JPH069707A - 高アセチル化率ヒアルロン酸及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記一般式化１の構造を有する高アセチル化
率ヒアルロン酸及びその製造方法。 【化１】 なお、上記化１において、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄は水素ま
たはエステル結合されたアセチル基を意味し、且つ平均
して各繰り返し構造においてＲ₁〜Ｒ₄の少なくとも１以
上がアセチル基である。Ｒ₅は水素またはアルカリ金属
原子を示す。 【効果】 本発明に係る高アセチル化率ヒアルロン酸
は、温和な条件で各種分子量ヒアルロン酸にアセチル化
率を各繰り返し構造において１以上の割合で結合させる
ことが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアセチル化ヒアルロン酸
及びその製造方法、特にヒアルロン酸のアルコール性水
酸基にアセチル基を高率で結合させた高アセチル化率ヒ
アルロン酸及びその製造方法の改良に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒアルロン酸は生体由来の高分子物質で
あり、高い増粘性、粘張性、曳糸性等の特異的な物性を
有しており、しかも生体適合性が高いことから各種分野
での応用が期待されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ヒアル
ロン酸は強水溶性であり、このため有機溶媒系での増粘
剤、油性基剤中での各種乳化安定剤、リポソームの被覆
強化剤、生体への埋め込み基剤、カプセル基剤等への用
途が期待されていながら、充分な応用が出来ないもので
あった（特開平３−１４３５４０、特開昭５４−３６３
８８等参照）。すなわち、ヒアルロン酸をアセチル化す
る工程を想定すると、一般の低分子物質のアセチル化
は、無水酢酸とピリジンの系で行なわれることが多い
が、前述したようにヒアルロン酸は強水溶性であり、無
水酢酸−ピリジン系でのアセチル化は困難であり、しか
も反応工程中でのヒアルロン酸の分解を免れない。その
他、数十種類に及ぶ方法で検討したことが、結果は同様
であった。このため、高アセチル化率のヒアルロン酸誘
導体を製造することは極めて困難であり、しかもヒアル
ロン酸の本来有する特性自体を失うことが多かった。

【０００４】一方、例えば特開平３−１４３５４０号公
報には、ヒアルロン酸の繰り返し単位にアセチル基等の
アシル基を導入した乳化安定剤が示されている。しかし
ながら、このヒアルロン酸誘導体は修飾率が極めて低
く、アシル基／Ｎ−アセチル基の比率が数分の１以下で
ある。すなわち、数個ないし数十個の繰り返し単位に一
つのアシル基が導入されているのみであり、このような
修飾率では、パルミトイル基等の高油性アシル基を導入
しなければ乳化剤としての機能を事実上奏することは出
来ず、しかも前記ピリジン系を用いるため、修飾率を高
くしようとすればヒアルロン酸の分解等を生じてしま
う。本発明は前記従来技術の課題に鑑みなされたもので
あり、その目的はヒアルロン酸の本来有する機能を保持
し、各種特異な物性を有する高アセチル化率ヒアルロン
酸及びその製造方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に本発明者が鋭意検討した結果、ヒアルロン酸を酢酸と
共存させ、しかも触媒として無水トリフルオロ酢酸、な
いしｐ−トルエンスルホン酸と無水酢酸を加えることに
より、温和な条件で高アセチル化率ヒアルロン酸が製造
出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。即
ち、本出願の請求項１記載の高アセチル化率ヒアルロン
酸は、次の化２を構造を有することを特徴とする。

【０００６】

【化２】 尚、上記化２中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄は、水素またはエ
ステル結合されたアセチル基を示し、且つ平均すると各
繰り返し構造においてＲ₁〜Ｒ₄の少なくとも１以上がア
セチル基である。Ｒ₅は水素又はアルカリ金属原子を示
す。なお、以下においては、Ｒ₁〜Ｒ₄のうちの１がアセ
チル基である場合をアセチル化度１と表現する。請求項
２記載の高アセチル化率ヒアルロン酸の製造方法は、粉
末状ヒアルロン酸を酢酸に懸濁し、触媒としてトリフル
オル酢酸を加え反応させることを特徴とする。請求項３
記載の高アセチル化率ヒアルロン酸の製造方法は、粉末
状ヒアルロン酸を酢酸に分散させ、ｐ−トルエンスルホ
ン酸を加えて、前記微粉末ヒアルロン酸を膨潤させ、更
に無水酢酸を加え反応させることを特徴とする。以下、
本発明の構成を更に詳細に説明する。本発明において、
ヒアルロン酸とは、ヒアルロン酸及びヒアルロン酸塩を
意味し、各種分子量のものを用いることができる。

【０００７】又、本発明にかかる高アセチル化率ヒアル
ロン酸の製造方法において、ヒアルロニダーゼ等の酵素
処理により、オリゴヒアルロン酸から分子量１０，００
０ｋｄ以上におよぶ広範囲の高アセチル化率ヒアルロン
酸を得ることができ、又エステル化反応時間を変えるこ
とにより修飾化率を大幅に変更することができる。ま
た、本出願の請求項２記載の方法において、トリフルオ
ロ酢酸は触媒として機能し、ヒアルロン酸と酢酸の反応
は、例えば室温にて数時間行なえば済み、温和な条件で
ヒアルロン酸自体の構造に変化を与えることなく、高ア
セチル化率ヒアルロン酸を製造することができる。又、
本出願の請求項３記載の方法において、ｐ−トルエンス
ルホン酸は触媒として機能し、反応は例えば５０℃程度
にて行えばすみ、前記請求項２記載の方法と同様に温和
な条件でヒアルロン酸自体の構造に変化を与えることな
く、しかも高アセチル化率のヒアルロン酸を製造するこ
とができる。

【０００８】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づき説明する。
尚、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。実施例１ アセチル化ヒアルロン酸 ５００mlのガラス製ビーカーに市販の特級氷酢酸を入
れ、２ｇのバイオヒアロ１２（分子量約１２００kdのヒ
アルロン酸 資生堂（株）製）の微細粉末を攪拌しなが
ら少しずつ加える。続いて、２０mlの無水トリフルオロ
酢酸をゆっくり加え、室温で１時間攪拌してアセチル化
反応を行なわせる。次に２００mlのピリジンを加え中和
後、２００mlの水を加え攪拌し、沈殿物を完全に溶解さ
せる。４００mlのアセトンを攪拌しながら徐々に加え生
成物を沈殿させる。沈殿は、３，０００rpm１０分間遠
心分離することにより分取する。沈殿は再度２００mlの
１％酢酸ナトリウムに溶解後、前記同様にアセトン沈殿
させる。この溶剤沈殿操作を２度繰り返すことにより、
純水なアセチル化ヒアルロン酸を得る。続いて、アセト
ン洗浄により完全に脱水させた後、減圧乾燥し、アセチ
ル化ヒアルロン酸の白色粉末を得る。

【０００９】本実施例品は、高分子量のアセチル化ヒア
ルロン酸となる。本実施例にかかるアセチル化ヒアルロ
ン酸を、０．１〜１％（w/v）の濃度となるように水に
溶解させ、１／２〜３倍量のエタノール等の有機溶剤を
加え、攪拌すると増粘しゲル状となる。又、本実施例の
１％水溶液は、図１に示すように紫外部に明瞭な吸収ピ
ークを示さず、原料としたヒアルロン酸水溶液の紫外部
吸収スペクトルに酷似する。実施例２ アセチル化ヒアルロン酸 ５００mlのガラス製ビーカーに４００mlの市販の特級氷
酢酸を入れ、５ｇのバイオヒアルロン酸（分子量約２，
２００kdのヒアルロン酸 資生堂（株）製）の微細粉末
を攪拌しながら少しずつ加える。これに１００mlの無水
トリフルオロ酢酸をゆっくり加え、室温で一晩攪拌して
反応させる。反応液は粘張な無色透明な液体となる。２
ｌのガラス製ビーカーに、予め７００mlの精製水を氷冷
しておく。攪拌しながら上記反応液をゆっくり加える。
生じたアセチル化ヒアルロン酸の沈殿を濾別して分取す
る。沈殿は精製水で洗浄液が中性となるまで繰り返し洗
浄する。そして、真空乾燥機で脱水することにより、ア
セチル化ヒアルロン酸の白色粉末を得る事が出来る。

【００１０】本実施例品は高分子量で且つ高アセチル化
度のアセチル化ヒアルロン酸となる。本実施例品はジメ
チルスルホキサイド、ジメチルホルムアミド等の有機溶
媒に可溶である。又、少量の水を含むエタノール、アセ
トン等にも可溶である。又、本実施例品の希薄な有機溶
媒溶液を薄く平らにのばし、溶媒を蒸発させることによ
り、アセチル化ヒアルロン酸のフィルムを得ることが出
来る。更に、本実施例品は有機溶剤可溶性であるので、
カルボジイミド、クロロ蟻酸イソブチル等を触媒とし
て、アミノ基、水酸基等を有する多くの生理活性物質を
共有結合により導入することができる。本実施例品の赤
外吸収スペクトルを図２に示す。同図より明らかな様
に、Ｏ−アセチル基のカルボニルの伸縮振動に基づく吸
収を１，７３８cm^-1に、同様にエーテル結合に基づく吸
収を１，２４８cm^-1に認める。尚、１，６５２cm^-1の吸
収は、Ｎ−アセチル基のカルボニルによる伸縮振動に由
来する。

【００１１】同図より、本実施例品が極めてアセチル化
度の高いものであることが確認された。実施例３ アセチル化ヒアルロン酸 前記バイオヒアロ１２ ２ｇを、１０mg/mlの濃度に１
００mM酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解させ
る。攪拌しながら３７℃に加温し、１０Ｕ/mlの牛睾丸
由来のヒアルロニダーゼを加え、この温度で４時間反応
させる。１００℃５分間加熱し、酵素を失活させる。４
００mlのアセトンを攪拌させながら徐々に加え、低分子
化したヒアルロン酸を沈殿させる。続いてアセトン洗浄
により脱水させる。粉末粉砕機により微粉にした後、実
施例１ないし実施例２と同様な方法により高アセチル化
率ヒアルロン酸を得る。本実施例においては、分子量１
００kd程度の高アセチル化率ヒアルロン酸を得ることが
できる。

【００１２】本実施例品の１％溶液の粘度は、高分子量
のものと比べてかなり低い。又、ゲルを形成させた場
合、高分子量のものと比べて緩やかであるので、乳液な
どにも容易に配合され得る。実施例４ アセチル化ヒアルロン酸 前記バイオヒアロ１２ ２ｇを１０mg/mlの濃度となる
ように、１００mM酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）
に加熱溶解（１００℃）させ、加熱を３０分間維持す
る。３７℃に冷却したのち、攪拌させながら１０Ｕ/ml
の牛睾丸由来のヒアルロニダーゼを、滅菌された０．２
２μのメンブランフィルタを介して加える。２時間毎に
この操作を４回繰り返し（ヒアルロニダーゼの終濃度５
０Ｕ/ml）、更に一晩反応させる。１００℃で５分間加
熱し酵素を失活させる。そして、６００mlのアセトンを
攪拌させながら徐々に加え、低分子化したヒアルロン酸
を沈殿させ、アセトン洗浄により脱水させる。この状態
で、既にヒアルロン酸は微粉であるので、前記実施例１
ないし実施例２と同様な方法によりアセチル化ヒアルロ
ン酸を得る。

【００１３】本実施例においては、分子量１０kd程度又
はそれ以下の低分子量アセチル化ヒアルロン酸を得るこ
とが出来る。実施例５ 三角フラスコ内に酢酸約２００ｍｌを取り、これに分子
量２００万の微粉末ヒアルロン酸２ｇを分散させ、更に
ｐ−トルエンスルホン酸を４ｇを加え５０℃で４時間攪
拌しながら放置した。膨潤したところで、無水酢酸１０
０ｍｌを３０分かけて滴下したのち、５０℃で保ったま
ま２８時間攪拌しながら反応させた。反応液を水中に投
入し、繊維上に沈殿してきた反応精製物を１００倍量の
純粋で３回水洗後、真空乾燥してアセチル化ヒアルロン
酸を得た。図３に以上のようにして得たアセチル化ヒア
ルロン酸の¹Ｈ−ＮＭＲ分析結果が示されている。同図
において、（Ａ）〜（Ｆ）に移行するに従い、アセチル
化反応時間を短くしている。同図より明らかなように、
アセチル化反応時間が短い場合にはヒアルロン酸自体に
由来するＮ−アセチル基を示すピークが大きいが、反応
時間を長くするに従って他の部位に結合したアセチル基
を示すピークが顕著に増大し、該Ｎ−アセチル基の存在
量以上に他のアルコール性水酸基のアセチル化が進んで
いることが理解される。このように、本発明においては
アセチル基／Ｎ−アセチル基の比率が１以上となってお
り、従来事実上不可能であったアセチル化度１以上の高
アセチル化率ヒアルロン酸が得られている。

【００１４】尚、次の表１には前記図３に示した各高ア
セチル化率ヒアルロン酸の反応時間と概略アセチル化率
の関係が示されている。

【表１】 ──────────────────────────────────── アセチル化ＨＡ 反応時間 アセチル化度 水溶性 アルコール溶解性 ──────────────────────────────────── （Ａ） 168時間 3.1 × ○ （Ｂ） 74 2.9 × ○ （Ｃ） 32 2.5 △ △ （Ｄ） 20 2.0 △ △ （Ｅ） 8 1.5 △ × （Ｆ） 5 1.2 ○ × ──────────────────────────────────── 以上のようにして得られた高アセチル化率ヒアルロン酸
は、分子量あるいは修飾化率等によって著しく物性が異
なり、高分子量で中程度の修飾度のものは、少量の有機
溶剤の添加のより安定なゲルをつくる等、その化粧品基
剤、あるいはドラッグデリバリーシステムの基剤として
その応用が期待される。又、高分子量で高度アセチル化
等のものや、低分子量のものは、かなりの濃度の有機溶
剤に可溶であり、乳液などにも容易に配合され得る。そ
して、乳液等に配合された場合、使用時の滑らかさを増
すなど、種々の効果を発揮することが出来る。又、アセ
チル化等により脂溶性を増加させれば、表面が脂質膜で
ある角質層との親和性が増し、生体適合性を向上させる
ことが出来る。

【００１５】また、本発明にかかる高アセチル化ヒアル
ロン酸は、化粧品などに配合された場合にヒアルロン酸
の欠点でもあった曳糸性が著しく低下するという利点を
有する。尚、次の表２に高アセチル化率ヒアルロン酸
（アセチル化度約１．５）の各種溶媒に対する溶解性試
験の結果を示す。

【表２】

【００１６】

【発明の効果】以上説明したように本発明に係る高アセ
チル化率ヒアルロン酸は、温和な条件で各種分子量ヒア
ルロン酸にアセチル化率を各繰り返し構造において１以
上の割合で結合させることが出来る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１にかかるアセチル化ヒアルロン酸の
紫外部吸収スペクトル説明図である。

【図２】 実施例２にかかるアセチル化ヒアルロン酸の
赤外吸収スペクトル図である。

【図３】 実施例５にかかるアセチル化ヒアルロン酸の
反応時間とアセチル化率の時間を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 秋間 和雄 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式化１の構造を有する高アセチ
   ル化率ヒアルロン酸。 【化１】 なお、上記化１において、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄は水素ま
   たはエステル結合されたアセチル基を意味し、且つ平均
   すると各繰り返し構造においてＲ₁〜Ｒ₄の少なくとも１
   はアセチル基である。Ｒ₅は水素またはアルカリ金属原
   子を示す。
2. 【請求項２】 粉末状ヒアルロン酸を酢酸に懸濁し、触
   媒として無水トリフルオロ酢酸を加えて反応させること
   を特徴とする高アセチル化率ヒアルロン酸の製造方法。
3. 【請求項３】 粉末状ヒアルロン酸を酢酸に分散させ、
   ｐ−トルエンスルホン酸を加え、前記微粉末ヒアルロン
   酸を膨潤させ、更に無水酢酸を加えて反応させることを
   特徴とする高アセチル化率ヒアルロン酸の製造方法。