JPH0698653A - エキザカム属植物の種苗の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、品質の均一なエキザカム属植物の
種苗を大量に生産する方法を提供することを目的とす
る。 【構成】 次の（１）〜（３）の工程、（１）エキザカ
ム属植物の組織を培養し、カルスを誘導する工程、
（２）誘導したカルスを増殖する工程、（３）該カルス
から不定胚を形成させ、さらに不定胚から植物体を再生
する工程、からなることを特徴とする、エキザカム属植
物の種苗の生産方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エキザカム属植物の種
苗の大量生産方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】エキザカム属植物の繁殖には、種子繁殖
と栄養繁殖があり、栄養繁殖としてはいくつか知られて
いる。

【０００３】しかしながら、例えば、挿し木法では、苗
の活着率が低いことや形質が揃いにくい。

【０００４】また、エキザカム属植物の組織培養法に
は、不定芽培養法［ホートサイエンス（ＨｏｒｔＳｃｉ
ｅｎｃｅ）第１９巻 第２号 第２２４頁〜第２２５頁
（１９８４年）］が知られている。

【０００５】しかしながら、増殖の過程が明瞭に記載さ
れておらず、種苗の大量の生産方法とはいえない。

【０００６】一方、エキザカム属植物の属するリンド
ウ、エゾリンドウ、ムラサキセンブリなどのリンドウ科
植物では、組織片よりカルスを誘導してから不定胚を誘
導し、植物体に再生する方法［第１２回植物組織培養学
会大会シンポジウム講演要旨集第４６頁（１９９１
年）、園芸学会雑誌第６０巻別冊１第４５０頁〜第４５
１頁（１９９１年）、第９回植物培養学会大会シンポジ
ウム講演要旨集 第１５７頁（１９８５年）］が知られ
ている。

【０００７】しかしながら、エキザカム属植物では、組
織片より不定胚を誘導して植物体に再生する方法は知ら
れていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、品質の均一
なエキザカム属の種苗を大量に生産する方法を提供する
ことにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記した
目的を達成するために鋭意研究した。その結果、エキザ
カム属植物の組織を植物ホルモンを含む培地で培養して
得たカルスを増殖させ、固体培地上で不定胚を形成させ
て幼植物体を再生させるエキザカム属植物の種苗の大量
生産方法を見いだした。

【００１０】すなわち、本発明の要旨とするところは、
次の（１）〜（３）の工程、（１）エキザカム属植物の
組織を培養してカルスを誘導する工程、（２）誘導した
カルスを増殖する工程、（３）該カルスから不定胚を形
成させ、さらに不定胚から植物体を再生する工程、から
なることを特徴とする、エキザカム属植物の種苗の生産
方法にある。

【００１１】つぎに本発明の方法について説明する。

【００１２】本発明に用いられるエキザカム属植物は、
種としてExacum affine 、E.macranthum、 E.quinquenerui
um、 E.tetragonumが挙げられるが、これらの種や品種に
限定されるものではない。

【００１３】本発明の方法に用いる培地としては、例え
ばムラシゲ・スクーグ（以下「ＭＳ培地」という）、ガ
ンボルグのＢ５培地、ホワイト培地、ニッチ−ニッチ培
地、Ｎ６培地などの植物組織培養用の培地が挙げられ
る。これらの公知の培地組成に関しては、例えば、竹
内、中島、古谷著の「新植物組織培養」第３８６頁〜３
９１頁（１９７９年、朝倉書店発行）に記載されてい
る。

【００１４】本発明の方法の各工程では、これらの培地
の無機塩を所定濃度のままか、もしくは所定濃度を３分
の１または２分の１に希釈したものを用いればよいが、
特にＭＳ培地を用いて調製された培地が好ましい。

【００１５】本発明では植物ホルモンとしてオーキシン
類およびサイトカイニン類が使用される。そしてオーキ
シン類としては、インドール酢酸、α−ナフタレン酢酸
（以下「ＮＡＡ」という）、インドール酪酸、２，４−
ジクロロフェノキシ酢酸（以下「２，４−ＰＡ」とい
う）、３，６−ジクロロメトキシ安息香酸、４−アミノ
−３，５，６−トリクロロピコリン酸などが挙げられ
る。

【００１６】また、サイトカイニン類としては、ベンジ
ルアデニン（以下「ＢＡ」という）、カイネチン（以下
「ＫＩＮ」という）、ゼアチンなどが挙げられる。

【００１７】次に本発明のエキザカム属植物の種苗の生
産方法における（１）〜（３）の工程について詳細に説
明する。

【００１８】（１）カルスの誘導工程（第１工程） カルスの誘導工程に用いられるエキザカム属の植物体と
しては、例えば葉、茎、成長点、花梗、根などから採取
した組織片が利用でき、好ましくは葉片である。

【００１９】そして、これらの組織を７０％エタノール
溶液に１０秒間、次いで、有効塩素濃度が０．２％〜５
％、好ましくは１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に２分
〜３０分間、好ましくは１０分間浸漬し、殺菌処理す
る。次いで、この組織を取り出し、その表面に付着した
次亜塩素酸ナトリウムを滅菌水で３回洗浄後、これを無
菌条件下で切断して小切片とする。

【００２０】次に、ＭＳ培地の無機塩に、ショ糖などの
炭素源、オーキシン、サイトカイニンなどの植物ホルモ
ンを加え、ｐＨを４．０〜７．０に調整し、さらに、ゲ
ルライトなどのゲル化剤を添加後、オートクレーブで滅
菌し、カルス誘導培地を調製する。

【００２１】カルス誘導用培地に用いる植物ホルモン
は、オーキシンとサイトカイニンを併用するか、オーキ
シン単独で用ればよいが、好ましくは２，４−ＰＡを
０．２ｍｇ／ｌ（ｍｇ／リットル、以下同じ）〜１０．
０ｍｇ／ｌ、ＫＩＮを０．０１ｍｇ／ｌ〜１．０ｍｇ／
ｌ、さらに好ましくは２，４−ＰＡを４．０ｍｇ／ｌ、
ＫＩＮを０．１ｍｇ／ｌ添加して用いるのがよい。

【００２２】カルス誘導用培地の炭素源としては、ショ
糖、ブドウ糖などの糖類が挙げられるが、ショ糖を１０
ｇ／ｌ〜１２０ｇ／ｌ、好ましくは２０ｇ／ｌ〜５０ｇ
／ｌの濃度で用いるのがよい。

【００２３】カルス誘導用培地には、固体培地または液
体培地が使用できるが、好ましくは固体培地を使用する
のがよい。この場合、ゲル化剤としては寒天、アガロー
ス、ゲルライト（ゲランガム）、カラギーナンなどが用
いられるが、好ましくはゲルライトを０．１％〜２．０
％添加して使用するのがよい。

【００２４】このように調製したカルス誘導用培地に上
記により得た組織片を置床する。

【００２５】カルス誘導工程の培養温度は、１５℃〜３
０℃、好ましくは２５℃〜２８℃である。

【００２６】カルス誘導工程は、明所でも暗所でも培養
できるが、暗所で培養することが好ましい。暗所で培養
する場合、組織片の置床後３０日〜６０日間、好ましく
は５０日間培養することにより、不定胚形成能を持つカ
ルスが誘導される。

【００２７】（２）カルス増殖工程（第２工程） 誘導したカルスは、必要な量まで増殖させるためにカル
ス増殖用培地に移植して暗所で培養を行う。カルス増殖
用培地はカルス誘導用培地と同じ組織の培地を用いるこ
とができる。

【００２８】また、エキザカム属植物の品種によってカ
ルスの増殖効率が異なるので、増殖効率を高めるために
カルス誘導培地のオーキシン濃度とサイトカイニン濃度
を下げるか、またはオーキシン単独で添加した増殖用培
地を用いることもできる。使用されるオーキシン類、サ
イトカイニン類は、２，４−ＰＡやＫＩＮに限るもので
はない。

【００２９】培養温度は、１５℃〜３０℃、好ましくは
２５℃〜２８℃、培養期間は５日〜５０日間、好ましく
は３０日間である。

【００３０】カルス増殖用培地は、液体培地または固体
培地が用いられる。

【００３１】エキザカム属植物以外の多くの植物では、
カルスを移植し、継代培養するにつれて再分化能が低下
することが知られているが、本発明においては長期間カ
ルス増殖用培地で継代培養を続けてもカルスの植物体再
生能は一定のレベルに保持される。

【００３２】（３）不定胚形成および植物体再生工程
（第３工程） 増殖したカルスは、孔径１ｍｍのステンレス製ふるいを
用いて選別する。この場合、当該カルスの大きさは０．
０２ｍｍ〜１ｍｍ、好ましくは０．１２５ｍｍ〜０．５
ｍｍである。

【００３３】次いで、ＭＳ培地の無機塩に炭素源、ゲル
ライトを加えて再生培地を調製する。

【００３４】再生用培地の炭素源としては、ショ糖、ブ
ドウ糖などの糖類が挙げられるが、ショ糖を１０ｇ／ｌ
〜１２０ｇ／ｌ、好ましくは２０ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌの
濃度で使用するのがよい。

【００３５】また再生用培地は固体培地を使用するのが
よく、ゲル化剤として寒天、アガロース、ゲルライト
（ゲランガム）、カラギーナンなどが用いられるが、好
ましくはゲルライトを０．１％〜２．０％、好ましくは
１．０％添加して使用するのがよい。

【００３６】再生用培地の植物ホルモンは、植物ホルモ
ンを含まないか、添加する場合はサイトカイニンを単独
で用いるのがよく、その場合は、ＢＡを０．０１ｍｇ／
ｌ〜１ｍｇ／ｌ添加して用いるのがよい。

【００３７】再生用培地のｐＨは、ｐＨ４．０〜７．
０、好ましくはｐＨ５．８に調整すればよい。

【００３８】こうして得た再生用培地に、前記により得
た増殖カルスをあらかじめショ糖を含む液体のＭＳ培地
に懸濁し、その１ｍｌ（ミリリットル、以下同じ）（カ
ルスの数が２０〜１０００個、好ましくは５０〜１００
個を含む）を再生用培地に加えるとよい。

【００３９】次いで、このカルスを含む培地を１日に５
時間〜２０時間、好ましくは１６時間の照射（１００〜
１００，０００ルクス、好ましくは４０００ルクス）
下、置床後５日〜５０日、好ましくは１０日間培養する
ことにより、不定胚を得ることができる。さらに、この
不定胚を前記と同一組成の培地に移植して１０日間培養
すると幼植物体が再生する。

【００４０】また、再生工程の培養温度は、１５℃〜３
０℃、好ましくは２５℃〜２８℃である。

【００４１】

【実施例】次に本発明の実施例を示す。

【００４２】第１工程（カルス誘導工程） エキザカム（Exacum affine、品種：ロココ）の葉を７
０％エタノール溶液に１０秒間、次いで１％の次亜塩素
酸ナトリウム溶液に１０分間浸漬後、滅菌水で３回洗浄
する。滅菌した葉は、メスで１ｃｍの葉片に切り出し、
これを供試材料とする。

【００４３】このようにして得た葉片５片（１シャーレ
当り）は、ＭＳ培地の所定濃度の無機塩、ショ糖５％、
ゲルライト０．２％および表１に示した濃度の２，４−
ＰＡとＫＩＮを含有するカルス誘導用培地（ｐＨ５．
８）に置床する。

【００４４】次いで、２５℃、暗黒下で置床後３０日ご
とに前記と同一組成の培地で継代培養すると、培養３０
日後には白い砕けやすいカルスが誘導され始め、培養９
０日後には黄色の粒状のカルスが誘導される。この黄色
のカルスが不定胚形成能を持つカルスであり、このカル
スを次の工程に用いる。

【００４５】調査は、培養９０日後にカルスを誘導した
葉片数を調べ、下記式により、葉片１片当たりのカルス
誘導率（％）を求めた。その結果を表１に示した。

【００４６】

【数１】

【００４７】

【表１】

【００４８】第２工程（カルス増殖工程） 第１工程で得た直径約２ｃｍ（約４ｇ）のカルスを４等
分に分割する。次いで、ＭＳ培地の所定濃度の無機塩、
ショ糖５％、２，４−ＰＡ４ｍｇ／ｌ、ＫＩＮ０．１ｍ
ｇ／ｌ、ゲルライト０．２％を含有するカルス増殖用培
地（ｐＨ５．８）に、上記により得たカルス１ｇを置床
し、２５℃で３０日間、暗所で培養する。

【００４９】培養３０日後に１ｇのカルスから約４ｇの
カルスが得られる。

【００５０】第３工程（不定胚形成および植物体再生工
程） 第２工程で得たカルス１ｇを孔径１ｍｍのステンレス製
ふるいを用いて１ｍｍよりも小さいカルスを選び、これ
にＭＳ培地の無機塩（所定濃度を３分の１に希釈）、シ
ョ糖３０ｇ／ｌ（ｇ／リットル、以下同じ）を含む液体
培地（ｐＨ５．８）２００ｍｌを加えて、カルスを懸濁
する。

【００５１】次いで、ＭＳ培地の無機塩（所定濃度を３
分の１に希釈）、ショ糖３０ｇ／ｌおよび表２に示した
所定濃度のＢＡ、ゲルライトを含有する植物体再生用固
体培地（ｐＨ５．８）に、１シャーレ当たり上記により
得たカルス懸濁液を１ｍｌずつ置床する。置床直後、培
地上のカルスを数える。次いで、これを２５℃、１日に
明期（４０００ルクス）１６時間、暗期８時間で、２０
日間培養すると、培養１０日後頃から不定胚が形成さ
れ、培養２０日後には不定胚から発芽、発根した幼植物
体が得られる。

【００５２】調査は、培養２０日後に幼植物体に再生し
た固体数を調べ、下記式により植物体再生率（％）を求
めた。その結果を表２に示した。

【００５３】

【数２】

【００５４】

【表２】

【００５５】

【発明の効果】本発明の方法によれば、品質の均一なエ
キザカム属植物の種苗を大量に生産することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の（１）〜（３）の工程、（１）エキザ
   カム属植物の組織を培養して、カルスを誘導する工程、
   （２）誘導したカルスを増殖する工程、（３）該カルス
   から不定胚を形成させ、さらに不定胚から植物体を再生
   する工程、からなることを特徴とする、エキザカム属植
   物の種苗の生産方法。