されβ−ラクタマー
ゼのプロモーター及びリボゾーム結合部位を続いてβ−
ラクタマーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩
基配列を有するプラスミドｐＧＨ５５と、β−ウロガス
トロンをコードするＤＮＡ塩基配列をｐＢＲ３２２のＥ
ccＲＩ及びＢ_ａｍＨＩ制限サイト間に挿入して構築され
たプラスミドｐＵＧ３とから構築されるものである。該
プラスミドｐＵＧ２０１の構築の詳細は、後記実施例に
示す通りである。

上記プラスミドｐＵＧ２０１は、これを大腸菌ＨＢ１０
１株に導入して、このプラスミドｐＵＧ２０１保有株を
「ＨＢ１０１〔ｐＵＧ２０１〕」なる表示で、通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
その寄託番号は微工研条寄第６８１号（ＦＥＲＭＢＰ−
６８１）である。

また本発明においては、上記ベクターとして、プラスミ
ドｐＵＧ２０１の代りに、プラスミドｐＵＧＭ１０６を
用いることもできる。該プラスミドｐＵＧＭ１０６は、
上記プラスミドｐＵＧ２０１とプラスミドｐＧＨ４９と
から構築されたものであり、同様にβ−ラクタマーゼの
プロモーター及びリボゾーム結合部位に続いてβ−ラク
タマーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ塩基配
列とβ−ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配列と
を直接連結された形態で保有するものである。その構築
の詳細は、後記実施例に示す。

本発明では、上記したベクターで大腸菌、例えばＫ１２
株由来のＨＢ１０１株又はＪＭ１０３株を形質転換さ
せ、この形質転換した大腸菌を培養する。

上記ベクターの大腸菌への導入による形質転換は、通常
の方法に従い実施することができる。具体的には、例え
ば宿主細胞としての大腸菌を低温で塩化カルシウムを含
む水溶液中で処理し、該溶液中にベクターを添加する方
法〔Ｅ．Ｌederbeg，Ｓ．Ｃohen，Ｊ．Ｂacterol.，１
１９，１０７２（１９７４）〕等を例示できる。

また上記のごとくして得られる形質転換株の培養は、通
常の方法に従い、例えばＬブロス、Ｅ培地、Ｍ９培地等
の通常利用される培地又は之等に更に各種の炭素源、窒
素源、ビタミン、無機塩等を添加した培地を用いて実施
できる。培養法としても特に制限はなく、例えば通常の
振盪培養、通気攪拌法等の液体培養法の他、固体培養法
によることもできる。

上記培養によれば、菌の増殖に伴って或いはその後に、
形質転換株のペリプラズム空間に蓄積された目的ポリペ
プチドが、次第に菌体外に放出される。本発明方法はこ
の菌体外に放出される目的物を採取するものである。こ
の目的物の採取は、一般的な方法に伴い、菌体と培養上
澄とを分離し、上澄を集めることにより行ない得、かく
して得られる培養上澄は、更に例えばゲル過、吸着ク
ロマトグラフイー、高速液体クロマトグラフイー、イオ
ン交換クロマトグラフイー等及び之等の組合せにより精
製することができる。

実 施 例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げ
る。尚、各例においてアミノ酸、核酸塩基、その他の略
号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定又は当該分
野における慣用記号に従うものとする。また、各例にお
いて用いられる各方法及び操作は、特に明記しない限
り、以下の通り行なわれたものとする。

１．制限酵素によるＤＮＡの切断操作 ＤＮＡの水溶液（又は緩衝液溶液）或いは粉末に、下記
第１表に示した各緩衝液の濃縮液及び水を混和し、次い
で制限酵素を加え、３７℃の水浴中で３時間静置して反
応させる。制限酵素の標準的使用量は、ＤＮＡ１μｇに
対して１ユニットであり、最終液量は１０μ以上とな
るようにする。

２．フエノール抽出法 酵素反応の終了後、酵素を失活させ反応を停止させるた
めにこの抽出法を行なつた。即ち、反応液に、その液量
の半量となるＴＥ飽和フエノール（１ｍＭ ＥＤＴＡを
含む１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）緩衝液をフエノ
ールに飽和させたもの）を加えて充分混和した後、同じ
く半量のクロロホルムを加えて更に混和し、次いで遠心
分離してＤＮＡの含まれる感情液層を取る。更に０．１
倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）と２倍
量の冷エタノールとを加えて混和して、−２０℃で１時
間以上放置してＤＮＡを沈澱として回収することにより
フエノールを完全に除去する。

３．ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）によるＤＮ
Ａのブラントエンド化方法 ４０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、６ｍＭ塩化マ
グネシウム、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍ
Ｍ ＡＴＰ及び各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰを含む水溶液中に、ＤＮＡを溶かし、Ｄ
ＮＡ１μｇに対して１ユニットとなる量のＤＮＡポリメ
ラーゼＩ（クレノー断片、宝酒造（株）製）を加え、１
２℃で３０分間反応させる。

４．Ｔ_４ＤＮＡリカーゼによるＤＮＡ断片の結合（環状
化）操作 ６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、６．６ｍM塩化マ
グネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール及び１ｍＭ
ＡＴＰに０．０１％の牛血清アルブミンを添加した水溶
液中で、ＤＮＡ断片と、その１μｇ当り３ユニットとな
る量のＴ_４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）とを、１
２℃で５時間以上反応させることによりＤＮＡを結合
（環状化）させる。

５．形質転換方法 宿主細胞としては、大腸菌Ｋ１２株由来のＨＢ１０１株
を用いる。

ＨＢ１０１株を、ＬＢ培置（１％バクトトリプトン、
０．５％バクトイーストエキス、０．５％塩化ナトリウ
ム）で、３７℃下、６１０nmの吸光度０．２５になるま
で増殖させる。この培養液４０mlを遠心分離（６０００
回転／分×１０分）して菌体を回収し、次いで氷冷す
る。これを０．１Ｍ塩化マグネシウム２０mlで洗浄し、
続いて氷冷した０．１Ｍ塩化カルシウム及び０．０５Ｍ
塩化マグネシウム溶液２０mlに懸濁させ、１時間氷冷す
る。遠心分離（６０００回転／分×１０分）後、菌体を
氷冷した０．１Ｍ塩化カルシウム及び０．０５Ｍ塩化マ
グネシウム溶液２mlに再懸濁させる。この懸濁液０．２
mlに、Ｔ_４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させたＤＮＡ断
片の反応組成液０．０１mlを加え、１時間氷冷する。次
いで４２．５℃の水浴で９０秒間加温し、ＬＢ培置２．
８mlを加え、これを３７℃の水浴中で１時間静置する。

次に、得られる形質転換株を以下の抗生物質耐性で選択
する。即ち、１．５％寒天を含むＬＢ培置にアンピシリ
ン５０μｇ／ml又はテトラサイクリン２０μｇ／mlを添
加して調整した平板培地に、上記で得た反応組成液の溶
液各０．３mlずつを拡げ、これを３７℃で一晩培養し、
生育する大腸菌コロニーを分離する。

６．プラスミドの単離 プラスミドを保有する菌株を、アンピシリン５０μｇ／
ml又はテトラサイクリン２０μｇ／mlを添加したＬＢ培
置５００mlで、６１０nmでの吸光度が約０．６になるま
で３７℃で振盪培養する。次いでクロラムフエニコール
８０mgを加え、３７℃で１２〜１６時間振盪培養する。
これを遠心分離（６０００回転／分×１０分）して菌体
を集め、０．８５％塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。
菌体を２０％蕉糖を含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．
０）緩衝液２．５mlに懸濁させ、次に１％リゾチームを
含む０．２５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）緩衝液０．５
mlを加え、１０分間氷冷する。更に０．２５Ｍ ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８．０）１mlを加え、１０分間氷冷する。次に
６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＥＤＴＡ
及び０．１％トリトンＸ−１００の溶液４mlを加える。
これを超遠心（２５０００回転／分×９０分）して上清
を採取する。この上清８．２mlに塩化セシウム９．０ｇ
を加えて溶かし、次いで１％エチジウムフロマイド溶液
０．８mlを加える。これを遠心分離（２０００回転／分
×１０分）して浮遊物を除き、溶液を超遠心（５０００
０回転／分×１５時間）する。次いで紫外線照射により
螢光を発するプラスミド部分を分離する。これを５Ｍ塩
化ナトリウム溶液で飽和したイソプロパノールで５〜６
回抽出してこれからエチジウムブロマイドを除去する。
最後に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ８．０）緩衝液に対して透析して塩化セシウムを除去
する。

７．オリゴヌクレオチドの合成 下記に示す固相合成法（固相リン酸トリエステル法）に
より行なつた〔Ｈ．Ｉto et al，Ｎecleic Ａcids
Ｒesearch，１０，１７５５−１７６９（１９８
２）〕。

即ち、まず１％架橋ポリスチレン樹脂Ｓ−Ｘ１（２００
〜４００メツシユ、バイオラドラボラトリーズ社製）を
アミノメチル化したものと、５′−Ｏ−ジメトキシトリ
チルヌクレオシドのモノコハク酸エステルとを反応させ
て、ヌクレオシド担持樹脂を得る。次に、バーチエム社
製ＤＮＡ合成機を用いて以下の操作を行なう。

上記樹脂４０mgを反応管に入れ、１Ｍ臭化亜鉛のジクロ
ロメタン−イソプロパノール（８５：１５）溶液の用い
て５′位のジメトキシトリチル基を脱離させる。次に完
全に保護されたジヌクレオチド〔Ｃ．Ｂroka et al，
Ｎucleic Ａcids Ｒesearc，８，５４６１−５４７１
（１９８０）の方法により調製した〕のトリエチルアン
モニウム塩５０mgを加え、縮合剤（メシチレンスルホン
ニル−５−ニトロトリアゾール）を用いて縮合させる。
以上の操作を繰返して、順次鎖長をのばして、保護され
たオリゴヌクレオチドを担持した樹脂を得る。尚、最後
の縮合工程では、必要に応じてジヌクレオチドの代り
に、前記文献の記載の方法により調製されるモノヌクレ
オチドのトリエチルアンモニウム塩２５mgを使用する。

次に０．５Ｍピリジンカルドキシメートのピリジン−水
（１：１）溶液を用いて、保護されたオリゴヌクレオチ
ドを樹脂から脱離させる。これをセファデツクスＧ−５
０カラム（フアルマシア社製、２×１００cm）で、更に
高速液体クロマトグラフイー（ポンプ；ウオーターズ社
製６０００Ａ型、検出器；４４０型デイテクター、カラ
ム；マイクロボンダーパツクＣ１８、溶出溶媒；（５→
４０％）アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアン
モニウム水溶液）で精製する。次に８０％酢酸により脱
保護反応を行ない、再度高速液体クロマトグラフイーに
より単一ピークになるまで精製する。この高速液体クロ
マトグラフイーの条件は、溶出溶媒として（５→２５
％）アセトニトリル−０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニ
ウム水溶液を用いる以外は、上記と同一とする。

８．ＤＮＡ塩基配列の分析 ＤＮＡ塩基配列の分析は、メシング（Ｍessing）の方法
〔Ｍ１３法、Ｍethods Ｅnzymol．，１０１，２０（１
９８３）〕に従い、以上のように行なつた。即ち、まず
ＤＮＡ断片を制限酵素により切り出し、１％アガロース
ゲル電気泳動により分離する。このＤＮＡ断片をＭ１３
mp８ＲＦ（アマーシヤム社製）をベクターとしてクロー
ニングする。得られる組換えフアージＤＮＡをマンデル
（Ｍandel）とヒガ（Ｈiga）の方法〔Ｊ．Ｍol．Ｂio
l．，５３，１５４（１９７０）〕により、大腸菌ＪＭ
１０７株へ形質導入する。この菌体懸濁液０．２mlに、
２５mg／mlのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド
２５μ及び２０mg／mlの５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド４０μえ加て
た。次いでこの菌体懸濁液を加熱溶解させた後、５０℃
で保温したＨ−トツプアガー液（１％バクトトリプト
ン、０．８％塩化ナトリウム及び０．５％寒天）３mlを
加え、１．５％寒天を加えて固化させた２×ＴＹ培置
（１．６％バクトトリプトン、１％酵母エキス及び０．
５％塩化ナトリウム）の平板に重層し、３７℃で一晩培
養する。ＤＮＡ断片の挿入された組換えフアージは無色
のプラークを生じるのに対し、親株のＭ１３mp８は青色
のプラークを生じるので、目的の組換えフアージは容易
に選別できる。

次に単一の無色カプラークをパスツールピペツトにて取
り出し、これとＪＭ１０３株の培養液０．０１mlと２×
ＴＹ培置１mlに加え、約５時間、３７℃で振盪培養して
組換えフアージを増殖させる。培養後、遠心にて菌体を
除き、上清に２０％ポリエチレングリコール６０００の
０．２mlを混合し、室温で１５分以上静置した後、遠心
にて沈澱するフアージを集め、フエノール抽出によつ
て、フアージから一体鎖ＤＮＡを抽出し、これを鋳型一
本鎖ＤＮＡとして用いる。

鋳型一本鎖ＤＮＡとプライマー（宝酒造（株）製、Ｍ１
３の１５塩基プライマー〔５′ＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ
ＴＧＴＡ３′〕）との各々０．５p molずつを混合し、
６０℃で２０分間熱処理後、徐冷する。次にこの混合液
にα^３２Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシヤム社製、４００Ｃｉ／
m mol）２μとＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー、宝
酒造（株）製）２ユニツトとを加え、充分に混合した
後、その３．２μずつを、下記第２表に示した４種の
ｄＮＴＰ−ddＮＴＰ混合液のそれぞれ２μを含む反応
管に加える。室温で２０分間反応させた後、チエース反
応液（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの各
１ｍＭ）の１μをそれぞれに加え、更に２０分間反応
させる。ホルムアミド停止液（９５％ｖ／ｖホルムアミ
ド、０．１％キシレンシアノール及び０．１％ブロムフ
エノールブルー）を６μずつ加え、９５℃で３分間加
熱した後、急冷する。次にサンプル２μずつ６％又は
ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動（１８００Ｖ、
３０ｍＡ、２〜３時間）を行なう。泳動後、ゲルを紙
（ワツトマン３ＭＭ）に移し、ゲル乾燥器にて乾燥し、
オートラジオグラムをとり、ＤＮＡ塩基配列を解読す
る。

但し第２表中、ddＡはジデオキシアデノシンを、ddＣは
ジデオキシシチヂンを、ddＧはジデオキシグアノシン
を、またddＴはジデオキシチミジンをそれぞれ示す。

９．アガロースゲル電気泳動 シユライフ（Ｓchleif）とウエンシンク（Ｗensink）の
手引書〔“Ｐractical Ｍethods in Ｍolecular Ｂ
iology”（１９８１），Ｓpringer−Verlag社、pp１１
４−１２５〕に記載の方法に従って、アガロースゲル電
気泳動及び泳動後のゲルからのＤＮＡ断片の分離を行な
う。泳動用電源としては、アトー社製コンスターパワー
ＳＪ１０６５型、泳動槽としては１２×１５cmのプラス
チツク製水槽（白金電極付）を、アガロースとしてはア
ガロースＩ（同仁化学研究所製）を、また泳動用緩衝液
としては４０ｍＭトリス塩酸（５ｍＭ酢酸ナトリウム及
び１ｍＭ ＥＤＴＡ含有、ｐＨ７．９）をそれぞれ用い
る。

１０．ポリアクリルアミドゲル電気泳動 上記手引書の第７８−８７頁及び第１１４−１２５頁に
記載の方法に従い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及
び泳動後のゲルからのＤＮＡ断片の分離を行なう。泳動
用電源としては、アトー社製コンスターパワーＳＪ１０
６５型を、泳動槽としてはアトー社製ＳＪ１０６０ＳＤ
型を用いる。アクリルアミド溶液として、アクリルアミ
ドとＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド（２９：
１）との水溶液を、重合促進剤としてＮ，Ｎ，Ｎ′，
Ｎ′−テトラメチレンエチレンジアミンを、重合触媒と
して過硫酸アンモニウムをそれぞれ用いる。また泳動用
緩衝液として２．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する９０ｍＭ
トリスホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）を用いる。

実施例１ Ｉ）β−ウロガストロン発現用ベクターｐＧＨ５４及び
ｐＧＨ５５の構築 （Ａ） 中間体プラスミドｐＧＨ５３の構築 大腸菌のβ−ラクタマーゼのシグナルベプチドの一
部をコードするＤＡＮ塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドの合成のために、以下の塩基配列を有する４種のオ
リゴヌクレオチドのそれぞれを、前記した固相リン酸ト
リエステル法により合成した。

＜１＞ （５′）ＣＧＣＣＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＣＴＴ
ＣＣＴＧＴＣ（３′） ＜２＞ ＴＴＣＧＣＧＡＡＣＴＣＡＧＣＴＧＣ
Ａ ＜３＞ ＧＣＴＧＡＧＴＴＣＧＣＧＡＡＧＡＣ
ＡＧ ＜４＞ ＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣ
ＧＡＴ 上記オリコヌクレオチド＜２＞及び＜４＞の５′端をそ
れぞれＴ_４ポリヌクレオチジルキナーゼ（ＢＲＬ社製）
を用いてリン酸化した。即ち、各々１０μｇのオリゴヌ
クレオチドを５０ｍＭトリス塩酸水溶液（１０ｍＭ塩化
マグネシウム、５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ Ａ
ＴＰを含む、ｐＨ９．５）５０μに溶かし、これにＴ
_４ポリヌクレオチジルキナーゼ５ユニツトを加え、３７
℃で３０分間反応させ、フエノール抽出により反応を停
止させた。

クローニングベクターとして、プラスミドｐＢＲ３
２２〔Ｂolivar et al．Gene，２，９５−１１３（１
９７７）〕を利用した。

該プラスミドｐＢＲ３２２の１０μｇを、制限酵素Ｐｓ
ｔＩ（宝酒造（株）製）とＰvuＩ（ＮＥＢ社製）とを用
いて高塩濃度緩衝液中で切断し、１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、約４．２４kbのＤＮＡ断片を分離
した。

上記で得たＤＮＡ断片を、上記で調製されたリ
ン酸化したオリゴヌクレオチド＜２＞及び＜４＞並びに
リン酸化していないオリゴヌクレオチド＜１＞及び＜３
＞のそれぞれ約１μｇずつと合せて、Ｔ_４ＤＮＡリガー
ゼで結合反応させた。反応終了後、この反応組成液で大
腸菌Ｋ−１２株由来のＨＢ１０１株を形質変換させた。
得られたテトラサイクリン耐性を示す形質転換株の中か
ら１株を選び、これからプラスミドを単離し、目的のｐ
ＧＨ５３を得た。

一連の操作の概略は第１図に示す通りである。

得られたｐＧＨ５３は、１．０％アガロースゲル電気泳
動の結果、約４．３kbの大きさを有しており、そのＤＮ
Ａ塩基配列をＭ１３法により分析した結果、ｐＢＲ３２
２のＰ_ｓｔＩ及びＰ_ｖｕＩの両制限サイト間が欠失し、
代りに次に示すように、オリゴヌクレオチド＜１＞、＜
２＞、＜３＞及び＜４＞が挿入されていることが確認さ
れた。

該ｐＧＨ５３を保有するＨＢ１０１株は通商産業省技術
院微生物工業技術研究所に「ＨＢ１０１（ｐＧＨ５
３〕」なる表示で微工研寄第６７８号（ＦＥＲＭＢＰ−
６７８）として寄託されている。

（Ｂ） β−ウロガストロン発現用ベクターｐＧＨ５４
の構築 上記（Ａ）で得たｐＧＨ５３の１０μｇを制限酵素
ＮaeＩ（ＮＥＢ社製）及びＡvaＩ（宝酒造（株）製）を
用いて中塩濃度緩衝液中で切断し、次いで１．０％アガ
ロースゲル電気泳動を行なつて、約２．２２kbのＤＮＡ
断片《Ａ》を分離した。

この断片は、合成オリゴヌクレオチド由来のＤＮＡ配列
の大部分とプラスミドの複製開始領域を含んでいる。

ｐＢＲ３２２を制限酵素ＡvaＩ及びＨindIII（いず
れも宝酒造（株）製）で、中塩濃度緩衝液を用いて切断
し、１．０％アガロースゲル電気泳動を行なつて、約
１．４０kbのＤＮＡ断片《Ｂ》を得た。

この断片には、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモー
ターの一部とテトラサイクリン耐性の構造遺伝子の全て
が含まれている。

ｐＢＲ３２２の２０μｇを制限酵素Ｆnu４ＨＩ（Ｎ
ＥＢ社製）で低塩濃度緩衝液を用いて切断し、次いでＳ
１ヌクレアーゼによりＤＮＡ断片末端の突出塩基を分解
除去した。これはフエノール抽出後のＤＮＡを６ｍＭ酢
酸ナトリウム、４０ｍＭ塩化ナトリウム１ｍＭ硫酸亜鉛
緩衝液（ｐＨ４．５）１mlに溶かし、これに２０００ユ
ニツトのＳ１ヌクレアーゼ（ＢＲＬ社製）を加えて２０
℃で３０分間反応させることにより行なつた。次いで、
フエノール抽出後の、ＤＮＡを制限酵素Ｈind IIIで中
塩濃度緩衝液を用いて切断し、６％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行ない、約０．２８kbのＤＮＡ断片
《Ｃ》を得た。

この断片には、β−ラクタマーゼのプロモータ、リボゾ
ーム結合部位、シグナルペプチドをコードする遺伝子の
一部の他、テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター
の一部が含まれている。

上記で得た３つの断片《Ａ》、《Ｂ》及び《Ｃ》
を、Ｔ_４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応後、
この反応組成液でＨＢ１０１株を形質転換した。得られ
たテトラサイクリン耐性を示す形質転換株の中から１株
を選びプラスミドを単離した。かくしてｐＧＨ５４を得
た。

ｐＧＨ５４は、Ｍ１３法による塩基配列分析の結果、β
−ラクタマーゼのプロモーター及びリボゾーム結合部位
に続いてシグナルペプチドをコードするＤＮ塩基配列を
有し、この塩基配列の３′末端の上流側にＮruＩ及び下
流側にＰvu IIのそれぞれの制限酵素認識配列を有して
いることが確認された。

一連の操作の概略図を第２図に示す。

ｐＧＨ５４は、前記した通り約３．９kbの大きさ及び第
２図に示す制限酵素開裂地図により特徴付けられ、また
Ｍ１３法による塩基配列分析の結果、下式（１）に示す
塩基配列によりコードされるβ−ラクタマーゼシグナル
ペプチドの遺伝子を有することが確認された。

ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧ
ＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＴＴ
ＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＧＣＧＡＡＣＴＣＡ
ＧＣＴＧ （１） 上記プラスミドｐＧＨ５４を保有する大腸菌ＨＢ１０１
株は、「ＨＢ１０１〔ｐＧＨ５４〕」なる表示で微工研
条寄第６７９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７９）として寄託
されている。

（Ｃ） β−ウロガストロン発現用ベクターｐＧＨ５５
の構築 ｐＢＲ３２２のＡvaＩ及びＰvu II制限サイト間の
塩基配列を欠失させたプラスミドであるｐＢＲＨ０２を
次の操作により作成した。即ちｐＢＲ３２２の５μｇ
を、中塩濃度緩衝液中で、制限酵素ＡvaＩ及びＰvu II
（いずれも宝酒造（株）製）で切断し、フエノール抽出
後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片、宝酒造
（株）製）で切断断片をブラントエンド化した。次に
１．０％アガロースゲル電気泳動で約３．７２kbのＤＮ
Ａ断片を分離し、この断片をＴ_４ＤＮＡリガーゼで環状
化させた。反応終了後、この反応組成液でＨＢ１０１株
を形質転換し、得られるアンピシリン耐性及びテトラサ
イクリン耐性を示す形質転換株の中から一株を選択して
フラスミドを単離しｐＢＲＨ０２を得た。得られたｐＢ
ＲＨ０２はｐＢＲ３２２とは異なつて、ＡvaＩでもＰva
IIでも切断されなかつた。

上記で得たｐＢＲＨ０２の５μｇを制限酵素Ｐpt
Ｉ及びＢamＨＩ（いずれも宝酒造（株）製）を用いて中
塩濃度緩衝液中で切断し、次いで１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行なつて、約２．６０kbのＤＮＡ断片
《Ｄ》を分離した。

この断片は、テトラサイクリン耐性遺伝子の一部及びプ
ラスミドの複製開始領域を含んでいる。

ｐＧＨ５４の１０μｇを制限酵素ＰstＩ及びＢ_ａｍ
ＨＩで中塩濃度緩衝液を用いて切断し、次いで１．０％
アガロースゲル電気泳動を行ない、約０．６６kbのＤＮ
Ａ断片《Ｅ》を得た。

この断片には、β−ラクタマーゼのプロモーター、リボ
ゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列及びテトラサイクリン耐性遺伝子の一部が含まれて
いる。

上記で得た２つの断片《Ｄ》及び《Ｅ》を、Ｔ_４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応後、この反応組
成液でＨＢ１０１株を形質転換した。得られたテトラサ
イクリン耐性を示す形質転換株の中から１株を選びプラ
スミドを単離した。かくしてｐＧＨ５５を得た。

一連の操作の概略図を第３図に示す。

ｐＧＨ５５は、上記第３図に示される制限酵素開裂地図
により特徴付けられ、１．０％アガロースゲル電気泳動
の結果、約３．３kbの大きさを有していた。また該ｐＧ
Ｈ５５は、Ｍ１３法による塩基配列分析の結果、ｐＧＨ
５４における第２のＰvu II制限サイトを含む約０．６
４kbのＤＮＡを欠く以外は、該ｐＧＨ５４と同様であ
り、その第１のＰvu II制限サイトは、シグナルペプチ
ドをコードするＮＤＡ塩基配列の３′末端の近傍に存在
していることが確認された。

上記プラスミドｐＧＨ５５を保有する大腸菌ＨＢ１０１
株は、「ＨＢ１０１〔ｐＧＨ５５〕」なる表示で微工研
条寄第６８０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８０）として寄託
されている。

II）シグナルペプチド−β−ウロガストロン融合ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ塩基配列を有するベクターの
構築 （Ａ） β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配
列の合成 この塩基配列は、グレゴリー（Ｈ．Ｇregory）により報
告されたアミノ酸配列〔Ｎature，２５７，３２５−３
２７（１９７５）〕を参考にして、まずβ−ウロガスト
ロンをコードするＤＮＡ塩基配列の前後に開始コドン、
終止コドン及び制限酵素認識部位を付加してなる下記第
３表に示すＤＮＡ塩基配列を構築することより行なつ
た。このＤＡＮ塩基配列は、本発明者らにより既に特願
昭５９−１３７６９１号として特許出願されている。

（Ｂ） β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配
列を保有するプラスミドの構築 ｐＢＲ３２２の１０μｇを、まず高塩濃度緩衝液中
でＥcoＲＩ（宝酒造（株）製）とＢamＨＩとで切断し、
次いで１．０％アガロースゲル電気泳動を行ない、約
３．９９kbのＤＮＡ断片を単離した。

上記で得たＤＮＡ断片と、上記（Ａ）で得たβ−
ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩基配列とを、Ｔ_４
ＤＮＡリガーゼで結合させた。反応後、反応組成物でＨ
Ｂ１０１株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性を
示す形式転換株の中から一株を選びプラスミドを単離し
た。かくしてβ−ウロガストロンをコードするＤＮＡ塩
基配列をｐＢＲ３２２のＥcoＲＩ及びＢ_ａｍＨＩ制限サ
イト間に挿入されたプラスミドｐＵＧ３を得た。

このプラスミドｐＵＧ３を保有するＨＢ１０１株は、
「ＨＢ１０１〔ｐＵＧ３〕」なる表示で微高研菌条第５
４３号（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４３）として寄託されてい
る。

（Ｃ） ｐＵＧ２０１の構築 上記（Ｂ）で得たｐＵＧ３を制限酵素ＨinfＩで切断し
て得られるＤＮＡ断片を、ｐＧＨ５５のＰvu II制限サ
イト挿入して、シグナルペプチド−β−ウロガストロン
融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含むベ
クターであるｐＵＧ２０１を、以下の方法により構築し
た。

ｐＵＧ３の１５μｇを、高塩濃度緩衝液中でＨinf
Ｉ（宝酒造（株）製）で切断し、フエノール抽出後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）で切断断片をブラ
ントエンド化した。次いで６％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行ない、約０．４３kbのＤＮＡ断片《Ｆ》を
単離した。

この断片には、β−ウロガストロンをコードするＤＮＡ
塩基配列（翻訳停止コドンを含む）のうち５′端の７塩
基を除く塩基配列が含まれていた。

ｐＧＨ５５は、β−ラクタマーゼのシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ塩基配列の後に、β−ウロガスト
ロンのＮ端領域をコードする最初の７個のＤＮＡ塩基配
列が直結し、且つその直結で制限酵素Ｐvu IIにより切
断されるように構成されたＤＮＡ塩基配列を有するもの
であり、該ｐＧＨ５５の５μｇを中塩濃度緩衝液中で、
Ｐvu IIで切断して、約３．２kbのＤＮＡ断片《Ｇ》を
得た。

この断片は、ｐＧＨ５５の全ての遺伝情報を有してい
る。

上記で得た断片《Ｆ》の約１μｇと上記で得た
断片《Ｇ》の約０．５μｇとをＴ_４ＤＮＡリガーゼで結
合させた。反応後、この反応組成液でＨＢ１０１株を形
質転換し、得られるテトラサイクリン耐性の形質転換株
の中から一株を選び、プラスミドｐＵＧ２０１を単離し
た。

ｐＵＧ２０１は、１．０％アガロースゲル電気泳動の結
果、約３．８kbの大きさを有していた。これをＢamＨＩ
又はＨind IIIで切断すると、それぞれ２種類のＤＮＡ
断片が得られることから、該ｐＵＧ２０１にβ−ウロガ
ストロン遺伝子が含まれていることが判り、また該断片
の大きさを調べた結果より、目的のプラスミドであるこ
とが判った。更に、ｐＵＧ２０１について、β−ラクタ
マーゼのプロモーター部分からβ−ウロガストロン遺伝
子までを含むＤＮＡ断片の塩基配列を、Ｍ１３法による
塩基配列分析により調べた。その結果、該ＤＮＡ塩基配
列は下記第４表の通りであり、ｐＵＧ２０１がプロモー
ター、リボゾーム結合部並びにβ−ラクタマーゼのシグ
ナルペプチドをコードする塩基配列及びβ−ウロガスト
ロンをコードする塩基配列（融合ポリペプチドをコード
する塩基配列）が、正確にこの順序で配列されているこ
とが認識された。また第４表にはＤＮＡ塩基配列に対応
するアミノ酸配列も併記する。

上記ｐＵＧ２０１は、これを大腸菌ＨＢ１０１に保有さ
せ、この保有株を「ＨＢ１０１〔ｐＧＨ２０１〕」なる
表示で通商産業省工業技術院微生物工業研究所に寄託さ
れている。その寄託番号は、微工研条第６８１号（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６８１）である。

III）ｐＵＧ２０１を保有する大腸菌によるβ−ウロガ
ストロンの製造 （Ａ）ｐＵＧ２０１を保有する大腸菌ＨＢ１０１株の培
養 下記組成の修正Ｅ培地を用いた。

＜修正Ｅ培地（１当りの組成）＞ 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．２ｇ クエン酸・１水和物 ２．０ｇ 無水リン酸２カリウム １０．０ｇ リン酸水素アンモニウム・ナトリ ウム・４水塩 ３．５ｇ ブドウ糖 ２．０ｇ カザミノ酸 １．０ｇ Ｌ−プロリン ０．２３ｇ Ｌ−ロイシン ３９．５mg 塩酸チアミン １６．８５mg テトラサイクリン・塩酸塩 ２０．０mg ｐＵＧ２０１により形質転換された大腸菌ＨＢ１０１株
の前培養液１mlを修正Ｅ培地２００ml中で、３７℃で２
４時間振盪培養し、経時的に一定量（１０ml）を採取し
て、菌体と培養上澄とを分離し、その各々に含まれるβ
−ウロガストロン量を、β−ウロガストロン特異ラジオ
イムノアツセイ（ＲＩＡ）により測定した。

上記菌体と培養上澄との分離は、遠心分離（６０００回
転／分×１０分、４℃）により行なつた。得られた培養
上澄を菌体外画分とする。

また菌体を、浸透圧シヨツク法〔Ｈ．Ｃ．ＮeuとＬ．
Ａ．Ｈeppel，Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２４０，３６８５−３６
９２（１９６５）〕に従い、ペリヴラズム画分を抽出し
た。この操作はまず湿重量１ｇの菌体を２０％蕉糖を含
む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）８０mlに懸
濁させ、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ８．０）の
０．３２mlを加え、ロータリーシエーカーで２４℃にて
１８０回転／分で１０分間攪拌した後、遠心分離（９０
００回転／分×１０分）して菌体を集め、次いでこの菌
体を氷冷した水８０mlに再懸濁させ、氷中に１０分間静
置して時々攪拌し、遠心分離（９０００回転／分×１０
分）により菌体と上澄とを分離することにより行なつ
た。得られた上澄をペリプラズム画分とする。

更に、菌体を洗浄緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸及び３０
ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）で洗浄後、ＰＢＳ
（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナト
リウム、ｐＨ７．０）１０mlに懸濁させ、超音波破砕機
（大岳製作所製）５２０２型）を用いて出力１００Ｗに
て、３０秒ずつ３回破砕処理して、遠心分離（１８００
０回転／分×２０分、４℃）して上澄を得た。これを菌
体内画分とする。

（Ｂ）ＲＩＡによるβ−ウロガストロンの測定 上記（Ａ）で得たそれぞれの画分につき、以下の通りβ
−ウロガストロンの存在を、β−ウロガストロン特異ラ
ジオイムノアツセイ（ＲＩＡ）により検討した。ＲＩＡ
の方法は次の通りである。即ち、精製ヒトβ−ウロガス
トロンを抗原として、家兎を免疫し抗血清を作成した。
β−ウロガストロン３００μｇを蒸留水０．２mlに溶解
後、５０％ポリビルピロリドン液１．５mlを加え室温で
２時間攪拌した。コンプリート・フロインド・アジユバ
ント２．０mlを加えて乳化し、家兎３匹の胸部に皮下注
射した。２週間毎に免疫を４回くり返した後、さらに５
０μｇの抗原を静注し、３日後に全採血を行ない、血清
を分離した。

次にアツセイに用いる抗血清の希釈倍率を求めるタイト
レーシヨンカーブ、アツセイ条件を最適化するためイン
キユベーシヨン時間、抗体結合標識抗原（バウンド）と
遊離標識抗原（フリー）の分離方法等の検討を加え、下
記測定条件を設定した。

即ち、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１４０
ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム
を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を希釈液と
して用い、該希釈液４００μ、測定試料又は標準ヒト
β−ウロガストロン１００μ及び抗ヒトβ−ウロガス
トロン血清１００μを加えて４℃にて２４時間インキ
ユベートした後、^１２５Ｉ標識ヒトβ−ウロガストロン
１００μ（約５０００cpm）を加えた。更に４℃にて
４８時間インキユベートした後、第２抗体（抗家兎γ−
グロブリンヤギ血清）（１：２０）１００μ、正常家
兎血清（１：２００）１００μ及び５％ポリエチレン
グリコールを含む１０ｍＭ ＰＢＳ液９００μを加え
て４℃にて３時間インキユベートした。次に３００rpm
で３０分間遠心分離し、上清を除き沈澱物をカウントし
た。標準ヒトβ−ウロガストロンより得られた標準曲線
より試料中のヒトβ−ウロガストロン免疫活性物の含量
を求めた。

上記ＲＩＡの結果を第５図に示す。図において横軸は培
養時間（hr）を示し、縦軸はグラフ（１）で示される菌
体外β−ウロガストロン量（μｇ／ｌ）、グラフ（２）
で示されるペリプラズム層β−ウロガストロン量（μｇ
／ｌ）、グラフ（３）で示される菌体内β−ウロガスト
ロン量（μｇ／ｌ）、及びグラフ（４）で示される６１
０nmにおける吸光度（ＯＤ）を各々示す。

第５図より、本培養において、プリプラズム層β−ウロ
ガストロン（グラフ（２））は、６時間まで菌の増殖に
比例して増大するが以後減少し、これに代って菌体外β
−ウロガストロン量（グラフ（１））が増大してくるこ
とが明らかである。

（Ｄ）β−ウロガストロンの精製及び確認 上記菌体外画分２０中のβ−ウロガストロン免疫
活性物質を、ブチルトヨパール６５０Ｃ（東洋曹達株式
会社製）を用いた吸着クロマトグラフイー、ＤＥＡＥ−
トヨパール６５０Ｍ（同上社製）を用いた陰イオン交換
クロマトグラフイー、ＣＭ−トヨパール６５０Ｍ（同上
社製）を用いた陽イオン交換クロマトグラフイー及びセ
フアデツクスＧ−２５（フアルマシア社製）を用いたゲ
ル過クロマトグラフイー操作を順次行なうことにより
分画精製し、純度９９％以上の単一のポリペプチド９８
mgを得た。

得られたポリペプチドとヒト尿より単離精製された
天然β−ウロガストロン（日本ケミカルリサーチ社製）
の逆相高速液体クロマトグラフイーによる溶出パターン
を第６図に示す。該第６図はＴＳＫゲル−ＯＤＳ−１２
０Ｔカラム（東洋曹達株式会社社製）を用いて、２２％
アセトニトリルを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）により、毎分１．０mlの流速で溶出させた結果であ
り、図において縦軸は２８０nmでの吸光度及び横軸はリ
テンシヨンタイム（分）を示し、（１）は本発明に係わ
る上記ポリペプチドの結果及び（２）は天然β−ウロガ
ストロンの結果である。

該図より両者のリテンシヨンタイムは完全に一致してい
ることが判る。

また、上記で得たポリペプチドを、４Ｍメタルスル
ホン酸により加水分解し、日立アミノ酸分析機モデル８
３５型を用いて、オルトフタルアルデヒド法により求め
たアミノ酸分析結果を下記第５表に示す。

該表より、実測残基数は理論残基数とよく一致している
ことが判る。

更に、上記で得たポリペプチドの細胞増殖促進活性
の確認試験を以下の通り行なった。

この試験は、中村らの方法〔Ｊ．Ｂiochem．，９４（１
９８３）１０２９−１０３５〕に従い、成熟ラツトの初
代培養肝細胞による〔^３Ｈ〕−チミジンの高分子ＤＮＡ
への取り込みを測定することにより行なわれた。

結果を第７図に示す。図中（１）は本発明により得られ
たポリペプチドの結果であり、（２）は同様の活性を有
することが知られているマウスＥＧＦ（コラボレイテイ
ブリサーチ社製）につき同一試験を行なった結果であ
る。

上記図より、本発明に係わるポリペプチドはマウスＥＧ
Ｆよりも強い細胞増殖促進活性を示すことが明らかであ
る。

尚、上記以外にもポリアクリルアミドゲル電気泳動、ア
ミノ酸配列分析、新生マウスの早期眼瞼開裂活性試験等
を行なった結果、それらのいずれにおいても本発明ポリ
ペプチドは、天然β−ウロガストロンに一致することが
認められた。

実施例２ Ｉ） β−ウロガストロン発現ベクターｐＵＧＭ１０６
の構築 まず、プラスミドｐＧＬ１０１とｐＢＲ３２２とから、
ｐＧＨ４９を構築し、次いで該ｐＧＨ４９と実施例１I
I）の（Ｃ）で得たｐＵＧ２０１とから目的とするｐＵ
ＧＭ１０６を構築した。

一連の操作の概略を第６図に示す。

（Ａ） ｐＧＨ４９の構築 ｐＧＬ１０１は、大きさ約２．４kbのプラスミドで
あり、アンピシリン耐性遺伝子とlacＵＶ５プロモータ
ーを含んでいる〔Ｃ．Ｓ．Ｔhummelet al．，Ｊ．Ｖir
ology，３７，６８３−６９７（１９８１）〕。

ｐＧＬ１０１の５μｇをまず中塩濃度緩衝液中で制限酵
素ＨinＣIIを用いて切断し、次いで高塩濃度緩衝中で、
制限酵素ＥcoＲＩを用いて切断後、１．０％アガロース
ゲル電気泳動により約１．９４kbのＤＮＡ断片《Ｈ》を
分離した。この断片には、lacＵＶ５プロモーター及び
ベクターの複製開始領域が含まれる。

ｐＢＲ３２２を制限酵素ＳcaＩ及びＥcoＲＩを用い
て高塩濃度緩衝液中で切断した後、１．０％アガロース
ゲル電気泳動を行なつて、約３．８５kbのＤＮＡ断片
《Ｉ》を分離した。

この断片は、テトサイクリン耐性遺伝子及びベクターの
複製開始領域を含んでいる。

上記で得た２つの断片《Ｈ》及び《Ｉ》を、Ｔ_４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させた。反応終了後、この反
応組成液でＨＢ１０１株を形質転換した。得られたテト
ラサイクリン耐性を示す形質転換株の中から１株を選び
プラスミドｐＧＨ４９を単離した。

得られたｐＧＨ４９は、上記第８図に示される図により
特徴付けられ、１．０％アガロースゲル電気泳動の結
果、約５．８kbの大きさを有していた。

（Ｂ） ｐＵＧＭ１０６の構築 ｐＧＨ４９の１０μｇを、１５０ｍＭ塩化ナトリウ
ム、６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．９）、６ｍＭ塩化マグ
ネシウム及び６ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む
緩衝液（ＳalＩ緩衝液）中で、制限酵素ＳalＩを用いて
切断し、次いで中塩濃度緩衝液中で制限酵素ＰvuIIを用
いて切断した後、１．０％アガロースゲル電気泳動を行
ない、約０．７５kbのＤＮＡ断片《Ｊ》を単離した。

この断片には、lacＵＶ５プロモーターと共にテトラサ
イクリン耐性遺伝子の一部が含まれている。

ｐＵＧ２０１の１０μｇを、中塩濃度緩衝液中で、
制限酵素ＡatIIで切断した。このうちの１．５μｇを１
００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８．１）、１２ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ
を含む緩衝液４０μ中で、０．０３ユニツトのＢal３
１ヌクレアーゼ（ベセスダリサーチラボラトリーズ社
製）を用い、３７℃にて２０分間反応させることによ
り、部分分解を行なった。次いでこれをＳalＩ緩衝液中
でＳalＩを用いて切断し、１．０％アガロースゲル電気
泳動を行ない、約２．８〜２．９kbのＤＮＡ断片《Ｋ》
を単離した。

この断片には、β−ラクタマーゼのシグナルペプチドに
β−ウロガストロンが連結してなる融合ポリペプチドを
コードするＤＮＡ塩基配列、ベクターの複製開始領域及
びテトラサイクリン耐性遺伝子の一部が含まれていた。

上記で得た断片《Ｊ》と上記で得た断片《Ｋ》
とを混合し、Ｔ_４ＤＮＡリガーゼで結合させた。反応終
了後、この反応組成液でＨＢ１０１株を形質転換し、得
られるテトラサイクリン耐性の形質転換株の中から一株
を選択し、プラスミドｐＵＧＭ１０６を単離した。

得られたｐＵＧＭ１０６は、第８図に示される図で特徴
付けられ、１．０％アガロースゲル電気泳動の結果よ
り、約３．７kbの大きさを有し、β−ラクタマーゼのシ
グナルペプチドにβ−ウロガストロンが連結してなる融
合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列及びテトラ
サイクリン耐性遺伝子を含むベクターであることが判つ
た。更に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配
列の上流には、ｐＵＧ２０１において上記ポリペプチド
の発現のために用いたblaプロモーターはそのまま残っ
ており、その上流約９０塩基の位置に、ｐＧＨ４９から
由来するlcaＵＶ５プロモーターが組込まれていること
が、制限酵素ＨhaＩ及びＭboII等を用いて行なった解析
から確認された。

II） ｐＵＧＭ１０６を保有する大腸菌によるβ−ウロ
ガストロンの製造 （Ａ）ｐＵＧＭ１０６を保有する大腸菌ＨＢ１０１株の
培養 ベクターｐＵＧＭ１０６を保有するＨＢ１０１株を培養
し、β−ウロガストロンの菌体外への排出を以下に示す
方法により調べた。培養培地としては、グルコース、カ
ザミノ酸、プロリン、ロイシン、サイアミン及びテトラ
サイクリンを添加した下記組成のＭ９培地を用いた。

＜培地（１当りの組成）＞ リン酸二ナトリウム・１２水塩 １３．４ｇ リン酸一カリウム ３．０ｇ 塩化ナトリウム ０．５ｇ 塩化アンモニウム １．０ｇ 塩化カルシウム・２水塩 １４．７mg 塩化マグネシウム・６水塩 ２０３ mg グルコース ５．０ｇ カザミノ酸 ５．０ｇ Ｌ−プロリン ５０ mg Ｌ−ロイシン ４０ mg サイアミン塩酸塩 １ mg テトラサイクリン １５ mg 上記培地２００mlを入れたフラスコに菌を接種し、３７
℃で２４時間振盪培養を行なった。

６１０nmでの吸光度を測定し、次いで遠心分離（６００
０回転／分×１０分、４℃）により、菌体と培養上澄と
を分離後、前述した方法により菌体内画分と菌体外画分
とを得、これらの各々につきβ−ウロガストロン量をラ
ジオイムノアツセイ（ＲＩＡ）により測定した。ＲＩＡ
は、前述した方法により行なった。

上記ＲＩＡの結果を第６表に示す。また第６表には、対
照としてｐＵＧ２０１を保有するＨＢ１０１株を同様に
培養した結果を併記する。

上記表より、ｐＧＵＭ１０６保有株では、菌体内外のβ
−ウロガストロン量の合計で、ｐＵＧ２０１株を上回
り、その大部分は３７℃、２４時間の培養により、菌体
外に排出されていることが確認された。

（Ｂ）β−ウロガストロンの精製 上記菌体外画分中のβ−ウロガストロンの免疫活性物質
を、前記と同様にして単一のポリペプチドになるまで精
製した。

その結果、精製されたβ−ウロガストロンは、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、アミノ酸分析、Ｎ末端分析のすべてにお
いてヒト尿より単離精製されたβ−ウロガストロンと同
一物質であることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は起源ベクターｐＢＲ３２２に合成オリゴヌクレ
オチド＜１＞、＜２＞、＜３＞及び＜４＞をクローニン
グしてプラスミドｐＧＨ５３を得る工程及びこれにより
得られるｐＧＨ５３の特徴を示す図であり、図中□は合
成オリゴヌクレオチド由来の塩基配列を示している。 第２図はｐＧＨ５３とｐＢＲ３２２とからβ−ウロガス
トロン発現用ベクターｐＧＨ５４を得る工程及び得られ
たベクターｐＧＨ５４の特性を示す図であり、図中■は
シグナルペプチドをコードする塩基配列を示す。 第３図はｐＢＲ３２２からｐＢＲＨ０２を得、該ｐＢＲ
Ｈ０２とｐＧＨ５４とからβ−ウロガストロン発現用ベ
クターｐＧＨ５５を得る工程及び得られるｐＧＨ５５の
特性を示す図である。 第４図はｐＧＨ５５とｐＵＧ３とからシグナルペプチド
とβ−ウロガストロンとの融合ポリペプチドをコードす
るＤＡＮ塩基配列を含むベクターｐＵＧ２０１を得る工
程及び得られるベクターｐＵＧ２０１の特性を示す図で
あり、図中白ヌキの矢印はβ−ウロガストロンの遺伝子
を示す。 第５図は実施例１で得られるβ−ウロガストロン量の経
時変化を示すグラフである。 第６図は実施例１で得たポリペプチドと天然β−ウロガ
ストロンとの逆相高速液体クロマトグラフイーの結果を
示す図である。 第７図は実施例１で得たポリペプチドの細胞増殖促進活
性を調べた図である。 第８図はｐＧＬ１０１とｐＢＲ３２２とからｐＧＨ４９
を得、次いで得られるｐＧＨ４９とｐＵＧ２０１とから
ｐＵＧＭ１０６を得る各工程及び各ベクターの特性を示
す図である。図において黒塗りの矢印lacＵＶ５プロモ
ーターを、また白抜きの矢印はblaプロモーターを示
す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/31 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６８０ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６８１ (72)発明者 王子田 和秀 兵庫県赤穂市坂越3218−12 (72)発明者 谷野 真木 兵庫県赤穂市尾崎3139−60 (72)発明者 三原 茂 兵庫県赤穂市寿町１−７ (72)発明者 松代 愛三 大阪府吹田市青山台４丁目15番12号 (72)発明者 矢内原 昇 静岡県静岡市北403−22

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】大腸菌由来のβ−ラクタマ−ゼシグナルペ
   プチドをコードするＤＮＡ塩基配列とβ−ウロガストロ
   ンをコードするＤＮＡ塩基配列とが直接連結された融合
   ポリペプチドをコードする ＤＮＡ塩基配列を含むベクターで形質転換された大腸菌
   を培養し、菌体外に排出されるβ−ウロガストロンを採
   取することを特徴とするβ−ウロガストロンの製造方
   法。