JPH07107535B2

JPH07107535B2 - 固定化方法

Info

Publication number: JPH07107535B2
Application number: JP24274686A
Authority: JP
Inventors: 正章木田; 伊佐子北端; 和久窪津; 由嗣佐方
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1986-10-13
Filing date: 1986-10-13
Publication date: 1995-11-15
Anticipated expiration: 2010-11-15
Also published as: JPS6396560A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、医薬品のドラグ・デリバリーや、臨床検査、
免疫学等の分野に於て用いられる、生理活性物質、免疫
活性物質等のリポソームへの固定化法に関する。

〔従来の技術及びその問題点〕

リポソームに抗原、抗体やその他の蛋白質等を固定化す
る方法としては、これまでに下記（ｉ）〜（iv）に示す
方法が知られている。

（ｉ）蛋白質に疎水性基を導入することにより、リポソ
ームに対して親和性をもたせ、これを別途調製したリポ
ソームに組み込む方法〔Biochimica et Biophysica Act
a,812,116（1985）等。〕。

（ii）リポソーム調製時に予め化学修飾が可能な基を有
する物質、例えば、糖脂質等を混合しておき、その糖を
酸化剤で酸化することによりアルデヒド基を生成させ、
これと蛋白質のアミノ基とを反応させてシッフ塩基を形
成させることによりリポソームと蛋白質を結合させる方
法〔Biochimica et Biophysica Acta.640,66（1981）
等。〕。

（iii）（ii）と同様にリポソーム調製時にSH基と反応
し得る官能基を持つ脂質を混合しておき、これに別途SH
化剤で修飾した蛋白質を反応させて組み込む方法〔Jour
nal of Immunorogical Method,75,351（1984）;Biochem
ical and Biophysical Research Communications,117,3
99（1983）；特開昭60−117159号公報等。〕。

（iv）リポソームも蛋白質もそのままで、各々の持つ官
能基同士を架橋剤又は縮合剤等を用いて結合させる方法
〔Biochemical and Biophysical Research Communicati
ons,89,1114（1979）;Liposome Technology,155,（198
3）,CRC Press等。〕。

しかしながら、これらの方法はいずれも、直接、架橋剤
等を用いて、リポソームの表面近くで反応させ固定化さ
せる方法なので、リポソームの膜構造が反応時に損傷を
受ける可能性が強く、また、リポソームマトリックスの
立体障害の為、蛋白質の結合率も必ずしも充分ではなく
効率が悪い。

〔発明の目的〕

本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、有用
物質を内包したリポソームに何ら損傷を与えることなく
（内包物を流出させることなく）、且つ、結合率も充分
で効率良く、免疫活性物質、生理活性物質等をリポソー
ムに固定化させる方法を提供することを目的とする。

〔発明の概要〕

上記目的を達成する為、本発明は下記の構成から成る。

「リポソームに抗原、抗体等の免疫活性物質やハプテ
ン、薬物等の生理活性物質を固定化するに当り、予めリ
ポソームに導入された分子量5,000〜30,000程度の両親
媒性化合物を介してこれを行うことを特徴とする免疫活
性物質又は生理活性物質のリポソームへの固定化法。」即ち、本発明者らは、リポソームに何等損傷を与えるこ
となく、且つ、結合率よく免疫活性物質、生理活性物質
等をリポソームに固定させる方法について鋭意研究を重
ねた結果、リポソーム調製時に予め分子量5,000〜30,00
0程度の両親媒性化合物を組み込んでおき、これを介し
て免疫活性物質、生理活性物質等を結合させれば必然的
にリポソーム表面と適当に離れた位置で固定化されるの
で、膜表面上の乱れも少なく、安定に且つ効率よく固定
化できることを見出し、本発明を完成するに到った。

リポソームに組み込む分子量5,000〜30,000程度の両親
媒性化合物としては、例えばリポ多糖（以下、LPSと略
す。）のような多糖類、疎水性基を有する天然のポリペ
プチド若しくは疎水性基を導入した天然のポリペプチド
（例えば、インシュリンのアミノ基又はカルボキシル基
に疎水性基を導入したもの。）、疎水性基を有する合成
ポリペプチド、末端を疎水化した親水性ポリマー等が挙
げられる。

これら両親媒性化合物を介して免疫活性物質、生理活性
物質等をリポソームに固定化させる方法としては、両親
媒性化合物の官能基を活性化して反応させる方法、１価
性架橋剤,2価性架橋剤等架橋剤を用いて結合させる方
法、結合剤を用いる方法等自体公知の方法が全て挙げら
れる。

本発明に係るリポソームの構成素材としては、天然レシ
チン（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）やジパ
ルミトイルフォスファチジルコリン（DPPC），ジミリス
トイルフォスファチジルコリン（DMPC），ジステアロイ
ルフォスファチジルコリン（DSPC），ジオレオイルフォ
スファチジルコリン（DOPC），ジミリストイルフォスフ
ァチジルエタノールアミン（DMPE），ジパルミトイルフ
ォスファチジルグリセロール（DPPG），ジミリストイル
フォスファチジン酸（DMPA）等のリン脂質の一種又は二
種以上、或はこれらとコレステロール類との混合系等、
既存のリポソームの製造法に於て通常用いられる構成素
材は全て使用可能なものとして挙げられる。また、本発
明に係るリポソームが内包可能な化合物としては、例え
ば、酵素、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド、ホルモ
ン、免疫グロブリン類等から、各種薬剤や抗生物質、更
には色素、螢光性物質、発光化合物等に到るまで、既存
のリポソームに封入可能な物質は全て挙げられる。

本発明に係るリポソームの調製法としては、従来からよ
く知られているボルテクスイング法、超音波法、界面活
性剤法、逆相蒸発法（REV法）、エタノール注入法、エ
ーテル注入法、プレ−ベジクル（Pre−Vesicle）法、フ
レンチプレスエクストルージョン（French Press Extru
sion）法、Ca²⁺融合法、アニーリング（Annealing）
法、凍結融解融合法、W/O/Wエマルジョン法等の方法
や、最近、S.M.Grunerら〔Biochemistry,24,2833（198
5）〕により報告されたStable Plurilamellar vesicle
法（SPLV法）などの方法、更には、内包量の大きな“巨
大リポソーム（Giant Liposome）”と言われているリポ
ソームを調製する方法など、自体公知のリポソームの調
製法が全て挙げられる。

本発明の方法により固定化が可能な免疫活性物質、生理
活性物質としては、例えば、α−フェトプロテイン、ガ
ン胎児性抗原（CEA），塩基性フェトプロテイン（BF
P），膵ガン胎児性抗原（POA）等の腫瘍マーカー、例え
ばストレプトリジンＯ（SLO）,C−反応性蛋白（CRP）等
の抗原蛋白、IgA,IgE,IgG,IgM等の免疫グロブリン等の
抗原或はこれらの抗原に対する抗体、更にはインシュリ
ン、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（hCG）等のホルモンや
各種薬物、ハプテン抗原或はこれらの抗体等既存のリポ
ソームに固定化し得る免疫活性物質、生理活性物質は全
て挙げられる。

本発明の方法の概略を、両親媒性化合物としてLPSを用
い、IgGを固定する場合を例にとって説明すると、以下
の如くなる。

即ち、先ずLPSを組み込んだLPS−リポソームを、LPSの
存在下前記自体公知の方法によりリポソームを調製する
特願昭61−115405号に記載の方法に従って調製する。

次にこのLPS−リポソームの懸濁液〔通常、グッドの緩
衝液（HEPES,PIPES,MES等）、トリス緩衝液、炭酸緩衝
液等の緩衝液に分散して使用。〕に酸化剤（例えば、過
ヨウ素酸カリウム、メタ過ヨウ素酸ナトリウム等）の緩
衝液溶液を加え、室温で１乃至数時間撹拌反応させると
LPSの糖鎖部分が酸化されてアルデヒド基が生成する。
反応液を遠心分離して上清を除き、再度適当な緩衝液に
懸濁させた後、これにIgGの緩衝液溶液を加えて室温で
数時間撹拌反応させるとシッフ塩基が形成される。次い
で、これに還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム、
水素化リチウムアルミニウム等）の緩衝液溶液を加えて
室温で１乃至数時間撹拌反応させ、然る後遠心分離して
上清を除けば、IgG結合リポソームが高収率で得られ
る。

以下に実施例を示すが、本発明はこれら実施例により何
等限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例1. IgG結合リポソームの製造（１）LPS−リポソームの調製 20mM DPPC−クロロホルム溶液325μ、20mMコレステロ
ール−クロロホルム溶液325μ、7.6mM DPPG−クロロ
ホルム／メタノール（95/5）溶液85μ、及びLPS（分
子量約20,000）2mgをクロロホルム／メタノール（1:1）
1mlに懸濁させて溶液を試験管に入れて混合し、ロータ
リーエバポレーターで溶媒を留去した。デシケーター中
で３時間乾燥させた後、クロロホルム、ジエチルエーテ
ルを夫々0.5mlずつ加え、アルカリフォスファターゼ
（以下、APと略称する。）溶液〔シグマ社製5,000unit/
2.5mlの0.01M,HEPES（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラ
ジン−Ｎ′−エタンスルホン酸）緩衝液溶液pH7.4〕80
μを添加し、ボルテックスミキサーで激しく振とうし
た。これを水浴中（43〜48℃）、ロータリーエバポレー
ターで濃縮して有機溶媒を留去し、0.01M HEPES緩衝液1
mlを加えてボルテックスミキサーで均一に分散するまで
撹拌した。これを遠沈管に移し、４℃、34,000rpmで40
分間×５回遠心分離を繰り返して遊離のAPを除去した
後、0.3M重炭酸ナトリウム緩衝液（pH8.2、72.5mM NaCl
含有）3mlを加えて懸濁させ、４℃で保存した。

（２）IgG結合リポソームの製造（１）で得たリポソーム懸濁液1mlにメタ過ヨウ素酸ナ
トリウム0.706mgを0.3M重炭酸ナトリウム緩衝液1ml（pH
8.2）に溶かした溶液を加え、室温で１時間撹拌した後
遠沈管に移し、４℃、34,000rpmで40分間×２回遠心分
離を行った。その間、洗浄は0.01M炭酸カリウム緩衝液
（pH9.5、72.5mM NaCl含有）で行い、最後に同緩衝液1m
lに懸濁させた。これにIgG3mgを上記と同じ緩衝液に溶
解した溶液を加え、室温で２時間撹拌した後、水素化ホ
ウ素ナトリウム0.6mgを0.01M炭酸カリウム緩衝液100μ
に溶解して加え、更に１時間撹拌した。これを遠沈管
に移し、４℃、34,000rpmで40分間×３回遠心分離を繰
り返した。この間、洗浄は0.01M HEPES緩衝液で行い、
最後に同緩衝液2mlに懸濁させて４℃で保存した。

実施例2. リポソームに導入するLPS量、酸化剤NaIO₄量及びカップ
リングさせるIgG量を変化させて実施例1.の方法に準じ
て３種のIgG結合リポソームを製造した。

結合IgG量（ローリー法により測定）及び内包物（AP）
の活性保持率を表１に示す。また表中のの場合のIgG
結合リポソームについて補体存在下でImmunolysisを行
った結果を第１図に示す。

比較例1. 実施例2.に於けるLPSを低分子糖脂質のガングリオシド
（分子量約2,000）に代える以外は実施例2.と全く同様
にして３種のIgG結合リポソームを製造した。結合IgG量
及び内包物の活性保持率を表１に併せて示す。また、表
中のの場合のIgG結合リポソームについて補体存在下
でImmunolysisを行った結果を第２図に示す。

尚、AP活性保持率は、IgG結合前後のAP内包量を界面活
性剤（Brij58）によるlysisから求め、算出した。

また、第１図及び第２図は、各々のIgG結合リポソーム
に、（ａ）各種濃度の補体を作用させたとき、及び、
（ｂ）500倍希釈の抗IgG抗体（抗血清）と各種濃度の補
体とを作用させたときにリポソームが損傷を受けて放出
するAP量に対応して基質であるｐ−ニトロフェニルリン
酸から生成するｐ−ニトロフェノールの410nmの吸光度
が補体の濃度に伴って変化する様子を示したもので、縦
軸は410nmに於ける吸光度を、また横軸は補体の濃度を
夫々表わす。また、実線−補体のみを作用させたとき、は抗体と補体とを作用させたときを夫々表わす。

表１より明らかな如く、LPSをスペーサーとする本発明
の方法によりIgGを固定化したリポソームは、低分子糖
脂質であるガングリオシドをスペーサーとしてIgGを固
定化した方法（前記従来法（ii）の方法）に比べてIgG
結合量が約２倍と高く、また、IgGとのカップリング反
応の前後に於ける内包APの活性保持率も後者のそれが30
〜45％程度であるのに対し、60〜80％と遥かに高い。こ
のことは、IgGを結合させるカップリング反応時にリポ
ソームが蒙る損傷が本発明の方法の場合には従来法と比
べて極めて少ないことを示している。

また、第１図及び第２図から明らかな如く、本発明の方
法によりIgGを固定化したリポソーム（LPSをスペーサー
として使用）ではImmunolysisが明らかに認められるの
に対し、低分子糖脂質であるガングリオシドをスペーサ
ーとしてIgGを固定化したリポソームではImmunolysisが
全く認められなかった。

実施例3.ペプチド結合リポソームの製造 REV法で調製したリポソーム（LPS2mg含有）懸濁液2mlに
メタ過ヨウ素酸ナトリウム2.14mgを0.3M重炭酸ナトリウ
ム緩衝液1mlに溶かした溶液を加え、室温で１時間撹拌
した後、遠沈管に移し、４℃、34,000rpmで40分間×２
回遠心分離を行った。その間、洗浄は0.01M炭酸カリウ
ム緩衝液で行い、最後に同緩衝液2mlに懸濁させた。こ
れにhCGのβ−サブユニットのＣ末端ペプチド（CTP118
〜145）3mg（約１μmol）を同緩衝液1mlに溶かした溶液
を加え、室温で２時間撹拌した後水素化ホウ素ナトリウ
ム0.9mgを同緩衝液100μに溶解して加え、更に１時間
撹拌した。これを遠沈管に移し、４℃、34,000rpmで40
分間×３回遠心分離を繰り返した。この間、洗浄は0.01
M HEPES緩衝液で行い、最後に同緩衝液2mlに懸濁させ、
４℃で保存した。

上記のようにして調製したペプチドリポソームのペプチ
ド含量をフルオレッサミンを用いた螢光測定法で求めた
結果、9.6nmolのペプチドが結合していることがわかっ
た。即ち脂質１μmol当り約1.5nmolのペプチドが結合し
ていることになる。

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明は、有用物質を内包したリポソ
ームに何ら損傷を与えることなく、且つ、極めて効率よ
く免疫活性物質、生理活性物質等をリポソームに固定化
させる方法を提供するものであり、本発明の方法により抗原又は抗体を固定化した場合に
は、抗体又は抗原と容易に抗原抗体反応してImmunolysi
sが起こるので、安定なImmunolyposomeとして免疫測定
への使用が可能である。

また、本発明の方法により抗原を固定化した場合に
は、このImmunolyposomeを免疫することにより抗体産生
に於ても有効である。

更に、本発明の方法により抗体を固定化した場合には
in vivoで標的細胞へ充分安定に内包物を取り込ませる
ことも期待できる。

等の点に顕著な作用効果を有するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例2.に於けるImmunolysisの結果を示す。
また、第２図は比較例1.に於けるImmunolysisの結果を
示す。第１図，第２図共に、縦軸は410nmに於ける吸光
度を、また、横軸は補体の濃度を夫々示し、実線−はIg
G結合リポソームに補体のみを作用させた場合、また、はIgG結合リポソームに補体と抗IgG抗体（抗血清）とを
作用させた場合を夫々示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リポソームに抗原、抗体等の免疫活性物質
や、ハプテン、薬物等の生理活性物質を固定化するに当
り、予めリポソームに導入された分子量5,000〜30,000
程度の両親媒性化合物を介してこれを行うことを特徴と
する免疫活性物質又は生理活性物質のリポソームへの固
定化法。
【請求項２】両親媒性化合物の親水性部分を活性化する
ことにより、或は架橋剤若しくは縮合剤を用いることに
よりこれを行う特許請求の範囲第１項記載の固定化方
法。
【請求項３】両親媒性化合物がリポ多糖（LPS）、疎水
性基を有する天然のポリペプチド若しくは疎水性基を導
入した天然のポリペプチド、疎水性基を有する合成ポリ
ペプチド、又は末端を疎水化した親水性ポリマーである
特許請求の範囲第１項又は第２項記載の固定化法。