JPH07100720B2 - コロニー刺激因子の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は人尿又は、人由来単球−マクロファージコロニ
ー形成刺激因子産生細胞若しくは人由来単球−マクロフ
ァージコロニー刺激因子遺伝子組換細胞の培養液から分
離され、哺乳動物の単球−マクロファージ系細胞のコロ
ニー形成を刺激する新規なコロニー刺激因子の製造法に
関するものである。

〔従来の技術〕

コロニー刺激因子（以下CSFと略記する）は、哺乳動物
の造血組織、例えば骨髄などに存在する造血幹細胞の分
化・増殖を刺激する造血因子であり、多くのCSFは糖蛋
白質から成っている。これまで、単球−マクロファージ
系幹細胞に作用する因子（Ｍ−CSF又はCSF−１）、顆粒
球−単球系幹細胞に作用する因子（GM−CSF）、顆粒球
系幹細胞に作用する因子（Ｇ−CSF）、更に顆粒球、単
球、赤血球及び巨核球に共通な多能性幹細胞に作用する
因子（Multi−CSF、インターロイキン−３又はIL−３）
の４種が知られている。

Multi−CSFを除く上記３種の人由来CSFは、それぞれの
アミノ酸配列をコードする遺伝子cDNAがクローニングさ
れており、蛋白質構造が明らかにされている［G.G.Wong
ら,Science,228巻,810〜815頁,1985年;E.S.Kawasaki
ら、Science,230巻,291−296頁、1985年;S.Nagataら,Na
ture,319巻,415−418頁,1986年］。

人尿中に存在するCSFとしては、単球−マクロファージ
系細胞に作用する因子（CSF−１又はＭ−CSF）［S.K.Da
s ＆ E.R.Stanly,Journal of Biological Chemistry,25
7巻,13679〜13648頁,1982年］、顆粒球コロニーを刺激
するHGI−糖蛋白質［特公昭60−30291号公報］及びCSF
−HU［K.Motoyoshiら,Blood,52巻,1012〜1020頁,1978年
及びBlood,60巻,1378〜1386頁,1982年］が報告されてい
る。

それらのうち、単球−マクロファージ系細胞に作用する
上記CSF−１は完全に鈍化され、またその蛋白質をコー
ドするcDNAがクローニングされている（上記、E.S.Kawa
sakiら）。

鈍化CSF−１の構造は、糖鎖を含む二本のポリペプチド
がジスルフィド結合により、生物学的に活性なホモ２量
体を形成している。この２量体はジスルフィド結合を還
元剤により切断することにより同一の２個のサブユニッ
トを生成する。この生物学的活性を有する糖蛋白質の、
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動
法により測定した分子量は、45,000〜60,000ダルトンで
ある。また２量体を形成するポリペプチドサブユニット
の糖鎖を除いた分子量は14,000〜17,000ダルトンであ
る。このCSF−１サブユニットのアミノ酸配列をコード
していると考えられるcDNAから推定されたアミノ酸数は
224個、分子量26,000ダルトンのポリペプチドである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、抗ガン剤化学療法による白血球減少
症、免疫不全及び骨髄移植等に治療効果がある、CSF−
１と同様に作用するが、理化学的にCSF−１とは区別さ
れる従来知られていなかった新規な糖蛋白CSFの製造法
を提供することにある。

即ち、本発明は、下記の理化学的性質を有し、且つ哺乳
動物の単球−マクロファージ系細胞のコロニー形成刺激
作用を有する糖蛋白よりなる新規なCSFの製造法を提供
する。

ａ）分子量 CSF−１と同様に還元剤により同一のサブユニット２個
に解離されるホモ２量体であり、ドデシル硫酸ナトリウ
ム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量
が70,000〜90,000ダルトンであって、還元剤で解離さ
せ、生物活性を消失させたサブユニットについてドデシ
ル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
測定した分子量は35,000〜45,000ダルトンである。

（ｂ）サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
214個のアミノ酸配列を有し、 122番目及び140番目のアスパラギン（Asn）はそれぞれ
アスパラギン（Asn）−Ｘ−スレオニン（Thr）又はセリ
ン（Ser）で表わされる典型的なＮ−グリコシド結合部
位を有する。ただしＸは任意のアミノ酸を表わす。

ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（pI）
は3.1〜3.7である。

ｄ）糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析し、糖鎖
の構成単糖として、マンノース、ガラクトース、Ｎ−ア
セチルグルコサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸が同
定された。

ｅ）円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部CDスペクトルは波長208n
m及び222nmにそれぞれ極少ピークがあり、α−ヘリック
ス構造を含んでいる。

ｆ）熱安定性 60±0.5℃で60分間加熱しても生物活性は失なわれな
い。

ｇ）赤外線吸収スペクトル 第３図に示す赤外線吸収スペクトルを有する。

本発明の新規なCSFの製造法とは、哺乳動物の単球−マ
クロファージ系細胞のコロニー形成刺激作用を有し以上
の理化学的性質を有するコロニー刺激糖蛋白質を用いて
免疫した哺乳動物の血清より、上記コロニー刺激糖蛋白
質に対する特異抗体を単離・精製し、該特異抗体を不溶
性支持体に結合させて抗体結合支持体を調製し、該抗体
結合支持体に上記コロニー刺激糖蛋白を含有する溶液を
接触させ、該溶液中に含まれるコロニー刺激糖蛋白質を
吸着せしめ、上記吸着抗体結合支持体よりコロニー刺激
糖蛋白質を溶出させることを特徴とするコロニー刺激糖
蛋白質因子の製造法である。

〔発明の具体的な説明〕

本発明のCSFの製造法は、次のようである。

（１）CSFの製造 本発明の製造法は、次の３つの工程からなる。以下順次
説明する。

コロニー刺激糖蛋白質に対する特異抗体（以下、抗
CSF抗体という）の調製 後述する参考例１に示されるような製造法又は、別個に
行なった本発明の製造法によって得られたCSFを用い
て、哺乳動物例えばウサギ、ヤギ、ヒツジ及びウマ等を
免疫する。即ち、本発明のCSFを0.1〜1.0mg/mlの濃度に
なるように生理食塩液に溶解して、フロイントの完全ア
ジュバントと等量混合し、哺乳動物の皮下へ、週１〜２
回、４〜８週間投与して免疫する。免疫動物の血中抗体
価が上昇したら、静注又は皮下注による追加免疫を行
い、追加免疫後３〜７日目に採血を行い、CSF抗血清を
採取する。採取した抗血清のCSFに対する抗体価は、後
述するCSF生物力価中和試験によって測定されるが、抗
血清中のCSF抗体価は、1ml当り５×10⁶単位以上のCSF生
物力価を中和する抗血清を選択することが望ましい。採
取した抗血清は、２回の硫安塩析及び１回のDEAE−セル
ローズクロマトグラフィー等によって、免疫グロブリン
Ｇ又はＭ画分の抗CSF抗体として精製する。また必要で
あれば、CSF又は抗CSF抗体と交錯反応を示す夾雑タンパ
ク質をリガンドとする抗原カラムへ抗CSF抗体を通液
し、抗CSF抗体のみを吸着するか又は夾雑タンパク質を
吸着させて、更に抗CSF抗体を精製する。

抗体結合支持体の調製工程 抗CSF抗体を結合し得る不溶性支持体は、抗体蛋白質のN
H₂−基又はCOOH−基と化学結合できる不溶性支持体であ
れば、公知のいずれのものでも使用できる。例えば、臭
化シアン活性化又はエポキシ化多糖体ゲル、フォルミル
化多糖体ゲル、アミノエチル化又はヒドラジド化ポリマ
ー等である。不溶性支持体と抗CSF抗体との結合反応
は、選択される不溶性支持体の結合基によって条件が異
なるので、結合反応の至適条件となるよう抗体を調整す
る。例えば、臭化シアン活性支持体の場合は、pH8〜10
の炭酸緩衝液へ、エポキシ化支持体の場合は、pH10以上
の溶液へ、またフォルミル化支持体の場合は、中性の溶
液へ、それぞれ抗体を溶解し、調整する。またその結合
反応の温度条件も不溶性支持体によって異なるが、本発
明の結合反応の場合は、25℃以下の低温で行なうのが望
ましい。特に臭化シアン活性化支持体の場合は、４℃以
下で行う。結合させる抗体量は、不溶性支持体1g（湿重
量）当り、10〜50mg、好ましくは20〜30mgであり、結合
反応時の抗体濃度を１〜４％（w/v）に調整する。結合
反応終了後、支持体に残った抗体非結合反応基を適当な
処理法で不活化し、抗体結合支持体を得る。

抗体結合支持体によるCSFの精製工程 抗体結合支持体を0.5〜1.0Mの塩、例えば塩化ナトリウ
ムを含むpH6〜８の緩衝液で洗浄する。洗浄した抗体結
合支持体は、カラムへ充填するか又は緩衝液に懸濁させ
る。前者はカラム式、クロマトグラフィー、後者は、バ
ッチ式クロマトグラフィーとして使用する。CSFを含有
する溶液は、例えば人尿濃縮液、CSF産生細胞培養上澄
液或いはCSF遺伝子組換え細胞培養上澄液などが用いら
れ、これをpH6〜８に調整し、次いで抗体結合支持体の
洗浄に使用した前記緩衝液と同一の緩衝液と平衡化させ
るか又は0.5〜1.0M濃度になるように塩化ナトリウムを
加え、この処理液と抗体結合支持体とを接触させる。接
触はカラム式又はバッチ式のクロマトグラフィーで行な
われ、カラム式クロマトグラフィーの場合は、室温以
下、好ましくは10℃以下で、流速５〜20ml/cm²・時間で
通液させ、CSFを抗体結合支持体のカラムへ吸着させ
る。吸着CSF量は、抗体結合支持体1g（湿重量）当り、5
00〜2,000万単位が望ましい。吸着させた後、上記緩衝
液を通液して夾雑物質を洗浄・除去する。バッチ式クロ
マトグラフィーの場合は室温又は10℃以下で上記処理液
と抗体結合支持体を混合し、１〜10時間攪拌する。攪拌
後、ガラス濾紙等で濾過し、抗体結合支持体を回収す
る。該抗体結合支持体を上記の緩衝液で洗浄して、夾雑
物質を完全に除去する。抗体結合支持体と特異的に吸着
したCSFは、抗源抗体複合体の解離後、例えばpH2〜３の
酢酸緩衝液、３〜4Mのチオシアン酸塩又は0.1〜0.2Mの
2,4−ジニトロフェノール等の溶液で抗体結合支持体か
ら溶出させる。カラム式クロマトグラフィーの場合は、
溶離液をカラムへ通液することによって、またバッチ式
クロマトグラフィーの場合は抗体結合支持体を溶離液へ
懸濁し、攪拌することによって、CSFを溶出させる。こ
こに得られるCSFは不純物が除去された純粋なCSFであ
る。本発明の製造法は、以上〜の工程よりなるが、
更に後述する実施例１〜３を示して、詳細に説明する。

（２）CSFの理化学的性状 以上のような製造法によって得られたCSFは次のような
理化学的性状を有している。尚、この理化学的性状の試
験には、後述する実施例１の方法により純化したCSFを
用いた。

（ａ）分子量 還元剤の非存在下に、Laemmli（Nature,227巻,680−685
頁,1970年）の方法によるドデシル硫酸ナトリウム・ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分子量を測定すると、
70,000〜90,000ダルトンであった。

次に、0.2Mメルカプトエタノールで還元し、同様の方法
で測定すると、分子量35,000〜45,000ダルトンのサブユ
ニットに解離した（第１図）。

第１図は、本発明の製造法によって得られたCSFのドデ
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動の泳
動図であり、Ａ〜Ｅは非還元（２量体）、F,Gは分子量
マーカー蛋白質、Ｈ〜Ｌは還元（サブユニット）を示
し、縦軸の数字は分子量（×10³ダルトン）を示す。

（ｂ）サブユニット蛋白質のアミノ酸配列 NH₂−末端アミノ酸配列は、純化CSFを気相アミノ酸シー
ケンサーで常法により分析した。次に純化CSFを6Mグア
ニジンで変性させ、モノヨード酢酸でアルキル化した
後、脱塩し、トリプシン消化及び臭化シアン分解を行な
った。トリプシン消化及び臭化シアン分解ペプチドをVy
dac C−18逆相高速液体クロマトグラフィーで分画し、
分解されたペプチド画分を得、各画分をそれぞれ気相ア
ミノ酸シーケンサーで分析し、ペプチド断片のアミノ酸
配列を分析した。トリプシン消化及び臭化シアン分解ペ
プチド断片のアミノ酸配列と本発明者らがクローニング
したmRNAの塩基配列から、サブユニット蛋白質のアミノ
酸一次構造を決定した。その結果は第１表に示すとおり
である。

NH₂−末端のアミノ酸であるグルタミン酸から149番目の
グルタミンまでは、公知のCSF−１と同一であるが、150
番目から214番目までの65個のアミノ酸は、公知のそれ
と全く異なっていた。

また、COO−末端のアミノ酸としては、サブユニット蛋
白質の分子量に応じ214番目にプロリンが検出された。1
22番目と140番目のアスパラギンは、Asn−Ｘ−Ser/Thr
の典型的なＮ−グリコシド結合構造を有し、この部位で
糖鎖を結合しているものと推定された。ここにＸは任意
のアミノ酸を示す。

（ｃ）糖鎖の構成単糖 ポリペプチドと結合している糖鎖の構成単糖は、加水分
解して遊離させた後、高速液体クロマトグラフィーで分
析した。アルドース、シアル酸は陰イオン交換カラム、
ヘキソサミンは陽イオン交換カラムでホウ酸緩衝液濃度
勾配溶出法で分画し、シアノアセタミド又はアルギニン
によるポストカラム標識した後、ケイ光法により同定し
た。本CSF分子に含有される糖鎖は不均一であり、定量
することは困難であったが、構成単糖としてマンノー
ス、ガラクトース、Ｎ−アセチルグリコサミン、Ｎ−ア
セチルガラクトサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸が
同定された。

（ｄ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法により、等電点を測定し
た結果、pIは3.1〜3.7であった。

（ｅ）円二色性（CD）スペクトル 円二色性分散計（JASCO社製Ｊ−600）で遠紫外部に於け
るCDスペクトルを測定した（第２図）。

第図２は本発明の製造法によって得られたCSFののCDス
ペクトルを示し、横軸は波長（nm）、縦軸は楕円率（md
eg）を示す。波長208nm及び222nmにおいて極少ピークが
みとめられ、本CSFの二次構造にα−ヘリツクス構造が
含まれているものと推定された。

（ｆ）熱安定性 本CSFを１μg/mlの濃度で、希薄緩衝液（pH7.0）に溶解
し、60±0.5℃で60分間加熱し、そのコロニー刺激活性
（後述）を測定したが、活性の低下はほとんど認められ
なかった。

（ｇ）赤外線吸収スペクトル 本CSFの凍結乾燥粉末について透過測定法（KBr窓）によ
りフーリエ変換赤外分光装置（Nicolet社製5DXC）を用
いて測定した赤外線吸収スペクトルは第３図に示すとお
りであった。第３図は横軸は波数（cm^-1）を縦軸は透過
率を示す。

本CSFは1650cm^-1、1201cm^-1及び1133cm^-1に強い吸収、1
537cm^-1、1432cm^-1及び1068cm^-1に中程度の吸収を示し
た。

本発明の製造法について、更に実験例を示して、詳細に
説明する。

（実験例1:ウサギを用いた抗CSF抗体の調製） 体重2.5〜3.0kgのウサギ（白色種）に対して、後述する
参考例１の製造法によって得られた本発明のCSFを0.4mg
/ml濃度となるように生理食塩液に溶解した溶液を等量
のフロイント完全アジュバントと混合させて、その0.5m
lを家兎背部皮下へ、週１回の間隔で４週間投与して免
疫し、５週目に静注によるブースター免疫を行った。ブ
ースター免疫投与後５日目に採血を行い、抗CSF血清を
得た。また、免疫期間中は、１週間隔で耳静脈採血を行
い、CSF抗体価の上昇推移を試験した。

抗CSF抗体価は、次のCSF生物活性中和試験より求めた。
即ち、採取した血清を生理食塩水で段階的に希釈し、そ
の0.5mlをCSF（2,000単位/ml、0.02μg/ml）溶液0.5ml
と室温で５分間混合させる。混合後、その0.1mlをマウ
ス骨髄細胞１×10⁵個、20％牛胎児血清及び0.3％寒天を
含むマッコイ5A培地へ加え、7.5％CO₂通気下、37℃で７
日間培養する。培養後、CSFによって形成されたコロニ
ーを計測する。そして抗CSF抗体価は、次の式で求め
た。

抗CSF抗体価（中和単位/ml）＝（血清非添加で形成され
たコロニー数）−（血清添加で形成されたコロニー数）
×（血清希釈倍数）×10CSFで免疫した３匹の家兎の血
中抗CSF抗体価の推移を表１に示した。

表１で示したNo.1とNo.3の家兎血清50mlを、次の操作に
より精製した。尚、精製は４℃で行った。抗血清50mlを
攪拌下に飽和硫安溶液を40％（v/v）になる様に加え、
抗体を沈澱させる。沈澱物を蒸留水に再溶解し、再び飽
和硫安溶液を33％（v/v）になるように加えて、抗体を
沈澱させる。沈澱を蒸留水へ溶解し、0.02Mトリス−塩
酸緩衝液（pH8.6）で透析した後、上記トリス−塩酸緩
衝液とあらかじめ平衡化させたDEAE−セルロースカラム
へ通液し、DEAE−セルローズ非吸着のIgG画分を集め
て、IgG画分の抗CSF抗体として精製した。得られた抗CS
F抗体は、それぞれ480mg及び460mgであった。

（実験例2.抗体結合支持体の調製） 不溶性支持体として、臭化シアン活性化セファローズ4B
（ファルマシア社製）及びフォルミル−セルロファイン
（チッソ社製）をそれぞれ用い、抗CSF抗体との至適な
結合条件を検討した。臭化シアン活性化セファローズ4B
を用いる場合は、抗CSF抗体を0.1M炭酸緩衝液（pH9.0）
へ溶解し、抗体溶液とした。臭化シアン活性化セファロ
ーズ4Bは、1mM塩酸溶液中で膨潤させ、0.1M炭酸緩衝液
で洗浄した後、吸引濾過して緩衝液を除き、臭化シアン
活性化セファローズ4Bゲル1g（湿重量）を50ml容三角フ
ラスコへ取った。

表２に示す４種の濃度の抗体溶液2mlを加え、４℃、18
時間振とうして、抗体との結合を行った。結合後、0.1M
炭酸緩衝液で洗浄し、次いで0.2Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.0）で、支持体の反応基を不活化した。

また、フォルミル−セルロファインを用いる場合は、抗
CSF抗体を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）へ溶解
して、抗体溶液とした。フォルミル−セルロファインを
蒸留水及び0.1Mリン酸ナトリウムで洗浄した後、吸引濾
過して緩衝液を除き、フォルミル−セルロファイン1g
（湿重量）を50ml容三角フラスコへ取った。表３に示す
４種の濃度の抗体溶液2mlを加え、室温で２時間攪拌
し、次いで7mgの水素化シアノホウ素ナトリウムを加
え、更に室温で10時間攪拌して抗体を結合させた。結合
後、0.2Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.0）で洗浄し、5mgの
水素化シアノホウ素ナトリウムを含む2mlのトリス−塩
酸緩衝液を加え、室温で４時間攪拌して反応基を不活化
させた。

以上の結果得られた臭化シアン活性化セファローズ4B及
びフォルミル−セルロファインの抗体結合量を表２及び
表３に示す。

効率良くかつ多量に不溶性支持体へ抗CSF抗体を結合さ
せる抗体濃度は、臭化シアン活性化セファローズ4B及び
フォルミル−セルロファインの場合ともに20〜30mg/ml
の濃度であった。低濃度の場合は、結合率は高いが抗体
結合量は少なく、また高濃度の場合は、抗体結合量は多
いが、結合率は低かった。

（実験例３・抗体支持体によるCSFの精製） 抗体結合支持体として、実施例１と同様にフォルミル−
セルロファインを不溶性支持体とする抗体結合量31mg/g
ゲルの抗体結合支持体を調製し、CSFとして人尿をDEAE
−セルローズ及びゲル濾過処理して得られた比活性２×
10⁵単位/mg（純度１％未満）の部分精製CSFを含有する
溶液を用い、バッチ式クロマトグラフィーによりCSFの
精製の検討を行なった。

抗体結合支持体を0.5M塩化ナトリウムを含む0.02Mリン
酸緩衝液（pH7.0）で洗浄し、吸引濾過した。

そして、このCSFを含有する溶液を予め上記のリン酸緩
衝液と平衡化させた。抗体結合支持体1gに対してCSFを
含有する溶液を表４の４種の添加量において加え、10℃
にて６時間攪拌した後、上記緩衝液で十分洗浄して、0.
2M酢酸−塩酸緩衝液（pH2.5）でCSFを溶出させた。

CSFを高回収率で精製するためには、表４に示した通
り、抗体結合支持体1g（湿重量）当り、CSFを0.6〜1.5
×10⁷単位負荷するのが適当であった。また、回収され
たCSFについて比活性及びSDS−PAGEによる純度試験を行
った。

その結果を表５に示す。

表５に示した通り、フォルミル−セルロファインによる
アフィニティ−クロマトグラフィーによってCSFの部分
精製品は少なくとも245倍に精製され、SDS−PAGEによる
純度は、90％以上の均一な糖蛋白質であった。

（３）CSFの生物学的活性 前記（２）項と同様に、このコロニー刺激活性及び比活
性の試験には、実施例１の方法により純化したCSFを用
いた。

（ａ）コロニー刺激活性及び比活性 本発明の製造法によって得られたCSFのコロニー刺激活
性は、マウス骨髄細胞による単層軟寒天ゲルでのコロニ
ー形成試験法で測定した。CSF試料を0.3％寒天、20％牛
胎児血清（FCS）及びマウス骨髄細胞１×10⁵個を含むMc
Coy′s5A培地1mlと混合し、7.5％CO₂通気下、37℃で７
日間培養した。培養後、50個以上の細胞集塊をコロニー
と判定し、形成されたコロニー数を計測した。コロニー
刺激活性は単位で表現し、１単位は１コロニーを形成さ
せるに必要なCSF量と規定した。また比活性は、CSF蛋白
質1mg当り形成されるコロニー数（単位）で表わした。
その結果、本発明のCSFは、5.2×10⁷単位/mg・蛋白質の
比活性を有していた。また形成されたコロニーをヘマト
キシリン−エオジン染色して形態学的に分類したとこ
ろ、95％以上のコロニーが単球−マクロファージから形
成されていた。

（ｂ）in vitro及びin vivoでのマウス骨髄単球−マク
ロファージ系幹細胞（CFU−Ｍ）の増殖に及ぼす促進作
用 ｂ−１）in vitro試験 C₅₇BLマウスの骨髄細胞を平板吸着法にて、非吸着骨髄
細胞とし、20％FCSを含むMcCoy′s5A培地へ１×10⁶個/m
lの濃度に添加し、本発明の製造法によって得られるCSF
を０（対照）、100単位/ml、500単位/ml、1,000単位/ml
及び2,000単位/mlの割合でそれぞれ加え、7.5％CO₂通気
下、24時間、37℃で培養した。培養後、各骨髄細胞を遠
心法で洗浄した後、同じ培地で５倍に希釈し、各群４枚
のシャーレに、それぞれCSF1,000単位、0.3％寒天及び2
0％FCSを含むMcCoy′s5A培地1mlに対して0.1ml添加し、
7.5％CO₂通気下、37℃で７日間培養した。培養後、50個
以上の細胞集塊を単球−マクロファージ系幹細胞（CFU
−Ｍ）と判定し、形成されたCFU−Ｍ数を計測した。そ
の結果は表６に示すとおりであつた。

表６に示すようにCSFの添加濃度に依存して、マウス骨
髄細胞中のCFU−Ｍ数は増加した。

ｂ−２）in vivo試験 C₅₇BLマウス（５匹／群）に対して体重1kg当り０（生理
食塩液）、80×10⁴単位、160×10⁴単位及び320×10⁴単
位CSFを１日１回、連続３日間腹腔内に投与した。投与
終了の翌日に、各マウスにより大腿骨骨髄及び脾臓を摘
出し、骨髄及び脾臓中の単球−マクロファージ系幹細胞
（CFU−Ｍ）数を、1,000単位のCSFを刺激因子とする前
記軟寒天平板法によるコロニー形成試験で測定した。そ
の結果は表７及び表８に示すとおりであった。

表７及び表８に示す如く、80×10⁴単位/kg体重のCSF投
与により、骨髄及び脾臓でのCFU−Ｍの増加が認めら
れ、160×10⁴単位/kg体重以上の投与では顕著な増加が
認められた。

以上のような理化学的性質及び生物学的活性を有する本
発明の製造法によって得られるCSFを公知の類似した物
質と比較すると次のとおりである。

本発明の製造法によって得られるCSFは、CSF−１と同様
に糖鎖を含む二本のポリペプチドがジスルフィド結合
し、生物学的に活性なホモ２量体から構成されていて分
子量は、70,000〜90,000ダルトンであり、CSF−１のそ
れよりも大きい。更に、本発明のCSFを構成しているサ
ブユニットのポリペプチドは、214個のアミノ酸を有
し、分子量35,000〜45,000ダルトンであり、CSF−１の
それの14,000〜17,000ダルトンよりも大きい。また、サ
ブユニットのアミノ酸配列をCSF−１と比較すると、NH₂
−末端の１番から149番目までのアミノ酸配列は同じで
あったが、150番から214番目までのアミノ酸配列はCSF
−１のcDNAから推定されるものと異なっており、CSF−
１遺伝子上にコードされていなかった。従って、本発明
の製造法により得られるCSFは、一部CSF−１と共通性を
有するが、遺伝子的にも、構造的にも、公知のCSF−１
とは別個な因子であることが判明した。

参考例１ 健常人の尿200lをpH8.5に調整し、沈澱物を濾過除去
し、分画分子量50,000ダルトンの限外濾過膜（アミコン
社、H10×50）で濃縮と脱塩を行った。次に、濃縮液をp
H7.0に調整し、密封容器中で60℃、10時間加熱殺菌し
た。殺菌後、遠心分離（5,000×g 30分間）して沈澱物
を除去した後、0.02Mリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化し
たDEAE−セルロースと混合し、吸着させた。DEAE−セル
ロースを0.02Mリン酸緩衝液、0.05M食塩添加0.02Mリン
酸緩衝液（pH7.2）で洗浄した後、0.25M食塩添加緩衝液
（pH7.2）で溶出させた。溶出液を限外濾過膜（アミコ
ン社H1P10）で濃縮して、Sephacryi S−300（ファルマ
シア社、φ４×80cm）を用い、1M硫安添加緩衝液（pH7.
2）でゲル濾過した。ゲル濾過での分子量範囲70,000〜1
50,000ダルトンの画分を上記1M硫安添加緩衝液で平衡化
したphenyl−Sepharose4Bカラム（ファルマシア社製、
φ２×20cm）に吸着させ、次いで0.5M硫安添加緩衝液
（pH7.2）で溶出させた。溶出液を限外濾過膜（旭化成
製、NM−３）で濃縮して、TSKG−3,000SWカラム（東洋
曹達製、φ４×600mm×２）で高速液体クロマトグラフ
ィーにかけ、分子量範囲70,000〜150,000ダルトンの画
分を得た。この画分を再度濃縮し、Hi−Pore PR−304
（バイオラド社製、φ４×150mm）の逆相カラムで0.1％
トリフルオロ酢酸を含む、アセトニトリル０−100％（p
H2.0）の直線濃度勾配による高速液体クロマトグラフィ
ーにかけ、CSFを溶出し、精製された比活性1.4×10⁸単
位/mg・蛋白質であって、表１に示すとおりの214個のア
ミノ酸配列よりなるサブユニット蛋白質の２量体からな
るCSFを得た。上記製造工程の各ステップにおけるCSFの
精製度は表９に示すとおりであった。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ 参考例１で得られたCSFで免疫され、抗体価が十分に上
昇したウサギ10羽より抗CSF抗血清を採取し、実験例１
の方法により精製された抗CSF抗体を約4g得た。抗CSF抗
体を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）中で透析し、20mg/ml濃
度に調整した。該抗体溶液200mlを、あらかじめ蒸留水
及び0.1Mリン酸緩衝液で洗浄した100gのフォルミル−セ
ルロファインへ加え、室温で２時間攪拌した後、水素化
シアノホウ素ナトリウム700mgを加えて、更に16時間攪
拌し、フォルミル−セルロファインと抗CSF抗体を結合
させ抗体結合支持体を調製した。結合後、0.2Mトリス−
塩酸緩衝液で洗浄し、更に水素化シアノホウ素ナトリウ
ム500mgを含むトリス緩衝液200mlを加え、室温で４時間
攪拌して、未反応基を不活化した。次いで抗体結合支持
体を0.5MNaClを含有する0.02Mリン酸緩衝液で十分洗浄
した。抗体結合支持体は、支持体1g当り、29.5mgの抗CS
F抗体を結合していた。次に、健常人尿1,000lを限外濾
過濃縮機で濃縮し、脱塩した後、DEAE−セルローズに吸
着させ、非吸着の夾雑物質を除去し、0.3MNaCl溶液で溶
出し、該溶出液に0.5M濃度になるよう塩化ナトリウムを
加えてCSFを含有する溶液を調製した。このCSFの比活性
は、２×10⁵単位/mgであった。上記抗体結合支持体100g
に対し、このCSFを含有する溶液（全量500ml）を加え、
10℃以下で一夜攪拌しバッチ式クロマトグラフィー処理
を行なった。攪拌後、ガラスフィルターで濾過して、抗
体結合支持体を集め、0.5MNaClを含有する0.02Mリン酸
緩衝液で該抗体結合支持体を十分に洗浄した。洗浄後、
0.2M酢酸緩衝液（pH2.5）500mlを加え、10℃、１時間攪
拌して、CSFを溶出した。溶出液のpHを7.0にした後、限
外濾過膜で濃縮・脱塩して、表１に示すとおりの214個
のアミノ酸配列よりなるサブユニット蛋白質の２量体か
らなる精製CSF約10mgを得た。精製CSFの比活性は5.2×1
0⁷単位/mg、SDS−PAGE法による純度は90％以上であっ
た。

実施例２ 実施例１で調製された抗体結合支持体と同一の抗体結合
支持体10gをカラム（φ15×100mm）へ充填して、1.0M N
aClを含有する0.02Mリン酸緩衝液（pH7.0）を通液して
洗浄した。このカラムを用いて、CSF産生細胞培養上清
液からのCSFの単離・精製を行った。CSF産生細胞とし
て、ヒト膵臓癌細胞（MIA−PaCa−２細胞と記す）を用
いた。MIA−PaCa−２細胞を５％牛胎児血清を含むダル
ベッコ（Dulbecco）のMEM培地で７日間培養し、その培
養上清液１を限外濾過膜で濃縮しCSFを含有する溶液
を調製した。このCSFの比活性は、４×10⁵単位/mgであ
った。この溶液100mlに対して塩化ナトリウムが1.0Mの
濃度になるように加えてから、10℃に於て、上記カラム
へ通液した。通液後、1.0M NaClを含有するリン酸緩衝
液でカラムを洗浄した後、3.5Mチオシアン酸ナトリウム
でCSFを溶出させた。溶出液を0.02Mリン酸緩衝液中で透
析した後、限外濾過膜で濃縮して、表１に示すとおりの
214個のアミノ酸配列よりなるサブユニット蛋白質の２
量体からなる約1mgの精製CSFを得た。この精製CSFは7.8
×10⁷単位/mg、SDS−PAGE法による純度は90％以上であ
った。

〔発明の効果〕

本発明の製造法において、CSF（前記〔発明の具体的な
説明〕の第（２）項において定義されている理化学的性
状を有しているCSF:以下本CSFと略記する）を含有する
人尿又はその他の溶液例えば本CSF産生細胞又は本CSF遺
伝子組換え細胞の培養液から本CSFを精製することがで
き、抗体結合支持体の使用により、多様な夾雑物質ある
いは生体因子と共存する溶液の中から本CSFを選択的に
簡便に単離、精製することができ、その中のヒト以外の
異種蛋白質の除去作用が優れているため、安価でかつ高
純度の本CSFを医薬品として供給できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の製造法によって得られたCSFのドデシ
ル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（SDS
−PAGE）の泳動図であり、第２図及び第３図はそれぞれ
本発明の製造法によって得られたCSFの遠紫外部CDスペ
クトル及び赤外線吸収スペクトルを示す。 第１図において、 Ａ〜Ｅ……非還元物（２量体） F,G……分子量マーカ蛋白質 Ｈ〜Ｌ……還元物（サブユニット）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山田 宗夫 神奈川県川崎市高津区久地752 栄テラス 205号 (72)発明者 横田 肇 東京都港区白金２−５−１−406 (72)発明者 氏家 邦夫 東京都大田区仲池上２−10−16 森永乳業 株式会社池上寮 審査官 今村 玲英子 (56)参考文献 国際公開87／6954（ＷＯ，Ａ)

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】哺乳動物の単球−マクロファージ系細胞の
   コロニー形成刺激作用を有し以下に示すａ）〜ｇ）の理
   化学的性質を有するコロニー刺激糖蛋白質を用いて免疫
   した哺乳動物より、1ml当り５×10⁶単位以上のコロニー
   刺激糖蛋白質生物力価を中和する抗血清を採取し、該抗
   血清より、上記コロニー刺激糖蛋白質に対する特異抗体
   を単離・精製し、該特異抗体を、20〜30mg/mlの濃度
   で、不溶性支持体に1g当り10〜50mg結合させて抗体結合
   支持体を調製し、該抗体結合支持体に上記コロニー刺激
   糖蛋白質を含有する溶液を接触させ、該溶液中に含まれ
   る上記コロニー刺激糖蛋白質を吸着せしめ、上記吸着抗
   体結合支持体より上記コロニー刺激糖蛋白質を溶出させ
   て、90％以上の純度、5.2×10⁷単位/mg・蛋白質以上の
   比活性を有する上記コロニー刺激糖蛋白質を得ることを
   特徴とするコロニー刺激糖蛋白質因子の製造法： ａ）分子量 同一のサブユニット２個から成るホモ２量体であって、
   ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気
   泳動で測定した分子量が70,000〜90,000ダルトンであ
   り、還元剤で解離させて生物活性を消失させたサブユニ
   ットについてドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルア
   ミドゲル電気泳動で測定した分子量は、35,000〜45,000
   ダルトンである； ｂ）サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
   214個のアミノ酸配列を有し、122番目及び140番目のア
   スパラギン（Asn）はそれぞれアスパラギン（Asn）−Ｘ
   −スレオニン（Thr）／セリン（Ser）で表わされるＮ−
   グリコシド結合部位を有し、ここでＸは任意のアミノ酸
   を示す； ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
   ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（pI）
   は3.1〜3.7である； ｄ）糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析した糖鎖
   の構成単糖は、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチ
   ルグリコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−
   アセチルノイラミン酸である； ｅ）円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部CDスペクトルは波長208n
   m及び222nmにそれぞれ極少ピークがあり、α−ヘリック
   ス構造を含んでいる； ｆ）熱安定性 60±0.5℃で60分間加熱しても生物活性は失なわれな
   い； ｇ）赤外線吸収スペクトル 赤外線吸収スペクトルにおいて、1650cm^-1、1201cm^-1及
   び1133cm^-1に強い吸収、1537cm^-1、1432cm^-1及び1068cm
   ^-1に中程度の吸収を有する。
2. 【請求項２】コロニー刺激糖蛋白を含有する溶液が、人
   尿、コロニー刺激糖蛋白質産生細胞の培養液、コロニー
   刺激糖蛋白質遺伝子産生細胞の培養液及びこれらの濃縮
   物よりなる群より選択されたものであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第（１）項に記載のコロニー刺激糖蛋
   白質因子の製造法。