JPH07103158B2 - コロニー刺激因子―ゼラチン結合体 - Google Patents

コロニー刺激因子―ゼラチン結合体

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JPH07103158B2
JPH07103158B2 JP2011770A JP1177090A JPH07103158B2 JP H07103158 B2 JPH07103158 B2 JP H07103158B2 JP 2011770 A JP2011770 A JP 2011770A JP 1177090 A JP1177090 A JP 1177090A JP H07103158 B2 JPH07103158 B2 JP H07103158B2
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colony stimulating
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義人 筏
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はコロニー刺激因子（CSF）とゼラチンとを含ん
でなる水溶性CSF−ゼラチン結合体並びにその製造方法
並びに水溶性CSF−ゼラチン結合体（以下CSF−ゼラチン
結合体と略）を用いる腫瘍細胞増殖抑制剤およびCSF−
ゼラチン結合体を用いる白血球減少症治療剤に関する。
〔従来の技術〕
CSFは哺乳動物の骨髄白血球前駆細胞に作用して、この
細胞の顆粒球又はマクロファージへの分化増殖を促進す
る物質であり、二層軟寒天培養法で骨髄白血球前駆細胞
を培養するとき、その前駆細胞が分化と同時に増殖して
好中球系顆粒球（以下「顆粒球」と称す）や単球、マク
ロファージからなるコロニーを形成するに必要な因子で
ある〔Ichikawa,Y.等;Proceedings of the National Ac
ademy of science 56巻、p488,1966年;Metcalf,D.;Expe
rimental Hematology 1巻 p185,1973年〕。
CSFには、さまざまな異なった形の活性体が知られてお
り、顆粒球・CSF（G-CSF）、マクロファージ・CSF（M-C
SF）、顆粒球・マクロファージCSF（GM-CSF）及び多機
能型CSF（multiCSF又はIL-3）がこれに含まれる。CSFの
これら白血球への分化増殖機能より、CSFは制癌剤投与
や放射線照射に伴う白血球減少症の治療への応用が期待
される。又、CSFは成熟マクロファージを活性化し、抗
腫瘍性マクロファージへ誘導する機能を有することが報
告されている〔Weinberg,J.B.等;Journal of Immunolog
y,121巻、p72,1978年、Ralph,P.and Nakoing,I.;Cellul
ar Immunology,105巻、p270,1978年〕。CSFはマクロフ
ァージ活性化因子として癌の治療、又ウィルスや細菌、
寄生虫による感染症の予防、治療に対しても応用が期待
される。
しかし、CSFのマクロファージ活性化作用は小さく、又
生体内で分解をうけやすく不安定であることから、上記
治療への応用のためにはマクロファージ活性化作用の増
強、生体内での安定性の増大等の改良が加えられねばな
らない。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、マクロファージ活性化作用が小さく生体内で
分解されやすいというCSFの性質を改善し、マクロファ
ージ活性化作用が増強されており且つ生体内での安定性
が増大しているCSFの投与系を提供しようとするもので
ある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは上記問題点を解決するため鋭意検討した結
果、CSFとゼラチンを縮合剤（水溶性カルボジイミド）
の存在下に結合して得るCSF−ゼラチン結合体が極めて
有利な特徴を有することが判明し本発明を完成した。
従って本発明はコロニー刺激因子とゼラチンとを含んで
なる水溶性コロニー刺激因子−ゼラチン結合体；コロニ
ー刺激因子とゼラチンを水溶性カルボジイミドの存在下
に結合することを特徴とする水溶性コロニー刺激因子−
ゼラチン結合体の製造方法；並びに前記の水溶性コロニ
ー刺激因子−ゼラチン結合体を用いる腫瘍細胞増殖抑制
剤および白血球減少症治療剤を提供する。
〔具体的な記載〕
本発明のCSF−ゼラチン結合体は例えば以下の方法で得
ることができる。
ゼラチンを溶解させたバッファー中へCSFを加えたの
ち、水溶性カルボジイミドを加え４℃、５〜30時間反応
させる。反応終了後透析又はゲル過により未反応CSF
及びゼラチンを除去し、更に無菌過することによりCS
F−ゼラチン結合体を得る。
本発明に用いるCSFとしてはM-CSF,GM-CSF,G-CSF及びmul
ti CSFのいずれでもよく、又これらの混合物でもよい。
CSFの製造方法として、細胞培養法、生体成分（尿、腹
水等）からの抽出法、遺伝子組換法が報告されているが
本発明の目的にはいずれの方法で作製したCSFも使用す
ることができる。特に特願昭61−258163号公報記載のヒ
ト尿より精製して得るM-CSF、特願昭62-291776号公報記
載の細胞培養上清より高度に精製して得たM-CSF等M-CSF
が実質的に不純物を含まない高純度CSFとして好適に用
いられる。
本発明に用いられるゼラチンとしては任意のものが用い
られるが、中でも動物の骨、皮フを酸又はアルカリで処
理して得られる粗コラーゲンを水で加熱、抽出して製せ
られるものが好ましい。
ゼラチンとCSFの配合比は特に限定されるものではない
が、ゼラチン1mg当たり102〜109CSF単位（1ng〜10mg）
が好ましい。
縮合剤水溶性カルボジイミドとしては１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４
−エチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホン
酸塩、１−ベンジル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド等が用いられ、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
が特に好適に用いられる。結合反応時のpHは７以下が好
ましい。
本発明のCSF−ゼラチン結合体は水溶性であり、そのま
まバッファー、生食水、注射用溶媒等希釈剤に溶解しア
ッセイ及び治療に用いることができるが凍結乾燥し、使
用時に希釈剤に溶解し用いてもよい。
本発明のCSF−ゼラチン結合体は原CSFに比べ次の優れた
性質を有する。
（１）腫瘍細胞増殖抑制作用を指標としたマクロファー
ジ活性化作用が原CSFに比べ顕著に高い。
（２）安定性が高くCSF−ゼラチン結合体により活性化
されたマクロファージは長期間腫瘍細胞増殖抑制作用を
維持する。
（３）減少した生体内白血球数の回復促進作用が高い。
〔発明の効果〕
本発明のCSF−ゼラチン結合体によって活性化されたマ
クロファージは腫瘍細胞増殖抑制作用を有することから
腫瘍細胞増殖抑制剤（制癌剤および白血球減少症治療
剤）として利用できる他、感染症の予防薬、治療薬とし
ての用途が期待される。
以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例1. ゼラチン〔アルカリ型、pI4.9、新田ゼラチン（株）
製〕10mgを溶解させたPBS（リン酸緩衝生理食塩水、pH
4.7〕10ml中へ、HK細胞由来M-CSF（以下HK-CSFと略）又
はヒト尿由来M-CSF（以下Hu-CSFと略）6.9×105単位を
入れ、４℃で10分間攪拌した。その後水溶性カルボジイ
ミド〔１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩〕、（ナカライテスク（株）
製）10mgを加え、更に４℃で19時間反応させた。次いで
反応液を透析、過滅菌しCSF−ゼラチン結合体を取得
した。なお125I-CSFを用いて同様の反応を行った結果、
CSFの回収率はHK-CSF,Hu-CSFの場合共42.5％であり又CS
F−ゼラチン結合体中のCSF含量は68940単位（ｕ）／ゼ
ラチン1mgであった。
実施例2. 実施例１で作製したCSF（HK-CSF）−ゼラチン結合体で
活性化したマクロファージのマウス腫瘍細胞P815 masto
cytomaに対する増殖抑制率を次の方法に従って測定し
た。24ウェルプレートに10％FCS含有RPMI−1640培地
（以下RPMI-FCSと略）に分散したチオグリコレート誘導
マウス腹腔マクロファージ５×105細胞/ml、並びにCSF
（HK-CSF）−ゼラチン結合体又はゼラチン等サンプルを
加え、２日間、又は３日間37℃にて５％ CO2−95％空
気雰囲気下でインキュベートした（マクロファージ活性
化）。次いでRPMI−1640培地でマクロファージを洗浄
し、サンプルを完全に除いた後、同ウェルに標的腫瘍細
胞P815 mastocytoma 2.5×104細胞/ml RPMI-FCSを加え3
7℃、48時間培養した。P815 mastocytomaの生細胞を測
定し、細胞増殖抑制率（％）を次式より算出した。
結果を第１表に示す。
以上のとおり、本発明のCSF−ゼラチン結合体はもとのC
SF又はゼラチンに比べて非常に高い腫瘍細胞増殖抑制作
用を示した。
又ゼラチンとHK-CSFを混合しただけではマクロファージ
活性化は全く生じなかった。
実施例3. 実施例１で作製したCSF（HK-CSF）−ゼラチン結合体で
活性化したマクロファージのマウス腫瘍細胞R1 fibrosa
rcomaに対する増殖抑制率を標的腫瘍細胞にR1 fibrosar
comaを用いる以外実施例２と全く同様の方法により測定
した。結果を第２表に示す。
実施例4. 実施例１で作製したCSF（Hu-CSF）−ゼラチン結合体で
活性化したマクロファージのマウス腫瘍細胞P815 masto
cytoma又はR1 fibrosarcomaに対する増殖抑制率を次の
方法に従って測定した。24ウェルプレートにRPMI-FCSに
分散したチオグリコレート誘導マウス腹腔マクロファー
ジ５×105細胞/ml、並びにCSF（Hu-CSF）−ゼラチン結
合体又はゼラチン等サンプルを加え、２日間、37℃にて
５％CO2−95％空気雰囲気下でインキュベートした（マ
クロファージ活性化）。次いでRPMI−1640培地でマクロ
ファージを洗浄し、サンプルを完全に除いた後、同ウェ
ルに標的腫瘍細胞P815 mastocytoma又はR1 fibrosarcom
a 2.5×104細胞/mlRPMI-FCSを加え37℃、48時間培養し
た。細胞増殖抑制率は実施例２と同様に算出した。結果
を第３表に示す。
実施例5. 実施例１で調製した種々の濃度のCSF（HK-CSF）−ゼラ
チン結合体で活性化したマクロファージのマウス腫瘍細
胞P815 mastocytoma増殖抑制率を各種濃度の原HK-CSFで
活性化したマクロファージの腫瘍細胞増殖抑制率と比較
して第１図に示す。
CSF（HK-CSF）−ゼラチン結合体は原HK-CSFの約2,000分
の１の濃度で同程度の細胞増殖抑制率を示した。
実施例6. 実施例１で調製したCSF（HK-CSF）−ゼラチン結合体又
は原HK-CSFによるマクロファージ活性化時間と活性化マ
クロファージによるマウス腫瘍細胞P815 mastocytoma増
殖抑制率の関係を第２図に示す。CSF（HK-CSF）−ゼラ
チン結合体によりマクロファージは短時間で活性化され
活性持続時間も延長した。
実施例7. Balb/Cマウス（８週令、メス）に５−フルオロウラシル
（シグマ社製）を150mg/kg（3.75mg/マウス）静脈内接
種し、骨髄抑制マウスを作製した。５−フルオロウラシ
ル投与４時間後より５日間（５回）CSF（Hu-CSF）−ゼ
ラチン結合体5.3×103u／マウス／回、又は原CSF（Hu-C
SF）２×105u／マウス／回を腹腔内に投与した。投与終
了後、経時的に眼窩静脈叢より採血、白血球数を定量し
た。（白血球の計測：血液中の赤血球をチュルク液で破
塊後、核数を計数した。）結果を第３図に示した。
第３図に示すようにCSF（Hu-CSF）−ゼラチン結合体未
投与マウスに比べ、CSF（Hu-CSF）−ゼラチン結合体又
は、原CSF（Hu-CSF）投与マウスの白血球数の回復が早
く、又CSF（Hu-CSF）−ゼラチン結合体は原CSF（Hu-CS
F）の50分の１の濃度で同程度の回復を示した。
参考例1.マウスHK細胞由来CSFの作製法 マウス繊維芽細胞由来HK-CSF（３×108細胞／ローラー
ボトル）を1mM塩化リチウム及び0.1％炭酸水素ナトリウ
ム含有DM-160培地中で37℃、３日間培養して得た培養上
清〔1ml当たり3500uのCSF力価を含む。CSF力価はin vit
roマウス骨髄培養法（Shikita,M.ら;Journal of Cellul
ar Physiollogy,109巻、p161−169,1981年）により測
定。CSFの力価はコロニー１個形成させる活性を１単位
（ｕ）とした〕を10％リン酸でpH4.5に調整し、生成す
る沈殿を除去、上清をDEAE−セルロースクロマトグラフ
ィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、セフ
ァクリルＳ−300及びスーパーローズ12カラムクロマト
グラフィーを用いて精製し、SDS-PAGE分析で分子量100,
000±1,000、比活性1.8×108u/mgタンパク〔タンパク質
の定量はBCA Protein Assay Reagent（Pierce Chemical
Company）（Smith,P.K.ら;Analytical Biochemistry 1
50巻 p76−85,1985年）を用いて測定〕の物性値を有
し、in vitroマウス骨髄培養法でマクロファージコロニ
ーのみを形成するM-CSFを取得した。
参考例2.ヒト尿由来CSFの作製法 成人男子尿10,000lを粒状含水珪酸（商品名“ホワイト
カーボン”徳山曹達（株）製）20kgに吸着したタンパク
質を１％アンモニア水で抽出後、硫酸アンモニウムを80
％飽和になるように添加し沈殿させた。沈殿物を水に溶
解後、pH4.5にて60℃、10時間加熱処理した。析出した
沈殿物を遠心分離して除去、上清を脱塩しCSF原液とし
た。原液をDEAE−セルロースクロマトグラフィー、フェ
ニルセファロースクロマトグラフィー、セファクリルＳ
−300クロマトグラフィー、スーパーローズ12クロマト
グラフィー、マイクロボンダパックC18カラムクロマト
グラフィーを用いて精製し、SDS-PAGE分析で分子量82,0
00±6,000、比活性1.3×108u/mgタンパクの物性値を有
し、in vitroマウス骨髄培養法でマクロファージコロニ
ーのみを形成するM-CSFを取得した。
【図面の簡単な説明】
第１図は種々の濃度のCSF（HK-CSF）−ゼラチン結合体
で活性化したマクロファージのin vitro細胞増殖抑制活
性を示す。図中−●−は原HK-CSF、−○−はCSF（HK-CS
F）−ゼラチン結合体、−□−は原HK-CSF＋ゼラチンに
ついての結果である。 第２図はCSF（HK-CSF）−ゼラチン結合体で種々の時間
活性化したマクロファージのin vitro細胞増殖抑制活性
を示す。図中−●−は原HK-CSF（1000μ）、−○−はCS
F（HK-CSF）−ゼラチン結合体（586u）についての結果
である。 第３図は、５−フルオロウラシル誘起骨髄抑制マウスに
CSF（Hu-CSF）−ゼラチン結合体5.2×103u／マウス／回
又は、原CSF（Hu-CSF）２×105u／マウス／回、５日間
（５回）投与後の白血球数変化をCSF未投与マウスと比
較した結果を示す。図中−●−は原CSF（Hu-CSF）、−
○−はCSF（Hu-CSF）−ゼラチン結合体投与群、そして
−△−はCSF未投与群についての結果を示す。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】コロニー刺激因子とゼラチンとを含んでな
    る水溶性コロニー刺激因子−ゼラチン結合体。
  2. 【請求項２】前記コロニー刺激因子がマクロファージ・
    コロニー刺激因子である請求項１に記載の水溶性コロニ
    ー刺激因子−ゼラチン結合体。
  3. 【請求項３】コロニー刺激因子とゼラチンを水溶性カル
    ボジイミドの存在下に結合することを特徴とする、請求
    項１に記載の水溶性コロニー刺激因子−ゼラチン結合体
    の製造方法。
  4. 【請求項４】請求項１に記載の水溶性コロニー刺激因子
    −ゼラチン結合体を用いる腫瘍細胞増殖抑制剤。
  5. 【請求項５】請求項１に記載の水溶性コロニー刺激因子
    −ゼラチン結合体を含んで成る白血球減少症治療剤。
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日本生化学会「蛋白質の化学（下）」東京化学同人（１９８７−５−２０）Ｐ．６２２，６６０

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