JPH01272600A - 分化誘導因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、少な（とも、ヒト組織球性リンパ腫由来の単
芽球性株細胞［１−９３７およびヒト急性単球性白血病
株細胞ＴＨＰ−１に対して分化誘導活性を有する新規な
蛋白質に関する。

〔従来技術〕

骨髄性・単球住白血病患者から株化された種々の白血病
細胞株（ＭＬ−１，）ＩＬ−６０，Ｕ−９３７，ＴＨＰ
−１）は生体が産生ずる蛋白質分化誘導因子によりイン
ビトロで成熟細胞（マクロフｉ−ジ／頚粒球〉に分化誘
導される。

そして、これらの株化細胞を標的に分化誘導活性を有す
る蛋白質因子が探索され、ヒト末梢血白血球やヒト培養
細胞の培養上清がら数種の分化誘導因子の存在が明らか
になっている（特開昭６０−２８９３４、同６２−１６
９７３１　　、特願昭６１−２０３８８４　　）。

〔発明が解決しようとする課題〕

今回、ヒト肺由来線維芽細胞の培養上清中に従来より既
知の分化誘導因子とは異なる、新規な分化誘導因子が存
在することを見出し、これを単一蛋白にまで高度精製し
、その性状を明らかにした。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の分化誘導因子はヒト肺由来線維芽細胞の培養上
清中に存在する蛋白質であり、以下の性質を有する。

（ａ）分子量：２５０００±２０００ （還元下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による）（ｂ）等電点：
ｐＩ５．４±０．２ （等電点クロマトグラフィーによる） （ｃ）　Ｎ末端アミノ酸配列： ＶａｌＰｒｏＰｒｏＧ１ｙＧ１ｕＡｓｐＳｅｒＬｙｓＡ
ｓｐＶａｌＡ１ａ＾１ａＰｒｏＸＡｒｇＧｌｎＸ１ｅｕ
− （Ｘは未同定） （ｄ）生理活性： 少なくとも、ヒト組織球性リンパ腫由来の単芽球性株細
胞ｔｌ−９３７およびヒト急性単球性白血病株細胞ＴＨ
Ｐ−１に対して分化誘導活性を有する。

（ｅ）比活性：　５　ＸＩＯ”　〜１ＯｘｌＱ’ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｇ蛋白本発明の分化誘導因子は以下のような方
法で調製される。

（原料細胞） ヒト肺由来線維芽細胞として、好ましくは、ヒト肺由来
正常線維芽細胞をＳＶ４０等のウィルスで形質転換して
樹立した株化細胞Ｗｌ−２６ＶＡ４などを用いる。

（培養条件） 培地としては、例えばＲＰＭＩ−１６４０、ダルベツコ
（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｏｓ）　ＭＥＭ　、イーグルＭＥＭ
培地等が用いられ、当該培地中には０〜１０％の牛胎児
血清を添加してもよい。

培養温度は、室温〜３７℃（好適には３７℃）が好まし
く、さらに００２１〜１０％（好適には５％）、飽和水
蒸気中で培養されることが好ましい。培養時間は、通常
２〜７日間程度であり、その後、培養上清を回収する。

この培養上滑中に、本発明の分化誘導因子が産生されて
いる。

（精　製） 培養上清から本発明の分化誘導因子の精製する方法とし
ては、公知の方法、すなわち、遠心分離、透析、限外濾
過、塩析、ゲル濾過、吸着クロマト、等電点クロマト、
逆相クロマト等を適宜組合せることにより行なわれる。

具体的には以下のように行なわれる。

■シリカゲル処理 培養上清をシリカゲルに接触させ、吸着画分を回収する
。

吸着時にはｐＨ６〜８の緩衝液（例えば、リン酸ｕ！街
液など）、溶出時には２０〜６０％エチレングリ゛コー
ル、０．１〜２Ｍ塩化ナトリウムを含むｐｔ（６〜８の
緩衝液（例えば、リン酸緩衝液など）を用いる。

■ハイドロキシアパタイト処理 ■の溶出画分をハイドロキシアパタイトに接触させ、吸
着画分を回収する。

吸着時にはｐＨ６〜８の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液
など）、溶出時にはｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜ＩＭ
の直線型濃度勾配による緩衝液（例えば、リン酸緩衝液
など）を用いる。

■ゲル濾過 ■の溶出画分をゲル濾過処理し、活性画分を回収する。

ゲル濾適用担体としてはデキストラン系、ポリアクリル
アミド系、アガロース系、ポリスチレン系、ポリ酢酸ビ
ニル系等が挙げられる。溶出時には、０．１〜０．２Ｍ
塩化ナトリウムを含むｐＨ６〜８の緩衝液（例えば、リ
ン酸緩衝液など）を用Ｉｌ）る。

■等電点クロマト ■の溶出画分を等電点クロマト処理し、活性画分を回収
する。

等電点クロマト用担体としては陰イオン交換体（例えば
モノ−Ｐなど）等が挙げられる。接触時にはｐＨ６〜８
の緩衝液（例えば、イミダゾール−塩酸緩衝液など）を
、溶出時にはｐＨ３〜５の緩衝液（例えば、ポリバッフ
ァー７４−塩酸など）１こより形成されるｐＨ３〜８の
直線型ｐ）Ｉ勾配を用しする。

■逆相クロマト ■の溶出画分を逆相クロマトで処理し、活性画分を回収
する。

逆相クロマト用担体としてはＣ１系、ｃ、系、ｏＤｓ系
等が挙げられる。接触時にはｐＨ１〜３の溶媒（例えば
、トリフルオロ酢酸など）を、溶出時には、０〜８０％
のアセトニトリルを含むｐＨ１〜３の溶媒（例えば、ト
リフルオロ酢酸など）を用いる。

この場合、好ましくは、アセトニトリル□％から８０％
までの直線濃度勾配を用いる。

なお、上記の回収方法は本発明細胞分化誘導物質回収の
一例を示したにすぎず、勿論性の方法によって回収して
もよい。

〔作用・効果〕

かくして得られた分化誘導因子は単球性白血病細胞に対
して細胞分化誘導作用を示すものであり、化学用、薬理
学用の試薬として、また医薬品としても使用される。医
薬品として使用する場合には医薬品製造の通例技術にし
たがって、要すれば加熱処理、除菌濾過、凍結乾燥、分
注、製剤化を行えばよく、かくして新規な分化誘導因子
を含有する医薬品が提供される。

〔実施例〕

本発明をより詳細に説明するために、実施例を挙げるが
、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない
。

実施例 （１）分化誘導活性の測定 ヒト組織球性白血病細胞１１−９３７　を用いたＮＯＴ
　還元活性（特開昭６２−２５１６６４参照）で測定し
た。また他の骨髄性白血病細胞（ＭＬ−１、ＴＨＰ−１
）についても同様の活性を調べた。　活性の算出は以下
の通りである。

最大吸光度を示す分化誘導因子標品をスタンダードとし
て用い、その５０％吸光度値を示す活性を１　ｕｎｉｔ
とする。そして被検サンプルを段階希釈して未分化細胞
と培養し、ＮＢＴ反応後の吸光度を測定してスタンダー
ドの５０％吸光度値を示すところの被検サンプルの最大
希釈倍数を活性単位とする。

（２）産　生 ヒト正常線維芽細胞をＳＶ４０でトランスフオームし樹
立した株化細胞旧−２６Ｖ＾４（大日本製薬より購入）
を、アミノ酸溶液及びビタミン溶液を二倍濃度添加した
１０％牛脂児血清含有イーグルＭＥＭ培地にツスイ製）
で３７℃、７日間培養し上清を採取した。

（３）ｆｉ製 （ｉ）　　シリカゲル処理 培養上清を遠心（３０００ｒｐｌｎ　、　１５分）後、
限外濾過（分画分子量１万カツト）シた。リン酸緩衝液
（ｐ）ｌ　７　）で平衡化したシリカゲルを添加し、４
℃で一夜攪拌した。上清を除去した後、５６％エチレン
グリコール、１Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液（ｐ
）Ｉ　７　）を用いて４℃で３時間攪拌し、溶出画分を
回収した。

（ｉｉ）ハイドロキシアパタイト処理 （ｉ）の溶出画分を１０１１１Ｍ　’ｌｌ醋酸カリウム
緩衝液（ｐＨ６，８）で透析後、同緩衝液で平衡化した
ハイドロキシアパタイトに供した。溶出は０．０１〜０
．５Ｍ’Ｊン酸１カリウム緩衝液（ｐＨ６，８）の直線
型濃度勾配により行い、活性画分を回収した。

（ｉｉｉ）ゲル濾過 （ｉｉ）の溶出画分を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）Ｉ　７　）　で
平衡化したポリスチレン系ゲル濾過用カラム（ＴＳＫ−
Ｇ３０００ＳＷ　、東洋曹達社製）に供した。溶出は同
じ緩衝液を用い、活性画分を回収した。

（ｉｖ　）等電点クロマト （ｉｉｉ　）の溶出画分を２５ｍＭイミダゾール−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，４）に対して透析した後、同じ緩衝液
で平衡化した陰イオン交換体（Ｍｏｎｏ　Ｐ、　　ファ
ルマシア社製）に供した。溶出はポリバッファー７４−
塩酸（ｐＨ４、ファルマシア社製）を流すことにより形
成されるｐＨ７，４から３．７の直線型ｐＨ勾配により
行い、活性画分を回収した。

（ｖ）逆相クロマト （ｉｖ）の溶出画分を、０．１％トリフルオロ酢酸（ｐ
Ｈ２）で平衡化したＣ２系逆相用カラム（Ｂａｋｅｒｂ
ｏｎｄ　ＷＰ−Ｃ４、Ｊ、Ｔ、ベーカー社製）に供した
。溶出は０〜８０％アセトニトリル含有０．１％トリフ
ルオロ酢酸（ｐＨ２）を用いた直線型濃度勾配で行い、
活性画分を回収した。

精製結果を第１表に示す。

（４）性　状 （ｉ）分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法 本発明の分化誘導因子の一部（約０．５μｇ相当）を２
％ＳＯＳ、　０．３Ｍ　５ｕｃｒｏｓｅ含有０．０６２
５Ｍ　）リス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ６，８或いは同
バッファーに２％２−メルカプトエタノールを含んだバ
ッファーを添加し溶解して、室温で約３０分く前者バッ
ファー処理；非還元ＳＯＳ処理）或いは１００ｔ５分加
熱（後者バッファー処理：還元ＳＯＳ処理）後、５Ｏ３
−ＰＡＧＥに供した。泳動はＳＤＳ−ＰＡＧＥ　Ｐｈａ
ｓｔ　Ｇｅ１Ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇ−２５を用いたＰｈ
ａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ファルマシア製電気泳動装置
）で実施した。詳細はファルマシアマニュアルブックに
従った。泳動後、蛋白バンドは銀染色（銀染色キット、
和光製）により検出した。分子量マーカーとしてＰｈｏ
ｓｐｈｏｒｙｌａｓｅＢ（９４Ｋ）、　Ｂｏｖｉｎｅ　
ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕ＋ｎ１ｎ（６７Ｋ）、　Ｏｖａｌ
ｂｕｍｉｎ（４３Ｋ）、　Ｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙ
ｄｒａｓｅ（３０Ｋ）、　Ｔｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉ
ｔｏｒ（２０，１Ｋ）、　　α−Ｌａｃｔｏａｌｂｕｒ
ｎｉｎ（１４，４Ｋ）を用いた。その結果、還元下では
分子量２５にの位置に、また非還元下では分子量２７に
の位置にそれぞれ単一の蛋白バンドが検出された。

ゲル濾過法 前項（３）（ｊｉ）のゲル濾過法に準じて本発明の分化
誘導因子の分子量を分析したところ、分子量２万〜３万
０持胃に単一ピークとして得られた。

（ｊ）等電点 前項（３）（ｉｖ）の等電点クロマト法に準じて、本発
明の分化誘導因子の等電点を分析したところ、等電点ｐ
！は５．４であった。

（ｉｉｉ　）生物学的性状 本発明の分化誘導因子を用いて１１−９３７以外の骨髄
性白血病細胞株（急性骨髄性白血病由来ＭＬ−１細胞及
び急性単球性白血病由来ＴＨＰ−１細胞）二株について
分化誘導能を調べた。その結果ＴＨＰ−１ではＵ−９３
７（ε０５０；　０．２８ｎｇ／ｍｆ）と同程度（ＥＤ
５０；　０．２４ｎｇ／−）のＮＢＴ還元能が認められ
た。一方、ＭＬ−１においては同活性は認められなかっ
た（８０５０；　　＞１２５ｎｇ／ｍｌ）　、なお、Ｅ
　Ｄ　５０　（ｎｇ／ｍｌ）は５０％吸光度値を示す濃
度を意味する。

（ｉｖ）既知サイト力インとの関係 本発明の分化誘導因子のＬｌ−９３７細胞に対するＮＢ
Ｔ還元能（ＤＩＦ活性）は分化誘導能を有することが知
られている既知サイト力イン（ＴＮＦ　、　ＩＦＮ−β
。

ｒ　、　Ｐ−１００、ＩＬ−１α、β）に対する抗体で
は全く中和されなかった。

（ｖ）Ｎ末端アミノ酸配列 本発明の分化誘導因子４．７μｇを用いて、気相シーク
エンサーにかけ、エドマン分解法によりＮＨ２末端アミ
ノ酸からアミノ酸配列分析を行った。

その結果、本発明の分化誘導因子はＮ）１２末端Ｖａ１
から始まるシングルポリペプチドであることを確認した
。ＮＨ２末端から１８番目までのアミノ酸配列を以下に
示す。

Ｖａ　ＩＰｒｏＰｒｏＧ　Ｉ　ｙＧ　１ｕＡｓｐＳｅｒ
ＬｙｓＡｓｐＶａ　ＩＡ　ＩａＡ　１ａＰｒｏＸＡｒ　
ｇＧｌｎＸｌｅｕ−（Ｘは未同定）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト肺由来線維芽細胞の培養上清中に存在する蛋
   白質であり、以下の性質を有する分化誘導因子。 （ａ）分子量：２５０００±２０００ （還元下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による） （ｂ）等電点：ｐＩ５．４±０．２ （等電点クロマトグラフィーによる） （ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 （Ｘは未同定） （ｄ）生理活性： 少なくとも、ヒト組織球性リンパ腫由来 の単芽球性株細胞Ｕ−９３７およびヒト急性単球性白血
   病株細胞ＴＨＰ−１に対して分化誘導活性を有する。 （ｅ）比活性：５×１０＾６〜１０×１０＾６ｕｎｉｔ
   ｓ／ｍｇ蛋白（２）ヒト肺由来線維芽細胞が形質転換さ
   れた株化細胞である請求項（１）の分化誘導因子。