JPH069663A - リン脂質誘導体および細胞障害防御剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 生体内での活性酸素消去効果に優れ、活性酸
素による細胞障害に基づく疾病の予防および治療に優れ
た効果を発揮する細胞障害防御剤を得る。 【構成】 下式で表わされるリン脂質誘導体を有効成分
とする細胞障害防御剤。 【化１】 （Ｒ¹およびＲ²は互いに同一または異なった炭素数１６
〜２２の不飽和脂肪酸アシル残基、ＸはＨまたは塩形成
金属を示す。）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なリン脂質誘導
体、ならびにこれを有効成分とする活性酸素による細胞
障害に基づく疾病の予防および治療用の薬剤に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】生体内には多数の活性酸素消去システム
があり、酸化的なストレスから生体を保護している。そ
れらの防御システムの乱れから生じた活性酸素が様々な
疾病の発現に関与していることが明らかにされた。特に
近年、動脈硬化の発症機序に活性酸素による血管内皮細
胞の障害が深く関与していることが注目されている。

【０００３】活性酸素による細胞障害は、炎症や脳・心
臓・循環器・消化器などに起こる各種疾患の一部とみな
され、現在までにも生体内においてこれらの活性酸素を
消去する薬剤の検討が行われてきた。例えば、活性酸素
の消去や過酸化脂質の分解などの作用を有する抗酸化性
化合物が活性酸素消去剤として多方面からのアプローチ
によって開発されている（ラジカル消去剤，メビオ，
５，９０−９４，１９８８）。

【０００４】また、水溶性抗酸化剤であるビタミンＣを
脂溶化するために脂肪酸残基、またはアルキル基を直接
導入した化合物が検討されている（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅ
ｍ．，３１，７９３〜７９８，１９８８など）。

【０００５】ところで、特開平３−２９１２８９号公
報、特開平４−９９７２４号公報および特開平４−１１
７３９２号公報には、アスコルビン酸骨格を有するリン
脂質誘導体が開示されている。しかし、これらの公報に
は、２つのアシル基が共にパルミチン酸残基のリン脂質
誘導体および大豆レシチンまたは卵黄レシチン由来のリ
ン脂質誘導体の記載しかなく、またこれらのリン脂質誘
導体の細胞障害防御効果は不十分である。

【０００６】またＷＯ９０／１２８００号公報にも、ア
スコルビン酸骨格を有するリン脂質誘導体が開示されて
いる。しかしこの公報には、脂肪酸残基として不飽和脂
肪酸アシル基を有するリン脂質誘導体は開示されていな
い。このように、現在、特定の不飽和結合を有するアシ
ル基が１，２位共に規定されたアスコルビン酸骨格を有
するリン脂質誘導体は知られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
のアスコルビン酸骨格を有するリン脂質誘導体に比べて
細胞障害防御効果の高い新規かつ有用なリン脂質誘導体
および細胞障害防御剤を提供することである。

【０００８】一般的に生体内で細胞、例えば血管内皮細
胞に障害を与える物質としては、過酸化脂質およびスー
パーオキシド、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、過酸
化水素などの活性酸素種が知られている。本発明者ら
は、血管内皮細胞を培養した後、活性化した白血球によ
る内皮細胞障害を放射性クロミウムの放出反応により調
べる実験系をつくり、各種化合物の血管内皮細胞障害抑
制効果を種々検討した結果、特定のリン脂質誘導体に強
い抑制効果があることを見出し、本発明を完成した。

【０００９】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は次の
リン脂質誘導体およびそれを有効成分とする細胞障害防
御剤である。 （１）下記一般式〔１〕で表わされるリン脂質誘導体。

【化２】 （式中、Ｒ¹およびＲ²は互いに同一または異なった炭素
数１６〜２２の不飽和脂肪酸アシル残基、Ｘは水素原子
または塩形成金属を示す。） （２）上記（１）記載のリン脂質誘導体を有効成分とす
ることを特徴とする細胞障害防御剤。

【００１０】本発明において、前記一般式〔１〕のＲ¹
またはＲ²で示される炭素数１６〜２２の不飽和脂肪酸
アシル残基としては、例えばヘキサデセン酸、オクタデ
セン酸、エイコセン酸、ドコセン酸等の炭素数１６〜２
２の不飽和脂肪酸のアシル残基などがあげられる。Ｒ¹
およびＲ²は同一でも異なっていてもよい。Ｒ¹および／
またはＲ²がオレオイル基またはリノレオイル基の場
合、特に細胞障害防御効果が高い。

【００１１】前記一般式〔１〕のＸで示される塩形成金
属としては、例えばＮａ、Ｋなどのアルカリ金属；Ｃ
ａ、Ｍｇなどのアルカリ土類金属等の薬理学上許容され
る塩形成金属があげられる。

【００１２】本発明のリン脂質誘導体は、ホスファチジ
ン酸のクロリドとアスコルビン酸とを反応させるなどの
化学合成法、またはリン脂質とアスコルビン酸とをホス
ホリパーゼＤを用いて反応させる公知の方法（例えば特
開平３−２９１２８９号公報）により製造できる。リン
脂質としては、例えばホスファチジルコリン、ホスファ
チジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトー
ル、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン等があ
げられる。得られた前記一般式〔１〕で表わされるリン
脂質誘導体は、抽出・再結晶・クロマトグラフィーなど
の従来既知の方法により単離、精製することができる。

【００１３】本発明の細胞障害防御剤は前記一般式
〔１〕で表わされるリン脂質誘導体を有効成分として含
有するものである。

【００１４】本発明の細胞障害防御剤は、活性酸素によ
る細胞障害を防御するものであり、虚血性心疾患、虚血
性脳疾患、循環器疾患（例えば動脈硬化等）、消化器疾
患（例えば消化管、肝臓、膵臓などの疾患）、皮膚疾
患、癌、肺疾患などの疾患および炎症に対して有効であ
る。

【００１５】本発明のリン脂質誘導体を細胞障害防御剤
として用いる場合、リン脂質誘導体は、それ自体公知の
薬理的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などと混合
し、公知の方法に従って医薬組成物、例えば錠剤、カプ
セル剤、液剤、注射剤、坐剤等として経口的もしくは非
経口的に投与することができる。

【００１６】また、本発明のリン脂質誘導体が油脂成分
である点から、非経口投与に次のような剤形があげられ
る。注射や点滴では、水溶性懸濁液、リポソーム製剤や
リピッドマイクロスフェアー製剤等の油性製剤などがあ
る。局所適用剤形では眼内への点眼剤や点眼軟膏などが
あり、また直腸への脂質界面活性剤混合ミセルタイプの
坐剤などがある。

【００１７】投与量は投与対象、投与経路、症状などに
よっても異なるが、経口的に投与する場合、リン脂質誘
導体として通常１回量として約１〜１００ｍｇ／ｋｇ体
重、好ましくは約５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重を１日１〜３
回程度投与する。

【００１８】また、非経口的に投与する場合、例えば坐
剤ではリン脂質誘導体として約５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重
を１日１〜２回投与する。油性製剤の注射剤ではリン脂
質誘導体として約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重を１日１
〜２回投与することが好ましい。

【００１９】本発明のリン脂質誘導体は、それを構成す
るグリセロリン脂質骨格およびアスコルビン酸骨格がい
ずれも天然に存在し、食品中に含まれているものである
ので、生体に対する毒性は低い。

【００２０】本発明のリン脂質誘導体は、上記細胞障害
防御剤の他にも、食品、医薬品、化粧品の原料となり得
る。

【００２１】

【作用】本発明の前記一般式〔１〕で表わされるリン脂
質誘導体は、従来のリン脂質誘導体に比べて生体親和性
に優れ、生体膜に容易に取込まれることから、組織移行
性にも優れた細胞障害防御剤となる。

【００２２】

【発明の効果】以上の通り、本発明によれば、細胞障害
防御効果の高い新規かつ有用なリン脂質誘導体および細
胞障害防御剤が得られる。そしてこの細胞障害防御剤は
活性酸素による細胞障害に基づく疾病の予防および治療
に優れた効果を発揮する。

【００２３】

【実施例】次に本発明の実施例について説明する。各例
中％は特に言及しない限り重量％である。 実施例１ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リン（以下、ＤＯＰＣと略す。日本油脂（株）製）１．
５７４ｇをジエチルエーテル２００ｍｌに溶解した。こ
の溶液に、アスコルビン酸７０．４６ｇを２００ｍｌの
Ｈ₂Ｏに溶解して、ＮａＯＨ粒にてｐＨ４．５に調整し
た水溶液を加え、ホスホリパーゼＤ（東洋醸造（株）
製）９０２Ｕの存在下で反応させた。３７℃で６時間攪
拌後、有機層を分離し、水層をさらにジエチルエーテル
１００ｍｌで２回抽出した。有機層を合せて、水洗２回
後、ＭｇＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧留去後、ラード
状の粗精製物１．５５８ｇを得た。

【００２４】得られた粗精製物をシリカゲルクロマトグ
ラフィー（展開溶媒；クロロホルム：メタノール：水＝
１３：７：１）にて精製し、目的物３２７ｍｇ（粘性油
状物）を得た。得られた目的物の質量分析、ＮＭＲスペ
クトルおよび赤外吸収スペクトルを測定した。結果は次
の通りである。

【００２５】質量分析 Ｆａｂ（Ｎｅｇ） マトリックス：トリエタノールアミン ［Ｍ−Ｈ］^-：８５７ ［Ｍ−アスコルビン酸］^-：６９９

【００２６】¹H-NMR(270MHz、TMS標準、CDCl₃:CD₃OD=2:
1) δppm 0.89(t、6H、J=6.6Hz)、1.30(m、40H)、1.62(m、4H)、
2.03(m、8H)、2.30-2.37(m、4H)、4.01(m、5H)、4.16-
4.23(m、1H)、4.42(m、1H)、4.84(s、1H)、5.24(m、1
H)、5.35(m、4H)

【００２７】¹³C-NMR(67.8MHz、CDCl₃:CD₃OD=2:1) δppm 174.44、174.09、172.43、153.47、130.35、130.10、11
9.17、76.15、70.92、69.47、66.13、64.02、63.39、3
4.61-22.82、14.23

【００２８】IR(neat) ｃｍ^-1 3300(br、OH伸縮)、2920(CH伸縮)、2850(CH伸縮)、1740
(C=O伸縮)、1460(CH₃、CH₂変角)、1060(P-O伸縮)

【００２９】これらの結果から、上記実施例１で得られ
た粘性油状物は下記式で表わされる構造を有するリン脂
質誘導体であることがわかる。

【化３】

【００３０】実施例２ １，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
コリン（以下、ＤＬｏＰＣと略す。日本油脂（株）製）
３９１ｍｇをジエチルエーテル５０ｍｌに溶解した。こ
の溶液に、アスコルビン酸１７．６１ｇを５０ｍｌのＨ
₂Ｏに溶解して、ＮａＯＨ粒にてｐＨ４．５に調整した
水溶液を加え、ホスホリパーゼＤ（東洋醸造（株）製）
２２５Ｕの存在下で反応させた。３７℃で６時間攪拌
後、有機層を分離し、水層をさらにジエチルエーテル２
５ｍｌで２回抽出した。有機層を合せて、水洗２回後、
ＭｇＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧留去後、ラード状の
粗精製物２５６ｍｇを得た。

【００３１】得られた粗精製物をシリカゲルクロマトグ
ラフィー（展開溶媒；クロロホルム：メタノール：水＝
１３：７：１）にて精製し、目的物９４ｍｇ（粘性油状
物）を得た。得られた目的物の質量分析、ＮＭＲスペク
トルおよび赤外吸収スペクトルを測定した。結果は次の
通りである。

【００３２】質量分析 Ｆａｂ（Ｎｅｇ） マトリックス：トリエタノールアミン ［Ｍ−Ｈ］^-：８５３ ［Ｍ−アスコルビン酸］^-：６９５

【００３３】¹H-NMR(270MHz、TMS標準、CDCl₃:CD₃OD=2:
1) δppm 0.90(t、6H、J=6.6Hz)、1.22-1.45(m、36H)、1.61(m、4
H)、2.02-2.07(m、8H)、2.30-2.38(m、4H)、2.78(t、4
H、J=5.6Hz)、3.94-4.40(m、7H)、4.83(s、1H)、5.21-
5.45(m、4H)

【００３４】¹³C-NMR(67.8MHz、CDCl₃:CD₃OD=2:1) δppm 174.40、174.01、172.32、153.28、130.49、130.31、12
8.41、128.26、119.15、76.10、70.77、69.41、66.18、
64.10、62.91、34.56-22.89、14.20

【００３５】IR(neat) ｃｍ^-1 3450(br、OH伸縮)、2925(CH伸縮)、2855(CH伸縮)、1740
(C=O伸縮)、1460(CH₃、CH₂変角)、1060(P-O伸縮)

【００３６】これらの結果から、上記実施例２で得られ
た粘性油状物は下記式で表わされる構造を有するリン脂
質誘導体であることがわかる。

【化４】

【００３７】参考例１、２ 比較例で用いたリン脂質誘導体を次の方法で製造した。
実施例１のＤＯＰＣを１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−
グリセロ−３−ホスホコリン（参考例１）または大豆レ
シチン（参考例２）に代えた以外は、実施例１に準じて
操作を行い、目的とするリン脂質誘導体（以下、それぞ
れＤＰＰＡ−ＡＳＡ，ＳＯＹＰＡ−ＡＳＡと略す）を得
た。得られたＤＰＰＡ−ＡＳＡの質量分析、ＮＭＲスペ
クトルおよび赤外吸収スペクトルを示す。

【００３８】質量分析 Ｆａｂ（Ｎｅｇ） マトリックス：トリエタノールアミン ［Ｍ−Ｈ］^-：８０５ ［Ｍ−アスコルビン酸］^-：６４７

【００３９】¹H-NMR(270MHz、TMS標準、CDCl₃:CD₃OD=2:
1) δppm 0.89(t、6H、J=6.8Hz)、1.27(m、48H)、1.62(m、4H)、
2.30-2.37(m、4H)、4.03(m、5H)、4.15-4.22(m、1H)、
4.42(m、1H)、4.81(s、1H)、5.24(m、1H)

【００４０】¹³C-NMR(67.8MHz、CDCl₃:CD₃OD=2:1) δppm 174.37、174.03、172.50、153.19、118.96、76.21、70.
71、69.14、66.35、64.11、62.84、34.54-22.95、14.20

【００４１】IR(neat) ｃｍ^-1 3300(br、OH伸縮)、2920(CH伸縮)、2850(CH伸縮)、1740
(C=O伸縮)、1465(CH₃、CH₂変角)、1060(P-O伸縮)

【００４２】実施例３ 実施例１、２で得たリン脂質誘導体の薬理試験を次のよ
うにして行った。 １）ウシ血管内皮細胞の培養 ウシ頚動脈血管５〜１０ｃｍを摘出した後、抗生物質
（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を添加したＰ
ＢＳ（リン酸緩衝溶液）で軽く洗い、同様の抗生物質含
有ＭＥＭ（イーグル培地、ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎ
ｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）に浸し、氷冷して培養室に持
ち帰った。

【００４３】血管はさらに抗生物質含有ＭＥＭ培地で数
回洗浄した。その後、血管に付着していた脂肪をきれい
に取去り、ハサミで分岐部を切り、その分岐部を通る形
で血管を縦に切開いた。平らな固定面の上に血管を内膜
面を上にし、引張った形でピン固定した。＃１１のメス
を用い、内膜面に軽く触れるようにして内皮細胞を剥離
した。その際、メスを予め２０％ＦＢＳ（胎児牛血清）
含有ＭＥＭ培地（抗生物質を含有している）に湿らせ
て、メスの動きをよりスムーズにすると共に平滑筋細胞
の混入を防いだ。

【００４４】メスに付着した内皮細胞を上記ＭＥＭ培地
１０ｍｌに分散させ、８００ｒｐｍで５分間遠心分離し
た。その後、沈渣に上記ＭＥＭを加え、ピペットで内皮
細胞が数十個集まった稲穂状になるまで分散し、プラス
チックシャーレに播き培養した。

【００４５】２）血管内皮細胞を用いた活性酸素防御試
験 ９６穴マイクロプレートに上記１）の方法で単離して培
養したウシ頚動脈内皮細胞を、１穴あたり２×１０⁴個
の細胞を播きコンフレントにした。その中に、実施例
１、２で得た被験薬を各濃度になるように添加し、２４
時間培養して内皮細胞に取込ませた。その後⁵¹Ｃｒ−ク
ロム酸ナトリウムを１穴あたり０．５μＣｉ加えてさら
に１８時間培養し、細胞内に⁵¹Ｃｒ−クロム酸ナトリウ
ムを取込ませた。

【００４６】その後、ハンクス液で３回洗浄し、４×１
０⁵ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの白血球（ヒト末梢血よりフィ
コール（商品名、ファルマシア社製）で分離した好中
球）を加え、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール
−１３−アセテートを１０ｎｇ／ｍｌで刺激した。この
物質は白血球膜に作用してＮＡＤＰＨ依存性の五単糖リ
ン酸回路を刺激して活性酸素の産生を促進し、内皮細胞
を障害する。この時、活性酸素により障害を受けた細胞
からは放射能が放出される。

【００４７】５時間後に培養液中に放出されてきた放射
能をγ−シンチレーション・カウンターで測定し、被験
薬取込み状態での放出量とした。内皮細胞内に取込まれ
た⁵¹Ｃｒの総量は０．１％のトリトンＸ−１００を加え
細胞膜を溶かすことによって、培養液に放出された放射
能を測定し、トリトンＸ−１００添加時での放出量とし
た。また、白血球および１２−Ｏ−テトラデカノイル−
ホルボール−１３−アセテートを添加しない時の放射能
量を無刺激時放出量とした。

【００４８】内皮細胞の障害率は、下記計算式〔１〕で
導かれる⁵¹Ｃｒの放出率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｌｅ
ａｓｅ ｏｆ ⁵¹Ｃｒ：ＳＬ）により定量化した。

【数１】

【００４９】次に、内皮細胞障害抑制率を下記計算式
〔２〕より求めた。結果を表１に示す。

【数２】

【００５０】比較例１〜５ 被検薬として参考例１〜２で得たリン脂質誘導体または
表１に示す化合物を用いた以外は実施例３と同様にして
内皮細胞障害抑制率を求めた。結果を表１に示す。

【００５１】

【表１】

【００５２】以上の試験結果から明らかなように、実施
例１、２で得られた化合物には、濃度依存的に、活性酸
素による内皮細胞障害の抑制作用が統計的有意に認めら
れた。また同作用は、ＳＯＹＰＡ−ＡＳＡや他のリン脂
質、アスコルビン酸には認められなかった。

【００５３】実施例４ 下記の成分を用いて、通常手段により錠剤を製造した。
１錠あたりの組成は下記の通りである。 この錠剤を成人１人あたり１日２〜６錠を毎食後投与す
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式〔１〕で表わされるリン脂質
   誘導体。 【化１】 （式中、Ｒ¹およびＲ²は互いに同一または異なった炭素
   数１６〜２２の不飽和脂肪酸アシル残基、Ｘは水素原子
   または塩形成金属を示す。）
2. 【請求項２】 請求項１記載のリン脂質誘導体を有効成
   分とすることを特徴とする細胞障害防御剤。