JPH0717697B2 - カルボキシ含有ポリマーから製造された生物活性試薬、分析要素及び使用方法 - Google Patents
カルボキシ含有ポリマーから製造された生物活性試薬、分析要素及び使用方法Info
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- JPH0717697B2 JPH0717697B2 JP3242886A JP24288691A JPH0717697B2 JP H0717697 B2 JPH0717697 B2 JP H0717697B2 JP 3242886 A JP3242886 A JP 3242886A JP 24288691 A JP24288691 A JP 24288691A JP H0717697 B2 JPH0717697 B2 JP H0717697B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ポリマー粒子を用いて
製造された生物活性試薬に関する。本発明はまた、この
ような試薬を含む分析要素、ならびにそれらを用いるイ
ムノアッセイ及び特異的結合分析法に関する。さらに、
本発明はその試薬を用いる分析的精製方法に関する。本
発明は種々の臨床、診断、医学及び研究の目的に使用で
きる。
製造された生物活性試薬に関する。本発明はまた、この
ような試薬を含む分析要素、ならびにそれらを用いるイ
ムノアッセイ及び特異的結合分析法に関する。さらに、
本発明はその試薬を用いる分析的精製方法に関する。本
発明は種々の臨床、診断、医学及び研究の目的に使用で
きる。
【０００２】
【従来の技術】医学診療及び研究ならびに分析法及び診
断法において種々の液体、たとえば、生物学的液体中に
存在する化学的及び生物学的物質の迅速且つ正確な定量
が必要とされ続けている。たとえば、ヒトまたは動物の
体液または組織中における薬物、麻薬、ホルモン、ステ
ロイド、ポリペプチド、代謝産物、毒素、ウィルス、微
生物または核酸の存在は、有効な研究、診断または治療
のために迅速且つ正確に定量されなければならない。
断法において種々の液体、たとえば、生物学的液体中に
存在する化学的及び生物学的物質の迅速且つ正確な定量
が必要とされ続けている。たとえば、ヒトまたは動物の
体液または組織中における薬物、麻薬、ホルモン、ステ
ロイド、ポリペプチド、代謝産物、毒素、ウィルス、微
生物または核酸の存在は、有効な研究、診断または治療
のために迅速且つ正確に定量されなければならない。
【０００３】概ねこの２０年間において、種々の分析方
法が前記物質を検出するために開発された。一般に、技
術の状態は、分析及び診断方法が信頼性が高く、且つオ
ートメーションまたは医院または家庭で容易に使用でき
る試験キットによる使用に適当になる程度まで進歩し
た。このような方法の大部分は、検出すべき未知の物質
（「リガンド」として知られる）が対応する「レセプタ
ー」分子と特異的且つ優先的に反応する「特異的結合」
反応として公知であることによる。最もよく知られた特
異的結合反応は免疫反応体、たとえば、抗体と抗原（免
疫応答を生じる異物）との間で起こるが、他の特異的結
合反応（たとえば、アビジンとビオチン及び糖とレクチ
ンとの間におけるような）も公知である。
法が前記物質を検出するために開発された。一般に、技
術の状態は、分析及び診断方法が信頼性が高く、且つオ
ートメーションまたは医院または家庭で容易に使用でき
る試験キットによる使用に適当になる程度まで進歩し
た。このような方法の大部分は、検出すべき未知の物質
（「リガンド」として知られる）が対応する「レセプタ
ー」分子と特異的且つ優先的に反応する「特異的結合」
反応として公知であることによる。最もよく知られた特
異的結合反応は免疫反応体、たとえば、抗体と抗原（免
疫応答を生じる異物）との間で起こるが、他の特異的結
合反応（たとえば、アビジンとビオチン及び糖とレクチ
ンとの間におけるような）も公知である。
【０００４】特異的結合反応を使用する公知の方法は一
般に、未反応（及び一般に水溶性）物質が次に水不溶性
反応生成物（しばしば「複合体」と称する）から分離で
きるように反応体の１つもしくはそれ以上または両者が
ある型の固体支持体上に固定されることを必要とする。
さらに、このような固定された反応体は、このような物
質の混合物から目的の生物活性物質を除去するためにア
フィニティークロマトグラフィー中に使用できる。
般に、未反応（及び一般に水溶性）物質が次に水不溶性
反応生成物（しばしば「複合体」と称する）から分離で
きるように反応体の１つもしくはそれ以上または両者が
ある型の固体支持体上に固定されることを必要とする。
さらに、このような固定された反応体は、このような物
質の混合物から目的の生物活性物質を除去するためにア
フィニティークロマトグラフィー中に使用できる。
【０００５】これまで、生物活性物質はポリマー粒子、
動物及びヒトの赤血球、細菌細胞及び公知の他の固体物
質のような粒状支持体上に有利に固定されてきた。たと
えば、エポキシ基含有モノマーから製造された担体粒子
がＵＳ−Ａ−４，４１５，７００中に記載されている。
ポリマー粒子を担体支持体として使用する場合には、生
物活性物質は粒子表面上に反応性基を通して結合させ、
このような基はポリマー組成物からまたは粒子に結合し
た結合部分から提供される。ＵＳ−Ａ−４，４０１，７
６５はポリマー粒子上の多数の反応性基を記載してい
る。これに関する当業界のいくつかの進歩は特開昭６４
−５４２５９号公報及びＥＰ−Ａ−０ ３０８２３５中
に記載されている。これらの出願は、アクリル酸及びメ
タクリル酸によって提供される基のような表面カルボキ
シ基を含む種々の反応性表面基を有するポリマー粒子に
生物活性物質を結合させる種々の手段を記載している。
動物及びヒトの赤血球、細菌細胞及び公知の他の固体物
質のような粒状支持体上に有利に固定されてきた。たと
えば、エポキシ基含有モノマーから製造された担体粒子
がＵＳ−Ａ−４，４１５，７００中に記載されている。
ポリマー粒子を担体支持体として使用する場合には、生
物活性物質は粒子表面上に反応性基を通して結合させ、
このような基はポリマー組成物からまたは粒子に結合し
た結合部分から提供される。ＵＳ−Ａ−４，４０１，７
６５はポリマー粒子上の多数の反応性基を記載してい
る。これに関する当業界のいくつかの進歩は特開昭６４
−５４２５９号公報及びＥＰ−Ａ−０ ３０８２３５中
に記載されている。これらの出願は、アクリル酸及びメ
タクリル酸によって提供される基のような表面カルボキ
シ基を含む種々の反応性表面基を有するポリマー粒子に
生物活性物質を結合させる種々の手段を記載している。
【０００６】カルボキシル化ラテックス粒子はまた、Ｕ
Ｓ−Ａ−４，１８１，６３６中に示されるような診断試
薬を通過するのに使用されてきた。これらの粒子はアク
リル酸、メタクリル酸、イタコン酸、アコニチン酸、フ
マル酸またはマレイン酸のようなカルボキシル含有モノ
マーを用いて製造される。同様な粒子はＵＳ−Ａ−３，
８５７，９３１、ＵＳ−Ａ−４，１３８，３８３、ＵＳ
−Ａ−４，２６４，７６６中に記載されている。
Ｓ−Ａ−４，１８１，６３６中に示されるような診断試
薬を通過するのに使用されてきた。これらの粒子はアク
リル酸、メタクリル酸、イタコン酸、アコニチン酸、フ
マル酸またはマレイン酸のようなカルボキシル含有モノ
マーを用いて製造される。同様な粒子はＵＳ−Ａ−３，
８５７，９３１、ＵＳ−Ａ−４，１３８，３８３、ＵＳ
−Ａ−４，２６４，７６６中に記載されている。
【０００７】２種の市販モノマー、３−アクリルアミド
−３−メチルブタン酸及び２−アクリルアミド−２−ヒ
ドロキシ酢酸は重合されてポリマーを形成する。これら
のモノマーは一般に水溶性であり、親油性モノマーと共
重合するのが困難であり、重合して単分散粒子を形成す
るのが容易ではない。
−３−メチルブタン酸及び２−アクリルアミド−２−ヒ
ドロキシ酢酸は重合されてポリマーを形成する。これら
のモノマーは一般に水溶性であり、親油性モノマーと共
重合するのが困難であり、重合して単分散粒子を形成す
るのが容易ではない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】ポリマー表面上におけ
るタンパク質吸着の改良が、ポリマー技術をバイオテク
ノロジーにおけるイン・ビボ及びイン・ビトロの使用に
適用しようとする多くの研究者たちの共通の目的であっ
た。不所望のタンパク吸着が絶えず問題であった。たと
えば、非特異的吸着は、タンパク質の精製のためのアフ
ィニティークロマトグラフィーにポリマーを使用する場
合に重要な問題である。
るタンパク質吸着の改良が、ポリマー技術をバイオテク
ノロジーにおけるイン・ビボ及びイン・ビトロの使用に
適用しようとする多くの研究者たちの共通の目的であっ
た。不所望のタンパク吸着が絶えず問題であった。たと
えば、非特異的吸着は、タンパク質の精製のためのアフ
ィニティークロマトグラフィーにポリマーを使用する場
合に重要な問題である。
【０００９】ポリマー表面の改良は、物理的コーティン
グ、グラフト共重合、化学的処理及びプラズマガス放電
処理を含む多くの形態を取る。ポリマー表面の親水性
は、親水性の増加はいくつかのタンパク質の吸着を減少
させるが他の吸着は減少させないのでかなりの議論及び
研究の問題であった。前に引用した技術に示されるよう
に、反応性側鎖の使用はまた、当業界においてかなり配
慮されている。
グ、グラフト共重合、化学的処理及びプラズマガス放電
処理を含む多くの形態を取る。ポリマー表面の親水性
は、親水性の増加はいくつかのタンパク質の吸着を減少
させるが他の吸着は減少させないのでかなりの議論及び
研究の問題であった。前に引用した技術に示されるよう
に、反応性側鎖の使用はまた、当業界においてかなり配
慮されている。
【００１０】標準カルボキシ含有ポリマーから製造され
た標準試薬より進歩した新規な生物学的試薬を見い出す
ことが当業界において要求されている。生物学的物質が
結合したこのような試薬は研究ならびに種々の分析及び
診断方法において使用するのに特に有用であろう。
た標準試薬より進歩した新規な生物学的試薬を見い出す
ことが当業界において要求されている。生物学的物質が
結合したこのような試薬は研究ならびに種々の分析及び
診断方法において使用するのに特に有用であろう。
【００１１】
【課題を解決するための手段】公知試薬の場合の問題は （Ｉ）少なくともその表面が、 （ａ）コポリマーに疎水性を与える１種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー約６０〜約９
９．８モル％、 （ｂ）構造：
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー約６０〜約９
９．８モル％、 （ｂ）構造：
【００１２】
【化８】
【００１３】［式中、Ｒは水素、ハロまたは炭素数１〜
３のアルキルであり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンま
たはアンモニウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭
素、窒素、酸素及び硫黄原子からなる群から選ばれた８
〜５０個の原子を有する有機結合基である］によって表
される反応性カルボキシ基またはその塩を有する１種ま
たはそれ以上のエチレン系不飽和重合性モノマー約０．
２〜約４０モル％、ならびに （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）中において特定される以外
の１種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー０〜約１５モル％から誘導される反復単位を有す
るコポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）反応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒
子に共有結合した生物活性物質を含んでなる生物活性試
薬によって克服される。本発明はまた、前記生物活性試
薬を含んでなる分析要素を提供する。
３のアルキルであり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンま
たはアンモニウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭
素、窒素、酸素及び硫黄原子からなる群から選ばれた８
〜５０個の原子を有する有機結合基である］によって表
される反応性カルボキシ基またはその塩を有する１種ま
たはそれ以上のエチレン系不飽和重合性モノマー約０．
２〜約４０モル％、ならびに （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）中において特定される以外
の１種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー０〜約１５モル％から誘導される反復単位を有す
るコポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）反応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒
子に共有結合した生物活性物質を含んでなる生物活性試
薬によって克服される。本発明はまた、前記生物活性試
薬を含んでなる分析要素を提供する。
【００１４】さらに、特異的結合リガンドの定量方法は Ａ．（Ｉ）少なくともその表面が、 （ａ）コポリマーに疎水性を与える１種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー約６０〜約９
９．８モル％、 （ｂ）構造：
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー約６０〜約９
９．８モル％、 （ｂ）構造：
【００１５】
【化９】
【００１６】［式中、Ｒは水素、ハロまたは炭素数１〜
３のアルキルであり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンま
たはアンモニウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭
素、窒素、酸素及び硫黄原子からなる群から選ばれた８
〜５０個の原子を有する有機結合基である］によって表
される反応性カルボキシ基またはその塩を有する１種ま
たはそれ以上のエチレン系不飽和重合性モノマー約０．
２〜約４０モル％、ならびに （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）中において特定される以外
の１種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー０〜約１５モル％から誘導される反復単位を有す
るコポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）特異的結合リガンドまたはそのレセプターと特
異的に反応性である、反応性カルボキシ基またはその塩
を介して該粒子に共有結合した生物活性物質を含んでな
る生物活性試薬によって特異的結合リガンドまたはそれ
に対するレセプターの水不溶性特異的結合複合体を形成
し、そして Ｂ． 複合体の存在を検出する ことを含んでなる。
３のアルキルであり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンま
たはアンモニウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭
素、窒素、酸素及び硫黄原子からなる群から選ばれた８
〜５０個の原子を有する有機結合基である］によって表
される反応性カルボキシ基またはその塩を有する１種ま
たはそれ以上のエチレン系不飽和重合性モノマー約０．
２〜約４０モル％、ならびに （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）中において特定される以外
の１種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー０〜約１５モル％から誘導される反復単位を有す
るコポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）特異的結合リガンドまたはそのレセプターと特
異的に反応性である、反応性カルボキシ基またはその塩
を介して該粒子に共有結合した生物活性物質を含んでな
る生物活性試薬によって特異的結合リガンドまたはそれ
に対するレセプターの水不溶性特異的結合複合体を形成
し、そして Ｂ． 複合体の存在を検出する ことを含んでなる。
【００１７】本発明はまた、特異的結合リガンドと （Ｉ）少なくともその表面が前記コポリマーからなる水
不溶性粒子、及び （ＩＩ）反応性カルボキシ基またはその塩を介して粒子
に共有結合したリガンドのレセプター を含んでなる試薬の一成分として提供されるそのレセプ
ターの間において形成された水不溶性特異的結合複合体
の存在または量を検出することを含んでなる特異的結合
リガンドの定量のためのアッセイを提供する。
不溶性粒子、及び （ＩＩ）反応性カルボキシ基またはその塩を介して粒子
に共有結合したリガンドのレセプター を含んでなる試薬の一成分として提供されるそのレセプ
ターの間において形成された水不溶性特異的結合複合体
の存在または量を検出することを含んでなる特異的結合
リガンドの定量のためのアッセイを提供する。
【００１８】本発明の分析学的分離方法は、 Ａ． 生物活性物質の混合物を含む検体を、 （Ｉ）少なくともその表面が前記コポリマーから成る水
不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）検体混合物中の所定の生物活性物質に特異的で
ある、反応性カルボキシ基を介して該粒子に共有結合し
た特異的結合物質を含んでなるアフィニティークロマト
グラフィー試薬上に通過させ、そして Ｂ． 溶離剤中に残る複合体または物質を回収すること
を含んでなる。
不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）検体混合物中の所定の生物活性物質に特異的で
ある、反応性カルボキシ基を介して該粒子に共有結合し
た特異的結合物質を含んでなるアフィニティークロマト
グラフィー試薬上に通過させ、そして Ｂ． 溶離剤中に残る複合体または物質を回収すること
を含んでなる。
【００１９】
【作用】本発明の試薬の製造及びその製造方法に有用な
コポリマーの多くは、１９９０年６月１８日に出願され
たＵＳＳＮ５３９，７６８及び１９９１年２月１２日に
出願されたＵＳＳＮ６５４，１１２に対応する日本特許
出願中に詳述されている。
コポリマーの多くは、１９９０年６月１８日に出願され
たＵＳＳＮ５３９，７６８及び１９９１年２月１２日に
出願されたＵＳＳＮ６５４，１１２に対応する日本特許
出願中に詳述されている。
【００２０】コポリマーは以下の構造：
【化１０】
【００２１】［式中、Ｒは水素、ハロまたは炭素数１〜
３のアルキルであり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンま
たはアンモニウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭
素、窒素、酸素及び硫黄原子からなる群から選ばれた８
〜５０個の原子を有する有機結合基である］を有する１
種またはそれ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーか
ら誘導された反復単位を必須成分として有する。このよ
うなモノマーを１つだけ使用して各コポリマーを製造す
るのが好ましいが、所望ならばモノマーの混合物を使用
できる。
３のアルキルであり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンま
たはアンモニウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭
素、窒素、酸素及び硫黄原子からなる群から選ばれた８
〜５０個の原子を有する有機結合基である］を有する１
種またはそれ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーか
ら誘導された反復単位を必須成分として有する。このよ
うなモノマーを１つだけ使用して各コポリマーを製造す
るのが好ましいが、所望ならばモノマーの混合物を使用
できる。
【００２２】さらに詳しくは、前記構造において、Ｒは
水素、ハロ（たとえば、クロロまたはブロモ）または炭
素数１〜３のアルキル（たとえば、メチル、エチル、イ
ソプロピル及びｎ−プロピル）である。より好ましく
は、Ｒは水素またはメチルである。
水素、ハロ（たとえば、クロロまたはブロモ）または炭
素数１〜３のアルキル（たとえば、メチル、エチル、イ
ソプロピル及びｎ−プロピル）である。より好ましく
は、Ｒは水素またはメチルである。
【００２３】また、Ｍは水素、アルカリ金属イオン（た
とえば、リチウム、ナトリウム及びカリウム）またはア
ンモニウムイオン（たとえば、アンモニウム、テトラメ
チルアンモニウム及びテトラエチルアンモニウム）であ
る。好ましくは、Ｍは水素またはアルカリ金属イオン、
特に好ましくは、水素またはナトリウムである。
とえば、リチウム、ナトリウム及びカリウム）またはア
ンモニウムイオン（たとえば、アンモニウム、テトラメ
チルアンモニウム及びテトラエチルアンモニウム）であ
る。好ましくは、Ｍは水素またはアルカリ金属イオン、
特に好ましくは、水素またはナトリウムである。
【００２４】Ｌが鎖中に８〜５０個の炭素、窒素、酸素
または硫黄原子の組合せを有する有機結合基である。結
合は、前記ヘテロ原子またはヘテロ原子含有基、たとえ
ば、カルボニル、スルホニル、イミノ及び公知の他の基
によって結合したかまたは終了したアルキレン、アリー
レン、アルキレンアリーレン、アリーレンアルキレン及
び同様な基のような２個またはそれ以上の二価炭化水素
基を含んでなる。このような炭化水素基は１個（たとえ
ば、メチレン）〜１２個の炭素原子を有することがで
き、１個またはそれ以上のアルキル基（好ましくは炭素
数１〜１２個のアルキル基、たとえば、メチル、エチ
ル、イソプロピル、ヘキシル及びオクチル）、アルコキ
シ（好ましくは炭素数１〜１２個のアルコキシ、たとえ
ば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔ−ブトキシ及
びオクチルオキシ）、シクロアルキル（好ましくは炭素
数４〜６のシクロアルキル、たとえば、シクロブチル、
シクロヘキシル及びシクロペンチル）、アリール（好ま
しくは炭素数６〜１２のアリール、たとえば、フェニ
ル、トリル、キシリル、ナフチル、４−メトキシフェニ
ル及びクロロフェニル）によって置換されたか未置換の
分枝鎖、直鎖または環状の基であることができる。この
ような基は、合成化学に熟練した者にとっては設計また
は合成が困難ではない。
または硫黄原子の組合せを有する有機結合基である。結
合は、前記ヘテロ原子またはヘテロ原子含有基、たとえ
ば、カルボニル、スルホニル、イミノ及び公知の他の基
によって結合したかまたは終了したアルキレン、アリー
レン、アルキレンアリーレン、アリーレンアルキレン及
び同様な基のような２個またはそれ以上の二価炭化水素
基を含んでなる。このような炭化水素基は１個（たとえ
ば、メチレン）〜１２個の炭素原子を有することがで
き、１個またはそれ以上のアルキル基（好ましくは炭素
数１〜１２個のアルキル基、たとえば、メチル、エチ
ル、イソプロピル、ヘキシル及びオクチル）、アルコキ
シ（好ましくは炭素数１〜１２個のアルコキシ、たとえ
ば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔ−ブトキシ及
びオクチルオキシ）、シクロアルキル（好ましくは炭素
数４〜６のシクロアルキル、たとえば、シクロブチル、
シクロヘキシル及びシクロペンチル）、アリール（好ま
しくは炭素数６〜１２のアリール、たとえば、フェニ
ル、トリル、キシリル、ナフチル、４−メトキシフェニ
ル及びクロロフェニル）によって置換されたか未置換の
分枝鎖、直鎖または環状の基であることができる。この
ような基は、合成化学に熟練した者にとっては設計また
は合成が困難ではない。
【００２５】好ましくは、Ｌはオキシ、チオ、イミノ
（−ＮＲ１−）、カルボニルオキシ（−ＣＯＯ−）、カ
ルボニルイミノ（−ＣＯＮＲ１−）、ウレイレン（−Ｎ
Ｒ１ＣＯＮＲ１−）またはスルホニルイミノ（−ＳＯ２
ＮＲ１−）基と結合したまたはその基で終了する２個ま
たはそれ以上のアルキレンまたはアリーレンアルキレン
基を含んでなり、前記基中の各Ｒ１は独立して、水素、
炭素数１〜１０のアルキル（たとえば、メチル、エチ
ル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ヘキシル、ベンジル及
び２，４−ジメチルペンチル）、主鎖中に４〜１０個の
炭素原子を有するシクロアルキル（たとえば、シクロペ
ンチル、シクロヘキシル及び１，３−ジメチルシクロヘ
キシル）または主鎖中に６〜１４個の炭素原子を有する
アリール（たとえば、フェニル、キシリル、ｐ−クロロ
フェニル、ナフチル及びアントリル）である。
（−ＮＲ１−）、カルボニルオキシ（−ＣＯＯ−）、カ
ルボニルイミノ（−ＣＯＮＲ１−）、ウレイレン（−Ｎ
Ｒ１ＣＯＮＲ１−）またはスルホニルイミノ（−ＳＯ２
ＮＲ１−）基と結合したまたはその基で終了する２個ま
たはそれ以上のアルキレンまたはアリーレンアルキレン
基を含んでなり、前記基中の各Ｒ１は独立して、水素、
炭素数１〜１０のアルキル（たとえば、メチル、エチ
ル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ヘキシル、ベンジル及
び２，４−ジメチルペンチル）、主鎖中に４〜１０個の
炭素原子を有するシクロアルキル（たとえば、シクロペ
ンチル、シクロヘキシル及び１，３−ジメチルシクロヘ
キシル）または主鎖中に６〜１４個の炭素原子を有する
アリール（たとえば、フェニル、キシリル、ｐ−クロロ
フェニル、ナフチル及びアントリル）である。
【００２６】代表的なＬとしては以下のものが挙げられ
るが、それらに限定されない：ｐ−フェニレンメチレン
オキシカルボニルトリメチレン、カルボニルオキシエチ
レンオキシカルボニルトリメチレン、カルボニルオキシ
エチレンウレイレンペンタメチレン、カルボニルペンタ
（オキシエチレン）オキシカルボニルトリメチレン、カ
ルボニルデカ（オキシエチレン）オキシカルボニルトリ
メチレン、ｐ−フェニレンメチレンチオエチレンオキシ
カルボニルトリメチレン、カルボニルオキシエチレンイ
ミノカルボニルトリメチレン、カルボニルオキシテトラ
メチレンオキシカルボニルテトラメチレン、ｐ−フェニ
レンメチレンイミノカルボニルトリメチレン、ｐ−フェ
ニレンエチレンイミノカルボニルトリメチレン、ｐ−フ
ェニレン（メチル）イミノエチレンオキシカルボニルト
リメチレン、ｐ−フェニレンメチレンチオエチレン、ｐ
−フェニレンメチレンチオエチレンイミノカルボニルメ
チレンオキシメチレン、ｐ−フェニレンメチレンチオエ
チレンイミノカルボニルメチレンチオメチレン、ｐ−フ
ェニレンメチレンチオエチレンイミノカルボニルトリメ
チレン、フェニレンメチレンチオ−１−カルボキシエチ
レン、フェニレンメチレンチオフェニレン、フェニレン
メチレンチオエチレンオキシエチレンチオメチレンオキ
シカルボニルエチレン、フェニレンメチレンオキシフェ
ニレンメチレンチオエチレン、フェニレンメチレンチオ
エチレンオキシエチレンチオエチレンオキシカルボニル
エチレン、フェニレンメチレンオキシフェニレンメチレ
ンチオフェニレンメチレンチオトリメチレン、及びフェ
ニレンメチレンチオエチレンオキシエチレンチオエチレ
ンオキシカルボニ ルフェニレン。
るが、それらに限定されない：ｐ−フェニレンメチレン
オキシカルボニルトリメチレン、カルボニルオキシエチ
レンオキシカルボニルトリメチレン、カルボニルオキシ
エチレンウレイレンペンタメチレン、カルボニルペンタ
（オキシエチレン）オキシカルボニルトリメチレン、カ
ルボニルデカ（オキシエチレン）オキシカルボニルトリ
メチレン、ｐ−フェニレンメチレンチオエチレンオキシ
カルボニルトリメチレン、カルボニルオキシエチレンイ
ミノカルボニルトリメチレン、カルボニルオキシテトラ
メチレンオキシカルボニルテトラメチレン、ｐ−フェニ
レンメチレンイミノカルボニルトリメチレン、ｐ−フェ
ニレンエチレンイミノカルボニルトリメチレン、ｐ−フ
ェニレン（メチル）イミノエチレンオキシカルボニルト
リメチレン、ｐ−フェニレンメチレンチオエチレン、ｐ
−フェニレンメチレンチオエチレンイミノカルボニルメ
チレンオキシメチレン、ｐ−フェニレンメチレンチオエ
チレンイミノカルボニルメチレンチオメチレン、ｐ−フ
ェニレンメチレンチオエチレンイミノカルボニルトリメ
チレン、フェニレンメチレンチオ−１−カルボキシエチ
レン、フェニレンメチレンチオフェニレン、フェニレン
メチレンチオエチレンオキシエチレンチオメチレンオキ
シカルボニルエチレン、フェニレンメチレンオキシフェ
ニレンメチレンチオエチレン、フェニレンメチレンチオ
エチレンオキシエチレンチオエチレンオキシカルボニル
エチレン、フェニレンメチレンオキシフェニレンメチレ
ンチオフェニレンメチレンチオトリメチレン、及びフェ
ニレンメチレンチオエチレンオキシエチレンチオエチレ
ンオキシカルボニ ルフェニレン。
【００２７】前に同定された構造によって表される代表
的なモノマーとしては以下のものが挙げられるが、これ
らに限定されない：モノ−ｍ＆ｐ−ビニルベンジルグル
タレート、モノ−ｐ−ビニルベンジルグルタレート、モ
ノ−２−メタクリロイルオキシエチルグルタレート、２
−（４−カルボキシブチルアミド）エチルメタクリレー
ト、２−［Ｎ′−（５−カルボキシペンチル）ウレイ
ド］エチルメタクリレート、モノ−メタクリロイルペン
タ（オキシエチレン）グルタレート、モノ−（４−アク
リロイルオキシブチル）グルタレート、４−（４−カル
ボキシブチルアミド）スチレン、モノ−メタクリロイル
デカ（オキシエチレン）グルタレート、モノ−２−（ｐ
−ビニルベンジルチオ）エチルグルタレート、モノ−２
−（ｍ−及びｐ−ビニルベンジルチオ）エチルグルタレ
ート、４−（４−カルボキシブチルアミドメチル）スチ
レン、モノ−２−［Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ビニルベン
ジル）アミノ］エチルグルタレート、３−（ｐ−ビニル
ベンジルチオ）プロピオン酸、４−［２−（４−カルボ
キシブチルアミド）エチルチオメチル］スチレン、４−
［２−（カルボキシメトキシアセトアミド）エチルチオ
メチル］スチレン、４−［２−（カルボキシメチルチオ
アセトアミド）エチルチオメチル］スチレン、モノ−２
−（４−ビニルベンジルチオ）エチルスクシネート、４
−［２−（カルボキシメトキシアセトキシ）エチルチオ
メチル］スチレン、モノ−４−ビニルベンジルスクシネ
ート、２−（４−ビニルベンジルチオ）コハク酸、２−
（４−ビニルベンジルチオ）安息香酸、モノ−２−［２
−（４−ビニルベンジルチオ）エトキシ］エチルチオメ
チルマロネート、モノ−メタクリロイルペンタ（オキシ
エチレン）フタレート、モノ−メタクリロイルデカ（オ
キシエチレン）フタレート、モノ−２−｛２−［２−
（４−ビニルベンジルチオ）エトキシ］エチルチオ｝エ
チルスクシネート、モノ−２−｛２−［２−（４−ビニ
ルベンジルチオ）エトキシ］エチルチオ｝エチルフタレ
ート、３−［４−（４−ビニルベンジルオキシ）ベンジ
ルチオ］プロピオン酸及び４−｛４−［４−（４−ビニ
ルベンジルオキシ）ベンジルチオ］ベンジルチオ｝酪
酸。最も好ましいモノマーは３−（ｐ−ビニルベンジル
チオ）プロピオン酸である。
的なモノマーとしては以下のものが挙げられるが、これ
らに限定されない：モノ−ｍ＆ｐ−ビニルベンジルグル
タレート、モノ−ｐ−ビニルベンジルグルタレート、モ
ノ−２−メタクリロイルオキシエチルグルタレート、２
−（４−カルボキシブチルアミド）エチルメタクリレー
ト、２−［Ｎ′−（５−カルボキシペンチル）ウレイ
ド］エチルメタクリレート、モノ−メタクリロイルペン
タ（オキシエチレン）グルタレート、モノ−（４−アク
リロイルオキシブチル）グルタレート、４−（４−カル
ボキシブチルアミド）スチレン、モノ−メタクリロイル
デカ（オキシエチレン）グルタレート、モノ−２−（ｐ
−ビニルベンジルチオ）エチルグルタレート、モノ−２
−（ｍ−及びｐ−ビニルベンジルチオ）エチルグルタレ
ート、４−（４−カルボキシブチルアミドメチル）スチ
レン、モノ−２−［Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ビニルベン
ジル）アミノ］エチルグルタレート、３−（ｐ−ビニル
ベンジルチオ）プロピオン酸、４−［２−（４−カルボ
キシブチルアミド）エチルチオメチル］スチレン、４−
［２−（カルボキシメトキシアセトアミド）エチルチオ
メチル］スチレン、４−［２−（カルボキシメチルチオ
アセトアミド）エチルチオメチル］スチレン、モノ−２
−（４−ビニルベンジルチオ）エチルスクシネート、４
−［２−（カルボキシメトキシアセトキシ）エチルチオ
メチル］スチレン、モノ−４−ビニルベンジルスクシネ
ート、２−（４−ビニルベンジルチオ）コハク酸、２−
（４−ビニルベンジルチオ）安息香酸、モノ−２−［２
−（４−ビニルベンジルチオ）エトキシ］エチルチオメ
チルマロネート、モノ−メタクリロイルペンタ（オキシ
エチレン）フタレート、モノ−メタクリロイルデカ（オ
キシエチレン）フタレート、モノ−２−｛２−［２−
（４−ビニルベンジルチオ）エトキシ］エチルチオ｝エ
チルスクシネート、モノ−２−｛２−［２−（４−ビニ
ルベンジルチオ）エトキシ］エチルチオ｝エチルフタレ
ート、３−［４−（４−ビニルベンジルオキシ）ベンジ
ルチオ］プロピオン酸及び４−｛４−［４−（４−ビニ
ルベンジルオキシ）ベンジルチオ］ベンジルチオ｝酪
酸。最も好ましいモノマーは３−（ｐ−ビニルベンジル
チオ）プロピオン酸である。
【００２８】前記モノマーは一般に、１種またはそれ以
上の別のエチレン系不飽和重合性モノマーと共重合させ
る。（ａ）モノマーとして前に識別した親油性モノマー
は、得られたコポリマーに疎水性または水不溶性を与え
るのに有用である。所望ならば、このようなモノマーの
混合物を使用できる。このようなモノマーとしては以下
のものが挙げられるが、これらに限定されない：ビニル
芳香族炭化水素（たとえば、スチレン及びスチレン誘導
体、たとえば、４−ビニルトルエン、α−メチルスチレ
ン、２，５−ジメチルスチレン、４−ｔ−ブチルスチレ
ン及び２−クロロスチレン）、アクリル酸及びメタクリ
ル酸エステル及びアミド（たとえば、アクリル酸メチ
ル、メタクリル酸メチル、ｎ−ブチルアクリレート、２
−エチルヘキシルメタクリレート、ベンジルアクリレー
ト及びＮ−フェニルアクリルアミド）、ブタジエン、ア
クリロニトリル、酢酸ビニル、ビニルベンジルアセテー
ト、臭化ビニル、塩化ビニリデン及び２個またはそれ以
上の重合性基を有する架橋性モノマー。有用な架橋性モ
ノマーとしては以下のものが挙げられるが、これらに限
定されない：ジビニルベンゼン、アリルアクリレートな
らびにジ−及びトリアクリレート及びメタクリレート
（たとえば、２，２−ジメチル−１，３−プロピレンジ
アクリレート、１，４−シクロヘキシレンジメチレンジ
メタクリレート、エチレンジアクリレート、エチレンジ
メタクリレート、プロピレンジアクリレート、プロピレ
ンジメタクリレート、エチリジントリメタクリレート）
ならびに高分子化学における熟練者にとって容易にわか
る他の化合物。
上の別のエチレン系不飽和重合性モノマーと共重合させ
る。（ａ）モノマーとして前に識別した親油性モノマー
は、得られたコポリマーに疎水性または水不溶性を与え
るのに有用である。所望ならば、このようなモノマーの
混合物を使用できる。このようなモノマーとしては以下
のものが挙げられるが、これらに限定されない：ビニル
芳香族炭化水素（たとえば、スチレン及びスチレン誘導
体、たとえば、４−ビニルトルエン、α−メチルスチレ
ン、２，５−ジメチルスチレン、４−ｔ−ブチルスチレ
ン及び２−クロロスチレン）、アクリル酸及びメタクリ
ル酸エステル及びアミド（たとえば、アクリル酸メチ
ル、メタクリル酸メチル、ｎ−ブチルアクリレート、２
−エチルヘキシルメタクリレート、ベンジルアクリレー
ト及びＮ−フェニルアクリルアミド）、ブタジエン、ア
クリロニトリル、酢酸ビニル、ビニルベンジルアセテー
ト、臭化ビニル、塩化ビニリデン及び２個またはそれ以
上の重合性基を有する架橋性モノマー。有用な架橋性モ
ノマーとしては以下のものが挙げられるが、これらに限
定されない：ジビニルベンゼン、アリルアクリレートな
らびにジ−及びトリアクリレート及びメタクリレート
（たとえば、２，２−ジメチル−１，３−プロピレンジ
アクリレート、１，４−シクロヘキシレンジメチレンジ
メタクリレート、エチレンジアクリレート、エチレンジ
メタクリレート、プロピレンジアクリレート、プロピレ
ンジメタクリレート、エチリジントリメタクリレート）
ならびに高分子化学における熟練者にとって容易にわか
る他の化合物。
【００２９】さらに、モノマー（ａ）または（ｂ）に関
して前述した以外のエチレン系不飽和重合性モノマー
（ｃ）を共重合させて所望の性質を与えることができ
る。たとえば、このようなモノマーとしては、スルホン
酸基またはそれらの塩を含む陰イオン性モノマー、たと
えば、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホ
ン酸、３−メタクリロイルオキシプロパン−１−スルホ
ン酸、ｐ−スチレンスルホン酸及びそれらの塩ならびに
当業者には容易にわかる他の化合物が挙げられる。モノ
マーの（ｃ）群には、非イオン性親水性モノマー、たと
えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−イソプ
ロピルアクリルアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレ
ート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−ビニ
ル−２−ピロリドン及び当業者には容易にわかる他の化
合物が含まれる。さらに、活性メチレン基を有するモノ
マー、たとえば、２−アセトアセトキシエチルメタクリ
レート、ならびに陽イオン性モノマー、たとえば、Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｎ−ビニルベンジルアンモニウム
クロリド及び３−ヒドロキシエチル−１−ビニルイミダ
ゾリウムクロリドが使用できるであろう。
して前述した以外のエチレン系不飽和重合性モノマー
（ｃ）を共重合させて所望の性質を与えることができ
る。たとえば、このようなモノマーとしては、スルホン
酸基またはそれらの塩を含む陰イオン性モノマー、たと
えば、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホ
ン酸、３−メタクリロイルオキシプロパン−１−スルホ
ン酸、ｐ−スチレンスルホン酸及びそれらの塩ならびに
当業者には容易にわかる他の化合物が挙げられる。モノ
マーの（ｃ）群には、非イオン性親水性モノマー、たと
えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−イソプ
ロピルアクリルアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレ
ート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−ビニ
ル−２−ピロリドン及び当業者には容易にわかる他の化
合物が含まれる。さらに、活性メチレン基を有するモノ
マー、たとえば、２−アセトアセトキシエチルメタクリ
レート、ならびに陽イオン性モノマー、たとえば、Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｎ−ビニルベンジルアンモニウム
クロリド及び３−ヒドロキシエチル−１−ビニルイミダ
ゾリウムクロリドが使用できるであろう。
【００３０】一般に、本発明のコポリマーは、（ａ）約
６０〜９９．８モル％、（ｂ）約０．２〜４０モル％及
び（ｃ）０〜約１５モル％から誘導された反復単位から
なる。好ましいコポリマーは（ａ）８５〜９９．５モル
％、（ｂ）０．５〜１５モル％及び（ｃ）０〜１０モル
％から製造される。
６０〜９９．８モル％、（ｂ）約０．２〜４０モル％及
び（ｃ）０〜約１５モル％から誘導された反復単位から
なる。好ましいコポリマーは（ａ）８５〜９９．５モル
％、（ｂ）０．５〜１５モル％及び（ｃ）０〜１０モル
％から製造される。
【００３１】本発明のコポリマーは標準乳化または懸濁
重合法を用いて製造する。本明細書中に記載したコポリ
マーは、本発明の試薬を製造するために粒子の形態で使
用する。一般に、それは０．０１〜２０μｍ、好ましく
は０．１〜１０μｍである。
重合法を用いて製造する。本明細書中に記載したコポリ
マーは、本発明の試薬を製造するために粒子の形態で使
用する。一般に、それは０．０１〜２０μｍ、好ましく
は０．１〜１０μｍである。
【００３２】本発明の試薬は粒子の外面上の反応性カル
ボキシ基を介してポリマー粒子に共有結合した１種また
はそれ以上の生物活性物質を含む。本明細書中で使用す
る用語「生物活性物質」とは、生体内に見られるかまた
は診断、治療もしくは細胞物質もしくは生体の遺伝子工
学において有用であって、且つ別の生物学的もしくは化
学的物質と相互作用する能力を有する任意の有機化合物
を含むものである。このような物質は生物学的液体中に
天然に存在するものであってもよいし、存在しないもの
であってもよい。このような物質は後述のように適当な
活性化剤を用いて反応性カルボキシ基を介して粒子に結
合できるものでなければならない。従って、一般に、こ
れは、生物活性物質が反応に利用できるアミノまたはス
ルフヒドリル基を有することを意味する。
ボキシ基を介してポリマー粒子に共有結合した１種また
はそれ以上の生物活性物質を含む。本明細書中で使用す
る用語「生物活性物質」とは、生体内に見られるかまた
は診断、治療もしくは細胞物質もしくは生体の遺伝子工
学において有用であって、且つ別の生物学的もしくは化
学的物質と相互作用する能力を有する任意の有機化合物
を含むものである。このような物質は生物学的液体中に
天然に存在するものであってもよいし、存在しないもの
であってもよい。このような物質は後述のように適当な
活性化剤を用いて反応性カルボキシ基を介して粒子に結
合できるものでなければならない。従って、一般に、こ
れは、生物活性物質が反応に利用できるアミノまたはス
ルフヒドリル基を有することを意味する。
【００３３】試薬の目的とする用途に応じて、生物活性
物質は種々の天然に存在するまたは合成によって製造さ
れた物質であることができ、その例としては以下のもの
が挙げられるがそれらに限定されない： アミン、酵
素、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質
（たとえば、抗生物質、Ｃ−反応性タンパク質ならびに
アビジン及びその誘導体）、リポタンパク、糖タンパ
ク、ホルモン、薬物（たとえば、ジゴキシン、フェニト
イン、フェノバルビタール、チロキシン、トリヨードチ
ロニン、ゲンタマイシン、カルバマゼピン及びテオフィ
リン）、ステロイド、ビタミン、多糖類、糖脂質、アル
カロイド、微生物、ウィルス、原生動物、真菌類、寄生
虫、リケッチア、カビ、血液成分、組織及び器官成分、
医薬、ハプテン、レクチン、毒素、核酸（一本鎖及び二
本鎖オリゴヌクレオチドを含む）、抗原性物質（タンパ
ク質及び炭水化物を含む）、ビオチンまたはその誘導
体、及びここに列挙した物質のいずれかの成分、ならび
に当業者に公知の他の物質。
物質は種々の天然に存在するまたは合成によって製造さ
れた物質であることができ、その例としては以下のもの
が挙げられるがそれらに限定されない： アミン、酵
素、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質
（たとえば、抗生物質、Ｃ−反応性タンパク質ならびに
アビジン及びその誘導体）、リポタンパク、糖タンパ
ク、ホルモン、薬物（たとえば、ジゴキシン、フェニト
イン、フェノバルビタール、チロキシン、トリヨードチ
ロニン、ゲンタマイシン、カルバマゼピン及びテオフィ
リン）、ステロイド、ビタミン、多糖類、糖脂質、アル
カロイド、微生物、ウィルス、原生動物、真菌類、寄生
虫、リケッチア、カビ、血液成分、組織及び器官成分、
医薬、ハプテン、レクチン、毒素、核酸（一本鎖及び二
本鎖オリゴヌクレオチドを含む）、抗原性物質（タンパ
ク質及び炭水化物を含む）、ビオチンまたはその誘導
体、及びここに列挙した物質のいずれかの成分、ならび
に当業者に公知の他の物質。
【００３４】本発明の特に有用な試薬は、生物活性物質
が問題のリガンドに特異的なレセプター分子であるもの
である。従って、試薬を含む特異的結合反応は種々の方
法（以下においてより詳細に記載する）に使用できる。
リガンド−レセプター複合体（すなわち、リガンドとレ
セプターとの反応）の例は抗体−抗原、抗体−ハプテ
ン、アビジン−ビオチン、糖−レクチン、ゼラチン−フ
ィブロネクチン及びＰｒｏｔｅｉｎＡ−ＩｇＧ複合体を
含むが、これらに限定されない。本発明のためには、相
補的核酸（すなわち、相補的ストランドのハイブリット
形成生成物）も特異的結合物質と考えられる。このよう
な相補的核酸（少なくとも２個の塩基を有するオリゴヌ
クレオチド）は全塩基対において相補的である必要はな
く、核酸配列の全ての位置に匹敵する塩基である必要は
ない。すなわち、ストランドの一方が他方より長くても
よいし、一方が差の配列においてそれに相補的な多数の
オリゴヌクレオチドを有することもできる。
が問題のリガンドに特異的なレセプター分子であるもの
である。従って、試薬を含む特異的結合反応は種々の方
法（以下においてより詳細に記載する）に使用できる。
リガンド−レセプター複合体（すなわち、リガンドとレ
セプターとの反応）の例は抗体−抗原、抗体−ハプテ
ン、アビジン−ビオチン、糖−レクチン、ゼラチン−フ
ィブロネクチン及びＰｒｏｔｅｉｎＡ−ＩｇＧ複合体を
含むが、これらに限定されない。本発明のためには、相
補的核酸（すなわち、相補的ストランドのハイブリット
形成生成物）も特異的結合物質と考えられる。このよう
な相補的核酸（少なくとも２個の塩基を有するオリゴヌ
クレオチド）は全塩基対において相補的である必要はな
く、核酸配列の全ての位置に匹敵する塩基である必要は
ない。すなわち、ストランドの一方が他方より長くても
よいし、一方が差の配列においてそれに相補的な多数の
オリゴヌクレオチドを有することもできる。
【００３５】多くの有用な生物活性物質は免疫反応性物
質として公知であるものである。たとえば、免疫物質は
抗原物質または抗体（抗−抗体を含む）であることがで
きる。単クローン及び多クローン性抗体は共に有用であ
り、粒子上に反応性カルボキシ基との反応のための反応
性部位を少なくとも１つ有する限りはそれらは分子全体
であるかまたはそれらの種々のフラグメントであること
ができる。
質として公知であるものである。たとえば、免疫物質は
抗原物質または抗体（抗−抗体を含む）であることがで
きる。単クローン及び多クローン性抗体は共に有用であ
り、粒子上に反応性カルボキシ基との反応のための反応
性部位を少なくとも１つ有する限りはそれらは分子全体
であるかまたはそれらの種々のフラグメントであること
ができる。
【００３６】特に有用な生物活性物質としては、歯周疾
患、カルバマゼピン、チロシン、ヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン、フェノバルビタール、フェニトイン、ジゴキシン
またはＣ−反応性タンパク質と関連した微生物であるＳ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＡに関する抗体が挙げられ
る。
患、カルバマゼピン、チロシン、ヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン、フェノバルビタール、フェニトイン、ジゴキシン
またはＣ−反応性タンパク質と関連した微生物であるＳ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＡに関する抗体が挙げられ
る。
【００３７】いくつかの実施態様において、免疫物質は
結合のための反応性基を有する酵素である。代表的な酵
素としては以下のものが挙げられるがこれに限定されな
い：西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アスパルテ
ートアミノトランスアミナーゼ、アラニンアミノトラン
スアミナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、クレアチ
ンホスホキナーゼ、γ−グルタミルトランスフェラー
ゼ、アルカリホスファターゼ、酸フォスファターゼ及び
前立腺酸ホスファターゼ。
結合のための反応性基を有する酵素である。代表的な酵
素としては以下のものが挙げられるがこれに限定されな
い：西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アスパルテ
ートアミノトランスアミナーゼ、アラニンアミノトラン
スアミナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、クレアチ
ンホスホキナーゼ、γ−グルタミルトランスフェラー
ゼ、アルカリホスファターゼ、酸フォスファターゼ及び
前立腺酸ホスファターゼ。
【００３８】他の実施態様において、たとえば、薬物ま
たは妊娠を測定するための競合的結合アッセイに関して
は、生物活性物質が、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、フェ
ノバルビタール、フェニトインまたはジゴキシンに関す
る抗体である。
たは妊娠を測定するための競合的結合アッセイに関して
は、生物活性物質が、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、フェ
ノバルビタール、フェニトインまたはジゴキシンに関す
る抗体である。
【００３９】所望ならば、生物活性物質は、結合のため
の結合部分を提供することを含めて、結合のための反応
性基を提供するために改質または化学的に変化させるこ
とができる。
の結合部分を提供することを含めて、結合のための反応
性基を提供するために改質または化学的に変化させるこ
とができる。
【００４０】生物活性物質は、活性化剤を用いてここに
記載したコポリマーの粒子に結合させる。これらの活性
化剤はカルボキシ基を、利用可能なアミンまたは物質の
スルフヒドリル基と反応性である中間体（たとえば、エ
ステル）に変換することができる化合物である。
記載したコポリマーの粒子に結合させる。これらの活性
化剤はカルボキシ基を、利用可能なアミンまたは物質の
スルフヒドリル基と反応性である中間体（たとえば、エ
ステル）に変換することができる化合物である。
【００４１】有用な活性化剤としては、Ｎ−エチル−５
−フェニルイソキサゾリウム−３′−スルホネート、ク
ロロホルメート、水溶性カルボジイミド、ジカチオンエ
ーテル及びカルバモイルオニウム化合物が挙げられる
が、これに限定されることはない。
−フェニルイソキサゾリウム−３′−スルホネート、ク
ロロホルメート、水溶性カルボジイミド、ジカチオンエ
ーテル及びカルバモイルオニウム化合物が挙げられる
が、これに限定されることはない。
【００４２】本発明の試薬を製造するための一般的方法
は２つの工程で起こる。第１の工程はポリマー粒子の水
性懸濁液（またはラテックス）と活性化剤とを接触させ
て、元のカルボキシ基の代わりに粒子に結合した反応性
中間体（たとえば、エステルまたは混合無水物）を生成
することを含む。この工程は、適当である酸または緩衝
剤を用いて適当なｐＨにおいて実施する。カルバモイル
オニウム化合物及びジカチオンエーテルの場合には、ｐ
Ｈは一般に６未満である。カルボジイミドの場合には、
ｐＨは一般に４．５〜７である。製造において使用する
活性化剤の量は一般に、ポリマー粒子中の全カルボキシ
ル基の理論濃度より少なくとも２倍過剰であるが、最適
量は、ここに示す、公知の教示を用いて日常実験によっ
て容易に測定される。
は２つの工程で起こる。第１の工程はポリマー粒子の水
性懸濁液（またはラテックス）と活性化剤とを接触させ
て、元のカルボキシ基の代わりに粒子に結合した反応性
中間体（たとえば、エステルまたは混合無水物）を生成
することを含む。この工程は、適当である酸または緩衝
剤を用いて適当なｐＨにおいて実施する。カルバモイル
オニウム化合物及びジカチオンエーテルの場合には、ｐ
Ｈは一般に６未満である。カルボジイミドの場合には、
ｐＨは一般に４．５〜７である。製造において使用する
活性化剤の量は一般に、ポリマー粒子中の全カルボキシ
ル基の理論濃度より少なくとも２倍過剰であるが、最適
量は、ここに示す、公知の教示を用いて日常実験によっ
て容易に測定される。
【００４３】反応混合物中において、粒子の％固形分は
一般に０．０１〜１０％である。生物活性物質の量は一
般に物質対コポリマーの重量比０．０００５：１〜０．
５：１によって示される。
一般に０．０１〜１０％である。生物活性物質の量は一
般に物質対コポリマーの重量比０．０００５：１〜０．
５：１によって示される。
【００４４】生物活性物質と粒子との混合は２０〜３７
℃において２〜３０時間実施する。生物活性物質は試薬
中にポリマー粒子の０．００２５〜３０重量％の量で存
在するのが望ましい。
℃において２〜３０時間実施する。生物活性物質は試薬
中にポリマー粒子の０．００２５〜３０重量％の量で存
在するのが望ましい。
【００４５】オリゴヌクレオチドが必要な反応性アミン
またはスルフヒドリル基を有さない場合には、それらの
公知の手法を用いて添加できる。
またはスルフヒドリル基を有さない場合には、それらの
公知の手法を用いて添加できる。
【００４６】本発明の分析または診断方法において、試
薬を使用して、レセプター分子が存在する全ての特異的
結合リガンドを検出することができる。本発明の試薬中
の生物活性物質はリガンドまたはそのレセプターと特異
的に反応性であることができる。リガンドの検出は、水
性液体（たとえば、生物学的液体）または組織または細
胞物質の溶液の検体を用いて溶液または乾燥形態（後
述）において実施でき、定性、定量または両者であるこ
とができる。特に、本発明は動物、ヒトまたは植物の生
物学的液体、好ましくは、全血、血清、血漿、リンパ、
胆汁、尿、脊髄液、痰、涙、汗、綿棒標本、組織培養
物、糞便分泌物、細胞性液、膣分泌物及び精液を含むヒ
トの液体をアッセイするのに使用できる。また、骨格
筋、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄または皮膚のようなヒト
または動物の組織の液体標本をアッセイすることもでき
る。
薬を使用して、レセプター分子が存在する全ての特異的
結合リガンドを検出することができる。本発明の試薬中
の生物活性物質はリガンドまたはそのレセプターと特異
的に反応性であることができる。リガンドの検出は、水
性液体（たとえば、生物学的液体）または組織または細
胞物質の溶液の検体を用いて溶液または乾燥形態（後
述）において実施でき、定性、定量または両者であるこ
とができる。特に、本発明は動物、ヒトまたは植物の生
物学的液体、好ましくは、全血、血清、血漿、リンパ、
胆汁、尿、脊髄液、痰、涙、汗、綿棒標本、組織培養
物、糞便分泌物、細胞性液、膣分泌物及び精液を含むヒ
トの液体をアッセイするのに使用できる。また、骨格
筋、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄または皮膚のようなヒト
または動物の組織の液体標本をアッセイすることもでき
る。
【００４７】リガンドは、１種またはそれ以上の同一ま
たは異なるレセプター分子との複合体形成のための部位
を１個またはそれ以上有する薬物、ハプテン、ホルモ
ン、抗原物質（リポポリサッカライドまたはタンパク
質）または抗体であることができる。本発明のイムノア
ッセイにおいて、リガンドは薬物（たとえば、ジゴキシ
ン、フェニトイン及びカルバマゼピン）、ホルモン（た
とえば、甲状腺刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピ
ン、ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、及びチ
ロキシン）、レトロウィルス（たとえば、ＨＩＶ−Ｉ成
分またはその抗体）、細菌感染剤もしくはその成分また
はそれに対する抗体（たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ Ａ抗原、クラミジア属または淋菌抗原または抗
体）、ウィルスまたはその成分（たとえば、肝炎、サイ
トメガロウィルスまたはヘルペス抗原）またはそれに対
する抗体、癌形成物質、またはＣ−反応性タンパク質で
あることができる。リガンドはまた、ビオチンまたはそ
の誘導体であることができ、レセプターはアビジンまた
はその誘導体である。
たは異なるレセプター分子との複合体形成のための部位
を１個またはそれ以上有する薬物、ハプテン、ホルモ
ン、抗原物質（リポポリサッカライドまたはタンパク
質）または抗体であることができる。本発明のイムノア
ッセイにおいて、リガンドは薬物（たとえば、ジゴキシ
ン、フェニトイン及びカルバマゼピン）、ホルモン（た
とえば、甲状腺刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピ
ン、ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、及びチ
ロキシン）、レトロウィルス（たとえば、ＨＩＶ−Ｉ成
分またはその抗体）、細菌感染剤もしくはその成分また
はそれに対する抗体（たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ Ａ抗原、クラミジア属または淋菌抗原または抗
体）、ウィルスまたはその成分（たとえば、肝炎、サイ
トメガロウィルスまたはヘルペス抗原）またはそれに対
する抗体、癌形成物質、またはＣ−反応性タンパク質で
あることができる。リガンドはまた、ビオチンまたはそ
の誘導体であることができ、レセプターはアビジンまた
はその誘導体である。
【００４８】他の実施態様において、リガンドは核酸
（通常は一本鎖型）であることができ、その量または存
在を、レセプター分子として相補的一本鎖核酸を用いて
検出する。核酸検出のためには多くの種々のアッセイ形
態があるが、それはすべて当業者に容易にわかるもので
ある。ＨＩＶ−ＩＤＮＡ、β−グロビンＤＮＡまたはサ
イトメガロウィルスＤＮＡの検出は本発明の実施におい
て特に重要である。
（通常は一本鎖型）であることができ、その量または存
在を、レセプター分子として相補的一本鎖核酸を用いて
検出する。核酸検出のためには多くの種々のアッセイ形
態があるが、それはすべて当業者に容易にわかるもので
ある。ＨＩＶ−ＩＤＮＡ、β−グロビンＤＮＡまたはサ
イトメガロウィルスＤＮＡの検出は本発明の実施におい
て特に重要である。
【００４９】一般に、特異的結合リガンドの定量方法
は、 Ａ． 問題の特異的結合リガンドまたはそのレセプター
の水不溶性特異的結合複合体を、 （Ｉ）前記水不溶性非孔質粒子、及び （ＩＩ）リガンドまたはそれに対するレセプターと特異
的に反応性である、反応性基を介して粒子に共有結合し
た生物活性物質を含んでなる試薬によって形成し、そし
て Ｂ． 検体中のリガンドの存在または不存在の指標とし
て複合体の存在を検出することを含んでなる。
は、 Ａ． 問題の特異的結合リガンドまたはそのレセプター
の水不溶性特異的結合複合体を、 （Ｉ）前記水不溶性非孔質粒子、及び （ＩＩ）リガンドまたはそれに対するレセプターと特異
的に反応性である、反応性基を介して粒子に共有結合し
た生物活性物質を含んでなる試薬によって形成し、そし
て Ｂ． 検体中のリガンドの存在または不存在の指標とし
て複合体の存在を検出することを含んでなる。
【００５０】１つの実施態様において、試薬は特異的結
合リガンドの定量のための競合的結合アッセイにおいて
使用できる。一般に、このようなアッセイは、 Ａ． 水溶性特異的結合リガンドをその水溶性レセプタ
ーと、及び前記試薬と接触させて、レセプターとリガン
ドとの間の特異的結合複合体（ａ）、ならびにレセプタ
ーと水不溶性試薬との間の特異的結合複合体（ｂ）を形
成し、そして Ｂ． 複合体（ａ）及び（ｂ）の分離後にいずれかの複
合体の存在を検出することを含んでなる。
合リガンドの定量のための競合的結合アッセイにおいて
使用できる。一般に、このようなアッセイは、 Ａ． 水溶性特異的結合リガンドをその水溶性レセプタ
ーと、及び前記試薬と接触させて、レセプターとリガン
ドとの間の特異的結合複合体（ａ）、ならびにレセプタ
ーと水不溶性試薬との間の特異的結合複合体（ｂ）を形
成し、そして Ｂ． 複合体（ａ）及び（ｂ）の分離後にいずれかの複
合体の存在を検出することを含んでなる。
【００５１】このような競合的結合アッセイは溶液にお
いて実施できる。所望ならば、結合及び未結合物質の物
理的分離は、任意の適当な分離法を用いて実施できる。
分析要素（後述）を使用する場合には、垂直方向または
水平方向の分離のいずれも使用できる。結合リガンドは
公知の光散乱、濁度測定、放射線測定または分光光度測
定法を用いて定量できる。
いて実施できる。所望ならば、結合及び未結合物質の物
理的分離は、任意の適当な分離法を用いて実施できる。
分析要素（後述）を使用する場合には、垂直方向または
水平方向の分離のいずれも使用できる。結合リガンドは
公知の光散乱、濁度測定、放射線測定または分光光度測
定法を用いて定量できる。
【００５２】本発明方法はまた、乾燥分析要素を用いて
実施できる。最も簡単な要素は、吸収剤、液体透過性支
持体、たとえば、自立吸収剤または吸水性材料、の薄い
シートたとえば、濾紙または紙ストリップからなること
ができる。この支持体は、化学的、生物学的または特異
的結合反応が中で起こる１つまたはそれ以上の反応帯域
を有する。本発明の試薬はこれらの帯域の少なくとも１
つの中に存在する。他の任意の帯域としては、色素、色
素形成化合物、掃去剤、酸化防止剤、酵素基質または緩
衝剤及び当業者に容易にわかる他の材料が挙げられる。
このような要素は試験片、分析要素、スライドまたは浸
漬スティックとして公知である。
実施できる。最も簡単な要素は、吸収剤、液体透過性支
持体、たとえば、自立吸収剤または吸水性材料、の薄い
シートたとえば、濾紙または紙ストリップからなること
ができる。この支持体は、化学的、生物学的または特異
的結合反応が中で起こる１つまたはそれ以上の反応帯域
を有する。本発明の試薬はこれらの帯域の少なくとも１
つの中に存在する。他の任意の帯域としては、色素、色
素形成化合物、掃去剤、酸化防止剤、酵素基質または緩
衝剤及び当業者に容易にわかる他の材料が挙げられる。
このような要素は試験片、分析要素、スライドまたは浸
漬スティックとして公知である。
【００５３】好ましくは、リガンド類似体は後述するよ
うな酵素で標識し、リガンドは抗原物質、ホルモン、ハ
プテンまたは薬物であり、レセプターは対応する抗体で
ある。このような要素はカルバマゼピン、チロキシン、
フェノバルビタール、フェニトインまたはジゴキシンの
定量に特に有用である。最も好ましくは、それらはフェ
ノバルビタール、フェニトインまたはジゴキシンの定量
に有用である。
うな酵素で標識し、リガンドは抗原物質、ホルモン、ハ
プテンまたは薬物であり、レセプターは対応する抗体で
ある。このような要素はカルバマゼピン、チロキシン、
フェノバルビタール、フェニトインまたはジゴキシンの
定量に特に有用である。最も好ましくは、それらはフェ
ノバルビタール、フェニトインまたはジゴキシンの定量
に有用である。
【００５４】本発明の別の実施態様は、リガンドを本発
明の試薬と複合体形成させて粒子の検出可能な凝集また
は集塊を形成する凝集アッセイとして公知であるもので
ある。得られた凝集は種々の方法、たとえば、目視でま
たは適当な光散乱検出装置によって検出できる。
明の試薬と複合体形成させて粒子の検出可能な凝集また
は集塊を形成する凝集アッセイとして公知であるもので
ある。得られた凝集は種々の方法、たとえば、目視でま
たは適当な光散乱検出装置によって検出できる。
【００５５】凝集アッセイは好ましくは、ある方法で、
たとえば、粒子中もしくはそれに結合した生物活性物質
中の放射性同位体によって、または粒子と会合した比色
または蛍光測定色素によって標識されて検出可能な本発
明の試薬を用いて実施する。最も好ましくは、色素は、
生物活性物質の結合またはその複合体形成を妨害しない
ように表面から離れた粒子の内部にある。このような粒
子はコアポリマー内に色素を有するコアシェル粒子であ
ることができ、シェルコポリマーは色素を含まない。
たとえば、粒子中もしくはそれに結合した生物活性物質
中の放射性同位体によって、または粒子と会合した比色
または蛍光測定色素によって標識されて検出可能な本発
明の試薬を用いて実施する。最も好ましくは、色素は、
生物活性物質の結合またはその複合体形成を妨害しない
ように表面から離れた粒子の内部にある。このような粒
子はコアポリマー内に色素を有するコアシェル粒子であ
ることができ、シェルコポリマーは色素を含まない。
【００５６】免疫物質の定量方法は Ａ． 免疫物質を該免疫物質に対するレセプターを有す
る本発明の試薬と接触させて該免疫物質とレセプターと
水不溶性免疫複合体を形成し、そして Ｂ． 複合体形成しなかった物質を該複合体から分離
後、複合体の存在を検出することを含んでなる。
る本発明の試薬と接触させて該免疫物質とレセプターと
水不溶性免疫複合体を形成し、そして Ｂ． 複合体形成しなかった物質を該複合体から分離
後、複合体の存在を検出することを含んでなる。
【００５７】免疫物質は抗原物質であり、レセプターは
それに対する抗体であることができる。あるいは、免疫
物質が抗体であって、レセプターがそれに対して特異的
な抗原物質であることができる。さらにまた、免疫物質
が抗体であって、レセプターがそれに対して特異的な抗
体であることもできる。
それに対する抗体であることができる。あるいは、免疫
物質が抗体であって、レセプターがそれに対して特異的
な抗原物質であることができる。さらにまた、免疫物質
が抗体であって、レセプターがそれに対して特異的な抗
体であることもできる。
【００５８】さらに別の実施態様において、本発明の試
薬は免疫測定アッセイにおいて使用できる。このような
アッセイにおいて、問題のリガンドは２個またはそれ以
上のレセプター分子（同一であっても異なってもよい）
と複合体を形成し、このレセプター分子の一方は不溶化
されているかまたは不溶化されることができ（たとえ
ば、アビジン−ビオチン結合によって）、他方は水溶性
であって適当に標識される（たとえば、放射性同位体、
酵素、化学蛍光部分または他の公知の標識によって）。
薬は免疫測定アッセイにおいて使用できる。このような
アッセイにおいて、問題のリガンドは２個またはそれ以
上のレセプター分子（同一であっても異なってもよい）
と複合体を形成し、このレセプター分子の一方は不溶化
されているかまたは不溶化されることができ（たとえ
ば、アビジン−ビオチン結合によって）、他方は水溶性
であって適当に標識される（たとえば、放射性同位体、
酵素、化学蛍光部分または他の公知の標識によって）。
【００５９】好ましくは、サンドイッチアッセイにおい
ては、本発明の試薬による水不溶性複合体の形成の前
に、それと同時にまたはその後に、問題のリガンドをそ
れに対して特異的反応性である水溶性特異的結合成分と
反応させる。
ては、本発明の試薬による水不溶性複合体の形成の前
に、それと同時にまたはその後に、問題のリガンドをそ
れに対して特異的反応性である水溶性特異的結合成分と
反応させる。
【００６０】本発明に従ってサンドイッチアッセイにお
いて検出できる他のリガンドとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ抗原、歯周疾患に関連した微生物から抽出
された抗原、肝炎抗原、Ｈ１Ｖ−Ｉ及び他のレトロウィ
ルス抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
いて検出できる他のリガンドとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ抗原、歯周疾患に関連した微生物から抽出
された抗原、肝炎抗原、Ｈ１Ｖ−Ｉ及び他のレトロウィ
ルス抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】本発明の別の実施態様は、目標核酸が相補
的プローブを用いて検出されるハイブリッド形成アッセ
イとして知られるものである。相補的プローブの一方は
適当に標識されており、他方は固定されているか固定さ
れることができるものである。本発明の試薬はこのよう
なアッセイにおいて固定プローブ（捕獲プローブとして
も知られる）として使用できる。これらの試薬はまた、
ポリメラーゼ連鎖反応増幅として公知であるものの後に
捕獲プローブとして使用できる。
的プローブを用いて検出されるハイブリッド形成アッセ
イとして知られるものである。相補的プローブの一方は
適当に標識されており、他方は固定されているか固定さ
れることができるものである。本発明の試薬はこのよう
なアッセイにおいて固定プローブ（捕獲プローブとして
も知られる）として使用できる。これらの試薬はまた、
ポリメラーゼ連鎖反応増幅として公知であるものの後に
捕獲プローブとして使用できる。
【００６２】特に、核酸の検出方法は Ａ． 核酸と、反応性カルボキシ基またはその塩を介し
て粒子に共有結合した、核酸に対して実質的に相補的で
あるオリゴヌクレオチドを含むここに記載した試薬との
間で水不溶性ハイブリッド形成生成物を形成し、そして Ｂ． 該ハイブリッド形成生成物の存在を検出すること
を含んでなる。
て粒子に共有結合した、核酸に対して実質的に相補的で
あるオリゴヌクレオチドを含むここに記載した試薬との
間で水不溶性ハイブリッド形成生成物を形成し、そして Ｂ． 該ハイブリッド形成生成物の存在を検出すること
を含んでなる。
【００６３】好ましいハイブリッド形成アッセイにおい
て、問題の核酸は、本発明の試薬による捕獲の前に、適
当な試薬（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、
プライマー）とのポリメラーゼ連鎖反応（公知）を用い
て増幅する。ＨＩＶ−ＩＤＮＡ、サイトメガロウィルス
ＤＮＡ及びβ−グロビンＤＮＡは増幅及び本発明に係る
検出を用いて容易に検出される。
て、問題の核酸は、本発明の試薬による捕獲の前に、適
当な試薬（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、
プライマー）とのポリメラーゼ連鎖反応（公知）を用い
て増幅する。ＨＩＶ−ＩＤＮＡ、サイトメガロウィルス
ＤＮＡ及びβ−グロビンＤＮＡは増幅及び本発明に係る
検出を用いて容易に検出される。
【００６４】本発明の分析、サンドイッチ及びハイブリ
ッド形成アッセイは、複合体形成またはハイブリッド形
成生成物を捕獲しまたは複合体を形成していない物質か
ら濾過によって分離する適当な装置及び手法を用いて実
施できる。好ましくは、このようなアッセイは微孔質濾
過膜を含む使い捨て試験装置を用いて実施する。
ッド形成アッセイは、複合体形成またはハイブリッド形
成生成物を捕獲しまたは複合体を形成していない物質か
ら濾過によって分離する適当な装置及び手法を用いて実
施できる。好ましくは、このようなアッセイは微孔質濾
過膜を含む使い捨て試験装置を用いて実施する。
【００６５】本発明の分析的分離法は、生物学的物質の
混合物から１種またはそれ以上の問題の分析物を単離す
るのに使用できる。従って、本発明の試薬（または粒子
に種々の物質が結合したいくつかの試薬）は一般に、生
物学的物質の混合物を含む液体を注ぐカラム中に入れ、
試薬に、単離したい物質を液体から抽出させる。これ
は、核酸、酵素、炭水化物、タンパク質、脂質、ビタミ
ン、ステロイド、抗体、ペプチドまたはホルモンの精製
に有用であることができる。この手法はまた、アフィニ
ティークロマトグラフィーとして知られている。
混合物から１種またはそれ以上の問題の分析物を単離す
るのに使用できる。従って、本発明の試薬（または粒子
に種々の物質が結合したいくつかの試薬）は一般に、生
物学的物質の混合物を含む液体を注ぐカラム中に入れ、
試薬に、単離したい物質を液体から抽出させる。これ
は、核酸、酵素、炭水化物、タンパク質、脂質、ビタミ
ン、ステロイド、抗体、ペプチドまたはホルモンの精製
に有用であることができる。この手法はまた、アフィニ
ティークロマトグラフィーとして知られている。
【００６６】アフィニティークロマトグラフィーはま
た、タンパク質の変性型を精製タンパク質から除去する
ために、ならびに特異的化学的改質から生ずるタンパク
質及びペプチド成分の分離及び分割においてタンパク質
の希薄溶液を濃縮するために使用できる。
た、タンパク質の変性型を精製タンパク質から除去する
ために、ならびに特異的化学的改質から生ずるタンパク
質及びペプチド成分の分離及び分割においてタンパク質
の希薄溶液を濃縮するために使用できる。
【００６７】本発明の試薬は、前記方法のいずれかに単
独材料として、あるいは前記分析要素中に、または診断
試験キット中において他の試薬、試験装置及び装備と組
み合わせて供給できる。精製方法に関しては、試薬はま
たアフィニティークロマトグラフィーカラム中に供給で
きる。
独材料として、あるいは前記分析要素中に、または診断
試験キット中において他の試薬、試験装置及び装備と組
み合わせて供給できる。精製方法に関しては、試薬はま
たアフィニティークロマトグラフィーカラム中に供給で
きる。
【００６８】本発明の分析的精製方法において、クロマ
トグラフィーカラム中の試薬はカラムを通って流れる物
質の混合物中の１種またはそれ以上の物質を捕獲する。
トグラフィーカラム中の試薬はカラムを通って流れる物
質の混合物中の１種またはそれ以上の物質を捕獲する。
【００６９】１つの実施態様において、所定の物質が試
薬によって捕獲され、最初の溶離剤は廃棄され、捕獲さ
れた物質は、物質が複合体形成され得ないように物質の
結合特性を変化させる溶媒を用いてカラムから除去され
る。このような溶媒としてはｐＨを変化させる緩衝剤、
複合体のイオン性を変化させる塩溶液、または試薬を特
異的に結合し且つ捕獲された物質に取って代わる第２の
物質を含む溶液が挙げられる。あるいは、試薬によって
捕獲された所定の物質は廃棄され、最初の溶離剤中に残
る他の化学的または生物学的物質が回収される。
薬によって捕獲され、最初の溶離剤は廃棄され、捕獲さ
れた物質は、物質が複合体形成され得ないように物質の
結合特性を変化させる溶媒を用いてカラムから除去され
る。このような溶媒としてはｐＨを変化させる緩衝剤、
複合体のイオン性を変化させる塩溶液、または試薬を特
異的に結合し且つ捕獲された物質に取って代わる第２の
物質を含む溶液が挙げられる。あるいは、試薬によって
捕獲された所定の物質は廃棄され、最初の溶離剤中に残
る他の化学的または生物学的物質が回収される。
【００７０】
【実施例】以下の実施例は説明のためであって、本発明
の範囲を限定するものではない。全ての百分率は、特に
断わらない限り重量に基づく。
の範囲を限定するものではない。全ての百分率は、特に
断わらない限り重量に基づく。
【００７１】実施例１：標識されたウシガンマグロブリ
ンを含む試薬 この実施例は、ポリマー粒子に結合した、放射性同位体
で標識されたタンパク質を含む本発明のいくつかの試薬
の製造を説明する。２つの異なる活性化剤を用いて試薬
を製造した。試薬は、本発明の範囲外のコポリマーを用
いて同様にして製造した対照試験に比較した。
ンを含む試薬 この実施例は、ポリマー粒子に結合した、放射性同位体
で標識されたタンパク質を含む本発明のいくつかの試薬
の製造を説明する。２つの異なる活性化剤を用いて試薬
を製造した。試薬は、本発明の範囲外のコポリマーを用
いて同様にして製造した対照試験に比較した。
【００７２】コポリマーは次の通りであった： 試験Ａ：ポリ（スチレン−コ−モノ−２−メタクリロイ
ルオキシエチルグルタレート）（モル比９７．８４：
２．１６）， 試験Ｂ：ポリ（スチレン−コ−モノ−ｍ＆ｐ−ビニルベ
ンジルグルタレート）（モル比９７．８：２．２）， 試験Ｃ：ポリ［スチレン−コ−モノメタクリロイルペン
タ（オキシエチレン）グルタレート］（モル比９８．
７：１．３）， 対照 ：ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）（モル比９
５：５）。
ルオキシエチルグルタレート）（モル比９７．８４：
２．１６）， 試験Ｂ：ポリ（スチレン−コ−モノ−ｍ＆ｐ−ビニルベ
ンジルグルタレート）（モル比９７．８：２．２）， 試験Ｃ：ポリ［スチレン−コ−モノメタクリロイルペン
タ（オキシエチレン）グルタレート］（モル比９８．
７：１．３）， 対照 ：ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）（モル比９
５：５）。
【００７３】カルバモイルオニウム化合物：（ａ）１−
（４−モルホリノカルボニル）−４−（２−スルホエチ
ル）ピリジニウムヒドロキシド、内部塩、または（ｂ）
１−（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウムクロ
リドのいずれかを活性化剤として用いたこれらのポリマ
ーのカルボキシ基にタンパク質を結合させた。同一条件
下で全てのポリマーを処理した。最終分散液は２−（４
−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐ
Ｈ５．５）中にポリマー粒子ｇ当り３Ｈウシガンマグロ
ブリン１％、粒子乾燥重量３０ｍｇ当りタンパク質０．
３ｍｇを含んでいた。活性化剤の量は管当り（ａ）１
６．６ｍｇまたは（ｂ）９．６ｍｇであった。
（４−モルホリノカルボニル）−４−（２−スルホエチ
ル）ピリジニウムヒドロキシド、内部塩、または（ｂ）
１−（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウムクロ
リドのいずれかを活性化剤として用いたこれらのポリマ
ーのカルボキシ基にタンパク質を結合させた。同一条件
下で全てのポリマーを処理した。最終分散液は２−（４
−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐ
Ｈ５．５）中にポリマー粒子ｇ当り３Ｈウシガンマグロ
ブリン１％、粒子乾燥重量３０ｍｇ当りタンパク質０．
３ｍｇを含んでいた。活性化剤の量は管当り（ａ）１
６．６ｍｇまたは（ｂ）９．６ｍｇであった。
【００７４】これらの分散液は、粒子（乾燥重量３０ｍ
ｇ）の懸濁液を大きなミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕ
ｇｅ）管中に入れることによって調製し、各々を前記緩
衝液を用いて容量１．５ｍｌとした。得られた懸濁液を
１４，０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離した。各
管に緩衝液（１ｍｌ，０．１Ｍ）を加え、次いで、活性
化剤の溶液（３００μＬ）を加えた。活性化剤（ａ）の
溶液は、０．１Ｍ緩衝液３．６ｍｌ中に１９９ｍｇを溶
解させることによって調製し、活性化剤の溶液（ｂ）は
０．１Ｍ緩衝液３．６ｍｌ中に１１５ｍｇを溶解するこ
とによって調製した。次いで、管を蓋締めし、室温にお
いて１０分間転倒型で回転させた。標識タンパク質（１
０ｍｇ／ｍｌ）の溶液（３０μＬ）を各管に加え、次に
室温で４時間転倒型で回転させた。
ｇ）の懸濁液を大きなミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕ
ｇｅ）管中に入れることによって調製し、各々を前記緩
衝液を用いて容量１．５ｍｌとした。得られた懸濁液を
１４，０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離した。各
管に緩衝液（１ｍｌ，０．１Ｍ）を加え、次いで、活性
化剤の溶液（３００μＬ）を加えた。活性化剤（ａ）の
溶液は、０．１Ｍ緩衝液３．６ｍｌ中に１９９ｍｇを溶
解させることによって調製し、活性化剤の溶液（ｂ）は
０．１Ｍ緩衝液３．６ｍｌ中に１１５ｍｇを溶解するこ
とによって調製した。次いで、管を蓋締めし、室温にお
いて１０分間転倒型で回転させた。標識タンパク質（１
０ｍｇ／ｍｌ）の溶液（３０μＬ）を各管に加え、次に
室温で４時間転倒型で回転させた。
【００７５】タンパク質と粒子上のカルボキシ基との反
応は、各管にウシ血清アルブミン（２５０μＬ，タンパ
ク質１００ｍｇ／リットル）を加えることによって抑え
た。次いで、室温においてさらに１６時間、管を再び回
転させ、各反応混合物（２５０μＬ）を除去して全標識
タンパク質を定量した。
応は、各管にウシ血清アルブミン（２５０μＬ，タンパ
ク質１００ｍｇ／リットル）を加えることによって抑え
た。次いで、室温においてさらに１６時間、管を再び回
転させ、各反応混合物（２５０μＬ）を除去して全標識
タンパク質を定量した。
【００７６】各反応混合物のサンプル（５００μＬ）を
また、除去し、緩衝液（４００μＬ，０．１Ｍ）及びド
デシル硫酸ナトリウム（脱イオン蒸留水中１０％溶液１
００μＬ）によっ処理した。得られた混合物を、４５゜
の角度で取り付けられた回転円盤上で３７℃において１
６時間混転することによって混合した（界面活性剤によ
る処理によって吸着されたが共有結合していないタンパ
ク質が粒子から除去された）。反応混合物を遠心分離
し、アリコート（各５００μＬ）を除去して遊離標識タ
ンパク質の量を測定した。
また、除去し、緩衝液（４００μＬ，０．１Ｍ）及びド
デシル硫酸ナトリウム（脱イオン蒸留水中１０％溶液１
００μＬ）によっ処理した。得られた混合物を、４５゜
の角度で取り付けられた回転円盤上で３７℃において１
６時間混転することによって混合した（界面活性剤によ
る処理によって吸着されたが共有結合していないタンパ
ク質が粒子から除去された）。反応混合物を遠心分離
し、アリコート（各５００μＬ）を除去して遊離標識タ
ンパク質の量を測定した。
【００７７】以下の表１中に、粒子に結合した３Ｈウシ
ガンマグロブリンの総量、粒子に共有結合した３Ｈウシ
ガンマグロブリンの量及び共有結合／全結合の比を示
す。結果は、本発明に従って製造された試薬がイムノア
ッセイにおいて使用するための抗体に許容され得る程度
に結合することを示す。
ガンマグロブリンの総量、粒子に共有結合した３Ｈウシ
ガンマグロブリンの量及び共有結合／全結合の比を示
す。結果は、本発明に従って製造された試薬がイムノア
ッセイにおいて使用するための抗体に許容され得る程度
に結合することを示す。
【００７８】
【００７９】実施例２：抗チロキシン抗体を含む試薬 この実施例は、ポリマー粒子に共有結合したチロキシン
に対する抗体分子を含む本発明の試薬の製造を説明す
る。標識ウシガンマグロブリンの代わりに抗体溶液（１
３０μＬ，タンパク質２．３ｍｇ／ｍｌ）を用いる以外
は、実施例１に記載された手法を用いて単クローン性抗
チロキシン抗体（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ／Ｖｅｎｔｒｅｘ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手）を同
一コポリマーに結合させた。両活性化剤（ａ）及び
（ｂ）を用いて試薬を調製した。反応を抑え、反応混合
物を遠心分離し、上澄み液をデカントし、粒子を燐酸塩
緩衝化生理的塩溶液（１ｍｌ，ｐＨ７．４）中に再懸濁
させた。この工程を４回繰り返し、最後の回の間に固形
分を燐酸塩緩衝化生理的塩溶液（１．８ｍｌ）中に再懸
濁させ、メルチオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）保
存剤（０．０２％）を加えた。
に対する抗体分子を含む本発明の試薬の製造を説明す
る。標識ウシガンマグロブリンの代わりに抗体溶液（１
３０μＬ，タンパク質２．３ｍｇ／ｍｌ）を用いる以外
は、実施例１に記載された手法を用いて単クローン性抗
チロキシン抗体（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ／Ｖｅｎｔｒｅｘ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手）を同
一コポリマーに結合させた。両活性化剤（ａ）及び
（ｂ）を用いて試薬を調製した。反応を抑え、反応混合
物を遠心分離し、上澄み液をデカントし、粒子を燐酸塩
緩衝化生理的塩溶液（１ｍｌ，ｐＨ７．４）中に再懸濁
させた。この工程を４回繰り返し、最後の回の間に固形
分を燐酸塩緩衝化生理的塩溶液（１．８ｍｌ）中に再懸
濁させ、メルチオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）保
存剤（０．０２％）を加えた。
【００８０】得られた分散液中の活性抗体の相対量を、
試薬分散液の連続希釈を一定濃度のアルカリホスファタ
ーゼ及びチロキシンの酵素標識類似体（Ｉｔｏらによっ
てＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３０（１０），１６８２〜１
６８５頁、１９８４年に記載されたようにして調製し
た）と混合するアッセイにおいて測定した。希釈度はウ
シ血清アルブミン（１％）を含む燐酸塩緩衝化生理的塩
溶液中において室温で約１時間絶えず撹拌しながらイン
キュベートした。遠心分離後に溶液中に残っている標識
類似体の量を測定し、類似体５０％を結合するのに必要
なチロキシン結合部位の濃度を計算した。結果を表２中
に次のように要約する。これらのデータは、本発明の試
薬がいずれの活性化剤を用いても、対照試薬よりもかな
り低い（３〜５倍）濃度において標識類似体を結合する
ことを示す。
試薬分散液の連続希釈を一定濃度のアルカリホスファタ
ーゼ及びチロキシンの酵素標識類似体（Ｉｔｏらによっ
てＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３０（１０），１６８２〜１
６８５頁、１９８４年に記載されたようにして調製し
た）と混合するアッセイにおいて測定した。希釈度はウ
シ血清アルブミン（１％）を含む燐酸塩緩衝化生理的塩
溶液中において室温で約１時間絶えず撹拌しながらイン
キュベートした。遠心分離後に溶液中に残っている標識
類似体の量を測定し、類似体５０％を結合するのに必要
なチロキシン結合部位の濃度を計算した。結果を表２中
に次のように要約する。これらのデータは、本発明の試
薬がいずれの活性化剤を用いても、対照試薬よりもかな
り低い（３〜５倍）濃度において標識類似体を結合する
ことを示す。
【００８１】
【００８２】実施例３：粒子に共有結合したオリゴヌク
レオチドを含む試薬 この実施例は、問題の核酸に対して相補的であるオリゴ
ヌクレオチド（または核酸）を含む本発明の試薬の製造
を説明する。ポリ（スチレン−コ−モノ−ｍ＆ｐ−ビニ
ルベンジルグルタレート（モル比９７．８：２．２）粒
子のサンプル（５０ｍｇ，１３．１８％懸濁液０．３７
９ｍｌ）を２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸緩
衝液（５ｍｌ，０．１Ｍ，ｐＨ６）に加えた。得られた
懸濁液を３，２００ｒｐｍにおいて遠心分離し、ポリマ
ー粒子をペレット化した。上澄み液をデカントした後、
粒子を遠心管中で緩衝液（５ｍｌ）中に再懸濁させた。
これに、活性化剤、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロ
ピル］−Ｎ′−エチルカルボジイミドヒドロクロリド
（１８．８ｍｇ）、次いでβ−グロビンＤＮＡに対して
相補的な以下の配列：
レオチドを含む試薬 この実施例は、問題の核酸に対して相補的であるオリゴ
ヌクレオチド（または核酸）を含む本発明の試薬の製造
を説明する。ポリ（スチレン−コ−モノ−ｍ＆ｐ−ビニ
ルベンジルグルタレート（モル比９７．８：２．２）粒
子のサンプル（５０ｍｇ，１３．１８％懸濁液０．３７
９ｍｌ）を２−（４−モルホリノ）エタンスルホン酸緩
衝液（５ｍｌ，０．１Ｍ，ｐＨ６）に加えた。得られた
懸濁液を３，２００ｒｐｍにおいて遠心分離し、ポリマ
ー粒子をペレット化した。上澄み液をデカントした後、
粒子を遠心管中で緩衝液（５ｍｌ）中に再懸濁させた。
これに、活性化剤、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロ
ピル］−Ｎ′−エチルカルボジイミドヒドロクロリド
（１８．８ｍｇ）、次いでβ−グロビンＤＮＡに対して
相補的な以下の配列：
【００８３】５′−Ｘ−ＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧ ＡＣＡ
ＣＣＡＴＧＧＴ ＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣ−３′
ＣＣＡＴＧＧＴ ＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣ−３′
【００８４】［式中、Ｘは構造：
【化１１】
【００８５】を有する、ＵＳ−Ａ−４，９１４，２１０
教示に従って結合されたテトラエチレングリコールアミ
ンリンカーを表す］を有するオリゴヌクレオチド（光学
濃度０．６２５，１．８７５ｎｍｏｌｅ）を加えた。管
を蓋締めし、室温において１８時間転倒型で回転した。
教示に従って結合されたテトラエチレングリコールアミ
ンリンカーを表す］を有するオリゴヌクレオチド（光学
濃度０．６２５，１．８７５ｎｍｏｌｅ）を加えた。管
を蓋締めし、室温において１８時間転倒型で回転した。
【００８６】次いで、懸濁液を３，２００ｒｐｍにおい
て遠心分離し、上澄み液をデカントし、固形分をメルチ
オレート（０．０１％）を含むグリシン（０．１Ｍ，ｐ
Ｈ８．５）中に再懸濁させた。この洗浄法を２回繰り返
した。最終懸濁液は、分光光度的光散乱を用いて測定し
たところ、試薬の固形分０．８７％を含んでいた。
て遠心分離し、上澄み液をデカントし、固形分をメルチ
オレート（０．０１％）を含むグリシン（０．１Ｍ，ｐ
Ｈ８．５）中に再懸濁させた。この洗浄法を２回繰り返
した。最終懸濁液は、分光光度的光散乱を用いて測定し
たところ、試薬の固形分０．８７％を含んでいた。
【００８７】実施例４：ヒト絨毛性ゴナドトロピンに対
する抗体を含む試薬 この実施例は実施例２と同様である。これはイムノアッ
セイにおいて有用な試薬の製造を説明する。 実施例３
に記載したポリマー粒子のサンプル（１０ｍｇ，１５．
２％懸濁液６５．８μＬ）を２−（４−モルホリノ）エ
タンスルホン酸緩衝液（１ｍｌ，０．１Ｍ，ｐＨ６）に
加えた。得られた懸濁液を３，２００ｒｐｍにおいて遠
心分離して、ポリマー粒子をペレット化した。上澄み液
をデカントした後、粒子を遠心管中において緩衝液（１
ｍｌ）中に懸濁させた。これに活性化剤、Ｎ−［３−
（ジメチルアミノ）プロピル］−Ｎ′−エチルカルボジ
イミドヒドロクロリド（３．７６ｍｇ）を加えた。管を
蓋締めし、室温において１０分間、転倒型で回転した。
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のβサブユニット
に対するアフィニティ精製ヤギ抗体（０．１２３ｍｇ）
を管に加え、再び１８時間回転した。懸濁液を３，２０
０ｒｐｍにおいて遠心分離し、上澄み液を廃棄し、ペレ
ットを、メルチオレート（０．０１％）を含むグリシン
（０．１Ｍ，ｐＨ８．５）中に再懸濁させた。この手法
を２回繰り返して、粒子に共有結合した抗体を含む本発
明の試薬が提供される。
する抗体を含む試薬 この実施例は実施例２と同様である。これはイムノアッ
セイにおいて有用な試薬の製造を説明する。 実施例３
に記載したポリマー粒子のサンプル（１０ｍｇ，１５．
２％懸濁液６５．８μＬ）を２−（４−モルホリノ）エ
タンスルホン酸緩衝液（１ｍｌ，０．１Ｍ，ｐＨ６）に
加えた。得られた懸濁液を３，２００ｒｐｍにおいて遠
心分離して、ポリマー粒子をペレット化した。上澄み液
をデカントした後、粒子を遠心管中において緩衝液（１
ｍｌ）中に懸濁させた。これに活性化剤、Ｎ−［３−
（ジメチルアミノ）プロピル］−Ｎ′−エチルカルボジ
イミドヒドロクロリド（３．７６ｍｇ）を加えた。管を
蓋締めし、室温において１０分間、転倒型で回転した。
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のβサブユニット
に対するアフィニティ精製ヤギ抗体（０．１２３ｍｇ）
を管に加え、再び１８時間回転した。懸濁液を３，２０
０ｒｐｍにおいて遠心分離し、上澄み液を廃棄し、ペレ
ットを、メルチオレート（０．０１％）を含むグリシン
（０．１Ｍ，ｐＨ８．５）中に再懸濁させた。この手法
を２回繰り返して、粒子に共有結合した抗体を含む本発
明の試薬が提供される。
【００８８】実施例５〜７：フェノバルビタール、フェ
ニトイン及びジゴキシンに対する抗体を含む試薬 これらの実施例は溶液及び乾燥競合的結合アッセイにお
いて有用な本発明の試薬の製造を説明する。実施例１中
に使用したポリマー粒子の懸濁液を用いた［試験Ａ〜Ｃ
及び対照（ただし、対照のポリマー粒子はモル比９６．
６５：３．３５を有していた）］。使用した活性化剤は
１−（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウムクロ
リドであった。粒子全てを同様に処理した。最終分散液
は抗体（実施例５の場合には抗フェニトイン、実施例６
の場合には抗フェノバルビタール及び実施例７の場合に
は抗ジゴキシン）、２−（４−モルホリノ）−エタンス
ルホン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ５．５）中粒子乾燥重
量３０ｍｇ当りタンパク質０．３ｍｇ、及び活性化剤
（１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ粒子、すなわち、０．０４５ｍ
ｍｏｌｅ）を含んでいた。
ニトイン及びジゴキシンに対する抗体を含む試薬 これらの実施例は溶液及び乾燥競合的結合アッセイにお
いて有用な本発明の試薬の製造を説明する。実施例１中
に使用したポリマー粒子の懸濁液を用いた［試験Ａ〜Ｃ
及び対照（ただし、対照のポリマー粒子はモル比９６．
６５：３．３５を有していた）］。使用した活性化剤は
１−（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウムクロ
リドであった。粒子全てを同様に処理した。最終分散液
は抗体（実施例５の場合には抗フェニトイン、実施例６
の場合には抗フェノバルビタール及び実施例７の場合に
は抗ジゴキシン）、２−（４−モルホリノ）−エタンス
ルホン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ５．５）中粒子乾燥重
量３０ｍｇ当りタンパク質０．３ｍｇ、及び活性化剤
（１．５ｍｍｏｌｅ／ｇ粒子、すなわち、０．０４５ｍ
ｍｏｌｅ）を含んでいた。
【００８９】これらの分散液は、粒子（乾燥重量３０ｍ
ｇ）の懸濁液を大きなミクロフュージ管中に入れること
によって調製し、各々を前記緩衝液を用いて容量１．５
ｍｌとした。得られた懸濁液を１３，０００ｒｐｍにお
いて１５分間遠心分離し、上澄み液を廃棄した。各管に
緩衝液（１ｍｌ，０．１Ｍ）を加え、次いで活性化剤
（緩衝液中０．１５Ｍの溶液０．３ｍｌ）を加えた。次
いで、管を蓋締めし、室温において１０分間転倒型で回
転させた。抗体の溶液を各管に加えた：抗一フェニトイ
ン（４．３ｍｇ／ｍｌ）０．０７ｍｌ、抗−フェノバル
ビタール（２．６ｍｇ／ｍｌ）０．１１５ｍｌ及び抗−
ジゴキシン（１．５３ｍｇ／ｍｌ）０．１９６ｍｌ（そ
れぞれ全抗体０．３ｍｇ）。次に室温で４時間転倒型で
回転させた。
ｇ）の懸濁液を大きなミクロフュージ管中に入れること
によって調製し、各々を前記緩衝液を用いて容量１．５
ｍｌとした。得られた懸濁液を１３，０００ｒｐｍにお
いて１５分間遠心分離し、上澄み液を廃棄した。各管に
緩衝液（１ｍｌ，０．１Ｍ）を加え、次いで活性化剤
（緩衝液中０．１５Ｍの溶液０．３ｍｌ）を加えた。次
いで、管を蓋締めし、室温において１０分間転倒型で回
転させた。抗体の溶液を各管に加えた：抗一フェニトイ
ン（４．３ｍｇ／ｍｌ）０．０７ｍｌ、抗−フェノバル
ビタール（２．６ｍｇ／ｍｌ）０．１１５ｍｌ及び抗−
ジゴキシン（１．５３ｍｇ／ｍｌ）０．１９６ｍｌ（そ
れぞれ全抗体０．３ｍｇ）。次に室温で４時間転倒型で
回転させた。
【００９０】抗体と活性化粒子との反応は、各管にウシ
血清アルブミン（３００μＬ，タンパク質１００ｍｇ／
ｍｌ）を加えることによって抑えた。次いで、室温にお
いてさらに１６時間、管を再び回転させ、遠心分離し、
次のＥＬＩＳＡ分析のために上澄み液を除去し、燐酸緩
衝化生理的塩溶液（１ｍｌ，ｐＨ７．４）中に再懸濁さ
せた。この工程を３回繰り返し、最終再懸濁液はメルチ
オレート（０．０２％）を含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶
液（１．８ｍｌ）中であった。
血清アルブミン（３００μＬ，タンパク質１００ｍｇ／
ｍｌ）を加えることによって抑えた。次いで、室温にお
いてさらに１６時間、管を再び回転させ、遠心分離し、
次のＥＬＩＳＡ分析のために上澄み液を除去し、燐酸緩
衝化生理的塩溶液（１ｍｌ，ｐＨ７．４）中に再懸濁さ
せた。この工程を３回繰り返し、最終再懸濁液はメルチ
オレート（０．０２％）を含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶
液（１．８ｍｌ）中であった。
【００９１】反応混合物からの上澄み液をＥＬＩＳＡに
よって全抗体濃度について分析した。ＥＬＩＳＡの結果
から粒子に共有結合した抗体の量を計算した。試薬の連
続希釈を一定濃度の接合体：アルカリホスファターゼ−
標識フェニトイン、アルカリホスファターゼ−標識フェ
ノバルビタールまたは西洋わさびペルオキシダーゼ−標
識ジゴキシンと混合するアッセイにおいて標本中の活性
抗体の相対量を測定した。希釈試薬分散液と酵素標識類
似体との反応は、室温において１時間、０．１または１
％ウシ血清アルブミンを含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶液
中において絶えす撹拌しながらインキュベートした。遠
心分離後に上澄み液中に残る酵素標識類似体の量を測定
し、酵素標識類似体の５０％を結合するのに必要な抗体
結合部位の濃度を計算した。結果を以下のように表３中
に要約する。
よって全抗体濃度について分析した。ＥＬＩＳＡの結果
から粒子に共有結合した抗体の量を計算した。試薬の連
続希釈を一定濃度の接合体：アルカリホスファターゼ−
標識フェニトイン、アルカリホスファターゼ−標識フェ
ノバルビタールまたは西洋わさびペルオキシダーゼ−標
識ジゴキシンと混合するアッセイにおいて標本中の活性
抗体の相対量を測定した。希釈試薬分散液と酵素標識類
似体との反応は、室温において１時間、０．１または１
％ウシ血清アルブミンを含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶液
中において絶えす撹拌しながらインキュベートした。遠
心分離後に上澄み液中に残る酵素標識類似体の量を測定
し、酵素標識類似体の５０％を結合するのに必要な抗体
結合部位の濃度を計算した。結果を以下のように表３中
に要約する。
【００９２】
【００９３】結果は、結合部位の５０％を結合するのに
対照の一部として固定された同一の抗体に比べて少ない
試薬を必要とするので、実施例５及び６の試薬はそれぞ
れ、活性が高いことが示される。実施例７において、フ
ェルバルビタール試薬は対照より優れた活性を示した
が、他の２種の試薬は対照よりわずかに活性が低かっ
た。
対照の一部として固定された同一の抗体に比べて少ない
試薬を必要とするので、実施例５及び６の試薬はそれぞ
れ、活性が高いことが示される。実施例７において、フ
ェルバルビタール試薬は対照より優れた活性を示した
が、他の２種の試薬は対照よりわずかに活性が低かっ
た。
【００９４】実施例８〜９：ヨウ素化タンパク質を含む
試薬 これらの例は、ポリマー粒子に共有結合したヨウ素化ウ
シガンマグロブリンを含む本発明の試薬の製造を示す。
粒子はすべて同様に処理し、最終反応分散液は２−（４
−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐ
Ｈ５．５）中に１２５Ｉ−ウシ血清ガンマグロブリン
（０．３ｍｇ）、ポリマー粒子（乾燥重量３０ｍｇ）、
１−（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウムクロ
リド活性化剤（０．５ｍｍｏｌｅ／ｇ粒子）を含んでい
た。
試薬 これらの例は、ポリマー粒子に共有結合したヨウ素化ウ
シガンマグロブリンを含む本発明の試薬の製造を示す。
粒子はすべて同様に処理し、最終反応分散液は２−（４
−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐ
Ｈ５．５）中に１２５Ｉ−ウシ血清ガンマグロブリン
（０．３ｍｇ）、ポリマー粒子（乾燥重量３０ｍｇ）、
１−（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウムクロ
リド活性化剤（０．５ｍｍｏｌｅ／ｇ粒子）を含んでい
た。
【００９５】使用した粒子は試験Ｂ（実施例８）、試験
Ｃ（実施例９）及び前記実施例１の対照として識別され
るものであった。粒子分散液のアリコートを２ｍｌミク
ロフュージ管中に入れ、緩衝液（０．１Ｍ）を全量１．
５ｍｌとなるように加えた。分散液を１３，０００ｒｐ
ｍにおいて１０分間遠心分離し、上澄み液を廃棄した。
ビーズを緩衝液（１ｍｌ）及び活性化剤（０．３ｍｌ，
０．１５Ｍ）中に再分散させた。間を蓋締めし、１０分
間転倒型で回転させた。ヨウ素化タンパク質の溶液を各
管に総量０．３ｍｇとなるように加え、一方のセットの
反応混合物を室温において６時間転倒型で回転し、他方
のセットは室温において５２時間転倒型で回転させた。
反応混合物を遠心分離し、上澄み液を除去して放射能に
ついて分析した。得られた試薬を燐酸塩緩衝化生理的塩
溶液（１ｍｌ）中に再懸濁させ、遠心分離し、ドデシル
硫酸ナトリウム（１％）中に再懸濁させ、放射能につい
て分析して、粒子に結合したヨウ素化タンパク質の総量
を測定した。
Ｃ（実施例９）及び前記実施例１の対照として識別され
るものであった。粒子分散液のアリコートを２ｍｌミク
ロフュージ管中に入れ、緩衝液（０．１Ｍ）を全量１．
５ｍｌとなるように加えた。分散液を１３，０００ｒｐ
ｍにおいて１０分間遠心分離し、上澄み液を廃棄した。
ビーズを緩衝液（１ｍｌ）及び活性化剤（０．３ｍｌ，
０．１５Ｍ）中に再分散させた。間を蓋締めし、１０分
間転倒型で回転させた。ヨウ素化タンパク質の溶液を各
管に総量０．３ｍｇとなるように加え、一方のセットの
反応混合物を室温において６時間転倒型で回転し、他方
のセットは室温において５２時間転倒型で回転させた。
反応混合物を遠心分離し、上澄み液を除去して放射能に
ついて分析した。得られた試薬を燐酸塩緩衝化生理的塩
溶液（１ｍｌ）中に再懸濁させ、遠心分離し、ドデシル
硫酸ナトリウム（１％）中に再懸濁させ、放射能につい
て分析して、粒子に結合したヨウ素化タンパク質の総量
を測定した。
【００９６】次いで、転倒型で混転しながら粒子を室温
においてドデシル硫酸ナトリウム（１％）中で１６時間
インキュベートして、吸着されたタンパク質は除去した
が共有結合したタンパク質は結合したままにした。試薬
をペレット化し、上澄み液を除去し、放射能について分
析し、次いで、ドデシル硫酸ナトリウム（１％）中に再
懸濁させた。試薬を再び、遠心分離し、上澄み液を廃棄
し、試薬を放射能について分析した。
においてドデシル硫酸ナトリウム（１％）中で１６時間
インキュベートして、吸着されたタンパク質は除去した
が共有結合したタンパク質は結合したままにした。試薬
をペレット化し、上澄み液を除去し、放射能について分
析し、次いで、ドデシル硫酸ナトリウム（１％）中に再
懸濁させた。試薬を再び、遠心分離し、上澄み液を廃棄
し、試薬を放射能について分析した。
【００９７】各試薬について粒子に共有結合したヨウ素
化タンパク質の％を以下のように表４中に示す。
化タンパク質の％を以下のように表４中に示す。
【００９８】これらの結果は、実施例８において使用し
たポリマー粒子は対照粒子よりも速くタンパク質と反応
するので、タンパク質と粒子との完全な反応に必要な時
間はより短いことを示す。これは製造上の利点である。
また、結合に必要な条件に感受性であり得る抗体は反応
時間がより短いためにそれらの条件によってはより奪活
されにくい点で有利である。反応の６時間後、実施例９
の粒子は対照と同様な優れた結果を提供しなかったが、
この実施例はそれがそれでも有用な試薬であることを証
明する。タンパク質と粒子カルボキシ基との反応の時間
が長いほど全粒子の完全な結合が起こる。これは、目的
の試薬を製造するためには種々のポリマー及びタンパク
質が種々の反応条件を必要とする可能性があることを示
し、それは当業者には容易に理解できることであろう。
たポリマー粒子は対照粒子よりも速くタンパク質と反応
するので、タンパク質と粒子との完全な反応に必要な時
間はより短いことを示す。これは製造上の利点である。
また、結合に必要な条件に感受性であり得る抗体は反応
時間がより短いためにそれらの条件によってはより奪活
されにくい点で有利である。反応の６時間後、実施例９
の粒子は対照と同様な優れた結果を提供しなかったが、
この実施例はそれがそれでも有用な試薬であることを証
明する。タンパク質と粒子カルボキシ基との反応の時間
が長いほど全粒子の完全な結合が起こる。これは、目的
の試薬を製造するためには種々のポリマー及びタンパク
質が種々の反応条件を必要とする可能性があることを示
し、それは当業者には容易に理解できることであろう。
【００９９】実施例１０：サイトメガロウィルスＤＮＡ
に対するオリゴヌクレオチドを含む試薬の製造 この実施例は、前述のようにしてカルボキシ含有コポリ
マーに共有結合したオリゴヌクレオチドを含む試薬の製
造を証明する。オリゴヌクレオチドはサイトメガロウィ
ルスＤＮＡの核酸配列に関する。ここで使用するオリゴ
ヌクレオチドは、活性化剤（Ｂｅｃｋｍａｎから入手さ
れるＡｃｔｉｖａｔｏｒ Ｇｏｌｄ）、追加の水性洗浄
工程（酸化前）及び４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピ
ロジンの代わりのキャッピング試薬としての１−メチル
イミダゾールにおいていくつかの改良をされたホスホア
ミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法によっ
てＢｉｏｓｅａｒｃｈ ８６５０ ＤＮＡ合成機を用い
て合成した。リンカー及びスペーサーに加えるためにオ
リゴヌクレオチドを誘導するのに使用する試薬はＵＳ−
Ａ−４，９１４，２１０中に記載されている。オリゴヌ
クレオチド試薬は、（１）３′−末端における単一のア
ミノリンカー（ＬＢ０９として識別）または（２）３′
−末端におけるアミノリンカー及び２個のテトラエチレ
ングリコールスペーサー（ＬＢ０８として識別）によっ
て設計された。オリゴヌクレオチド配列は標準塩基固定
（Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）を用いて以下の通りである：５′
−ＴＣＡＣＣＣＣＣＡＧ ＡＧＴＣＣＣＣＴＧＴ ＡＣ
ＣＣ−Ｘ−３′［ＬＢ０８の場合にはＸは２個のテトラ
エチレングリコールスペーサー単位に結合したアミンリ
ンカーを表し、ＬＢ０９に関してはＸは構造：
に対するオリゴヌクレオチドを含む試薬の製造 この実施例は、前述のようにしてカルボキシ含有コポリ
マーに共有結合したオリゴヌクレオチドを含む試薬の製
造を証明する。オリゴヌクレオチドはサイトメガロウィ
ルスＤＮＡの核酸配列に関する。ここで使用するオリゴ
ヌクレオチドは、活性化剤（Ｂｅｃｋｍａｎから入手さ
れるＡｃｔｉｖａｔｏｒ Ｇｏｌｄ）、追加の水性洗浄
工程（酸化前）及び４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピ
ロジンの代わりのキャッピング試薬としての１−メチル
イミダゾールにおいていくつかの改良をされたホスホア
ミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法によっ
てＢｉｏｓｅａｒｃｈ ８６５０ ＤＮＡ合成機を用い
て合成した。リンカー及びスペーサーに加えるためにオ
リゴヌクレオチドを誘導するのに使用する試薬はＵＳ−
Ａ−４，９１４，２１０中に記載されている。オリゴヌ
クレオチド試薬は、（１）３′−末端における単一のア
ミノリンカー（ＬＢ０９として識別）または（２）３′
−末端におけるアミノリンカー及び２個のテトラエチレ
ングリコールスペーサー（ＬＢ０８として識別）によっ
て設計された。オリゴヌクレオチド配列は標準塩基固定
（Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）を用いて以下の通りである：５′
−ＴＣＡＣＣＣＣＣＡＧ ＡＧＴＣＣＣＣＴＧＴ ＡＣ
ＣＣ−Ｘ−３′［ＬＢ０８の場合にはＸは２個のテトラ
エチレングリコールスペーサー単位に結合したアミンリ
ンカーを表し、ＬＢ０９に関してはＸは構造：
【０１００】
【化１２】
【０１０１】を有するスペーサーを含まない同一のアミ
ノリンカーを表す］。
ノリンカーを表す］。
【０１０２】精製された脱ブロックオリゴヌクレオチド
の５′−末端をδ３２Ｐ−ＡＴＰで燐酸化することによ
って３２Ｐで標識した。ＬＢ０８及びＬＢ０９［各々２
０μＬ中２．０ＯＤ（２６０ｎｍ）単位］を標識し、試
験において直接使用した。ＬＢ０８及びＬＢ０９オリゴ
ヌクレオチド（２μＬ）をここに示すような活性化ビー
ズサンプルに加えた。
の５′−末端をδ３２Ｐ−ＡＴＰで燐酸化することによ
って３２Ｐで標識した。ＬＢ０８及びＬＢ０９［各々２
０μＬ中２．０ＯＤ（２６０ｎｍ）単位］を標識し、試
験において直接使用した。ＬＢ０８及びＬＢ０９オリゴ
ヌクレオチド（２μＬ）をここに示すような活性化ビー
ズサンプルに加えた。
【０１０３】この実施例において使用したポリマー粒子
は以下の通りであった： ポリマーＡ：ポリ（スチレン−コ−モノ−２−メタクリ
ロイルオキシエチルグルタレート）（モル比９７．８：
２．２） ポリマーＢ：ポリ［スチレン−コ−モノ−ｍ＆ｐ−（６
０：４０）−ビニルベンジルグルタレート］（モル比９
７．７：２．２） ポリマーＣ：ポリ［スチレン−コ−モノメタクリロイル
−ペンタ（オキシエチレン）グルタレート］（モル比９
８．７：１．３） ポリマーＤ：ポリ［スチレン−コ−モノメタクリロイル
−デカ（オキシエチレン）グルタレート］（モル比９
８．３：１．７） ポリマーＥ：ポリ［スチレン−コ−モノ−２−（ｍ＆ｐ
（６０：４０）ビニルベンジルチオ）エチルグルタレー
ト］（モル比９８．３：１．７） ポリマーＦ：ポリ（スチレン−コ−モノ−ｐ−ビニルベ
ンジルグルタレート）（モル比９７．２：２．２） ポリマーＧ：ポリ［スチレン−コ−モノ−２−（ｐ−ビ
ニルベンジルチオ）エチルグルタレート）（モル比９
８．３：１．７） ポリマーＨ：ポリ［スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベ
ンジルチオ）プロピオン酸］（モル比９７．６：２．
４） 対照Ａ ：ポリ（スチレン−コ−３−アクリル酸）
（モル比９７．５：２．５） 対照Ｂ ：ポリ（スチレン−コ−３−アクリルアミド
−３−メチルブタン酸）（モル比９６．９：３．１）。
は以下の通りであった： ポリマーＡ：ポリ（スチレン−コ−モノ−２−メタクリ
ロイルオキシエチルグルタレート）（モル比９７．８：
２．２） ポリマーＢ：ポリ［スチレン−コ−モノ−ｍ＆ｐ−（６
０：４０）−ビニルベンジルグルタレート］（モル比９
７．７：２．２） ポリマーＣ：ポリ［スチレン−コ−モノメタクリロイル
−ペンタ（オキシエチレン）グルタレート］（モル比９
８．７：１．３） ポリマーＤ：ポリ［スチレン−コ−モノメタクリロイル
−デカ（オキシエチレン）グルタレート］（モル比９
８．３：１．７） ポリマーＥ：ポリ［スチレン−コ−モノ−２−（ｍ＆ｐ
（６０：４０）ビニルベンジルチオ）エチルグルタレー
ト］（モル比９８．３：１．７） ポリマーＦ：ポリ（スチレン−コ−モノ−ｐ−ビニルベ
ンジルグルタレート）（モル比９７．２：２．２） ポリマーＧ：ポリ［スチレン−コ−モノ−２−（ｐ−ビ
ニルベンジルチオ）エチルグルタレート）（モル比９
８．３：１．７） ポリマーＨ：ポリ［スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベ
ンジルチオ）プロピオン酸］（モル比９７．６：２．
４） 対照Ａ ：ポリ（スチレン−コ−３−アクリル酸）
（モル比９７．５：２．５） 対照Ｂ ：ポリ（スチレン−コ−３−アクリルアミド
−３−メチルブタン酸）（モル比９６．９：３．１）。
【０１０４】粒子を、以下の表５中に示した固形分％を
有する水性ラテックス分散液として提供した。オリゴヌ
クレオチドの結合は、２種の活性化剤：（ａ）Ｎ−（３
−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ′−エチ
ルカルボジイミドヒドロクロリド（試験１〜６について
は１７０ｍｇ／１．３５ｍｌ溶液１００μＬ、または試
験７〜１６については５３８ｍｇ／ｍｌ溶液１００μ
Ｌ）、及び（ｂ）１−（１−ピロリジニルカルボニル）
ピリジニウムクロリド（５３８ｍｇ／ｍｌ溶液１００μ
Ｌ）のいずれかを用いて行った。活性化剤を各分散液の
サンプルに加え、１０分間（試験１〜６）または２５分
間（試験７〜１６）反応させた。
有する水性ラテックス分散液として提供した。オリゴヌ
クレオチドの結合は、２種の活性化剤：（ａ）Ｎ−（３
−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ′−エチ
ルカルボジイミドヒドロクロリド（試験１〜６について
は１７０ｍｇ／１．３５ｍｌ溶液１００μＬ、または試
験７〜１６については５３８ｍｇ／ｍｌ溶液１００μ
Ｌ）、及び（ｂ）１−（１−ピロリジニルカルボニル）
ピリジニウムクロリド（５３８ｍｇ／ｍｌ溶液１００μ
Ｌ）のいずれかを用いて行った。活性化剤を各分散液の
サンプルに加え、１０分間（試験１〜６）または２５分
間（試験７〜１６）反応させた。
【０１０５】次いで、得られた活性化ポリマー粒子をい
ずれかの標識オリゴヌクレオチド（ＬＢ０８またはＬＢ
０９，２．０μＬ）で処理し、試験１〜６は混合後１時
間反応させ、試験７〜１６は混合後２．５時間反応させ
た。次いで、結合オリゴヌクレオチドを遠心分離（２分
間）によって分離し、放射能計数のために上澄み液をデ
カントした。得られた試薬を３回水洗し、再懸濁させ、
且つ遠心分離した。各試験からの合した上澄み液及び再
懸濁した試薬を次に放射能について評価し、結果を以下
の表５に示す。
ずれかの標識オリゴヌクレオチド（ＬＢ０８またはＬＢ
０９，２．０μＬ）で処理し、試験１〜６は混合後１時
間反応させ、試験７〜１６は混合後２．５時間反応させ
た。次いで、結合オリゴヌクレオチドを遠心分離（２分
間）によって分離し、放射能計数のために上澄み液をデ
カントした。得られた試薬を３回水洗し、再懸濁させ、
且つ遠心分離した。各試験からの合した上澄み液及び再
懸濁した試薬を次に放射能について評価し、結果を以下
の表５に示す。
【０１０６】結果は、粒子に共有結合したオリゴヌクレ
オチドの量（％）が本発明の試薬の場合には対照試薬に
比較して改良されたことを示す。いくつかの試験では他
よりはるかに優れた改良を示し、いくつかの試薬ではあ
る活性化剤の場合のみ改良を示した。これらのデータ
は、サイトメガロウィルスＤＮＡの検出のための実質的
に改良された試薬をいかにして見い出すかを当業者に示
唆するであろう。
オチドの量（％）が本発明の試薬の場合には対照試薬に
比較して改良されたことを示す。いくつかの試験では他
よりはるかに優れた改良を示し、いくつかの試薬ではあ
る活性化剤の場合のみ改良を示した。これらのデータ
は、サイトメガロウィルスＤＮＡの検出のための実質的
に改良された試薬をいかにして見い出すかを当業者に示
唆するであろう。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
【表２】
【０１０９】実施例１１：ヒト絨毛性ゴナドトロピンの
アッセイ この実施例は、本発明に試薬を用いてｈＣＧを検出する
本発明の実施を証明する。
アッセイ この実施例は、本発明に試薬を用いてｈＣＧを検出する
本発明の実施を証明する。
【０１１０】材料： 各々ＦｌｕｏｒａｄＴＭＦＣ１３５非イオン性界面活性
剤（０．０５ｇ／ｍ２）が塗布されたＬｏＰｒｏｄｙｎ
ｅＴＭ微孔質膜（５μｍ）を含むＳｕｒｅｃｅｌｌＴＭ
使い捨て試験装置を用いた。本発明の試薬は、活性化剤
として１−（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウ
ムクロリドを用いてポリ［スチレン−コ−３−（ｐ−ビ
ニルベンジルチオ）プロピオン酸］（モル比９７．６：
２．４）の粒子にアフィニティー精製ヤギ抗−ｈＣＧα
−多クローン性抗体を共有結合させることによって調製
した。抗体を結合させる手法は次の通りであった：
剤（０．０５ｇ／ｍ２）が塗布されたＬｏＰｒｏｄｙｎ
ｅＴＭ微孔質膜（５μｍ）を含むＳｕｒｅｃｅｌｌＴＭ
使い捨て試験装置を用いた。本発明の試薬は、活性化剤
として１−（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウ
ムクロリドを用いてポリ［スチレン−コ−３−（ｐ−ビ
ニルベンジルチオ）プロピオン酸］（モル比９７．６：
２．４）の粒子にアフィニティー精製ヤギ抗−ｈＣＧα
−多クローン性抗体を共有結合させることによって調製
した。抗体を結合させる手法は次の通りであった：
【０１１１】ポリマー粒子の懸濁液（固形分３％）をミ
クロフュージ管中、２−（４−モルホリノ）エタンスル
ホン酸緩衝液中において活性化剤（０．１Ｍ）を混合し
た。管を蓋締めし、室温において１０分間転倒型で回転
した。多クローン性抗体（１３．２ｍｇ／ ｍｌ）の溶
液（８１０μＬ）を管に加え、室温において１８時間転
倒型で回転させた。得られた試薬はポリマー粒子に共有
結合した理論的抗体の約９９％を含んでいた。
クロフュージ管中、２−（４−モルホリノ）エタンスル
ホン酸緩衝液中において活性化剤（０．１Ｍ）を混合し
た。管を蓋締めし、室温において１０分間転倒型で回転
した。多クローン性抗体（１３．２ｍｇ／ ｍｌ）の溶
液（８１０μＬ）を管に加え、室温において１８時間転
倒型で回転させた。得られた試薬はポリマー粒子に共有
結合した理論的抗体の約９９％を含んでいた。
【０１１２】グリシン緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ８．５）
中に試薬（０．９％）、ポリアクリルアミド（５％）、
ＵｖｉｔｅｘＴＭ色素（０．０１％）及びチメロサール
保存剤（０．０１％）を含んでなる組成物（２μＬ）
を、試験ウェル（サンプルウェルとも称する）の１つに
おいて 膜の限定された領域に沈着させた。
中に試薬（０．９％）、ポリアクリルアミド（５％）、
ＵｖｉｔｅｘＴＭ色素（０．０１％）及びチメロサール
保存剤（０．０１％）を含んでなる組成物（２μＬ）
を、試験ウェル（サンプルウェルとも称する）の１つに
おいて 膜の限定された領域に沈着させた。
【０１１３】ヤギガンマグロブリンを、同様な手法を用
いて同様な型の粒子に共有結合させ 、得られた試薬
を、別の試験ウェル（負の対照ウェルとも称する）中で
膜に沈着 させた。第３の試験ウェル（正の対照ウェル
とも称する）は、同様な型の粒子に 共有結合した抗−
ｈＣＧ抗体及び抗体にあらかじめ結合したｈＣＧ抗原を
含んで いた。
いて同様な型の粒子に共有結合させ 、得られた試薬
を、別の試験ウェル（負の対照ウェルとも称する）中で
膜に沈着 させた。第３の試験ウェル（正の対照ウェル
とも称する）は、同様な型の粒子に 共有結合した抗−
ｈＣＧ抗体及び抗体にあらかじめ結合したｈＣＧ抗原を
含んで いた。
【０１１４】試験溶液は、燐酸塩緩衝化生理的塩溶液
（塩化ナトリウム１５０ｍＭ，燐酸ナトリウム５０ｍ
Ｍ，ｐＨ６．２）、ウシ血清アルブミン（０．７％）及
びメルチオレート（０．０１％）の溶液中にｈＣＧ（５
０ｍＩ．Ｕ．／ｍｌ）を含んでいた。
（塩化ナトリウム１５０ｍＭ，燐酸ナトリウム５０ｍ
Ｍ，ｐＨ６．２）、ウシ血清アルブミン（０．７％）及
びメルチオレート（０．０１％）の溶液中にｈＣＧ（５
０ｍＩ．Ｕ．／ｍｌ）を含んでいた。
【０１１５】抗−ｈＣＧ単クローン性抗体と西洋わさび
ペルオキシダーゼとの接合体を、ヨシタケら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５（１９７９）に
よって記載された手法を用いて調製した。この接合体
を、ＬｏｎｚａｉｎｅＴＭＣ両性界面活性剤（０．１
％）を含むＭｅｄｉｘ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｄｉｌ
ｕｅｎｔと混合した。最終接合体濃度は３．３８μｇ／
ｍｌであった。
ペルオキシダーゼとの接合体を、ヨシタケら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，３９５（１９７９）に
よって記載された手法を用いて調製した。この接合体
を、ＬｏｎｚａｉｎｅＴＭＣ両性界面活性剤（０．１
％）を含むＭｅｄｉｘ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｄｉｌ
ｕｅｎｔと混合した。最終接合体濃度は３．３８μｇ／
ｍｌであった。
【０１１６】洗浄溶液は、燐酸ナトリウム（０．１Ｍ，
ｐＨ７．２）、デシル硫酸ナトリウム（１００ｍＭ，
２．７％）、塩化ナトリウム（０．３Ｍ）及びチメロサ
ール（０．０１％）から調製した。
ｐＨ７．２）、デシル硫酸ナトリウム（１００ｍＭ，
２．７％）、塩化ナトリウム（０．３Ｍ）及びチメロサ
ール（０．０１％）から調製した。
【０１１７】色素形成組成物は、２−（４−ヒドロキシ
−３−メトキシフェニル）−４，５−ビス（４−メトキ
シフェニル）イミダゾールロイコ色素（０．００５
％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、燐酸ナトリ
ウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ６．８）、ジエチレントリア
ミンペンタ酢酸（１０μＭ）、４′−ヒドロキシアセト
アニリド（２ｍＭ）及び過酸化水素（１０ｍＭ）を含む
ものであった。
−３−メトキシフェニル）−４，５−ビス（４−メトキ
シフェニル）イミダゾールロイコ色素（０．００５
％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、燐酸ナトリ
ウム緩衝液（５ｍＭ，ｐＨ６．８）、ジエチレントリア
ミンペンタ酢酸（１０μＭ）、４′−ヒドロキシアセト
アニリド（２ｍＭ）及び過酸化水素（１０ｍＭ）を含む
ものであった。
【０１１８】アッセイ法：ｈＣＧ（５０ｍＩ．Ｕ．／ｍ
ｌ）を含む試験溶液（１５０μＬ）を、試験装置の３つ
の試験ウェルに加え、膜を通して液体を排水させた。標
識抗体を含む緩衝化組成物（１滴、約４０μＬ）を各試
験ウェルに加え、排水させた。試験ウェルを２回洗浄し
（各回３００μＬ）、排水させた。次いで、色素形成組
成物（５０μＬ）を各試験ウェルに加え、排水させた。
室温で１分未満インキュベーション後、膜上の色素濃度
を、１０が最も高い濃度を示す色素濃度のカラーチャー
トと対照して評価した。試験ウェル中の、適用した組成
物の回りの領域をバックグラウンドとして評価した。ア
ッセイは３回実施した。
ｌ）を含む試験溶液（１５０μＬ）を、試験装置の３つ
の試験ウェルに加え、膜を通して液体を排水させた。標
識抗体を含む緩衝化組成物（１滴、約４０μＬ）を各試
験ウェルに加え、排水させた。試験ウェルを２回洗浄し
（各回３００μＬ）、排水させた。次いで、色素形成組
成物（５０μＬ）を各試験ウェルに加え、排水させた。
室温で１分未満インキュベーション後、膜上の色素濃度
を、１０が最も高い濃度を示す色素濃度のカラーチャー
トと対照して評価した。試験ウェル中の、適用した組成
物の回りの領域をバックグラウンドとして評価した。ア
ッセイは３回実施した。
【０１１９】結果は、３回の試験の各々について特定の
試験ウェル中に見られる可視色素濃度として、以下の表
６中に示す：
試験ウェル中に見られる可視色素濃度として、以下の表
６中に示す：
【０１２０】
【０１２１】これらのデータから、３つの別々のアッセ
イにおいて、本発明の試薬を用いて極めて低濃度のｈＣ
Ｇ（５０ｍＩ．Ｕ．）をゼロバックグラウンドによって
容易に検出できることが示される。
イにおいて、本発明の試薬を用いて極めて低濃度のｈＣ
Ｇ（５０ｍＩ．Ｕ．）をゼロバックグラウンドによって
容易に検出できることが示される。
【０１２２】比較のために、ポリ［スチレン−コ−ｍ＆
ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン］
（モル比９５．５：４．５）から同様にして調製した粒
子に共有結合した多クローン性抗体によって調製した対
照試薬を用いる以外は前記例を繰り返した（１９８９年
７月１２日に発行されたＥＰ−Ａ−０ ３２３ ６９２
中の教示を参照）。対照粒子の懸濁液（固形分３％）と
硼酸塩緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ８．５）とをミクロフュ
ージ管中で混合することによって抗体を結合させた。多
クローン性抗体（１３．２ｍｇ／ｍｌ）の溶液（８１０
μＬ）を管に加えた後、室温において１８時間転倒型で
回転させた。得られた試薬は、粒子に共有結合した理論
的抗体の９９％を含んでいた。
ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン］
（モル比９５．５：４．５）から同様にして調製した粒
子に共有結合した多クローン性抗体によって調製した対
照試薬を用いる以外は前記例を繰り返した（１９８９年
７月１２日に発行されたＥＰ−Ａ−０ ３２３ ６９２
中の教示を参照）。対照粒子の懸濁液（固形分３％）と
硼酸塩緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ８．５）とをミクロフュ
ージ管中で混合することによって抗体を結合させた。多
クローン性抗体（１３．２ｍｇ／ｍｌ）の溶液（８１０
μＬ）を管に加えた後、室温において１８時間転倒型で
回転させた。得られた試薬は、粒子に共有結合した理論
的抗体の９９％を含んでいた。
【０１２３】ｈＣＧ、接合体組成物、洗浄溶液及び色素
形成組成物を含む試験溶液は前記と同様であった。前記
手法を用いた対照アッセイの結果は以下のようであるこ
とがわかった：低濃度（５０ｍＩ．Ｕ．／ｍｌ）のｈＣ
Ｇでは色素形成がより少なく、背景は無視され得るもの
であった。アッセイは２分未満以内に実施したので、８
個の異なる試験についての色素シグナルは平均してわず
か１．９であった。それは、本発明によって提供される
結果（表６）よりもかなり低かった。
形成組成物を含む試験溶液は前記と同様であった。前記
手法を用いた対照アッセイの結果は以下のようであるこ
とがわかった：低濃度（５０ｍＩ．Ｕ．／ｍｌ）のｈＣ
Ｇでは色素形成がより少なく、背景は無視され得るもの
であった。アッセイは２分未満以内に実施したので、８
個の異なる試験についての色素シグナルは平均してわず
か１．９であった。それは、本発明によって提供される
結果（表６）よりもかなり低かった。
【０１２４】実施例１２：ＨＩＶ−ＩＤＮＡ検出のため
の試薬及びアッセイ この実施例は、ポリマー粒子に共有結合したオリゴヌク
レオチドを有する本発明のいくつかの試薬の製造、なら
びにＨＩＶ−ＩＤＮＡ、β−グロビンＤＮＡまたは両方
の検出のための核酸アッセイにおけるそれらの使用を説
明する。試薬をＬｏＰｒｏｄｙｎｅＴＭ微孔質膜（５μ
ｍ）上に試薬を固定する方法を実施する。
の試薬及びアッセイ この実施例は、ポリマー粒子に共有結合したオリゴヌク
レオチドを有する本発明のいくつかの試薬の製造、なら
びにＨＩＶ−ＩＤＮＡ、β−グロビンＤＮＡまたは両方
の検出のための核酸アッセイにおけるそれらの使用を説
明する。試薬をＬｏＰｒｏｄｙｎｅＴＭ微孔質膜（５μ
ｍ）上に試薬を固定する方法を実施する。
【０１２５】材料： 評価のための試薬を調製するのに使用したポリマーは以
下の通りである： 対照 ：ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）（モル
比９７．５：２．５） ポリマーＡ：ポリ（スチレン−コ−モノ−ｍ＆ｐ（６
０：４０）−ビニルベンジル グルタレー
ト（モル比９７．８４：２．１６） ポリマーＢ：ポリ［スチレン−コ−モノ−３−（ｐ−ビ
ニルベンジルチオ）プロピオン酸］（モル比９７．５
９：２．４１） ポリマーＣ：ポリ［スチレン−コ−モノ−２−（４−ビ
ニルベンジルチオ）エチルスクシネート］（モル比９
８．１７：１．８３） ポリマーＤ：ポリ（スチレン−コ−モノ−４−ビニルベ
ンジルスクシネート）（モル比９７．７１：２．２９）
下の通りである： 対照 ：ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）（モル
比９７．５：２．５） ポリマーＡ：ポリ（スチレン−コ−モノ−ｍ＆ｐ（６
０：４０）−ビニルベンジル グルタレー
ト（モル比９７．８４：２．１６） ポリマーＢ：ポリ［スチレン−コ−モノ−３−（ｐ−ビ
ニルベンジルチオ）プロピオン酸］（モル比９７．５
９：２．４１） ポリマーＣ：ポリ［スチレン−コ−モノ−２−（４−ビ
ニルベンジルチオ）エチルスクシネート］（モル比９
８．１７：１．８３） ポリマーＤ：ポリ（スチレン−コ−モノ−４−ビニルベ
ンジルスクシネート）（モル比９７．７１：２．２９）
【０１２６】試薬を調製するのに使用したオリゴヌクレ
オチドはｇａｇ領域においてＨＩＶ−ＩＤＮＡの一部分
に相補的なものであって、以下の核酸配列：
オチドはｇａｇ領域においてＨＩＶ−ＩＤＮＡの一部分
に相補的なものであって、以下の核酸配列：
【０１２７】５′−Ｘ−ＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡ ＡＴＡ
ＧＴＡＡＧＡＡＴ−３′［式中、ＸはＵＳ−Ａ−４，９
１４，２１０に従ってエチレングリコールスペーサーに
よってオリゴヌクレオチドに結合したアミノ基を表す］
を有する。
ＧＴＡＡＧＡＡＴ−３′［式中、ＸはＵＳ−Ａ−４，９
１４，２１０に従ってエチレングリコールスペーサーに
よってオリゴヌクレオチドに結合したアミノ基を表す］
を有する。
【０１２８】各ポリマーの粒子の懸濁液を、２−（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ
６）で洗浄した。粒子のサンプル（３０μｇ）を緩衝液
（１ｍｌ）中に懸濁させ、オリゴヌクレオチド（５７．
３ＯＤ／ｍｌ精製水の０．０２８８ｍｌ，１．６５ＯＤ
単位）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−
エチルカルボジイミドヒドロクロリド（１００ｍｇ／ｍ
ｌ緩衝液の０．１５ｍｌ）と混合した。得られた混合物
を室温において１５時間転倒型で回転させ、遠心分離し
た。試薬を精製水で３回洗浄し、固形分０．９％で精製
水中に再懸濁させた。
モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ
６）で洗浄した。粒子のサンプル（３０μｇ）を緩衝液
（１ｍｌ）中に懸濁させ、オリゴヌクレオチド（５７．
３ＯＤ／ｍｌ精製水の０．０２８８ｍｌ，１．６５ＯＤ
単位）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−
エチルカルボジイミドヒドロクロリド（１００ｍｇ／ｍ
ｌ緩衝液の０．１５ｍｌ）と混合した。得られた混合物
を室温において１５時間転倒型で回転させ、遠心分離し
た。試薬を精製水で３回洗浄し、固形分０．９％で精製
水中に再懸濁させた。
【０１２９】得られた試薬をＳｕｒｅｃｅｌｌＴＭ使い
捨て試験装置の試験ウェル中に位置する別々のＬｏＰｒ
ｏｄｙｎｅＴＭ微孔質膜上において直径２ｍｍ２未満の
一定の領域に沈着させ、室温で約３０分間乾燥させた。
得られた診断試験要素を次に下記のアッセイにおいて使
用した。
捨て試験装置の試験ウェル中に位置する別々のＬｏＰｒ
ｏｄｙｎｅＴＭ微孔質膜上において直径２ｍｍ２未満の
一定の領域に沈着させ、室温で約３０分間乾燥させた。
得られた診断試験要素を次に下記のアッセイにおいて使
用した。
【０１３０】ＨＩＶ−ＩＤＮＡの増幅において使用した
プライマーは以下の核酸配列を有していた：
プライマーは以下の核酸配列を有していた：
【０１３１】５′−Ｘ−ＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴ ＧＴＣ
ＴＴＡＴＧＴＣ ＣＡＧＡＡＴＧＣ−３′及び５′−Ａ
ＴＡＡＴＣＣＡＣＣ ＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡ ＧＧＡＧ
ＡＡＡＴ−３′［式中、ＸはＵＳ−Ａ−４，９１４，２
１０に従って調製し且つ結合させたビオチンテトラエチ
レングリコールエステルスペーサーを表す］。
ＴＴＡＴＧＴＣ ＣＡＧＡＡＴＧＣ−３′及び５′−Ａ
ＴＡＡＴＣＣＡＣＣ ＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡ ＧＧＡＧ
ＡＡＡＴ−３′［式中、ＸはＵＳ−Ａ−４，９１４，２
１０に従って調製し且つ結合させたビオチンテトラエチ
レングリコールエステルスペーサーを表す］。
【０１３２】β−グロビンＤＮＡの増幅において使用し
たプライマー配下の核酸配列を有していた：
たプライマー配下の核酸配列を有していた：
【０１３３】５′−Ｘ−ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣ ＣＡＣ
ＧＴＴＣＡＣＣ−３′及び５′−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴ
ＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−３′［式中、ＸはＵＳ−Ａ−
４，９１４，２１０に従って調製し且つ結合させたビオ
チンアミノリンカーを表す］。
ＧＴＴＣＡＣＣ−３′及び５′−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴ
ＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−３′［式中、ＸはＵＳ−Ａ−
４，９１４，２１０に従って調製し且つ結合させたビオ
チンアミノリンカーを表す］。
【０１３４】この実施例（及びこの出願の他の全ての実
施例）において使用した全てのプライマー及びオリゴヌ
クレオチドは、標準ホスホアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏ
ｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を用いて製造し、高速液体クロ
マトグラフィーによって精製し、標準配列法によって特
性決定した。
施例）において使用した全てのプライマー及びオリゴヌ
クレオチドは、標準ホスホアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏ
ｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を用いて製造し、高速液体クロ
マトグラフィーによって精製し、標準配列法によって特
性決定した。
【０１３５】ＤＮＡポリメラーゼはＵＳ−Ａ−４，８８
９，８１８に記載された手法に従ってＴｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離した（１単位は３７℃にお
いて３０分でプライマー拡張生成物中に組み込まれたｄ
ＮＴＰ１０ｍｍｏｌｅに対応する）。
９，８１８に記載された手法に従ってＴｈｅｒｍｕｓ
ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離した（１単位は３７℃にお
いて３０分でプライマー拡張生成物中に組み込まれたｄ
ＮＴＰ１０ｍｍｏｌｅに対応する）。
【０１３６】ストレプトアビジン−西洋わさびペルオキ
シダーゼ接合体をＺｙｍｅｄ Ｌａｂｓから入手し、カ
ゼイン（０．５％）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン
スルホン酸緩衝剤（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）及び保存
剤（０．０１％）を含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶液で
１：４０００に希釈した。最終接合体濃度は３１２ｎｇ
／ｍｌであった。燐酸塩緩衝化生理的塩溶液は燐酸ナト
リウム（２５ｍＭ，ｐＨ７．３）及び塩化ナトリウム
（７５ｍＭ）を含んでいた。
シダーゼ接合体をＺｙｍｅｄ Ｌａｂｓから入手し、カ
ゼイン（０．５％）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン
スルホン酸緩衝剤（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）及び保存
剤（０．０１％）を含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶液で
１：４０００に希釈した。最終接合体濃度は３１２ｎｇ
／ｍｌであった。燐酸塩緩衝化生理的塩溶液は燐酸ナト
リウム（２５ｍＭ，ｐＨ７．３）及び塩化ナトリウム
（７５ｍＭ）を含んでいた。
【０１３７】色素形成組成物は２−（４−ヒドロキシ−
３−メトキシフェニル）−４，５−ビス（４−メトキシ
フェニル）イミダゾールロイコ色素（０．００５％）、
ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、燐酸ナトリウム緩
衝剤（５ｍＭ，ｐＨ６．８）、ジエチレントリアミンペ
ンタ酢酸（１０μＭ）、４′−ヒドロキシアセトアニリ
ド（５ｍＭ）及び過酸化水素（１０ｍＭ）を含んでい
た。
３−メトキシフェニル）−４，５−ビス（４−メトキシ
フェニル）イミダゾールロイコ色素（０．００５％）、
ポリ（ビニルピロリドン）（１％）、燐酸ナトリウム緩
衝剤（５ｍＭ，ｐＨ６．８）、ジエチレントリアミンペ
ンタ酢酸（１０μＭ）、４′−ヒドロキシアセトアニリ
ド（５ｍＭ）及び過酸化水素（１０ｍＭ）を含んでい
た。
【０１３８】アッセイ：ＨＩＶ−Ｉ検出法は以下のよう
にして実施した。ＨＩＶ−ＩＤＮＡ標的を、Ｓｙｒａｃ
ｕｓｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ．Ｂｅｒｎｉｅ
Ｐｏｉｅｓｚから入手したＨＩＶウィルスゲノムの単一
組み込みコピー（ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ｃｏｐｙ）を含むＨＵＴ細胞系から単離した。
にして実施した。ＨＩＶ−ＩＤＮＡ標的を、Ｓｙｒａｃ
ｕｓｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｒ．Ｂｅｒｎｉｅ
Ｐｏｉｅｓｚから入手したＨＩＶウィルスゲノムの単一
組み込みコピー（ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ｃｏｐｙ）を含むＨＵＴ細胞系から単離した。
【０１３９】３種の標的サンプルを増幅及び検出方法に
供した： サンプルＡ：ＨＩＶ−ＩＤＮＡ標的、β−グロビンＤＮ
Ａ標的及びＨＩＶ−ＩＤＮＡ標的のみに対するプライマ
ーを含んでいた。 サンプルＢ：β−グロビンＤＮＡ標的及びそれのみに対
するプライマーを含んでいた。 サンプルＣ：両標的及び両標的に対するプライマーを含
んでいた。
供した： サンプルＡ：ＨＩＶ−ＩＤＮＡ標的、β−グロビンＤＮ
Ａ標的及びＨＩＶ−ＩＤＮＡ標的のみに対するプライマ
ーを含んでいた。 サンプルＢ：β−グロビンＤＮＡ標的及びそれのみに対
するプライマーを含んでいた。 サンプルＣ：両標的及び両標的に対するプライマーを含
んでいた。
【０１４０】標的ＨＩＶ−ＩＤＮＡを増幅するポリメラ
ーゼ連鎖反応のための混合物はトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン緩衝剤（１０ｍＭ，ｐＨ８）、塩化カ
リウム（５０ｍＭ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）、
ゼラチン（１０μｇ）、前記の適当なプライマー（各１
００ｐＭ）、ｄＮＴＰ（各々１．５ｍＭ）、前記ＤＮＡ
ポリメラーゼ（７．５単位）及び標的：β−グロビンＤ
ＮＡ（１μｇ）またはＨＩＶ−ＩＤＮＡ（約１０−１６
Ｍ）を含んでいた。各混合物の総量は１００μＬであっ
た。
ーゼ連鎖反応のための混合物はトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン緩衝剤（１０ｍＭ，ｐＨ８）、塩化カ
リウム（５０ｍＭ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）、
ゼラチン（１０μｇ）、前記の適当なプライマー（各１
００ｐＭ）、ｄＮＴＰ（各々１．５ｍＭ）、前記ＤＮＡ
ポリメラーゼ（７．５単位）及び標的：β−グロビンＤ
ＮＡ（１μｇ）またはＨＩＶ−ＩＤＮＡ（約１０−１６
Ｍ）を含んでいた。各混合物の総量は１００μＬであっ
た。
【０１４１】各反応混合物をポリプロピレンミクロ遠心
管に入れ、プライマー拡張生成物を形成し、標的核酸の
増幅を以下のようにして３０回の熱サイクルを用いて実
施した： ７０℃， ９５℃に上昇 １分間 ９５℃， ０．５分間 ９５℃， ５５℃に低下 １．２５分間 ５５℃， ０．５分間 ５５℃， ７０℃に上昇 ０．７５分間 ７０℃， １分間
管に入れ、プライマー拡張生成物を形成し、標的核酸の
増幅を以下のようにして３０回の熱サイクルを用いて実
施した： ７０℃， ９５℃に上昇 １分間 ９５℃， ０．５分間 ９５℃， ５５℃に低下 １．２５分間 ５５℃， ０．５分間 ５５℃， ７０℃に上昇 ０．７５分間 ７０℃， １分間
【０１４２】増幅後、各反応混合物のアリコート（５μ
Ｌ）を、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
剤（１０ｍＭ，ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ｍＭ）、
塩化マグネシウム（１０ｍＭ）及びゼラチン（１μＬ／
１０ｍｌ溶液）を含む溶液（９５μＬ）に加え、熱変性
させ（９５℃において５分間）、試薬が固定されたＳｕ
ｒｅｃｅｌｌＴＭ前記試験装置に加えた（各試験ウェル
中において各混合物約９５μＬ）。
Ｌ）を、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
剤（１０ｍＭ，ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ｍＭ）、
塩化マグネシウム（１０ｍＭ）及びゼラチン（１μＬ／
１０ｍｌ溶液）を含む溶液（９５μＬ）に加え、熱変性
させ（９５℃において５分間）、試薬が固定されたＳｕ
ｒｅｃｅｌｌＴＭ前記試験装置に加えた（各試験ウェル
中において各混合物約９５μＬ）。
【０１４３】各試験ウェルをテープで密封し、装置を４
２℃で５分間インキュベートして、試験ウェル中で固定
された水不溶性試薬に対して増幅された標的ＨＩＶ−Ｉ
ＤＮＡをハイブリッド形成させた。各試験ウェルから密
封テープを取り除き、５５℃において燐酸塩緩衝剤（２
０ｍＭ，ｐＨ７．４）、塩化ナトリウム（３００ｍＭ）
及びエチレンジアミン四酢酸（２ｍＭ）を含む緩衝化溶
液（２５０μＬ）で洗浄を行った。
２℃で５分間インキュベートして、試験ウェル中で固定
された水不溶性試薬に対して増幅された標的ＨＩＶ−Ｉ
ＤＮＡをハイブリッド形成させた。各試験ウェルから密
封テープを取り除き、５５℃において燐酸塩緩衝剤（２
０ｍＭ，ｐＨ７．４）、塩化ナトリウム（３００ｍＭ）
及びエチレンジアミン四酢酸（２ｍＭ）を含む緩衝化溶
液（２５０μＬ）で洗浄を行った。
【０１４４】ペルオキシダーゼ接合体（５０μＬ，１
５．６ｎｇ）を各試験ウェルに加え、試験装置を室温で
２分間インキュベートした。第２の洗浄（２５０μＬ）
を前記緩衝化溶液を用いて行った。次いで、色素形成組
成物（１００μＬ）を各試験ウェルに加え、次いで室温
で２分間もう一度インキュベートした。アジ化ナトリウ
ム（０．１％溶液１００μＬ）の添加によって色素形成
を停止させ、試験ウェル中の得られた赤色色素を目視評
価した。各アッセイを繰り返した。
５．６ｎｇ）を各試験ウェルに加え、試験装置を室温で
２分間インキュベートした。第２の洗浄（２５０μＬ）
を前記緩衝化溶液を用いて行った。次いで、色素形成組
成物（１００μＬ）を各試験ウェルに加え、次いで室温
で２分間もう一度インキュベートした。アジ化ナトリウ
ム（０．１％溶液１００μＬ）の添加によって色素形成
を停止させ、試験ウェル中の得られた赤色色素を目視評
価した。各アッセイを繰り返した。
【０１４５】色素形成の結果を、１０が最高色素濃度を
表す０〜１０の尺度で評価した。以下の表７の結果は、
各試薬及びサンプルに関する二重反復試験の読みであ
る。
表す０〜１０の尺度で評価した。以下の表７の結果は、
各試薬及びサンプルに関する二重反復試験の読みであ
る。
【０１４６】
【０１４７】これらの結果は、本発明の試薬が増幅され
たＨＩＶ−ＩＤＮＡの検出のためのプローブとしてうま
く使用されたことを示す。しかしながら、β−グロビン
ＤＮＡはその増幅後でさえ認知できる程度に検出されな
かったが、これはβ−グロビンＤＮＡに対して相補的な
オリゴヌクレオチドを含む捕獲試薬を用いなかったため
である。バックグラウンド色素濃度（サンプルＢ）は許
容され得る程度に低かった。
たＨＩＶ−ＩＤＮＡの検出のためのプローブとしてうま
く使用されたことを示す。しかしながら、β−グロビン
ＤＮＡはその増幅後でさえ認知できる程度に検出されな
かったが、これはβ−グロビンＤＮＡに対して相補的な
オリゴヌクレオチドを含む捕獲試薬を用いなかったため
である。バックグラウンド色素濃度（サンプルＢ）は許
容され得る程度に低かった。
【０１４８】実施例１３：ＨＩＶ−ＩＤＮＡ及びβ−グ
ロビンＤＮＡ検出のための試薬及びアッセイ この実施例は、ＨＩＶ−ＩＤＮＡ検出用の試薬の調製に
おいて種々のオリゴヌクレオチドを用い且つβ−グロビ
ンＤＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む試
薬を用いて標的核酸の増幅後にβ−グロビンＤＮＡも検
出する以外は実施例１２と同様にして実施した。
ロビンＤＮＡ検出のための試薬及びアッセイ この実施例は、ＨＩＶ−ＩＤＮＡ検出用の試薬の調製に
おいて種々のオリゴヌクレオチドを用い且つβ−グロビ
ンＤＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む試
薬を用いて標的核酸の増幅後にβ−グロビンＤＮＡも検
出する以外は実施例１２と同様にして実施した。
【０１４９】ＨＩＶ−ＩＤＮＡ検出のための試薬を、以
下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて調製し
た：
下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて調製し
た：
【０１５０】５′−Ｘ−ＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴ ＴＡＡ
ＡＴＡＡＡＡＴ ＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧ ＴＡＴＡＧＣ
ＣＣＴＡＣ−３′［式中、ＸはＵＳ−Ａ−４，９１４，
２１０に記載された手法を用いてスペーサーによってオ
リゴヌクレオチドに結合させたアミノ基である］。
ＡＴＡＡＡＡＴ ＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧ ＴＡＴＡＧＣ
ＣＣＴＡＣ−３′［式中、ＸはＵＳ−Ａ−４，９１４，
２１０に記載された手法を用いてスペーサーによってオ
リゴヌクレオチドに結合させたアミノ基である］。
【０１５１】β−グロビンＤＮＡ検出用の試薬を、以下
の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて調製した：
の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて調製した：
【０１５２】５′−Ｘ−ＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧ ＡＣＡ
ＣＣＡＴＧＧＴ ＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣ−３′［式
中、ＸはＵＳ−Ａ−４，９１４，２１０に記載された手
法を用いてオリゴヌクレオチドに結合させたアミノ基で
ある］。
ＣＣＡＴＧＧＴ ＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣ−３′［式
中、ＸはＵＳ−Ａ−４，９１４，２１０に記載された手
法を用いてオリゴヌクレオチドに結合させたアミノ基で
ある］。
【０１５３】３個の標的サンプルを、ＨＩＶ−ＩＤＮＡ
試薬及びβ−グロビンＤＮＡ試薬を用いて増幅及び検出
法に供した： サンプルＡ：ＨＩＶ−ＩＤＮＡ標的、β−グロビンＤＮ
Ａ標的及びＨＩＶ−ＩＤＮＡ標的のみに対するプライマ
ーを含んでいた。 サンプルＢ：β−グロビンＤＮＡ標的及びそれのみに対
するプライマーを含んでいた。 サンプルＣ：両標的及び両標的に対するプライマーを含
んでいた。
試薬及びβ−グロビンＤＮＡ試薬を用いて増幅及び検出
法に供した： サンプルＡ：ＨＩＶ−ＩＤＮＡ標的、β−グロビンＤＮ
Ａ標的及びＨＩＶ−ＩＤＮＡ標的のみに対するプライマ
ーを含んでいた。 サンプルＢ：β−グロビンＤＮＡ標的及びそれのみに対
するプライマーを含んでいた。 サンプルＣ：両標的及び両標的に対するプライマーを含
んでいた。
【０１５４】増幅は実施例１２に記載されたようにして
実施し、得られた色素濃度をここに示すようにして評価
した。試験結果を各試薬及び試験サンプルについて以下
の表８中に示す。
実施し、得られた色素濃度をここに示すようにして評価
した。試験結果を各試薬及び試験サンプルについて以下
の表８中に示す。
【０１５５】
【０１５６】実施例１４：ポリマーパウチ中におけるＨ
ＩＶ−ＩＤＮＡのアッセイ この実施例は、アッセイ用の試薬を保持するのに有用な
明確な形の容器を用いてＨＩＶ−ＩＤＮＡを検出する以
外は実施例１２と同様である。
ＩＶ−ＩＤＮＡのアッセイ この実施例は、アッセイ用の試薬を保持するのに有用な
明確な形の容器を用いてＨＩＶ−ＩＤＮＡを検出する以
外は実施例１２と同様である。
【０１５７】材料：ポリ（エチレンテレフタレート）上
のポリエチレンの貼合わせシートである、Ｓｃｏｔｃｈ
ｐａｋ ２４１ＴＭヒートシール可能なフィルム（３Ｍ
Ｃｏｒｐ．）の２枚のシートからアッセイ用の容器を
調製した。フィルムのポリエチレン側は熱活性化接着剤
として役立つ。溝を有する金型上にシートのうち１枚を
置き、ポリエチレンの融点未満の温度において加熱し、
熱緩和させながら、フィルムを溝の中に機械的に伸ばす
ことによって、１枚のシート中に流路を形成した。次い
で、流路形成片を、本発明の試薬（後記）が特定の領域
中に固定されたＳｃｏｔｃｈｐａｋ ２４１ＴＭヒート
シール可能なフィルムの第２の試験片とそろえた。これ
は、互いに向かい合う２枚のフィルムのポリエチレン表
面とそろえた。次いで、２枚のフィルムを流路の両側の
境界に沿ってヒートシールしたので、それらの両側に沿
って漏れはなかった。
のポリエチレンの貼合わせシートである、Ｓｃｏｔｃｈ
ｐａｋ ２４１ＴＭヒートシール可能なフィルム（３Ｍ
Ｃｏｒｐ．）の２枚のシートからアッセイ用の容器を
調製した。フィルムのポリエチレン側は熱活性化接着剤
として役立つ。溝を有する金型上にシートのうち１枚を
置き、ポリエチレンの融点未満の温度において加熱し、
熱緩和させながら、フィルムを溝の中に機械的に伸ばす
ことによって、１枚のシート中に流路を形成した。次い
で、流路形成片を、本発明の試薬（後記）が特定の領域
中に固定されたＳｃｏｔｃｈｐａｋ ２４１ＴＭヒート
シール可能なフィルムの第２の試験片とそろえた。これ
は、互いに向かい合う２枚のフィルムのポリエチレン表
面とそろえた。次いで、２枚のフィルムを流路の両側の
境界に沿ってヒートシールしたので、それらの両側に沿
って漏れはなかった。
【０１５８】得られた「検出流路」を用いて、「フロー
−バイ」アッセイ形態をシミュレートした。各検出流路
はサンプル導入のための入口、固定された本発明の試
薬、及び液体を流路から出させ且つ回収させる出口を有
していた。液体試薬は流路へ押し込まれて、固定された
試薬と接触させられてから、流路から出る。
−バイ」アッセイ形態をシミュレートした。各検出流路
はサンプル導入のための入口、固定された本発明の試
薬、及び液体を流路から出させ且つ回収させる出口を有
していた。液体試薬は流路へ押し込まれて、固定された
試薬と接触させられてから、流路から出る。
【０１５９】この実施例において使用する試薬は、実施
例１２のポリマーＢ、Ｃ及びＤを使用し且つその実施例
の手法を用いて調製した。得られた試薬（０．９％懸濁
液２μＬ）を、前記の個々のパウチの検出流路の一定の
領域（直径約２ｍｍ）上に沈着させ（流路寸法は約１９
ｍｍ×８ｍｍであった）、室温で乾燥させた。
例１２のポリマーＢ、Ｃ及びＤを使用し且つその実施例
の手法を用いて調製した。得られた試薬（０．９％懸濁
液２μＬ）を、前記の個々のパウチの検出流路の一定の
領域（直径約２ｍｍ）上に沈着させ（流路寸法は約１９
ｍｍ×８ｍｍであった）、室温で乾燥させた。
【０１６０】ＨＩＶ−ＩＤＮＡ標的及びプライマーは実
施例１２において使用したのと同一であった。ポリメラ
ーゼ連鎖反応のための反応混合物は、ゼラチンが０．０
１％で且つプライマーが各々、１μＭで存在する以外は
同一であった。
施例１２において使用したのと同一であった。ポリメラ
ーゼ連鎖反応のための反応混合物は、ゼラチンが０．０
１％で且つプライマーが各々、１μＭで存在する以外は
同一であった。
【０１６１】アッセイ：ＨＩＶ−ＩＤＮＡ標的（１０
−１６Ｍ）を含む溶液を、以下のプロトコールを用い
て、３０〜３３周期の間、標準サーモサイクラー上のポ
リメラーゼ連鎖ブリスター（ｃｈａｉｎ ｂｌｉｓｔｅ
ｒ）及びポリメラーゼ連鎖反応混合物（１００ｍｌ）を
用いて増幅した： ９４℃におけるインキュベーション
４秒、及び６５℃におけるインキュベーション３０秒。
−１６Ｍ）を含む溶液を、以下のプロトコールを用い
て、３０〜３３周期の間、標準サーモサイクラー上のポ
リメラーゼ連鎖ブリスター（ｃｈａｉｎ ｂｌｉｓｔｅ
ｒ）及びポリメラーゼ連鎖反応混合物（１００ｍｌ）を
用いて増幅した： ９４℃におけるインキュベーション
４秒、及び６５℃におけるインキュベーション３０秒。
【０１６２】緩衝剤溶液［トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン緩衝剤（１０ｍＭ，ｐＨ８．３）、塩化カ
リウム（５０ｍＭ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）及
びゼラチン（０．０１％）を含む］中における得られた
増幅反応混合物の５：９５希釈のサンプル（２００μ
Ｌ）を９５℃において５分間、管中で加熱して２本鎖標
的を変性させた。加熱した溶液をシリンジバレルに移
し、流路中において固定試薬の均一な付着量を保証する
ように各検出流路に注入した。次いで、４２℃において
５分間、各流路をインキュベートして、一本鎖ＨＩＶ−
Ｉ核酸標的に試薬をアニールした。空気によって液体を
追い出すことによって液体を検出流路から除去し、液体
をシリンジによって回収した。
アミノメタン緩衝剤（１０ｍＭ，ｐＨ８．３）、塩化カ
リウム（５０ｍＭ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）及
びゼラチン（０．０１％）を含む］中における得られた
増幅反応混合物の５：９５希釈のサンプル（２００μ
Ｌ）を９５℃において５分間、管中で加熱して２本鎖標
的を変性させた。加熱した溶液をシリンジバレルに移
し、流路中において固定試薬の均一な付着量を保証する
ように各検出流路に注入した。次いで、４２℃において
５分間、各流路をインキュベートして、一本鎖ＨＩＶ−
Ｉ核酸標的に試薬をアニールした。空気によって液体を
追い出すことによって液体を検出流路から除去し、液体
をシリンジによって回収した。
【０１６３】予熱した（５５℃）洗浄溶液を各検出流路
に注入した。この溶液は、燐酸二水素ナトリウム（１０
ｍＭ，ｐＨ７．４）、塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）、
エチレンジアミン四酢酸（１ｍＭ）及びデシル硫酸ナト
リウム（１％）を含んでなる緩衝剤溶液（４００μＬ）
からなるものであった。洗浄溶液を除去し、次いで、実
施例１２のストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシ
ダーゼ接合体（２００μＬ）を各検出流路中に注入し、
室温で２分間インキュベートした。液体を除去し、第２
の洗浄溶液（４００μＬ）を導入し、除去した。次い
で、実施例１２の色素形成組成物（２００μＬ）を各流
路に導入し、室温で１〜２分間インキュベートして除去
した。最後に、アジ化ナトリウムの溶液（０．１％溶液
２００μＬ）を導入して色素形成を停止させ、それを除
去した。
に注入した。この溶液は、燐酸二水素ナトリウム（１０
ｍＭ，ｐＨ７．４）、塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）、
エチレンジアミン四酢酸（１ｍＭ）及びデシル硫酸ナト
リウム（１％）を含んでなる緩衝剤溶液（４００μＬ）
からなるものであった。洗浄溶液を除去し、次いで、実
施例１２のストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシ
ダーゼ接合体（２００μＬ）を各検出流路中に注入し、
室温で２分間インキュベートした。液体を除去し、第２
の洗浄溶液（４００μＬ）を導入し、除去した。次い
で、実施例１２の色素形成組成物（２００μＬ）を各流
路に導入し、室温で１〜２分間インキュベートして除去
した。最後に、アジ化ナトリウムの溶液（０．１％溶液
２００μＬ）を導入して色素形成を停止させ、それを除
去した。
【０１６４】各流露中で形成された得られた色素を、１
０が最高色素濃度を示す０〜１０の尺度で目視によって
等級分けした。各試薬に関する３つの別々の試験の平均
について、読みの結果を以下の表９中に示す。
０が最高色素濃度を示す０〜１０の尺度で目視によって
等級分けした。各試薬に関する３つの別々の試験の平均
について、読みの結果を以下の表９中に示す。
【０１６５】
【０１６６】色素が形成される容器が、アッセイに必要
な全試薬及び溶液のための区分室及び反応のための別の
区分室を有する自蔵容器（またはパウチ）である同様な
実験を行って成功した。このような自蔵容器については
Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．３３９，９２３（前記）中により詳細
に述べられている。
な全試薬及び溶液のための区分室及び反応のための別の
区分室を有する自蔵容器（またはパウチ）である同様な
実験を行って成功した。このような自蔵容器については
Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．３３９，９２３（前記）中により詳細
に述べられている。
【０１６７】実施例１５：サイトメガロウィルスＤＮＡ
の検出に有用な試薬の製造 本実施例は、ハイブリッド形成またはポリメラーゼ連鎖
反応アッセイにおいて使用できるハイブリッド形成試薬
の新規製造方法を記載する。試薬はサイトメガロウィル
スＤＮＡの検出に有用である。
の検出に有用な試薬の製造 本実施例は、ハイブリッド形成またはポリメラーゼ連鎖
反応アッセイにおいて使用できるハイブリッド形成試薬
の新規製造方法を記載する。試薬はサイトメガロウィル
スＤＮＡの検出に有用である。
【０１６８】材料：ポリ［スチレン−コ−３−（ｐ−ビ
ニルベンジルチオ）プロピオン酸］からなるポリマー粒
子（モル比９７．６：２．４，平均直径１．４μｍ）を
用いて試薬を調製した。活性化剤は１−（３−ジメチル
アミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロク
ロリドであり、緩衝剤は２−（Ｎ−モルホリノ）エタン
スルホン酸（０．１Ｍ，ｐＨ６）であった。
ニルベンジルチオ）プロピオン酸］からなるポリマー粒
子（モル比９７．６：２．４，平均直径１．４μｍ）を
用いて試薬を調製した。活性化剤は１−（３−ジメチル
アミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロク
ロリドであり、緩衝剤は２−（Ｎ−モルホリノ）エタン
スルホン酸（０．１Ｍ，ｐＨ６）であった。
【０１６９】使用したオリゴヌクレオチドは以下の配列
を有している（塩基に関する標準表示法を用いて識
別）： ＃１ ５′−ＧＧＴＧＴＣＡＣＣＣ ＣＣＡＧＡＧＴＣ
ＣＣ ＣＴＧＴＡＣＣＣＧＣ−３′ ＃２ ５′−ＧＡＣＡＣＡＧＴＧＴ ＣＣＴＣＣＣＧＣ
ＴＣ ＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡ−３′ ＃３ ５′−ＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧ ＧＣＴＣＣＣＴＧ
ＧＡ ＡＧＣＣＧＧＴＣＧＴ−３′ ＃４ ５′−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＧ ＣＣＧＧＣＴＣＡ
ＣＣ ＴＣＴＡＴＧＴＴＧＧ−３′
を有している（塩基に関する標準表示法を用いて識
別）： ＃１ ５′−ＧＧＴＧＴＣＡＣＣＣ ＣＣＡＧＡＧＴＣ
ＣＣ ＣＴＧＴＡＣＣＣＧＣ−３′ ＃２ ５′−ＧＡＣＡＣＡＧＴＧＴ ＣＣＴＣＣＣＧＣ
ＴＣ ＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡ−３′ ＃３ ５′−ＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧ ＧＣＴＣＣＣＴＧ
ＧＡ ＡＧＣＣＧＧＴＣＧＴ−３′ ＃４ ５′−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＧ ＣＣＧＧＣＴＣＡ
ＣＣ ＴＣＴＡＴＧＴＴＧＧ−３′
【０１７０】オリゴヌクレオチドは以下の結合基：
【０１７１】
【化１３】
【０１７２】を用いて３′−末端を解して粒子に結合さ
せた。
せた。
【０１７３】試薬の調製：ポリマー粒子の懸濁液（固形
分約１２〜１６％）を遠心分離し（５０００ｒｐｍ）、
得られたペレットを２−（４−モルホリノ）エタンスル
ホン酸緩衝剤（５００μＬ，０．１Ｍ，ｐＨ６）に加
え、再び、約７分間遠心分離した。この手法を繰り返
し、最後に粒子を緩衝液（固形分約１２％）に再懸濁さ
せた。
分約１２〜１６％）を遠心分離し（５０００ｒｐｍ）、
得られたペレットを２−（４−モルホリノ）エタンスル
ホン酸緩衝剤（５００μＬ，０．１Ｍ，ｐＨ６）に加
え、再び、約７分間遠心分離した。この手法を繰り返
し、最後に粒子を緩衝液（固形分約１２％）に再懸濁さ
せた。
【０１７４】前記懸濁液（３８０μＬ）を緩衝液（１２
０μＬ）に加えることによって、粒子の前記懸濁液を含
む４つの管を調製した。活性化剤（５００μＬナノピュ
ア水中１２５ｍｇ）の溶液（１００μＬ）を各管に加
え、得られた混合物を室温において約５分間手動転倒型
回転によって混合して活性化ポリマー粒子を生成した。
０μＬ）に加えることによって、粒子の前記懸濁液を含
む４つの管を調製した。活性化剤（５００μＬナノピュ
ア水中１２５ｍｇ）の溶液（１００μＬ）を各管に加
え、得られた混合物を室温において約５分間手動転倒型
回転によって混合して活性化ポリマー粒子を生成した。
【０１７５】各オリゴヌクレオチドの溶液（２ＯＤ）を
種々の管に以下の容量で加えた：＃１４８．３μＬ、＃
２ ３７．７μＬ、＃３ ４５．４μＬ及び＃４３２．
３μＬ。各管は活性化粒子を６００μＬ含んでいた。次
いで、管を室温において約１８時間転倒型で回転して、
オリゴヌクレオチドを活性化粒子に共有結合させた。
種々の管に以下の容量で加えた：＃１４８．３μＬ、＃
２ ３７．７μＬ、＃３ ４５．４μＬ及び＃４３２．
３μＬ。各管は活性化粒子を６００μＬ含んでいた。次
いで、管を室温において約１８時間転倒型で回転して、
オリゴヌクレオチドを活性化粒子に共有結合させた。
【０１７６】次いで、反応混合物を遠心分離し、ペレッ
トをナノピュア水（５００μＬ）中に再懸濁させ、再び
遠心分離した。水による処理及び遠心分離をさらに２回
繰り返し、最終ペレットをナノピュア水（６００μＬ）
中に再懸濁させて、試薬の懸濁液（固形分約１２％）を
調製した。この懸濁液を、アッセイに使用するために固
形分約１％まで希釈した。濃度を、希釈及び標準希釈曲
線との比較によって分光光度法で測定した。
トをナノピュア水（５００μＬ）中に再懸濁させ、再び
遠心分離した。水による処理及び遠心分離をさらに２回
繰り返し、最終ペレットをナノピュア水（６００μＬ）
中に再懸濁させて、試薬の懸濁液（固形分約１２％）を
調製した。この懸濁液を、アッセイに使用するために固
形分約１％まで希釈した。濃度を、希釈及び標準希釈曲
線との比較によって分光光度法で測定した。
【０１７７】実施例１６：サイトメガロウィルスＤＮＡ
のアッセイ ポリマー粒子の１２％懸濁液を用いて調製した、実施例
１５中に前記した試薬を使用して、サイトメガロウィル
スＤＮＡのアッセイを実施した。ポリマー粒子の約１〜
３％懸濁液を用いて先行技術の方法を用いて調製した本
発明の試薬を用いて実施したアッセイＢに、それを比較
した。
のアッセイ ポリマー粒子の１２％懸濁液を用いて調製した、実施例
１５中に前記した試薬を使用して、サイトメガロウィル
スＤＮＡのアッセイを実施した。ポリマー粒子の約１〜
３％懸濁液を用いて先行技術の方法を用いて調製した本
発明の試薬を用いて実施したアッセイＢに、それを比較
した。
【０１７８】材料及び方法：検出すべき標的ＤＮＡは、
後期（ｌａｔｅ）抗原（ＬＡ）領域の２００ヌクレオチ
ド分節、及びＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ菌株（ＡＴＣＣ ＶＲ
９ ７７）のＭａｊｏｒ Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒ
ｌｙ（ＭＩＥ）領域の２６５ヌクレオチド分節であっ
た。
後期（ｌａｔｅ）抗原（ＬＡ）領域の２００ヌクレオチ
ド分節、及びＣＭＶ Ｔｏｗｎｅ菌株（ＡＴＣＣ ＶＲ
９ ７７）のＭａｊｏｒ Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒ
ｌｙ（ＭＩＥ）領域の２６５ヌクレオチド分節であっ
た。
【０１７９】ＬＡ領域を検出するために使用したオリゴ
ヌクレオチドは以下の配列を有していた：５′−ＧＴＣ
ＧＡＡＧＧＣＧ ＧＣＴＣＧＣＴＧＧＡ ＡＧＣＣＧＧ
ＴＣＧＴ−３′及び５′−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＣ ＣＧ
ＧＣＴＣＡＣＣＴＣＴＡＴＧＴＴＧＧ−３′
ヌクレオチドは以下の配列を有していた：５′−ＧＴＣ
ＧＡＡＧＧＣＧ ＧＣＴＣＧＣＴＧＧＡ ＡＧＣＣＧＧ
ＴＣＧＴ−３′及び５′−ＧＡＡＣＣＧＡＧＧＣ ＣＧ
ＧＣＴＣＡＣＣＴＣＴＡＴＧＴＴＧＧ−３′
【０１８０】ＬＡ領域の検出に使用したプライマーは以
下の配列を有していた：５′−ＣＡＣＣＡＣＧＣＡＧ
ＣＧＧＣＣＣＴＴＧＡ ＴＧＴＴＴ−３′及び５′−Ｇ
ＴＣＧＣＣＴＧＣＧ ＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴ ＣＧ−
３′
下の配列を有していた：５′−ＣＡＣＣＡＣＧＣＡＧ
ＣＧＧＣＣＣＴＴＧＡ ＴＧＴＴＴ−３′及び５′−Ｇ
ＴＣＧＣＣＴＧＣＧ ＣＣＡＧＧＴＧＣＴＴ ＣＧ−
３′
【０１８１】ＭＩＥ領域の検出に使用したオリゴヌクレ
オチドは以下の配列を有していた：５′−ＧＧＴＧＴＣ
ＡＣＣＣ ＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣ ＣＴＧＴＡＣＣＣＧ
Ｃ−３′及び５′−ＧＡＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣＴＣＣＣ
ＧＣＴＣ ＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡ−３′
オチドは以下の配列を有していた：５′−ＧＧＴＧＴＣ
ＡＣＣＣ ＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣ ＣＴＧＴＡＣＣＣＧ
Ｃ−３′及び５′−ＧＡＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣＴＣＣＣ
ＧＣＴＣ ＣＴＣＣＴＧＡＧＣＡ−３′
【０１８２】ＭＩＥ領域のためのプライマーは以下の配
列を有していた：５′−ＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣ ＣＴＣ
ＣＴＣＴＴＣＣ ＴＣＴＧＧ−３′及び５′−ＧＡＧＧ
ＣＴＡＴＴＧ ＴＡＧＣＣＴＡＣＡＣ ＴＴＴＧＧ−
３′
列を有していた：５′−ＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣ ＣＴＣ
ＣＴＣＴＴＣＣ ＴＣＴＧＧ−３′及び５′−ＧＡＧＧ
ＣＴＡＴＴＧ ＴＡＧＣＣＴＡＣＡＣ ＴＴＴＧＧ−
３′
【０１８３】粒子の約１２％懸濁液を用いてオリゴヌク
レオチドを実施例１５に記載したポリマー粒子に結合さ
せて、アッセイＡのための本発明の試薬（またはプロー
ブ）を調製した。アッセイＢに関しては、粒子の１〜３
％懸濁液を用いてオリゴヌクレオチドをポリマー粒子に
結合させてアッセイＢのための試薬（またはプローブ）
を調製した。
レオチドを実施例１５に記載したポリマー粒子に結合さ
せて、アッセイＡのための本発明の試薬（またはプロー
ブ）を調製した。アッセイＢに関しては、粒子の１〜３
％懸濁液を用いてオリゴヌクレオチドをポリマー粒子に
結合させてアッセイＢのための試薬（またはプローブ）
を調製した。
【０１８４】ＬＡ領域のためのアッセイＡ用の試薬を混
合し（各試薬の０．５％懸濁液１μＬ）、１セットのＳ
ｕｒｅｃｅｌｌＴＭ試験装置（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄ
ａｋＣｏ．）の試験ウェル中の膜（５μｍ Ｌｏｐｒｏ
ｄｙｎｅＴＭ微孔質膜）の所定の領域上にスポットし
た。ＭＩＥ領域のためにアッセイＡ用試薬を同様に混合
し、同一装置中の同一膜の第２の所定の領域上にスポッ
トした。適用した試薬は室温で約３０分間乾燥させた。
合し（各試薬の０．５％懸濁液１μＬ）、１セットのＳ
ｕｒｅｃｅｌｌＴＭ試験装置（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄ
ａｋＣｏ．）の試験ウェル中の膜（５μｍ Ｌｏｐｒｏ
ｄｙｎｅＴＭ微孔質膜）の所定の領域上にスポットし
た。ＭＩＥ領域のためにアッセイＡ用試薬を同様に混合
し、同一装置中の同一膜の第２の所定の領域上にスポッ
トした。適用した試薬は室温で約３０分間乾燥させた。
【０１８５】ＬＡ領域のためのアッセイＢ用の試薬（先
行技術の方法を用いて調製）を混合して、第２のセット
の試験装置中に前述したようにしてスポットした。ＭＩ
Ｅ領域のためのアッセイＢ用試薬を混合して、同一膜の
第２の所定の領域上にスポットした。
行技術の方法を用いて調製）を混合して、第２のセット
の試験装置中に前述したようにしてスポットした。ＭＩ
Ｅ領域のためのアッセイＢ用試薬を混合して、同一膜の
第２の所定の領域上にスポットした。
【０１８６】ストレプトアビジン−西洋わさびペルオキ
シダーゼ接合体はＺｙｍｅｄ Ｌａｂｓから入手し、カ
ゼイン（０．５％）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン
スルホン酸緩衝剤（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）及び保存
剤（０．０１％）を含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶液で
１：８０００に希釈した。最終接合体濃度は１５６ｎｇ
／ｍｌであった。燐酸塩緩衝化生理的塩溶液は燐酸ナト
リウム（２５ｍＭ，ｐＨ７．３）及び塩化ナトリウム
（７５ｍＭ）を含んでいた。
シダーゼ接合体はＺｙｍｅｄ Ｌａｂｓから入手し、カ
ゼイン（０．５％）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン
スルホン酸緩衝剤（１００ｍＭ，ｐＨ７．５）及び保存
剤（０．０１％）を含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶液で
１：８０００に希釈した。最終接合体濃度は１５６ｎｇ
／ｍｌであった。燐酸塩緩衝化生理的塩溶液は燐酸ナト
リウム（２５ｍＭ，ｐＨ７．３）及び塩化ナトリウム
（７５ｍＭ）を含んでいた。
【０１８７】２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキ
シフェノール）−４，５−ビス（４−メトキシフェニ
ル）イミダゾールを含む色素形成組成物を以下のように
して調製した：固体ロイコ色素（０．１％溶液を調製す
るため）を燐酸ナトリウム緩衝液（５ｍＭ）中２０％ポ
リ（ビニルピロリドン）の溶液中に溶解させた。次い
で、この溶液を、燐酸ナトリウム緩衝液中に過酸化水素
（１０ｍＭ）、４′−ヒドロキシアセトアニリド電子剤
（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ａｇｅｎｔ）（５ｍＭ）及びジエ
チレントリアミン五酢酸キレート化剤（１０μＭ）を含
む溶液に加えて、最終濃度をポリ（ビニルピロリドン）
１％及びロイコ色素０．００５％とした。
シフェノール）−４，５−ビス（４−メトキシフェニ
ル）イミダゾールを含む色素形成組成物を以下のように
して調製した：固体ロイコ色素（０．１％溶液を調製す
るため）を燐酸ナトリウム緩衝液（５ｍＭ）中２０％ポ
リ（ビニルピロリドン）の溶液中に溶解させた。次い
で、この溶液を、燐酸ナトリウム緩衝液中に過酸化水素
（１０ｍＭ）、４′−ヒドロキシアセトアニリド電子剤
（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ａｇｅｎｔ）（５ｍＭ）及びジエ
チレントリアミン五酢酸キレート化剤（１０μＭ）を含
む溶液に加えて、最終濃度をポリ（ビニルピロリドン）
１％及びロイコ色素０．００５％とした。
【０１８８】ＥＰ−Ａ−０ ０２５８ ０１７に記載さ
れた手法に従って調製されたＤＮＡポリメラーゼ（１単
位は３７℃において３０分でプライマー拡張生成物中に
取り込まれたｄＮＴＰ１０ｍｍｏｌｅに対応する）はＣ
ｅｔｕｓ Ｃｏｒｐから入手した。
れた手法に従って調製されたＤＮＡポリメラーゼ（１単
位は３７℃において３０分でプライマー拡張生成物中に
取り込まれたｄＮＴＰ１０ｍｍｏｌｅに対応する）はＣ
ｅｔｕｓ Ｃｏｒｐから入手した。
【０１８９】アッセイ：トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン緩衝剤（１０ｍＭ，ｐＨ８）、塩化カリウム
（５０ｍＭ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）及びゼラ
チン（１０μｇ）を含む緩衝剤溶液に前記プライマー
（各４０ｐｍｏｌｅ）、ｄＮＴＰ（各１．５Ｍ）及び前
記ポリメラーゼ（７．５単位）を加えた。さらに、前記
のＴｏｗｎｅ菌株標的を加えた。総容量は１００μＬで
あった。
ミノメタン緩衝剤（１０ｍＭ，ｐＨ８）、塩化カリウム
（５０ｍＭ）、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）及びゼラ
チン（１０μｇ）を含む緩衝剤溶液に前記プライマー
（各４０ｐｍｏｌｅ）、ｄＮＴＰ（各１．５Ｍ）及び前
記ポリメラーゼ（７．５単位）を加えた。さらに、前記
のＴｏｗｎｅ菌株標的を加えた。総容量は１００μＬで
あった。
【０１９０】前記各溶液をポリプロピレンミクロフュー
ジ管に入れ、プライマー拡張生成物を形成し、以下のよ
うな３３回の逐次熱サイクルを用いて増幅を促進した： ６６℃ ９２．５℃まで上昇 ３５秒間 ９２．５℃ １分間 ９２．５℃ ６６℃まで低下 ４５秒間 ６６℃ １分間。
ジ管に入れ、プライマー拡張生成物を形成し、以下のよ
うな３３回の逐次熱サイクルを用いて増幅を促進した： ６６℃ ９２．５℃まで上昇 ３５秒間 ９２．５℃ １分間 ９２．５℃ ６６℃まで低下 ４５秒間 ６６℃ １分間。
【０１９１】増幅後、各混合物のアリコート（５μＬ）
を、塩化カリウム（５０ｍＭ）、塩化マグネシウム（１
０ｍＭ）及びゼラチン（１μｇ／１０ｍｌ溶液）を含む
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（１０
ｍＭ，ｐＨ８）の溶液に加え、熱変性させ（９５℃にお
いて５分間）、次いで、前記ＳｕｒｅｃｅｌｌＴＭ試験
装置の試験ウェルに加えた（個々のウェル中に各溶液約
９５μＬ）。
を、塩化カリウム（５０ｍＭ）、塩化マグネシウム（１
０ｍＭ）及びゼラチン（１μｇ／１０ｍｌ溶液）を含む
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（１０
ｍＭ，ｐＨ８）の溶液に加え、熱変性させ（９５℃にお
いて５分間）、次いで、前記ＳｕｒｅｃｅｌｌＴＭ試験
装置の試験ウェルに加えた（個々のウェル中に各溶液約
９５μＬ）。
【０１９２】試験装置を４２℃において５分間インキュ
ベートして、試験ウェル中において固定された各試薬
（またはプローブ）に増幅ＤＮＡ標的をハイブリッド形
成した。ハイブリッド形成された生成物を、５５℃にお
いて燐酸塩緩衝剤（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）、塩化ナト
リウム（１５０ｍＭ）、エチレンジアミン四酢酸（１ｍ
Ｍ）及びデシル硫酸ナトリウム（１％）を含む緩衝化溶
液（２５０μＬ）で洗浄した。
ベートして、試験ウェル中において固定された各試薬
（またはプローブ）に増幅ＤＮＡ標的をハイブリッド形
成した。ハイブリッド形成された生成物を、５５℃にお
いて燐酸塩緩衝剤（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）、塩化ナト
リウム（１５０ｍＭ）、エチレンジアミン四酢酸（１ｍ
Ｍ）及びデシル硫酸ナトリウム（１％）を含む緩衝化溶
液（２５０μＬ）で洗浄した。
【０１９３】前記のペルオキシダーゼ標識アビジン接合
体（５０μＬ，７．８ｎｇ）を各試験ウェルに加え、装
置を室温で２分間インキュベートした。前記緩衝化溶液
を用いて２度目の洗浄（２５０μＬ）を行った。ロイコ
色素溶液（１００μＬ）を各試験ウェルに加え、次い
で、室温で２分間もう一度インキュベーションを行っ
た。色素の形成を、アジ化ナトリウム（０．１％溶液１
００μＬ）の添加によって加え、得られる色素シグナル
を膜上で評価した。
体（５０μＬ，７．８ｎｇ）を各試験ウェルに加え、装
置を室温で２分間インキュベートした。前記緩衝化溶液
を用いて２度目の洗浄（２５０μＬ）を行った。ロイコ
色素溶液（１００μＬ）を各試験ウェルに加え、次い
で、室温で２分間もう一度インキュベーションを行っ
た。色素の形成を、アジ化ナトリウム（０．１％溶液１
００μＬ）の添加によって加え、得られる色素シグナル
を膜上で評価した。
【０１９４】各試験装置中の色素の量を、１０が最高色
素濃度を表す０〜１０の値を有する色尺度と対照して目
視評価した。結果を、アッセイＡ及びＢのそれぞれに関
する４つの別々の試験について以下の表１０中に示す。
素濃度を表す０〜１０の値を有する色尺度と対照して目
視評価した。結果を、アッセイＡ及びＢのそれぞれに関
する４つの別々の試験について以下の表１０中に示す。
【０１９５】
【０１９６】実施例１７：試薬の比較例 この実施例は本発明のいくつかの試薬の調製、及び本発
明の範囲外のポリマーを用いて製造した試薬とのそれら
の比較を説明する。
明の範囲外のポリマーを用いて製造した試薬とのそれら
の比較を説明する。
【０１９７】試薬を調製するのに使用した粒子は以下の
コポリマーからなるものであった： 試験Ａ：ポリ（スチレン−コ−モノ−ｍ＆ｐ−ビニルベ
ンジルグルタレート）（モル比９７．８４：２．１
６）， 試験Ｂ：ポリ（スチレン−コ−モノ−ｐ−ビニルベンジ
ルグルタレート−コ−ジビニルベンゼン）（モル比９
７．０１：２．１６：０．８３）， 試験Ｃ：ポリ（スチレン−コ−モノ−２−メタクリロイ
ルオキシエチルグルタレート）（モル比９７．８４：
２．１６）， 試験Ｄ：ポリ（スチレン−コ−モノ−２−メタクリロイ
ルオキシエチルグルタレート−コ−ジビニルベンゼン）
（モル比９７．０１：２．１６：０．８３）， 試験Ｅ：ポリ［スチレン−コ−モノメタクリロイルペン
タ（オキシエチレン）グルタレート］（モル比９８．
７：１．３）， 試験Ｆ：ポリ［スチレン−コ−モノメタクリロイルデカ
（オキシエチレン）グルタレート］（モル比９９．２：
０．８）， 試験Ｇ：ポリ［スチレン−コ−モノ−２−（ｍ＆ｐ−ビ
ニルベンジルチオ）エチルグルタレート］（モル比９
８．３：１．７）， 試験Ｈ：ポリ［スチレン−コ−モノ−２−（ｐ−ビニル
ベンジルチオ）エチルグルタレート］（モル比９８．２
５：１．７５）， 試験Ｉ：ポリ［スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジ
ルチオ）プロピオン酸］（モル比９７．５９：２．４
１）， 試験Ｊ：ポリ［スチレン−コ−モノ−２−（４−ビニル
ベンジルチオ）エチルスクシネート］（モル比９８．１
７：１．８３）， 試験Ｋ：ポリ｛スチレン−コ−４−［２−（カルボキシ
メトキシアセトキシ）エチルチオメチル］スチレン｝
（モル比９８．２６：１．７４）， 試験Ｌ：ポリ（スチレン−コ−モノ−４−ビニルベンジ
ルスクシネート）（モル比９７．７１：２．２９）， 試験Ｍ：ポリ［スチレン−コ−モノ−メタクリロイルペ
ンタ（オキシエチレン）フタレート］（モル比９８．８
１：１．１９）， 対照Ａ：ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）（モル比９
５：５），及び 対照Ｂ：ポリ（スチレン−コ−３−アクリルアミド−３
−メチルブタン酸）（モル比９６．９：３．１）。
コポリマーからなるものであった： 試験Ａ：ポリ（スチレン−コ−モノ−ｍ＆ｐ−ビニルベ
ンジルグルタレート）（モル比９７．８４：２．１
６）， 試験Ｂ：ポリ（スチレン−コ−モノ−ｐ−ビニルベンジ
ルグルタレート−コ−ジビニルベンゼン）（モル比９
７．０１：２．１６：０．８３）， 試験Ｃ：ポリ（スチレン−コ−モノ−２−メタクリロイ
ルオキシエチルグルタレート）（モル比９７．８４：
２．１６）， 試験Ｄ：ポリ（スチレン−コ−モノ−２−メタクリロイ
ルオキシエチルグルタレート−コ−ジビニルベンゼン）
（モル比９７．０１：２．１６：０．８３）， 試験Ｅ：ポリ［スチレン−コ−モノメタクリロイルペン
タ（オキシエチレン）グルタレート］（モル比９８．
７：１．３）， 試験Ｆ：ポリ［スチレン−コ−モノメタクリロイルデカ
（オキシエチレン）グルタレート］（モル比９９．２：
０．８）， 試験Ｇ：ポリ［スチレン−コ−モノ−２−（ｍ＆ｐ−ビ
ニルベンジルチオ）エチルグルタレート］（モル比９
８．３：１．７）， 試験Ｈ：ポリ［スチレン−コ−モノ−２−（ｐ−ビニル
ベンジルチオ）エチルグルタレート］（モル比９８．２
５：１．７５）， 試験Ｉ：ポリ［スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジ
ルチオ）プロピオン酸］（モル比９７．５９：２．４
１）， 試験Ｊ：ポリ［スチレン−コ−モノ−２−（４−ビニル
ベンジルチオ）エチルスクシネート］（モル比９８．１
７：１．８３）， 試験Ｋ：ポリ｛スチレン−コ−４−［２−（カルボキシ
メトキシアセトキシ）エチルチオメチル］スチレン｝
（モル比９８．２６：１．７４）， 試験Ｌ：ポリ（スチレン−コ−モノ−４−ビニルベンジ
ルスクシネート）（モル比９７．７１：２．２９）， 試験Ｍ：ポリ［スチレン−コ−モノ−メタクリロイルペ
ンタ（オキシエチレン）フタレート］（モル比９８．８
１：１．１９）， 対照Ａ：ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）（モル比９
５：５），及び 対照Ｂ：ポリ（スチレン−コ−３−アクリルアミド−３
−メチルブタン酸）（モル比９６．９：３．１）。
【０１９８】活性化剤として１−（１−ピロリジニルカ
ルボニル）ピリジニウムクロリドを用いてポリマー粒子
にタンパク質を結合させた。全ての粒子を同一条件下で
処理した。最終分散液は、２−（４−モルホリノ）エタ
ンスルホン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ５．５）中１．７
ｍｇ／ｍ２の量の抗体（前記実施例１と同様なトリチウ
ム標識ウシガンマグロブリンまたは前記実施例２と同様
なチロキシン抗体）及び活性化剤（１．５ｍｍｏｌｅ／
ｇ粒子または０．０４５ｍｍｏｌｅ）を含んでいた。
ルボニル）ピリジニウムクロリドを用いてポリマー粒子
にタンパク質を結合させた。全ての粒子を同一条件下で
処理した。最終分散液は、２−（４−モルホリノ）エタ
ンスルホン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ５．５）中１．７
ｍｇ／ｍ２の量の抗体（前記実施例１と同様なトリチウ
ム標識ウシガンマグロブリンまたは前記実施例２と同様
なチロキシン抗体）及び活性化剤（１．５ｍｍｏｌｅ／
ｇ粒子または０．０４５ｍｍｏｌｅ）を含んでいた。
【０１９９】粒子（乾燥重量３０ｍｇ）の懸濁液を大ミ
クロフュージ管に加えることによって分散液を調製し、
示した緩衝液を用いて各々を容量１．５ｍｌとした。得
られた懸濁液を１３，０００ｒｐｍにおいて１５分間遠
心分離し、上澄み液を廃棄した。各管に緩衝液（１ｍ
ｌ，０．１Ｍ）を加え、次いで、活性化剤（緩衝液中
０．１５Ｍの溶液０．３ｍｌ）を添加した。次に、管を
蓋締めし、室温で１０分管転倒型で回転させて、活性化
ポリマー粒子を生成した。
クロフュージ管に加えることによって分散液を調製し、
示した緩衝液を用いて各々を容量１．５ｍｌとした。得
られた懸濁液を１３，０００ｒｐｍにおいて１５分間遠
心分離し、上澄み液を廃棄した。各管に緩衝液（１ｍ
ｌ，０．１Ｍ）を加え、次いで、活性化剤（緩衝液中
０．１５Ｍの溶液０．３ｍｌ）を添加した。次に、管を
蓋締めし、室温で１０分管転倒型で回転させて、活性化
ポリマー粒子を生成した。
【０２００】各タンパク質の溶液を、活性化ポリマー粒
子を含む各管に加えて、最終濃度を１．７ｍｇ／ｍ２ポ
リマー粒子とした。トリチウム標識ウシガンマグロブリ
ンをいくつかの管に加え、他の管にはチロキシン単クロ
ーン抗体（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ／Ｖｅｎｔｒｅｘ）を加
えた。次いで、全ての管に緩衝液を加えて、最終容量を
１．５ｍｌとした。管を室温において２４時間転倒型で
回転させて、タンパク質を活性化粒子と反応させた。
子を含む各管に加えて、最終濃度を１．７ｍｇ／ｍ２ポ
リマー粒子とした。トリチウム標識ウシガンマグロブリ
ンをいくつかの管に加え、他の管にはチロキシン単クロ
ーン抗体（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ／Ｖｅｎｔｒｅｘ）を加
えた。次いで、全ての管に緩衝液を加えて、最終容量を
１．５ｍｌとした。管を室温において２４時間転倒型で
回転させて、タンパク質を活性化粒子と反応させた。
【０２０１】抗体と粒子との反応を、各管にウシ血清ア
ルブミン（２５０μＬ，タンパク質１００ｍｇ／ｍｌ）
を添加することによって抑えた。次いで、管を再び室温
でさらに１６時間回転させた。結合した３Ｈウシガンマ
グロブリンを含む試薬を、実施例１に記載されたように
して処理して、結合したタンパク質の総量及び共有結合
した量を測定した。チロキシン抗体が都合した試薬を洗
浄し、得られた分散液中の活性抗体の相対量を実施例２
に記載したようにして測定した。
ルブミン（２５０μＬ，タンパク質１００ｍｇ／ｍｌ）
を添加することによって抑えた。次いで、管を再び室温
でさらに１６時間回転させた。結合した３Ｈウシガンマ
グロブリンを含む試薬を、実施例１に記載されたように
して処理して、結合したタンパク質の総量及び共有結合
した量を測定した。チロキシン抗体が都合した試薬を洗
浄し、得られた分散液中の活性抗体の相対量を実施例２
に記載したようにして測定した。
【０２０２】結果を以下の表１１中に要約する。結果
は、本発明の試薬のほとんどにおいて、トリチウム標識
ウシガンマグロブリンが非常によく共有結合したことを
示す。試験Ｅ及びＦの試薬はタンパク質も他の試薬も共
有結合しなかった。しかしながら、芳香族カルボキシ官
能基を結合基の末端に加えた場合には（試験Ｍにおける
試薬に関する）、共有結合したタンパク質の量はかなり
増加した。
は、本発明の試薬のほとんどにおいて、トリチウム標識
ウシガンマグロブリンが非常によく共有結合したことを
示す。試験Ｅ及びＦの試薬はタンパク質も他の試薬も共
有結合しなかった。しかしながら、芳香族カルボキシ官
能基を結合基の末端に加えた場合には（試験Ｍにおける
試薬に関する）、共有結合したタンパク質の量はかなり
増加した。
【０２０３】表１１の最終欄に示されるように、結合し
た抗体を含む試薬は、対照の試薬よりも３〜２０倍の大
きい活性を示した。
た抗体を含む試薬は、対照の試薬よりも３〜２０倍の大
きい活性を示した。
【０２０４】実施例１８：乾燥分析要素を用いるチロキ
シンのイムノアッセイ この実施例は、本発明の乾燥分析要素の製造及び液体サ
ンプル中のホルモンチロキシンを測定するための競合的
イムノアッセイにおけるその使用を説明する。アッセイ
において、本発明の２つの試薬を対照試薬に比較した。
シンのイムノアッセイ この実施例は、本発明の乾燥分析要素の製造及び液体サ
ンプル中のホルモンチロキシンを測定するための競合的
イムノアッセイにおけるその使用を説明する。アッセイ
において、本発明の２つの試薬を対照試薬に比較した。
【０２０５】実施例２の記載に従って調製した２つの試
薬をこのアッセイに用いた。対照試薬は、ＥＰ−Ａ−０
２８０ ５５６に記載された手法を用いて調製した。
使用した活性化剤は１−（１−ピロリジニルカルボニ
ル）ピリジニウムクロリドであった。試薬を２種の量で
要素の標準硫酸バリウム塗布層に取り入れた：ポリマー
２５ｍｇ／ｍ２層表面、またはポリマー５０ｍｇ／ｍ２
層表面。
薬をこのアッセイに用いた。対照試薬は、ＥＰ−Ａ−０
２８０ ５５６に記載された手法を用いて調製した。
使用した活性化剤は１−（１−ピロリジニルカルボニ
ル）ピリジニウムクロリドであった。試薬を２種の量で
要素の標準硫酸バリウム塗布層に取り入れた：ポリマー
２５ｍｇ／ｍ２層表面、またはポリマー５０ｍｇ／ｍ２
層表面。
【０２０６】試薬を調製するのに使用したコポリマーは
以下の通りであった： 試験Ａ：ポリ（スチレン−コ−モノ−ｍ＆ｐ−ビニルベ
ンジルグルタレート）（モル比９７．８４：２．１
６）， 試験Ｂ：ポリ（スチレン−コ−モノ−２−メタクリロイ
ルオキシエチルグルタレート）（モル比９７．８４：
２．１６）、ならびに 対照 ：ポリ（スチレン−コ−エチレンジメタクリレー
ト）（モル比９９：１）のコア及びポリ［スチレン−コ
−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチ
レン−コ−エチレンジメタクリレート］（モル比９４．
５：４．５：１）のシェルを有するコア／シェルポリマ
ー粒子。
以下の通りであった： 試験Ａ：ポリ（スチレン−コ−モノ−ｍ＆ｐ−ビニルベ
ンジルグルタレート）（モル比９７．８４：２．１
６）， 試験Ｂ：ポリ（スチレン−コ−モノ−２−メタクリロイ
ルオキシエチルグルタレート）（モル比９７．８４：
２．１６）、ならびに 対照 ：ポリ（スチレン−コ−エチレンジメタクリレー
ト）（モル比９９：１）のコア及びポリ［スチレン−コ
−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチ
レン−コ−エチレンジメタクリレート］（モル比９４．
５：４．５：１）のシェルを有するコア／シェルポリマ
ー粒子。
【０２０７】アッセイにおいて使用した要素の構造は以
下の通りであった：
下の通りであった：
【表３】
【０２０８】１０−５〜１０−１０Ｍの濃度で変化する
一連のチロキシン標準溶液をジメチルスルホキシド中１
×１０−３Ｍチロキシン原液から下記の緩衝液中に調製
した。緩衝液は燐酸塩緩衝化生理的塩溶液（ｐＨ７．
４）、ウシ血清アルブミン（１％）及び８−アニリノ−
１−ナフタレンスルホン酸（８．７×１０−４Ｍ）から
なるものであった。アルカリホスファターゼ標識チロキ
シンの溶液を２．０×１０−８Ｍの濃度で調製した。チ
ロキシン標準液及び標識類似体溶液を１：１で混合し
て、標識類似体の最終濃度が１．０×１０−８Ｍとなる
ようにした。
一連のチロキシン標準溶液をジメチルスルホキシド中１
×１０−３Ｍチロキシン原液から下記の緩衝液中に調製
した。緩衝液は燐酸塩緩衝化生理的塩溶液（ｐＨ７．
４）、ウシ血清アルブミン（１％）及び８−アニリノ−
１−ナフタレンスルホン酸（８．７×１０−４Ｍ）から
なるものであった。アルカリホスファターゼ標識チロキ
シンの溶液を２．０×１０−８Ｍの濃度で調製した。チ
ロキシン標準液及び標識類似体溶液を１：１で混合し
て、標識類似体の最終濃度が１．０×１０−８Ｍとなる
ようにした。
【０２０９】この混合物のアリコ−ト（１０μＬ）を要
素の塗布層上にスポットした。３７℃において５分間イ
ンキュベーション後、ｐ−ニトロフェニルホスフェート
（１５ｍＭ）を含む洗浄溶液（１０μＬ）を要素に加え
て、塗布層において形成された全ての複合体から、複合
体を形成していない標識類似体を除去した。１分間のイ
ンキュベーション後に、反射濃度（△ＤＲ）の変化を標
準分光光度計を用いて３７℃及び４００ｎｍにおいて要
素の中心で３０秒間、測定した。
素の塗布層上にスポットした。３７℃において５分間イ
ンキュベーション後、ｐ−ニトロフェニルホスフェート
（１５ｍＭ）を含む洗浄溶液（１０μＬ）を要素に加え
て、塗布層において形成された全ての複合体から、複合
体を形成していない標識類似体を除去した。１分間のイ
ンキュベーション後に、反射濃度（△ＤＲ）の変化を標
準分光光度計を用いて３７℃及び４００ｎｍにおいて要
素の中心で３０秒間、測定した。
【０２１０】２種のチロキシン濃度に関するアッセイの
結果を以下の表１２中に示す。これらの結果は、要素中
の本発明の２種の試薬上に固定されたチロキシン抗体が
対照試薬よりも優れた結果を提供することを示す。さら
に詳しくは、本発明の試薬は、チロキシンレベルが低い
「比較的速い反応」速度を示す。従って、試薬は標識類
似体に対して高い結合反応性を示し、アッセイに対する
比較的大きい使用範囲を提供する。使用範囲はここで
は、チロキシン１０−１０及び１０−５Ｍにおける速度
の差として定義する。
結果を以下の表１２中に示す。これらの結果は、要素中
の本発明の２種の試薬上に固定されたチロキシン抗体が
対照試薬よりも優れた結果を提供することを示す。さら
に詳しくは、本発明の試薬は、チロキシンレベルが低い
「比較的速い反応」速度を示す。従って、試薬は標識類
似体に対して高い結合反応性を示し、アッセイに対する
比較的大きい使用範囲を提供する。使用範囲はここで
は、チロキシン１０−１０及び１０−５Ｍにおける速度
の差として定義する。
【０２１１】
【０２１２】実施例１９：乾燥要素中におけるチロキシ
ンのアッセイ この実施例は、競合的結合アッセイ及び西洋わさびペル
オキシダーゼ標識接合体を用いて乾燥分析要素中におい
てチロキシンを検出するための本発明の実施を説明する
ンのアッセイ この実施例は、競合的結合アッセイ及び西洋わさびペル
オキシダーゼ標識接合体を用いて乾燥分析要素中におい
てチロキシンを検出するための本発明の実施を説明する
【０２１３】２種のチロキシン抗体を使用した： （ａ）ＢｉｏＰａｃｉｆｉｃから入手したもの（クロー
ン０３５−Ａ ２２０６Ａ）及び、（ｂ）Ｂｅｃｋｍａ
ｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから入手したもの（＃６８
４８２３）。実施例２に記載した手法及び活性化剤とし
ての１−（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウム
クロリドを用いてそれらをポリ［スチレン−コ−３−
（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸］（モル比９
７．５９：２，４１）の粒子に共有結合させた。得られ
た試薬を以下に説明する分析要素の塗布層中に取り入れ
た。
ン０３５−Ａ ２２０６Ａ）及び、（ｂ）Ｂｅｃｋｍａ
ｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから入手したもの（＃６８
４８２３）。実施例２に記載した手法及び活性化剤とし
ての１−（１−ピロリジニルカルボニル）ピリジニウム
クロリドを用いてそれらをポリ［スチレン−コ−３−
（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸］（モル比９
７．５９：２，４１）の粒子に共有結合させた。得られ
た試薬を以下に説明する分析要素の塗布層中に取り入れ
た。
【０２１４】
【表４】
【０２１５】一連のチロキシン標準溶液を、下記の緩衝
液中で１０−３Ｍ原液（ジメチルスルホキシド中）か
ら、１０−５〜１０−１０Ｍの濃度を生じるように調製
した。緩衝液は３−（４−モルホリノ）プロパンスルホ
ン酸緩衝剤（０．２Ｍ，ｐＨ７）、４−ヒドロキシアセ
トアニリド（０．０１Ｍ）、８−アニリノナフタレン−
１−スルホン酸（８．７×１０−４Ｍ）及びウシガンマ
グロブリン（０．１％）からなるものであった。西洋わ
さびペルオキシダーゼ標識チロキシン類似体溶液を２×
１０−９Ｍの濃度で調製した。
液中で１０−３Ｍ原液（ジメチルスルホキシド中）か
ら、１０−５〜１０−１０Ｍの濃度を生じるように調製
した。緩衝液は３−（４−モルホリノ）プロパンスルホ
ン酸緩衝剤（０．２Ｍ，ｐＨ７）、４−ヒドロキシアセ
トアニリド（０．０１Ｍ）、８−アニリノナフタレン−
１−スルホン酸（８．７×１０−４Ｍ）及びウシガンマ
グロブリン（０．１％）からなるものであった。西洋わ
さびペルオキシダーゼ標識チロキシン類似体溶液を２×
１０−９Ｍの濃度で調製した。
【０２１６】類似体及び標準溶液を１：１で混合して、
類似体の最終濃度が１０−９Ｍとなるようにした。チロ
キシンを含まない対照溶液も試験した。混合物のアリコ
ート（１０μＬ）を要素の塗布層上にスポットした。３
７℃において５分間インキュベーション後、過酸化水素
（１０μＬ）を含む洗浄溶液を加えて、要素の中心にお
いて複合体から、複合体を形成していない類似体を洗い
流した。室温で４０秒間インキュベーション後、標準分
光光度計を用いて３７℃及び６８０ｎｍにおいて要素の
中心で３０秒間、反射濃度の変化（△ＤＲ）を測定し
た。Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｃｌａｐｐｅｒ ｔｒａｎｓｆ
ｏｒｍ（Ｊ． Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．，４３，５９
５，１９５３）を用いて反射濃度を透過率値（△ＤＴ）
に変換した。結果を以下の表１３中に示す。それらは、
本発明の２種の試薬を用いた場合、所望のチロキシン濃
度範囲において速度がかなり変化することを示す。
類似体の最終濃度が１０−９Ｍとなるようにした。チロ
キシンを含まない対照溶液も試験した。混合物のアリコ
ート（１０μＬ）を要素の塗布層上にスポットした。３
７℃において５分間インキュベーション後、過酸化水素
（１０μＬ）を含む洗浄溶液を加えて、要素の中心にお
いて複合体から、複合体を形成していない類似体を洗い
流した。室温で４０秒間インキュベーション後、標準分
光光度計を用いて３７℃及び６８０ｎｍにおいて要素の
中心で３０秒間、反射濃度の変化（△ＤＲ）を測定し
た。Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｃｌａｐｐｅｒ ｔｒａｎｓｆ
ｏｒｍ（Ｊ． Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．，４３，５９
５，１９５３）を用いて反射濃度を透過率値（△ＤＴ）
に変換した。結果を以下の表１３中に示す。それらは、
本発明の２種の試薬を用いた場合、所望のチロキシン濃
度範囲において速度がかなり変化することを示す。
【０２１７】
【０２１８】
【発明の効果】本発明は、種々の分析、診断及び精製法
において有用な試薬を提供する。これらの試薬は標準カ
ルボキシ含有ポリマーを用いて製造された公知の試薬と
比べて改良されている。
において有用な試薬を提供する。これらの試薬は標準カ
ルボキシ含有ポリマーを用いて製造された公知の試薬と
比べて改良されている。
【０２１９】本発明の利点は、充分な長さでコポリマー
表面から伸張するカルボキシ基を有するいくつかのコポ
リマーを使用して、生物活性物質の結合及びそれらのそ
れ以後の使用に改良された結果を生ずることによって提
供される。従って、前記構造において、“Ｌ”として識
別される有機基は長さに関して臨界が８〜５０個の炭
素、窒素、酸素及び硫黄原子である。
表面から伸張するカルボキシ基を有するいくつかのコポ
リマーを使用して、生物活性物質の結合及びそれらのそ
れ以後の使用に改良された結果を生ずることによって提
供される。従って、前記構造において、“Ｌ”として識
別される有機基は長さに関して臨界が８〜５０個の炭
素、窒素、酸素及び硫黄原子である。
【０２２０】コポリマーを調製するのに使用されるモノ
マー上の伸張親水性カルボキシ基は公知の比較的短いカ
ルボキシ基を有するモノマーより優れたいくつかの利点
を提供する。乳化重合の間に、改良されたモノマーは水
相において溶液（または水溶性）ポリマーとして重合す
る傾向が比較的少ない。従って、改良されたモノマーは
比較的容易に且つ比較的完全に水不溶性ラテックス粒子
に取り入れられ、それによって、タンパク質または他の
生物学的化合物の結合を促進する。アクリル酸から製造
されたラテックスは水相中に不所望の可溶性ポリマーを
含むが、ある用途ではそれはかなりの費用を費やして除
去しなければならない。ここに記載した改良モノマーは
比較的水溶性でないポリマーを生成する。
マー上の伸張親水性カルボキシ基は公知の比較的短いカ
ルボキシ基を有するモノマーより優れたいくつかの利点
を提供する。乳化重合の間に、改良されたモノマーは水
相において溶液（または水溶性）ポリマーとして重合す
る傾向が比較的少ない。従って、改良されたモノマーは
比較的容易に且つ比較的完全に水不溶性ラテックス粒子
に取り入れられ、それによって、タンパク質または他の
生物学的化合物の結合を促進する。アクリル酸から製造
されたラテックスは水相中に不所望の可溶性ポリマーを
含むが、ある用途ではそれはかなりの費用を費やして除
去しなければならない。ここに記載した改良モノマーは
比較的水溶性でないポリマーを生成する。
【０２２１】さらに、Ｌの一部分として芳香族基（たと
えば、スチレン誘導体）を有するものである、本発明の
実施において使用する好ましいモノマーの反応性比は、
スチレン及びスチレン誘導体のような芳香族コモノマー
との重合のための公知カルボキシ含有モノマーよりも好
ましい。さらに、伸張結合基は、生物学的化合物が粒子
に結合する場合にカルボジイミドまたは他の活性化剤に
よってカルボキシ基が比較的容易に活性化されるように
する。
えば、スチレン誘導体）を有するものである、本発明の
実施において使用する好ましいモノマーの反応性比は、
スチレン及びスチレン誘導体のような芳香族コモノマー
との重合のための公知カルボキシ含有モノマーよりも好
ましい。さらに、伸張結合基は、生物学的化合物が粒子
に結合する場合にカルボジイミドまたは他の活性化剤に
よってカルボキシ基が比較的容易に活性化されるように
する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/545 Ｂ 9015−2Ｊ (72)発明者 ジョン ブルース ファインドレイ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，クロスローズ レーン 148 (72)発明者 フレッド テリー オークス アメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，スタントン レーン 216 (72)発明者 マーシャ デニス ベイル イーニック アメリカ合衆国，ニューヨーク 14610, ロチェスター，サン ガブリエル ドライ ブ 44 (72)発明者 イグナジオ サルバトーレ ポンティセロ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14534, ピッツフォード，カッパー ウッズ 21 (72)発明者 ハロルド チェスター ウォーレン，ザ サード アメリカ合衆国，ニューヨーク 14543, ラッシュ，ストニーブルック ロード 390
Claims (7)
- 【請求項１】 （Ｉ）少なくともその表面が、 （ａ）コポリマーに疎水性を与える１種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー６０〜９９．
８モル％、 （ｂ）構造： 【化１】 ［式中、Ｒは水素、ハロまたは炭素数１〜３のアルキル
であり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた８〜５０個の原子
を有する有機結合基である］によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する１種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー０．２〜４０モル％、
ならびに （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）中において特定される以外
の１種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー０〜１５モル％から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）反応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒
子に共有結合した生物活性物質を含んでなる生物活性試
薬。 - 【請求項２】 （Ｉ）少なくともその表面が、 （ａ）コポリマーに疎水性を与える１種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー６０〜９９．
８モル％、 （ｂ）構造： 【化２】 ［式中、Ｒは水素、ハロまたは炭素数１〜３のアルキル
であり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた８〜５０個の原子
を有する有機結合基である］によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する１種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー０．２〜４０モル％、
ならびに （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）中において特定される以外
の１種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー０〜１５モル％から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）反応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒
子に共有結合した生物活性物質を含んでなる生物活性試
薬を含む分析要素。 - 【請求項３】 Ａ．（Ｉ）少なくともその表面が、 （ａ）コポリマーに疎水性を与える１種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー６０〜９９．
８モル％、 （ｂ）構造： 【化３】 ［式中、Ｒは水素、ハロまたは炭素数１〜３のアルキル
であり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた８〜５０個の原子
を有する有機結合基である］によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する１種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー０．２〜４０モル％、
ならびに （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）中において特定される以外
の１種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー０〜１５モル％から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）リガンドまたはそのレセプターと特異的に反応
性である、反応性カルボキシ基またはその塩を介して該
粒子に共有結合した生物活性物質を含んでなる試薬によ
って特異的結合リガンドまたはそのレセプターの水不溶
性特異的結合複合体を形成し、そして Ｂ． 該複合体の存在を検出することを含んでなる特異
的結合リガンドの定量方法。 - 【請求項４】 Ａ． 水溶性特異的結合リガンドをその
水溶性レセプターならびに （Ｉ）少なくともその表面が、 （ａ）コポリマーに疎水性を与える１種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー６０〜９９．
８モル％、 （ｂ）構造： 【化４】 ［式中、Ｒは水素、ハロまたは炭素数１〜３のアルキル
であり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた８〜５０個の原子
を有する有機結合基である］によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する１種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー０．２〜４０モル％、
ならびに （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）中において特定される以外
の１種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー０〜１５モル％から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）反応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒
子に共有結合したリガンドの分子を含んでなる試薬と接
触させて、レセプターとリガンドとの間に特異的結合複
合体（ａ）を、ならびにレセプターと水不溶性試薬との
間に特異的結合複合体（ｂ）を形成せしめ、そして Ｂ． 該複合体（ａ）または（ｂ）の存在を検出するこ
とを含んでなる特異的結合リガンドの定量のための競合
的結合アッセイ。 - 【請求項５】 リガンドとそれに対するレセプターとの
間に形成される水不溶性特異的結合複合体を検出するこ
とを含んでなる特異的結合リガンドの定量のためのアッ
セイであって、該レセプターが （Ｉ）少なくともその表面が、 （ａ）コポリマーに疎水性を与える１種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー６０〜９９．
８モル％、 （ｂ）構造： 【化５】 ［式中、Ｒは水素、ハロまたは炭素数１〜３のアルキル
であり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた８〜５０個の原子
を有する有機結合基である］によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する１種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー０．２〜４０モル％、
ならびに （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）中において識別される以外
の１種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー０〜１５モル％から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）反応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒
子に共有結合した、リガンドに対するレセプターを含ん
でなる試薬の一成分として提供される特異的結合リガン
ドの定量のためのアッセイ。 - 【請求項６】 Ａ． 生物活性物質の混合物を含む検体
を、 （Ｉ）少なくともその表面が、 （ａ）コポリマーに疎水性を与える１種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー６０〜９９．
８モル％、 （ｂ）構造： 【化６】 ［式中、Ｒは水素、ハロまたは炭素数１〜３のアルキル
であり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた８〜５０個の原子
を有する有機結合基である］によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する１種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー０．２〜４０モル％、
ならびに （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）中において特定される以外
の１種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー０〜１５モル％から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）検体混合物中の所定の生物活性物質に特異的で
ある、反応性カルボキシ基を介して該粒子に共有結合し
た特異的結合物質 を含んでなるアフィニティークロマトグラフィー試薬上
に通過させて試薬と所定の物質との複合体を形成させ、
そして Ｂ． 溶離剤中に残る複合体または物質を回収すること
を含んで成る分析的分離方法。 - 【請求項７】 Ａ． 核酸と （Ｉ）少なくともその表面が、 （ａ）コポリマーに疎水性を与える１種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー６０〜９９．
８モル％、 （ｂ）構造： 【化７】 ［式中、Ｒは水素、ハロまたは炭素数１〜３のアルキル
であり、Ｍは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Ｌは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた８〜５０個の原子
を有する有機結合基である］によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する１種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー０．２〜４０モル％、
ならびに （ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）中において特定される以外
の１種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー０〜１５モル％から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに （ＩＩ）反応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒
子に共有結合した、核酸に対して実質的に相補的である
オリゴヌクレオチドを含んでなる試薬との間において水
不溶性ハイブリッド形成生成物を形成し、そして Ｂ． 該ハイブリッド形成生成物の存在を検出すること
を含んでなる核酸の検出方法。
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|---|---|---|---|
| US539774 | 1983-10-07 | ||
| US07/539,774 US5147777A (en) | 1990-06-18 | 1990-06-18 | Biologically active reagents prepared from carboxy-containing polymer, analytical element and methods of use |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04339808A JPH04339808A (ja) | 1992-11-26 |
| JPH0717697B2 true JPH0717697B2 (ja) | 1995-03-01 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP (1) | JPH0717697B2 (ja) |
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