JPH0695946B2 - ウリジンの製造法 - Google Patents
ウリジンの製造法Info
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- JPH0695946B2 JPH0695946B2 JP3056206A JP5620691A JPH0695946B2 JP H0695946 B2 JPH0695946 B2 JP H0695946B2 JP 3056206 A JP3056206 A JP 3056206A JP 5620691 A JP5620691 A JP 5620691A JP H0695946 B2 JPH0695946 B2 JP H0695946B2
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- Japan
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- uridine
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- producing
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】ウラシルやウリジンは、医薬品で
ある5-フルオロウラシルや2',3'-ジデオキシヌクレオシ
ド類といった、制癌剤や抗ウイルス剤の製造原料として
有用であり、本発明はこの発酵生産に用いる微生物およ
び製造法に関する。
ある5-フルオロウラシルや2',3'-ジデオキシヌクレオシ
ド類といった、制癌剤や抗ウイルス剤の製造原料として
有用であり、本発明はこの発酵生産に用いる微生物およ
び製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】発酵法によるウラシル類の生産に関して
は、ミクロモノスポラ属から誘導されたウラシルアナロ
グ耐性株を用いる方法（特公昭57-18873号）、ブレビバ
クテリウム属細菌から誘導されたプリンアナログ耐性株
を用いる方法（特公昭57-30476号）、バチルス属細菌か
ら誘導された、ウラシルアナログ耐性株を用いる方法
（特開昭61-10475号、アグリカルチュアル・バイオロジ
カル・ケミストリィ 52,1479,(1988）など）が知られて
いる。
は、ミクロモノスポラ属から誘導されたウラシルアナロ
グ耐性株を用いる方法（特公昭57-18873号）、ブレビバ
クテリウム属細菌から誘導されたプリンアナログ耐性株
を用いる方法（特公昭57-30476号）、バチルス属細菌か
ら誘導された、ウラシルアナログ耐性株を用いる方法
（特開昭61-10475号、アグリカルチュアル・バイオロジ
カル・ケミストリィ 52,1479,(1988）など）が知られて
いる。
【０００３】これらの方法は、培養液中に、塩基、ヌク
レオシド、ヌクレオチド体が混在したり、有用菌の育成
に多大の労力を要すものであった。
レオシド、ヌクレオチド体が混在したり、有用菌の育成
に多大の労力を要すものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ウリジンを
生産する菌株を簡便に育成し、発酵法による工業的に有
利なウリジン製造法を提供しようとするものである。
生産する菌株を簡便に育成し、発酵法による工業的に有
利なウリジン製造法を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、バチルス
属菌を用いてウリジン生産菌の簡便な育成法に関して鋭
意検討したところ、ウリジン分解能欠損株より誘導され
たオロト酸アナログ耐性株がウリジンを蓄積し、さら
に、チミジンアナログ耐性が付与されるとウリジンの著
量生産が可能になることを見いだした。
属菌を用いてウリジン生産菌の簡便な育成法に関して鋭
意検討したところ、ウリジン分解能欠損株より誘導され
たオロト酸アナログ耐性株がウリジンを蓄積し、さら
に、チミジンアナログ耐性が付与されるとウリジンの著
量生産が可能になることを見いだした。
【０００６】変異株の取得はポジティブセレクションで
きるので、簡便に、ウリジンを生産する菌株を育成する
ことに成功し、本発明を完成するに至った。
きるので、簡便に、ウリジンを生産する菌株を育成する
ことに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】本発明で使用される微生物としては、バチ
ルス・ズブチリス（Bacillus subutilis)IFO 13719 [(1
977): ATCC 6051-K.J.Conn,strain Marburg.(ATCC 605
1; NCIB3610; NCTC 3610; N.R.Smith 744 & 1315) Type
strain］の様に、入手の容易なごく一般的な枯草菌を
親株として用いることが出来る。また、土壌中よりスク
リーニングして親株としてもよい。
ルス・ズブチリス（Bacillus subutilis)IFO 13719 [(1
977): ATCC 6051-K.J.Conn,strain Marburg.(ATCC 605
1; NCIB3610; NCTC 3610; N.R.Smith 744 & 1315) Type
strain］の様に、入手の容易なごく一般的な枯草菌を
親株として用いることが出来る。また、土壌中よりスク
リーニングして親株としてもよい。
【０００８】さらに、変異株の誘導には、紫外線照射や
Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）処理などの公知の変異操作を行ってもよい
し、自然変異株の中より選択してもよい。また、変異株
の選択には、レプリカ法等ごく一般的な手法を用いれば
よい。
Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）処理などの公知の変異操作を行ってもよい
し、自然変異株の中より選択してもよい。また、変異株
の選択には、レプリカ法等ごく一般的な手法を用いれば
よい。
【０００９】この様にして、得られた使用菌の具体例と
しては、バチルス・ズブチリスＩＦＯ 13719を親株とし
たウリジン分解能欠損、オロト酸アナログ耐性、さらに
チミジンアナログ耐性を付与したバチルス・ズブチリス
ＴＬ１（微工研菌寄第11951号）（FERM P-11951）があ
る。
しては、バチルス・ズブチリスＩＦＯ 13719を親株とし
たウリジン分解能欠損、オロト酸アナログ耐性、さらに
チミジンアナログ耐性を付与したバチルス・ズブチリス
ＴＬ１（微工研菌寄第11951号）（FERM P-11951）があ
る。
【００１０】この菌株は、ウリジン分解能欠損、オロト
酸アナログ耐性あるいはチミジンアナログ耐性及びウリ
ジン生産能を有する点を除いては親株となんら変わると
ころはない。
酸アナログ耐性あるいはチミジンアナログ耐性及びウリ
ジン生産能を有する点を除いては親株となんら変わると
ころはない。
【００１１】本発明に言う「オロト酸アナログ」とは、
ウラシル類のデノボ生合成経路の中間体であるオロト酸
（6-カルボキシウラシル）と類似の構造を有し培地中に
加えると、微生物の成育を阻害するもので、例えば、5-
フルオロオロト酸、2-チオオロト酸などを言う。
ウラシル類のデノボ生合成経路の中間体であるオロト酸
（6-カルボキシウラシル）と類似の構造を有し培地中に
加えると、微生物の成育を阻害するもので、例えば、5-
フルオロオロト酸、2-チオオロト酸などを言う。
【００１２】また、「オロト酸アナログ耐性株」とは、
親株が成育できない濃度のオロト酸アナログを含む培地
でも成育できるよう、遺伝的に変化した菌株のことを云
う。
親株が成育できない濃度のオロト酸アナログを含む培地
でも成育できるよう、遺伝的に変化した菌株のことを云
う。
【００１３】「ウリジン分解能欠損株」とは、5-フルオ
ロウリジンに耐性な変異株より選択された5-フルオロウ
ラシルに感受性を示し微量のウリジンのみを生産する菌
株を言う。
ロウリジンに耐性な変異株より選択された5-フルオロウ
ラシルに感受性を示し微量のウリジンのみを生産する菌
株を言う。
【００１４】また、「チミジンアナログ」とは、チミジ
ンの類似化合物で、例えば、5-ブロモ-2'-デオキシウリ
ジン、5-クロロ-2'-デオキシウリジン、トリフルオロチ
ミジン等を言う。
ンの類似化合物で、例えば、5-ブロモ-2'-デオキシウリ
ジン、5-クロロ-2'-デオキシウリジン、トリフルオロチ
ミジン等を言う。
【００１５】ウリジン生産のための菌株の培地、培養
は、従来より一般的に行われている方法を用いればよ
い。
は、従来より一般的に行われている方法を用いればよ
い。
【００１６】例えば、グルコース、シュークロースなど
や安価な糖質である糖蜜や澱粉あるいは澱粉加水分解物
などを炭素源として用いることが出来る。
や安価な糖質である糖蜜や澱粉あるいは澱粉加水分解物
などを炭素源として用いることが出来る。
【００１７】窒素源としては、アンモニア、硝酸アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸ア
ンモニウム、等のアンモニウム塩類、尿素、ペプトン、
カゼイン加水分解物、肉エキス等の窒素性有機物、アラ
ニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸等、
枯草菌が資化出来るものなら、何れでもよい。
ニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸ア
ンモニウム、等のアンモニウム塩類、尿素、ペプトン、
カゼイン加水分解物、肉エキス等の窒素性有機物、アラ
ニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸等、
枯草菌が資化出来るものなら、何れでもよい。
【００１８】また必要に応じて、燐酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、ミネラル塩、ビタミン類を加えるこ
ともできる。
塩、カルシウム塩、ミネラル塩、ビタミン類を加えるこ
ともできる。
【００１９】 培養方法は、一般に行われている振盪培
養や通気攪拌培養を行えばよい。培養温度は、２０℃〜
４０℃が好適である。培養中のｐＨは、適当な中和剤を
用いてｐＨ５．５〜８．５の範囲に調節すればよい。
養や通気攪拌培養を行えばよい。培養温度は、２０℃〜
４０℃が好適である。培養中のｐＨは、適当な中和剤を
用いてｐＨ５．５〜８．５の範囲に調節すればよい。
【００２０】中和剤としては、アンモニア、アンモニア
水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム或いは炭酸カル
シウム等が使用できる。培養期間は、通常２〜７日行え
ばよい。
水、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム或いは炭酸カル
シウム等が使用できる。培養期間は、通常２〜７日行え
ばよい。
【００２１】ウリジンの採取に於いても、ごく一般的な
方法を用いればよい。例えば、培養終了液より菌体を除
去し、吸着法、沈澱法、抽出法、イオン交換樹脂処理法
などの既知の方法によってウリジンを回収することが出
来る。
方法を用いればよい。例えば、培養終了液より菌体を除
去し、吸着法、沈澱法、抽出法、イオン交換樹脂処理法
などの既知の方法によってウリジンを回収することが出
来る。
【００２２】
【作用】従来、核酸系化合物の発酵生産菌は、サルベー
ジ合成系の塩基アナログまたはヌクレオシドアナログ耐
性株より選択することが一般的であった。
ジ合成系の塩基アナログまたはヌクレオシドアナログ耐
性株より選択することが一般的であった。
【００２３】本発明では、デノボ合成系に位置するオロ
ト酸に着目し、そのアナログに耐性を有する菌株を選択
することで、効率的に目的とする生産株を取得するもの
であり、まったく新しい発想による。
ト酸に着目し、そのアナログに耐性を有する菌株を選択
することで、効率的に目的とする生産株を取得するもの
であり、まったく新しい発想による。
【００２４】また、ウリジンの分解能を欠損すると、5-
フルオロウリジンが分解しないので、生育阻害の強い5-
フルオロウラシルが生成されない。このため、ウリジン
分解能欠損株では、5-フルオロウリジンに耐性で5-フル
オロウラシルに感受性を示す。
フルオロウリジンが分解しないので、生育阻害の強い5-
フルオロウラシルが生成されない。このため、ウリジン
分解能欠損株では、5-フルオロウリジンに耐性で5-フル
オロウラシルに感受性を示す。
【００２５】一方、チミジン要求性の変異株が、ウラシ
ル類を蓄積する例が知られている（特公昭49-22710）。
ル類を蓄積する例が知られている（特公昭49-22710）。
【００２６】この事実より、チミジン系化合物によるウ
リジン類の生合成調節機構の存在が示唆される。チミジ
ンアナログ耐性により、この調節機構の解除がおきたも
のと考えられるが詳細は、不明である。
リジン類の生合成調節機構の存在が示唆される。チミジ
ンアナログ耐性により、この調節機構の解除がおきたも
のと考えられるが詳細は、不明である。
【００２７】
【実施例】以下、実施例をもって、さらに詳しく説明す
る。
る。
【００２８】実施例１ バチルス・ズブチリスＩＦＯ 13719を親株として、50μ
ｇ／mlのＮＴＧで30分間処理した（以下、ＮＴＧ処理は
同一条件で行った）後に基本培地に１mg／mlの5-フルオ
ロウリジンを添加した培地に塗抹し、30℃で５日間培養
し、出現したコロニーの中からレプリカ法によって、5-
フルオロウラシル（50μｇ／ml）の入った基本培地に成
育できず、基本培地に成育できるバチルス・ズブチリス
UR 1を選択した。
ｇ／mlのＮＴＧで30分間処理した（以下、ＮＴＧ処理は
同一条件で行った）後に基本培地に１mg／mlの5-フルオ
ロウリジンを添加した培地に塗抹し、30℃で５日間培養
し、出現したコロニーの中からレプリカ法によって、5-
フルオロウラシル（50μｇ／ml）の入った基本培地に成
育できず、基本培地に成育できるバチルス・ズブチリス
UR 1を選択した。
【００２９】 基 本 培 地 グルコース 2.0 ％ 硫酸アンモニウム 0.3 ％ 硫酸マグネシウム 0.03％ 燐酸二カリウム 0.2 ％ カザミノ酸 0.3 ％ 寒 天 1.5 ％（pH 7.0）
【００３０】こうして選択した。バチルス・ズブチリス
ＵＲ１に、ＮＴＧ処理を施した後、100μｇ／mlの5-フ
ルオロオロト酸を添加した基本培地に塗抹して、30℃
で、５日間培養し、出現したコロニーより、ウリジン生
産菌としてバチルス・ズブチリスＦ３Ａを選択した。
ＵＲ１に、ＮＴＧ処理を施した後、100μｇ／mlの5-フ
ルオロオロト酸を添加した基本培地に塗抹して、30℃
で、５日間培養し、出現したコロニーより、ウリジン生
産菌としてバチルス・ズブチリスＦ３Ａを選択した。
【００３１】更に、バチルス・ズブチリスＦ３ＡにＮＴ
Ｇ処理し、 100μｇ／ｌの5-ブロモ-2'-デオキシウリジ
ンを含む基本培地に塗布し、30℃で５日間培養した。出
現したコロニーの中から、ウリジン生産能の高い株とし
てバチルス・ズブチルスＴＬ１（微工研菌寄第 11951
号）（FERM P-11951）を選択した。これらの菌株の、各
種ピリミジンアナログに対する耐性度を表１に示す。
Ｇ処理し、 100μｇ／ｌの5-ブロモ-2'-デオキシウリジ
ンを含む基本培地に塗布し、30℃で５日間培養した。出
現したコロニーの中から、ウリジン生産能の高い株とし
てバチルス・ズブチルスＴＬ１（微工研菌寄第 11951
号）（FERM P-11951）を選択した。これらの菌株の、各
種ピリミジンアナログに対する耐性度を表１に示す。
【００３２】 次に、バチルス・ズプチリスＴＬ１及び
参考として、育成過程で取得した変異株を、発酵培地５
０ｍｌを含む５００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに接
種し、３０℃で３日間振盪培養を行い、ＨＰＬＣ（カラ
ム；ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ）にてウラシルま
たはウリジンの定量を行った。その結果を表２に示す。
参考として、育成過程で取得した変異株を、発酵培地５
０ｍｌを含む５００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに接
種し、３０℃で３日間振盪培養を行い、ＨＰＬＣ（カラ
ム；ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＱ）にてウラシルま
たはウリジンの定量を行った。その結果を表２に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】＊＋；生育あり −；生育なし ５ＦＲ；5-フルオロウリジン（1000μｇ／ml），５Ｆ
Ｕ；5-フルオロウラシル（50μｇ／ml），５ＦＯ；5-フ
ルオロオロト酸（ 100μｇ／ml），ＢＤＵ；5-ブロモ-
2'-デオキシウリジン（ 100μｇ／ml），ＣＤＵ；5-ク
ロロ-2'-デオキシウリジン（ 100μｇ／ml），ＴＦＴ；
トリフルオロチミジン（ 200μｇ／ml）
Ｕ；5-フルオロウラシル（50μｇ／ml），５ＦＯ；5-フ
ルオロオロト酸（ 100μｇ／ml），ＢＤＵ；5-ブロモ-
2'-デオキシウリジン（ 100μｇ／ml），ＣＤＵ；5-ク
ロロ-2'-デオキシウリジン（ 100μｇ／ml），ＴＦＴ；
トリフルオロチミジン（ 200μｇ／ml）
【００３５】 発 酵 培 地 グルコース 8.0 ％ 尿 素 1.0 ％ 燐酸二カリウム 0.2 ％ 硫酸マグネシウム 0.08％ 塩化カリウム 0.09％ 酵母エキス 0.4 ％ 炭酸カルシウム 2.0 ％（pH=7.0）
【００３６】
【表２】 ───────────────────── 蓄 積 量 （mg／ml） 菌 株 ウラシル ウリジン ───────────────────── 親 株 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＵＲ１ ＜ 0.01 0.2 Ｆ３Ａ 0.2 2.2 ＴＬ１ 0.4 4.0 ─────────────────────
【００３７】実施例２ バチルス・ズブチリスＴＬ１を、発酵培地１Ｌの入った
2.6Ｌ容ジャーファーメンターにて、30℃で３日間培養
した。遠心分離により、培養液から菌体を除去した後、
上清液を活性炭カラムに吸着させた。水洗し、 1.4％ア
ンモニア水を含む50％エタノールで溶出した。溶出液を
減圧濃縮させた後、メタノールを９倍容加えた。不溶解
分をろ過により除去し、更に濃縮乾固させた。固形物を
小量の水に溶解し、冷却下にエタノールを加え、ウリジ
ンの結晶 3.1ｇを得た。
2.6Ｌ容ジャーファーメンターにて、30℃で３日間培養
した。遠心分離により、培養液から菌体を除去した後、
上清液を活性炭カラムに吸着させた。水洗し、 1.4％ア
ンモニア水を含む50％エタノールで溶出した。溶出液を
減圧濃縮させた後、メタノールを９倍容加えた。不溶解
分をろ過により除去し、更に濃縮乾固させた。固形物を
小量の水に溶解し、冷却下にエタノールを加え、ウリジ
ンの結晶 3.1ｇを得た。
【００３８】
【発明の効果】本発明は、バチルス属菌よりウリジン生
産能を有する菌株を簡便に育成する方法を提供するとと
もに、ウリジンのみを効率よく製造するものであり、工
業的にきわめて有利である。
産能を有する菌株を簡便に育成する方法を提供するとと
もに、ウリジンのみを効率よく製造するものであり、工
業的にきわめて有利である。
Claims (3)
- 【請求項１】 バチルス属に属し、ウリジン分解能欠
損、オロト酸アナログ耐性およびチミジンアナログ耐性
を有し、ウリジン生産能を有する微生物を好気的に培養
し、その培養物より採取することを特徴とするウリジン
の製造法。 - 【請求項２】 微生物としてバチルス・ズプチリスの変
異株を使用する請求項１記載のウリジンの製造法。 - 【請求項３】 微生物として微工研菌寄第１１９５１号
（ＦＥＲＭＰ−１１９５１）を使用する請求項１記載の
ウリジンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3056206A JPH0695946B2 (ja) | 1991-01-23 | 1991-01-23 | ウリジンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3056206A JPH0695946B2 (ja) | 1991-01-23 | 1991-01-23 | ウリジンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04252190A JPH04252190A (ja) | 1992-09-08 |
| JPH0695946B2 true JPH0695946B2 (ja) | 1994-11-30 |
Family
ID=13020643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3056206A Expired - Fee Related JPH0695946B2 (ja) | 1991-01-23 | 1991-01-23 | ウリジンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0695946B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69813231T2 (de) | 1997-06-03 | 2003-12-04 | Itochu Techno-Chemical Inc., Tokio/Tokyo | Natürliche antitumor- oder antivirale substanzen und ihre anwendung |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61104795A (ja) * | 1984-10-26 | 1986-05-23 | Takeda Chem Ind Ltd | ウリジンの製造法 |
-
1991
- 1991-01-23 JP JP3056206A patent/JPH0695946B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04252190A (ja) | 1992-09-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |