JPS63250400A - コロニ−刺激因子及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は人尿から分離され、哺乳動物の単球−マクロフ
ァージ系細胞のコロニー形成を刺激する新規なコロニー
刺激因子とその製造法に関するものである。

［従来の技術］ コロニー刺激因子（以下Ｃ８Ｆと略記する）は、１？Ｉ
ｉ　！ＰＬ動物の造血組織、例えば骨髄などに存在する
造血９？１１１胞の分化・増殖を刺ｍする造血因子であ
り、多くのＣ３Ｆは糖蛋白質から成っている。これまで
、単球−マクロファージ系幹細胞に作用する因子（Ｍ−
Ｃ８Ｆ又はＣ３Ｆ−１）、顆粒球−ｍ球系幹細胞に作用
する因子（ＧＭ−Ｃ８Ｆ）、顆粒球系幹細胞に作用する
因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ）、更に顆粒球、単球、赤血球及び巨
核球に共通な多能性幹細胞に作用する因子（Ｍｕ　１℃
１−Ｃ３Ｆ、インターロイキン−３又はＩＬ−３＞の４
種が知られている。

Ｍｕｌｔｉ　−Ｃ８Ｆを除く上記３種の人由来Ｃ８Ｆは
、それぞれのアミノ酸配列をコードする遺伝子ｃＤＮＡ
がクローニングされており、蛋白質構造が明らかにされ
ている［Ｇ、　Ｇ、　Ｍｏｎｇら、　５ｃｉｅｎｃｅ　
。

２２８巻、８１０〜８１５頁、１９８５年；［、Ｓ、Ｋ
ａｗａｓａｋ　ｉら、　５ｃｉｅｎｃｅ　、　　２３０
巻、２９１−２９６頁、１９８５年；　Ｓ、　Ｎａｇａ
ｔａら、　Ｎａｔｕｒｅ。

３１９巻、４１５−４１８頁、１９８６年］。

人尿中に存在するＣ８Ｆとしては、単球−マクロファー
ジ系細胞に作用する因子（Ｃ３Ｆ−１又はＭ−Ｃ８Ｆ）
［３，に、　ＤａＳ　＆　Ｅ、　Ｒ，５ｔａｎ＋ｃｙ　
。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　、　２５７巻。

１３６７９〜１３６８４頁、１９８２年］、顆粒球コロ
ニーを刺激するＨＧＩ−糖蛋白質［特公昭６０−３０２
９１号公報］及びＣ３Ｆ−ＨＵ　［に。

Ｈｏｔｏｙｏｓｈｉら、　Ｂｆｏｏｄ　、　５２巻、１
０１２〜１０２０頁、１９７８年及びＢｆｏｏｄ　、　
６０巻、１３７８〜１３８６頁、１９８２年］が報告さ
れている。

それらのうち、単球−マクロファージ系１８胞に作用す
る上記Ｃ３Ｆ−１は完全に純化され、またその蛋白質を
コードするｃＤＮＡがクローニングされている（上記、
Ｅ、　Ｓ、にａｗａｓａｋｉら）。

純化Ｃ３Ｆ−１の構造は、糖鎖を含む二本のポリペプチ
ドがジスルフィド結合により、生物学的に活性なホモ２
Ｍ体を形成している。この２伍体はジスルフィド結合を
還元剤により切断することにより同一の２個のサブユニ
ットを生成する。この生物学的活性を有する糖蛋白質の
、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳
動法により測定した分子量は、４５．０００〜６０，０
００ダルトンである。また２量体を形成するポリペプチ
ドサブユニットの糖鎖を除いた分子量（ま１４．０００
〜１７，０００ダルトンである。このＣ３Ｆ−１サブユ
ニツトのアミノ酸配列をコードしていると考えられるｃ
ＤＮＡから推定されたアミノ酸数は２２４個、分子量２
６，０００ダルトンのポリペプチドである。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明者らは人尿中に、Ｃ３Ｆ−１と同様に作用するが
、理化学的にＣ３Ｆ−１とは区別される従来知られてい
なかった新規な糖蛋白Ｃ８Ｆが存在することを見い出し
てこれを単離し、その理化学的及び生物学的性質を明ら
かにすることにより本発明を完成した。

本発明の目的は、抗ガン剤化学療法による白血球減少症
、免疫不全及びＪＲ髄移植等に治療効果がある新規なＣ
３Ｆとその製造法を提供することにある。

即ち、本発明は、下記の理化学的性質を有し、且つ哺乳
動物の単球−マクロファージ系細胞のコロニー形成刺激
作用を有する糖蛋白よりなる新規なＣ８Ｆを提供する。

ａ）分子量 Ｃ３Ｆ−１と同様に還元剤により同一のサブユニット２
個に解離されるホモ２ｆｆｉ体であり、ドデシル硫酸ナ
トリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した
分子量が７０，０００〜９０゜０００ダルトンであって
、還元剤で解離させ、生物活性を消失させたサブユニッ
トについてドデシル＠酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で測定した分子量は３５．０００〜４５
，０００ダルトンである。

０　サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２吊体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
２１４個乃至２３８ｇのアミノ酸配列を有し、 １２２番目及び１４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ）は
それぞれアスパラギン（Ａｓｎ＞−Ｘ−スレオニン（Ｔ
ｈｒ）又はセリン（Ｓｅｒ）で表わされる典型的なＮ−
グリコシド結合部位を有する。ただしＸは任意のアミノ
酸を表わす。

Ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（ｐＩ
）は３．１〜３．７である。

ｄｌ＆’ｌ鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析し、糖鎖
の構成単糖として、マンノース、ガラクトース、Ｎ−ア
セデルグルコサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸が同
定された。

ｅ）円二色性スペクトル 円二色性分散系による遠紫外部Ｃ’Ｄスペクトルは波長
２０８　ｎｍ及び２２２ｎｍにそれぞれ極少ピークがあ
り、α−へソックス構造を含んでいる。

ｆ）熱安定性 ６０±０．５℃で６０分間加熱しても生物活性は失なわ
れない。

ｇ）赤外線吸収スペクトル 第３図に示す赤外線吸収スペクトルを有する。

以上の理化学的性質を有することを特徴とするコロニー
刺激因子を含む人尿をｐＨ８〜９に調整し、不溶物を沈
澱せしめ、その上澄を限外濾過膜で脱塩し、少なくとも
２００倍以上に濃縮した後、ｐｌ＋を６．５〜７．５に
調整し、６０℃で１０時間加熱処理し、生ずる沈澱物を
遠心除去後、陰イオン交換体へ吸着させ、０．２〜０．
４Ｍ緩衝液で溶出させ、次いで１〜４Ｍ！ｉ衝液中でゲ
ル濾過して分子量７０．０００ダルトン以上の画分を回
収し、該画分を疎水性親和体に吸着させて０．５〜１Ｍ
の緩衝液で溶出させ、該溶出物を高速液体ゲル濾過にか
け、分子量７０．０００〜１５０．０００ダルトンの画
分を回収し、該画分をｐ１１１〜２に調整して逆相高速
液体クロマトグラフィーにかけ、有効成分を溶出せしめ
ることを特徴とするコロニー刺激因子の製造法である。

［発明の詳細な説明］ （１）Ｃ８Ｆの製造 本発明のＣ８Ｆは次のようにして製造される。

健康人の尿をｐＨ８，０〜９．０に調整し、尿中の粘性
物質を沈澱・除去し、その上澄を分子量１０゜０００〜
５０．０００ダルトンを通過させる限外濾過膜を用いて
濃縮と脱塩を行う。

少なくとも２００倍以上に濃縮（蛋白質１度として１％
（Ｗ／Ｖ）以上）しだ後ｐＨを６．５〜７．５に調整し
、６０℃で１０時間加熱処理（ウィルス等の不活化）す
る。形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオン交換体、
例えばＤＥＡＥ−セルロース等、に有効成分を吸着させ
る。

次に０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（ｐＨ６，５〜７．５
）で該イオン交換体を洗浄した後０．２〜０．４Ｍの緩
衝液（ｐＨ６，５〜７．５）で有効成分を溶出する。該
溶出液を必要ならば限外濾過膜で濃縮し、１Ｍ〜４Ｍの
塩類、例えば硫安、食塩等を含有する緩衝液（Ｄ１１６
．５〜７．５）で平衡化させたゲルｌｌ！ｆ過剤、例え
ば５ｅｐｈａｃｒｙｌｏＳ　−３００（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　？ＬＨ）でゲル濾過し、分子量範囲が７０．００
０〜１５０．０００ダルトンの画分を回収する。次に該
画分を上記１Ｍ〜４Ｍ塩含有緩衝液で平衡化させた疎水
性親和体、例えばＰｈｅｎｙｌ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ”
　（Ｐｈａｒ鴎ａｃｉａ社製）に吸着させ、０．５〜１
．０Ｍの塩含有緩衝液（ｐＨ１６，５〜７．５）で溶出
する。該溶出液を限外濾過膜で濃縮し、高速液体ゲル濾
過カラム、例えばＴＳＫＧ−３０００ＳＷ　（東洋１１
Ｊｊ）　でゲルＷ１”１４し、分子量範囲が７０．００
０〜１５０，０００ダルトンの画分を回収する。該画分
を再度、濃縮し、０．１％トリフルオロ酢Ｍ（ＴＦＡ）
溶液（ｐＨ１〜２）で平衡化した高速液体逆相カラム、
例えば、旧−ＰｏｒｅｏＲＰ　−３０４（バイオラド社
製）に吸着させ、０．１％ＴＦＡを含む溶剤、例えばア
セトニトリル又はインプロパツールの直線濃度勾配溶出
法により溶出する。このようにして得られたＣ８Ｆは、
比活性１×１０８単位／η・蛋白質以上を有する純粋な
物質である。

（２）Ｃ８Ｆの理化学的性状 以上のようにして製造された本発明のＣ８Ｆは次のよう
な理化学的性状を有している。尚、この理化学的性状の
試験には、実施例１の方、法により純化したＣ３Ｆを用
いた。

（２）　分子量 還元剤の非存在下に、Ｌａｅｌｌｌｌ　ｉ　　（Ｎａｔ
ｕｒｅ、　２２７巻、６８０−６８５頁、１９７０年）
の方法によるドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分子ｍを測定すると、７０，０００
〜９０，０００ダルトンであった。

次に、０．２Ｍメルカプトエタノールで還元し、同様の
方法で測定すると、分子量３５，０００〜４５．０００
ダルトンのサブユニットに解離した（第１図）。

第１図は、本発明のＣ８Ｆのドデシル硫酸ナトリウム・
ポリアクリルアミド電気泳動の泳動図であり、Ａ〜Ｅは
非還元（２量体）、Ｆ、Ｇは分子量マーカー蛋白質、Ｈ
−Ｌは還元（ナブユニット）を示し、縦軸の数字は分子
１（ｘ１０３ダルトン）を示す。

■　サブユニット蛋白質のアミノ酸配列ＮＨ２−末端ア
ミノ酸配列は、純化Ｃ３Ｆを気相アミノ酸シーケンサ−
で常法により分析した。

次に純化Ｃ３Ｆを６Ｍグアニジンで変性させ、モノヨー
ド酢酸でアルキル化した後、脱塩し、トリプシン消化及
び臭化シアン分解を行なった。トリプシン消化及び臭化
シアン分解ペプチドをＶｙｄａｃＣ−１８逆相高速液体
クロマトグラフィーで分画し、分解されたペプチド画分
を得、各画分をそれぞれ気相アミノ酸シーケンサ−で分
析し、ペプチド断片のアミノ酸配列を分析した。トリプ
シン消化及び臭化シアン分解ペプチド断片のアミノ酸配
列と本発明者らがクローニングしたｍＲＮＡの塩基配列
から、サブユニット蛋白質のアミノ酸−次構造を決定し
た。その結果は表１に示すとおりである。

ＮＨ２−末端のアミノ酸であるグルタミン酸から１４９
番目のグルタミンまでは、公知のＣ３Ｆ−１と同一であ
るが、１５０番目から２１４番目乃至２３８掻目までの
６５個乃至８９個のアミノ酸は、公知のそれと全く異な
っていた。

また、Ｃ０ｏ−末端のアミノ酸としては、サブ］、ニッ
ト蛋白質の分子量に応じ２１４番目句プロリンが、そし
て２３８番目にリジンが検出された。

１２２番目と１４０番目のアスパラギンは、Ａｓｎ−Ｘ
−３ｅｒ／Ｔｈｒの典型的なＮ−グリコシド結合構造を
有し、この部位で糖鎖を結合しているものと推定された
。ここにＸは任意のアミノ酸を示す。

（へ）　糖鎖の構成単糖 ポリペプチドと結合している糖鎖の構成単糖は、加水分
解してＭＩｌｌさせた後、高速液体クロマトグラフィー
で分析した。アルドース、シアル酸は陰イオン交換カラ
ム、ヘキソサミンは陽イオン交換カラムでホウ酸緩衝液
濃度勾配溶出法で分画し、シアノアセタミド又はアルギ
ニンによるポストカラム標識した後、ケイ光法により同
定した。本Ｃ３Ｆ分子に含有される糖鎖は不均一であり
、定恒することは困難であったが、構成単糖としてマン
ノース、ガラクトース、Ｎ〜ルアセチルグリコサミンＮ
−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチルノイラミン
酸が同定された。

（ロ）　等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法により、等電点を測定し
た結果、ｐ■は３．１〜３．７であった。

（ｅ）　　円二色性（ＣＤ）スペクトル円二色性分散計
（ＪＡＳＣＯ社製Ｊ−６００）で遠紫外部に於けるＣＤ
スペクトルを測定したく第２図）。

第２図は本発明のＣ８ＦのＣＤスペクトルを示し、横軸
は波長（ｎｉ）、縦軸は楕円率（ｍｄｅｇ　）を示す。

波長２０８　ｎｍ及び２２２　ｎｌにおいて穫少ピーク
がみとめられ、本Ｃ３Ｆの二次構造にα−ヘリックス構
造が含まれているものと推定された。

（ｆ’）　　熱安定性 木Ｃ３Ｆを１μｇ／１１！１！の濃度で、希薄緩衝液（
ｏＨ７，０）に溶解し、６０±０．５℃で６０分間加熱
し、そのコロニー刺激活性（侵述）を測定したが、活性
の低下はほとんど認められなかった。

（ロ）　赤外線吸収スペクトル 本Ｃ８Ｆの凍結乾燥粉末について透過測定法（ＫＢｒ窓
）によりツーり工変換赤外分光装置（Ｎｉｃｏｌｅｔ社
製５ＤＸｃ）を用いて測定した赤外線吸収スペクトルは
第３図に示すとおりであつ″た。

第３図の横軸は波数（ｕ−１）を縦軸は透過率を示す。

本Ｃ８Ｆは１６５０α　、１２０１ｎ−’及び１１３３
ｃｔｌｉ　に強い吸収、１５３７ａ　　、１４３２Ｇ−
１及び１０６８ｃｒＲ−’に中程度の吸収を示した。

＋３１ｃｓＦの生物学的活性 （２０コロニー刺激活性及び比活性 本発明のＣ８Ｆのコロニー刺激活性は、マウス骨髄細胞
による単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法で測定し
た。Ｃ３Ｆ試料を０．３％寒天、２０％牛脂児血清（Ｆ
ｅ２）及びマウス骨髄細胞１×１０５個を含むＨＣＣＯ
Ｖ’Ｓ　５　Ａ培地１１Ｉｌと混合し、７．５％ＣＯ２
通気下、３７℃で７日間培養した。培養後、５０個以上
の細胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニー数
を計測した。コロニー刺激活性は単位で表現し、１単位
は１コロニーを形成させるに必要なＣ８Ｆｆｆｔと規定
した。

また比活性は、Ｃ８Ｆ蛋白質１穆当り形成されるコロニ
ー数（単位）で表わした。その結果、本発明のＣ８Ｆは
、１．４×１０８単位／１１１９・蛋白質の比活性を有
していた。また形成されたコロニーをヘマトキシリン−
エオシン染色して形態学的に分類したところ、９５％以
上のコロニーが単球−マクロファージから形成されてい
た。

ｔｉ　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏでのマウ
ス骨髄単球−マクロファージ系Ｖ？細胞（ＣＦＵ−Ｍ）
の増殖に及ぼす促進作用 ｂ−１）　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験 Ｃ５，ＢＬマウスの骨髄細胞を平板吸着法にて、非吸着
骨１１ｉ１１１１１胞とし、２０％ＦＣ８を含むＨＣＣ
ｏｙ“Ｓ５Ａ培地へ１×１０６個／ｄの濃度に添加し、
本発明のＣ８ＦをＯ（対照）、１００単位／ｄ、５００
単位／ｄ、１．０００単位／Ｉｄ及び２．０ＯＯ１１位
／ｄｌの割合でそれぞれ加え、７．５％ＣＯ２通気下、
２４時聞、３７℃で培養した。培養後、各４！＃髄細胞
を遠心法で洗浄した後、同じ培地で５倍に希釈し、各群
４枚のシ５ヤーレに、それぞれＣ３Ｆ１．０００単位、
０．３％寒天及び２０％ＦＣ８を含むＨｃＣｏｙ’ｓ　
５Ａ培地１ｍに対して０．１−添加し、７．５％ＣＯ２
通気下、３７℃で７日間培養した。培養後、５０個以上
の細胞集塊を単球−マクロファージ系幹細ＩＩ！　（Ｃ
ＦＵ−Ｍ）と判定し、形成されたＣＦＵ−Ｍ数を計測し
た。その結果は表２に示すとおりであった。

表２　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏのＣＦＵ−Ｍ増殖？進作用（
注）８及び０は、それぞれ５％及び１％の危険率で有意
の差があることを示す。

表２に示すようにＣ３Ｆの添加濃度に依存して、マウス
骨髄細胞中のＣＦＵ−Ｍ数は増加した。

ｂ−２）　　ｉｎ　ｖｉｖｏ試験 Ｃ５７Ｂシマウス（５匹／群）に対して体ｔｔ　１　Ｋ
ｇ当り０（生理食塩液）、８０Ｘ１０’単位、１６０×
１０　単位及び３２０Ｘ１０’単位Ｃ８Ｆを１日１回、
連続３日間腹腔内に投与した。投与終了の翌日に、各マ
ウスにより大腿骨骨髄及び牌臓を摘出し、骨髄及び牌城
中の単球−マクロファージ系幹細胞（ＣＦＵ−Ｍ）数を
、１．０００単位のＣ８Ｆを刺激因子とする前記軟寒天
平板法によるコロニー形成試験で測定した。その結果は
表３及び表４に示すとおりであった。

表３　マウス骨髄ＣＦＵ−Ｍ増殖促進作用（注）＊＊は
１％の危険率で有意の差のあることを示す。

表４　マウス牌臓ＣＦＵ−Ｍ増殖促進作用（注）＊＊は
１％の危険率で有意の差のあることを示す。

表３及び表４に示す如（，８０Ｘ１０’単位／幻体重の
Ｃ３Ｆ投与により、骨髄及び牌臓でのＣＦＵ−Ｍの増加
が認められ、１６０Ｘ１０４単位／Ｋｙ体重以上の投与
では顕著な増加が認められた。

以上のような理化学的性質及び生物学的活性を有する本
発明のＣ８Ｆを公知の類似した物質と比較すると次のと
おりである。

本発明のＣ３Ｆは、Ｃ３Ｆ−１と同様に糖鎖を含む二本
のポリペプチドがジスルフィド結合し、生物学的に活性
なホモ２吊体から構成されていて分子量は、７０．００
０〜９０．０００ダルトンであり、Ｃ３Ｆ−１のそれよ
りも大きい。更に、本発明のＣ８Ｆを構成しているサブ
ユニットのポリペプチドは、少なくとも２１４個乃至２
３８個のアミノ酸を有し、分子１２４．０００〜２６゜
５００ダルトンであり、Ｃ３Ｆ−１のそれの１４゜００
０〜１７，０００ダルトンよりも大ぎい。また、サブユ
ニットのアミノ酸配列をＣ３Ｆ−１と比較すると、ＮＨ
２−末端の１番から１４９番目までのアミノ酸配列は同
じであったが、１５０番から２１４番目乃至２３８番目
までのアミノ酸配列はＣ３Ｆ−１のｃＤＮＡから推定さ
れるものと異なっており、Ｃ３Ｆ−１遺伝子上にコード
されていなかった。従って、本発明のＣ８Ｆは、一部Ｃ
３Ｆ−１と共通性を有するが、遺伝子的にも、構造的に
も、公知のＣ３Ｆ−１とは別個な因子であることが判明
した。また、前記公知の１−ＩＧＩ−糖蛋白質及びＣＳ
　Ｆ　−１−Ｉ　Ｕとは、生物学的活性及び理化学的性
状が全く異なっている。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ 健常人の尿２００１をＤ１１８．５に調整し、沈澱物を
濾過除去し、分画分子型５０．０００ダルトンの限外濾
過膜（アミコン社、Ｈ１０Ｘ５０）で濃縮と脱塩を行っ
た。次に、濃縮液をｐＨ７，０に調整し、密封容器中で
６０℃、１０時間加熱殺菌した。殺菌後、遠心分離（５
，０ＯＯｘａ　　３０分間）して沈澱物を除去した後、
０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２＞で平衡化したＤ
ＥＡＥ−セルロースと混合し、吸着させた。ＤＥＡＥ−
セルロースを０．０２Ｍリン酸緩衝液、０．０５Ｍ食塩
添加０．０２Ｍリン酸緩衝液（Ｄ１１７．２）で洗浄し
た後、０．２５Ｍ食塩添加緩衝液（ｐＨ７，２）で溶出
させた。溶出液を限外濾過膜（アミコン社Ｈ１Ｐ１０）
１”濃縮して、５ｅｐｈａｃｒｙｉ　Ｓ　−３００（フ
ァルマシア社、φ４　ｘ　８０　ｒｓ　）を用い、１Ｍ
硫安添加緩衝液（ｐＨ７，２）でゲル濾過した。ゲル濾
過での分子量範囲７０．０００〜１５０．０００ダルト
ンの画分を上記１Ｍ硫安添加緩衝液で平衡化したｐｈｅ
ｎｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂカラム（ファルマ
シア社製、φ２　ｘ　２０　ａｓ、　）に吸着させ、次
いで０．５Ｍ硫安添加緩衝液（ｐＨ７，２）で溶出さけ
た。溶出液を限外濾過膜（層化成製、ＮＭ−３）で濃縮
して、ＴＳＫＧ−３，０ＯＯ８Ｗカラム（東洋四速製、
φ４Ｘ６００ｍＸ２）で高速液体クロマ］−グラフィー
にかけ、分子量範囲７０，０００・〜１５０，０００ダ
ルトンの画分を得た。こノ画分ヲ再度濃縮し、旧−Ｐｏ
ｒｅ　　ＲＰ　−３０４（バイオラド社製、φ４Ｘ１５
０ｍｇ＋）の逆相カラムで０．１％トリフルオロ酢酸を
含む、アセトニトリル０−１００％（ｐＨ２，ｏ）の直
線濃度勾配による高速液体クロマトグラフィーにかけ、
Ｃ３Ｆを溶出し、精製された比活性１．４×１０８単位
／句・蛋白質のＣ８Ｆを得た。上記製造工程の各ステッ
プにおけるＣ８Ｆの精製度は表５に示すとおりであった
。

実施例２ 実施例１の方法で５ｃｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−３００を
ＴＳＫＧ−３，０ＯＯ８Ｗ　（東洋曹達、ＨＬＣ−８３
７）　、Ｄｈｃｎｙｌ　−５ｅｐｈａｒｏｓｃ　４　Ｂ
をＴＳＫｐｈｃｎｙｌ　−５ｐ　ｗ　（東洋曹達）にか
えて、全て高速液体クロマトグラフィーにより精製した
。得られたＣ３Ｆは、比活性１．５Ｘ１０８単位／ｑで
あり、回収率も実施例１と同等であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のＣ８ＦのドデシルｌｉｉｌｔＭナトリ
ウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）の泳動図であり、第２図及び第３図はそれぞれ本発明
Ｃ８Ｆの遠紫外部ＣＤスペクトル及び赤外線吸収スペク
トルを示す。 第１図において、

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）哺乳類動物の単球−マクロファージ系細胞のコロ
   ニー形成刺激作用を有し、次の理化学的性質を有するこ
   とを特徴とするコロニー刺激糖蛋白質。 ａ）分子量 同一のサブユニット２個から成るホモ２量体であつて、
   ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気
   泳動で測定した分子量が７０，０００〜９０，０００ダ
   ルトンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させ
   たサブユニットについてドデシル硫酸ナトリウム・ポリ
   アクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量は、３５
   ，０００〜４５，０００ダルトンである。 ｂ）サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
   ２１４個乃至２３８個のアミノ酸配列を有し、１２２番
   目及び１４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ） 【アミノ酸配列があります】 はそれぞれアスパラギン（Ａｓｎ）−Ｘ−スレオニン（
   Ｔｈｒ）／セリン（Ｓｅｒ）で表わされる典型的なＮ−
   グリコシド結合部位を有する、ここでＸは任意のアミノ
   酸を示す。 ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシユクロ
   ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（ｐＩ
   ）は３．１〜３．７である。 ｄ）糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析したとこ
   ろ、同定された糖鎖の構成単糖は、マンノース、ガラク
   トース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラ
   クトサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸である。 ｅ）円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部ＣＤスペクトルは波長２
   ０８ｎｍ及び２２２ｎｍにそれぞれ極少ピークがあり、
   α−ヘリックス構造を含んでいる。 ｆ）熱安定性 ６０±０．５℃で６０分間加熱しても生物活性は失なわ
   れない。 ｇ）赤外線吸収スペクトル 第３図に示す赤外線吸収スペクトルを有する。
2. （２）人尿をｐＨ８〜９に調整し、不溶物を沈殿せしめ
   、その上澄を限外濾過膜で脱塩し、少なくとも２００倍
   以上に濃縮した後、ｐＨを６．５〜７．５に調整し、６
   ０℃で１０時間加熱処理し、沈殿物を遠心除去後、陰イ
   オン交換体に吸着させ、０．２〜０．４Ｍ緩衝液で溶出
   させ、次いで１〜４Ｍ緩衝液中でゲル濾過して分子量７
   ０，０００ダルトン以上の画分を回収し、該画分を疎水
   性親和体に吸着させ、０．５〜１Ｍの緩衝液で溶出させ
   、該溶出物を高速液体ゲル濾過にかけ、分子量７０，０
   ００〜１５０，０００ダルトンの画分を回収し、該画分
   をｐＨ１〜２に調整して逆相高速液体クロマトグラフィ
   ーにかけ、有効成分を溶出せしめることを特徴とする哺
   乳類動物の単球−マクロファージ系細胞のコロニー刺激
   性糖蛋白因子の製造法。