JPH0710814A - Ｎａｄ（ｐ）ｈを比色検出するための方法および薬剤、ならびにニトロソアニリン化合物 - Google Patents
Ｎａｄ（ｐ）ｈを比色検出するための方法および薬剤、ならびにニトロソアニリン化合物Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 干渉に対して殆んど影響されず、容易に実施
することができ、かつ特異的反応の結果として容易に目
で見て評価することができる可視光線の全波長範囲に亘
って色を発生させるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存形デヒドロゲナ
ーゼを使用して検出することができるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、
殊に分析物を検出するためのより敏感な比色検定法。 【構成】 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを酵素ベンジルアルコールデ
ヒドロゲナーゼと、電子受容体としての一般式Ｉ： 【化１】 で示されるニトロソアニリン化合物の存在下に反応さ
せ、この場合、このニトロソアニリン化合物は、この方
法で着色されたキノンジイミンに酵素的に還元され、キ
ノンジイミンをＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の測定値として測定
する。
することができ、かつ特異的反応の結果として容易に目
で見て評価することができる可視光線の全波長範囲に亘
って色を発生させるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存形デヒドロゲナ
ーゼを使用して検出することができるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、
殊に分析物を検出するためのより敏感な比色検定法。 【構成】 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを酵素ベンジルアルコールデ
ヒドロゲナーゼと、電子受容体としての一般式Ｉ： 【化１】 で示されるニトロソアニリン化合物の存在下に反応さ
せ、この場合、このニトロソアニリン化合物は、この方
法で着色されたキノンジイミンに酵素的に還元され、キ
ノンジイミンをＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の測定値として測定
する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、また
は反応してＮＡＤ（Ｐ）Ｈを形成させる酵素の基質であ
る分析物を、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素および色素原酸化
還元指示薬を使用して比色検出するための方法に関す
る。更に、本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、または反応して
ベンジルアルコール、デヒドロゲナーゼおよび色素原ニ
トロソアニリン化合物を含有するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを形成
させる酵素の基質である分析物を測定するための薬剤に
関する。その上、本発明は、新規のニトロソアニリン化
合物、その製造法ならびに分析物を酵素的に比色検出す
るための該化合物の使用に関する。
は反応してＮＡＤ（Ｐ）Ｈを形成させる酵素の基質であ
る分析物を、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素および色素原酸化
還元指示薬を使用して比色検出するための方法に関す
る。更に、本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、または反応して
ベンジルアルコール、デヒドロゲナーゼおよび色素原ニ
トロソアニリン化合物を含有するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを形成
させる酵素の基質である分析物を測定するための薬剤に
関する。その上、本発明は、新規のニトロソアニリン化
合物、その製造法ならびに分析物を酵素的に比色検出す
るための該化合物の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】分析学における酵素的酸化は、種々の試
料材料中の物質の検出および測定を可能にする。この方
法の場合、酸化酵素は、酸化反応の電子を受け入れる受
容体の存在下で適当な酵素基質に対して作用する。電子
受容体の還元は、酵素基質の存在を示す。この関係にお
いて、還元された電子受容体を色形成によって検出する
ことができることは、これまでに特に有利であることが
証明された。それというのも、この場合には、高価な測
定装置を用いて実施することは不要であるだけでなく、
必要に応じて目で見て実施することもできるからであ
る。
料材料中の物質の検出および測定を可能にする。この方
法の場合、酸化酵素は、酸化反応の電子を受け入れる受
容体の存在下で適当な酵素基質に対して作用する。電子
受容体の還元は、酵素基質の存在を示す。この関係にお
いて、還元された電子受容体を色形成によって検出する
ことができることは、これまでに特に有利であることが
証明された。それというのも、この場合には、高価な測
定装置を用いて実施することは不要であるだけでなく、
必要に応じて目で見て実施することもできるからであ
る。
【０００３】反応は、ＮＡＤ（Ｐ）依存形デヒドロゲナ
ーゼが含まれている分析物の比色検出にしばしば使用さ
れる。この分析物は、しばしばそれ自体このデヒドロゲ
ナーゼの基質でありかつＮＡＤ（Ｐ）Ｈの形成を伴ない
ながら酸化されるか、または種々の予備反応の反応カス
ケードにより、分析物は、ＮＡＤ（Ｐ）依存形デヒドロ
ゲナーゼの基質に変換され、さらにこの基質は、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの形成を伴ないながらこの反応カスケードによ
り酸化される。形成されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、例えばＵ
Ｖ測光分析によって測定することができる。この方法
は、むしろ融通が利かず、かつ高価な測定装置を必要と
する。目で見ての評価は、不可能である。
ーゼが含まれている分析物の比色検出にしばしば使用さ
れる。この分析物は、しばしばそれ自体このデヒドロゲ
ナーゼの基質でありかつＮＡＤ（Ｐ）Ｈの形成を伴ない
ながら酸化されるか、または種々の予備反応の反応カス
ケードにより、分析物は、ＮＡＤ（Ｐ）依存形デヒドロ
ゲナーゼの基質に変換され、さらにこの基質は、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの形成を伴ないながらこの反応カスケードによ
り酸化される。形成されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、例えばＵ
Ｖ測光分析によって測定することができる。この方法
は、むしろ融通が利かず、かつ高価な測定装置を必要と
する。目で見ての評価は、不可能である。
【０００４】直接電子受容体としてのテトラゾリウムを
使用する酸化還元触媒としての酵素ジアホラーゼの存在
下でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈについての非色検出試験は、例え
ばドイツ連邦共和国特許出願公開第２１４７４６６号明
細書の記載から公知である。この刊行物には、ラクテー
トおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドがラク
テートデヒドロゲナーゼ触媒によってピルビン酸および
還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換され
ることが記載されている。更に、形成されるＮＡＤＨ
は、酵素ジアホラーゼの存在下にテトラゾリウム塩と反
応され、ＮＡＤ+および着色されたホルマザンを形成す
ることができ、このＮＡＤ+および着色されたホルマザ
ンの濃度は、測光分析法により測定することができるか
または目で見て測定することができる。この方法の欠点
は、ジアホラーゼの特異性およびテトラゾリウム塩の不
安定性、殊に光および塩基に対する敏感性にある（ま
た、Ｈ．Ｕ．Bergmeyer,“Grundlagen der enzymatisch
en Analyse”、第３版,1977、第９０〜９５頁，“Verla
g Chemie, Weinheim”、参照）。
使用する酸化還元触媒としての酵素ジアホラーゼの存在
下でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈについての非色検出試験は、例え
ばドイツ連邦共和国特許出願公開第２１４７４６６号明
細書の記載から公知である。この刊行物には、ラクテー
トおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドがラク
テートデヒドロゲナーゼ触媒によってピルビン酸および
還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換され
ることが記載されている。更に、形成されるＮＡＤＨ
は、酵素ジアホラーゼの存在下にテトラゾリウム塩と反
応され、ＮＡＤ+および着色されたホルマザンを形成す
ることができ、このＮＡＤ+および着色されたホルマザ
ンの濃度は、測光分析法により測定することができるか
または目で見て測定することができる。この方法の欠点
は、ジアホラーゼの特異性およびテトラゾリウム塩の不
安定性、殊に光および塩基に対する敏感性にある（ま
た、Ｈ．Ｕ．Bergmeyer,“Grundlagen der enzymatisch
en Analyse”、第３版,1977、第９０〜９５頁，“Verla
g Chemie, Weinheim”、参照）。
【０００５】欧州特許出願公開第０４３１４５６号明細
書には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの非色検出のための電子受容体
としてテトラゾリウム塩の代わりに芳香族ニトロソ化合
物が記載されている。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、還元触媒とし
ての酵素ジアホラーゼの存在下に芳香族ニトロソ化合物
と再び酸化される。この方法の場合には、芳香族ニトロ
ソ化合物は、電子富有芳香族アミンに還元される。この
アミンそれ自体は、全く着色されないかまたは著しく僅
かにしか着色されないので、このアミンは、沈殿された
ヘテロポリ酸を使用するかまたは酸化剤との組合せ物の
色形成カップリング試薬を使用して比色検出のための着
色された反応生成物に変換されなければならない。種々
の試薬および反応工程の数は、このような試験を複雑か
つ高価なものにする。還元されたヘテロポリ酸の帯灰青
色は、殊に目で見ての評価には殆んど不適当である。酸
化剤の存在下で色形成カップリング試薬を使用しての酸
化カップリングの欠点は、アミンへのニトロソ芳香族化
合物の還元をアミンと色形成カップリング試薬とのその
後の酸化カップリングとは別個に実施しなければならな
いことである。それというのも、このために必要とされ
る酸化剤は、先の還元反応を妨害するからである。
書には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの非色検出のための電子受容体
としてテトラゾリウム塩の代わりに芳香族ニトロソ化合
物が記載されている。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、還元触媒とし
ての酵素ジアホラーゼの存在下に芳香族ニトロソ化合物
と再び酸化される。この方法の場合には、芳香族ニトロ
ソ化合物は、電子富有芳香族アミンに還元される。この
アミンそれ自体は、全く着色されないかまたは著しく僅
かにしか着色されないので、このアミンは、沈殿された
ヘテロポリ酸を使用するかまたは酸化剤との組合せ物の
色形成カップリング試薬を使用して比色検出のための着
色された反応生成物に変換されなければならない。種々
の試薬および反応工程の数は、このような試験を複雑か
つ高価なものにする。還元されたヘテロポリ酸の帯灰青
色は、殊に目で見ての評価には殆んど不適当である。酸
化剤の存在下で色形成カップリング試薬を使用しての酸
化カップリングの欠点は、アミンへのニトロソ芳香族化
合物の還元をアミンと色形成カップリング試薬とのその
後の酸化カップリングとは別個に実施しなければならな
いことである。それというのも、このために必要とされ
る酸化剤は、先の還元反応を妨害するからである。
【０００６】更に、２当量の分析物またはＮＡＤ（Ｐ）
Ｈは、殊に低い分析物濃度で検出方法の感度の限界を表
わすアミンへの１当量の芳香族ニトロソ化合物の還元の
間に還元される。
Ｈは、殊に低い分析物濃度で検出方法の感度の限界を表
わすアミンへの１当量の芳香族ニトロソ化合物の還元の
間に還元される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、従来技術の欠点を排除し、干渉に対して殆んど影響
されず、容易に実施することができ、かつ特異的反応の
結果として容易に目で見て評価することができる可視光
線の全波長範囲に亘って色を発生させるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
依存形デヒドロゲナーゼを使用して検出することができ
るＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、殊に分析物を検出するためのより敏
感な比色検定法を提供することであった。この方法の場
合には、殊にその後の付加的な反応を必要とすることな
しに色素原酸化還元指示薬を使用して１工程で直接に分
析物またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを検出することができるはず
である。
は、従来技術の欠点を排除し、干渉に対して殆んど影響
されず、容易に実施することができ、かつ特異的反応の
結果として容易に目で見て評価することができる可視光
線の全波長範囲に亘って色を発生させるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
依存形デヒドロゲナーゼを使用して検出することができ
るＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、殊に分析物を検出するためのより敏
感な比色検定法を提供することであった。この方法の場
合には、殊にその後の付加的な反応を必要とすることな
しに色素原酸化還元指示薬を使用して１工程で直接に分
析物またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを検出することができるはず
である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この課題は、特許請求の
範囲に特徴付けられたように本発明によって達成され
る。
範囲に特徴付けられたように本発明によって達成され
る。
【０００９】意外なことに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ依存形酵素ベンジルアルコールデヒドロゲナー
ゼおよび酵素／ＮＡＤＨ系の直接電子受容体としてのニ
トロソアニリン化合物を使用して着色されたキノンジイ
ミン化合物を形成させることによって著しく有利に測定
することができる。
（Ｐ）Ｈ依存形酵素ベンジルアルコールデヒドロゲナー
ゼおよび酵素／ＮＡＤＨ系の直接電子受容体としてのニ
トロソアニリン化合物を使用して着色されたキノンジイ
ミン化合物を形成させることによって著しく有利に測定
することができる。
【００１０】本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、または反応し
てＮＡＤ（Ｐ）Ｈを形成させる酵素の基質である分析物
を、直接色素原電子受容体の存在下でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
酸化酵素の酸化およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の測定値とし
ての還元された電子受容体の検出により比色検出するた
めの方法に関し、この方法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを酵素ベ
ンジルアルコールデヒドロゲナーゼと、電子受容体とし
ての一般式Ｉ：
てＮＡＤ（Ｐ）Ｈを形成させる酵素の基質である分析物
を、直接色素原電子受容体の存在下でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
酸化酵素の酸化およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の測定値とし
ての還元された電子受容体の検出により比色検出するた
めの方法に関し、この方法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを酵素ベ
ンジルアルコールデヒドロゲナーゼと、電子受容体とし
ての一般式Ｉ：
【００１１】
【化５】
【００１２】〔式中、Ｒ1は水素原子、ヒドロキシ基、
ハロゲン原子、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ基またはＣ1〜Ｃ6
−アルキルチオ基、Ｃ6〜Ｃ10−アリールオキシ基また
はＣ6〜Ｃ10−アリールチオ基、必要に応じてカルボキ
シ、ＰＯ3Ｈ2もしくはＳＯ3Ｈによって置換されたＣ1〜
Ｃ6−アルキル基、必要に応じて１回または２回Ｃ1〜Ｃ
6−アルキルによって置換され、さらに必要に応じてヒ
ドロキシもしくはカルボキシ、ＰＯ3Ｈ2、ジアルキルホ
スフィニルもしくはＳＯ3Ｈによって置換されていても
よいアミノ基を表わし、Ｒはキノンジイミン系との電子
共役によって色を形成する残基を表わす〕で示されるニ
トロソアニリン化合物の存在下に反応させ、この場合、
このニトロソアニリン化合物は、この方法で着色された
キノンジイミンに酵素的に還元され、キノンジイミンを
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の測定値として測定することによっ
て特徴付けられる。
ハロゲン原子、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ基またはＣ1〜Ｃ6
−アルキルチオ基、Ｃ6〜Ｃ10−アリールオキシ基また
はＣ6〜Ｃ10−アリールチオ基、必要に応じてカルボキ
シ、ＰＯ3Ｈ2もしくはＳＯ3Ｈによって置換されたＣ1〜
Ｃ6−アルキル基、必要に応じて１回または２回Ｃ1〜Ｃ
6−アルキルによって置換され、さらに必要に応じてヒ
ドロキシもしくはカルボキシ、ＰＯ3Ｈ2、ジアルキルホ
スフィニルもしくはＳＯ3Ｈによって置換されていても
よいアミノ基を表わし、Ｒはキノンジイミン系との電子
共役によって色を形成する残基を表わす〕で示されるニ
トロソアニリン化合物の存在下に反応させ、この場合、
このニトロソアニリン化合物は、この方法で着色された
キノンジイミンに酵素的に還元され、キノンジイミンを
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の測定値として測定することによっ
て特徴付けられる。
【００１３】Ｒ1の１つの好ましい残基は、水素原子で
ある。
ある。
【００１４】“分析物”は、本発明によれば、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ依存形デヒドロゲナーゼによって酵素的に酸化
される物質として理解される。多くの場合には、分析物
は、試験すべき試料の場合に直接に測定することが意図
される物質である。例えば、ラクテートは、ラクテート
デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤを使用して直接に使用す
ることができ、かつ形成されるＮＡＤＨの検出により比
色検出することができる。しかし、分析物を１つまたは
幾つかの予備反応によって別の物質から形成させること
も可能であり、したがって開始物質の濃度は、分析物ま
たはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの比色検出によって減少させること
ができる。本発明の分析物は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存形デ
ヒドロゲナーゼの基質として酸化される物質であり、そ
の結果還元ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成される。ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ依存形デヒドロゲナーゼは、主要な群ＥＣ １．ｘ．
１．ｙの酵素として理解される。適合するデヒドロゲナ
ーゼを有する分析物の例は、ラクテート／ラクテートデ
ヒドロゲナーゼ、エタノール／アルコールデヒドロゲナ
ーゼ、グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ、ピル
ビン酸／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ等である。
（Ｐ）Ｈ依存形デヒドロゲナーゼによって酵素的に酸化
される物質として理解される。多くの場合には、分析物
は、試験すべき試料の場合に直接に測定することが意図
される物質である。例えば、ラクテートは、ラクテート
デヒドロゲナーゼおよびＮＡＤを使用して直接に使用す
ることができ、かつ形成されるＮＡＤＨの検出により比
色検出することができる。しかし、分析物を１つまたは
幾つかの予備反応によって別の物質から形成させること
も可能であり、したがって開始物質の濃度は、分析物ま
たはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの比色検出によって減少させること
ができる。本発明の分析物は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存形デ
ヒドロゲナーゼの基質として酸化される物質であり、そ
の結果還元ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成される。ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ依存形デヒドロゲナーゼは、主要な群ＥＣ １．ｘ．
１．ｙの酵素として理解される。適合するデヒドロゲナ
ーゼを有する分析物の例は、ラクテート／ラクテートデ
ヒドロゲナーゼ、エタノール／アルコールデヒドロゲナ
ーゼ、グルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ、ピル
ビン酸／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ等である。
【００１５】ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのための色素原酸化還元指
示薬は、酵素触媒の下でＮＡＤ（Ｐ）Ｈから電子を受け
入れることができかつさらに酸化された形の色とは異な
る還元された形で目で見ることができる色を有する物質
として理解される。この場合には、酸化還元指示薬の酸
化された形の吸収ピークは、有利に非可視光線の範囲内
または青色の範囲内（≦５００ｎｍ）にあり、還元され
た形の色は、有利に５００〜７００ｎｍの波長範囲内に
ある。
示薬は、酵素触媒の下でＮＡＤ（Ｐ）Ｈから電子を受け
入れることができかつさらに酸化された形の色とは異な
る還元された形で目で見ることができる色を有する物質
として理解される。この場合には、酸化還元指示薬の酸
化された形の吸収ピークは、有利に非可視光線の範囲内
または青色の範囲内（≦５００ｎｍ）にあり、還元され
た形の色は、有利に５００〜７００ｎｍの波長範囲内に
ある。
【００１６】本発明による方法の場合には、式Ｉのニト
ロソアニリン化合物は、ベンジルアルコールデヒドロゲ
ナーゼの存在下に作用し、同時にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ベン
ジルアルコールデヒドロゲナーゼ系の直接電子受容体お
よび色素原酸化還元指示薬として作用する。直接電子受
容体は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酵素的酸化の間に放出される
電子が酵素触媒によってニトロソアニリン化合物上に移
動されることを意味する。更に、酵素ベンジルアルコー
ルデヒドロゲナーゼは、このような反応を著しく迅速に
特異的に触媒する。相応するヒドロキシルアミン−アニ
リン化合物は、ニトロソアニリン化合物の酵素的還元の
際の媒介物として形成され、次にこの化合物は自発的に
著しく迅速に水を分解し、したがって一般式ＩＩ：
ロソアニリン化合物は、ベンジルアルコールデヒドロゲ
ナーゼの存在下に作用し、同時にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ベン
ジルアルコールデヒドロゲナーゼ系の直接電子受容体お
よび色素原酸化還元指示薬として作用する。直接電子受
容体は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酵素的酸化の間に放出される
電子が酵素触媒によってニトロソアニリン化合物上に移
動されることを意味する。更に、酵素ベンジルアルコー
ルデヒドロゲナーゼは、このような反応を著しく迅速に
特異的に触媒する。相応するヒドロキシルアミン−アニ
リン化合物は、ニトロソアニリン化合物の酵素的還元の
際の媒介物として形成され、次にこの化合物は自発的に
著しく迅速に水を分解し、したがって一般式ＩＩ：
【００１７】
【化６】
【００１８】の着色されたキノンジイミンは、一般式Ｉ
の色素原ニトロソアニリン化合物の酵素還元の最終的生
成物として生じ、この生成物の色は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈま
たは試料溶液中の分析物の濃度で直接的に強度測定値の
形で補正することができるものと思われる。
の色素原ニトロソアニリン化合物の酵素還元の最終的生
成物として生じ、この生成物の色は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈま
たは試料溶液中の分析物の濃度で直接的に強度測定値の
形で補正することができるものと思われる。
【００１９】一般式ＩおよびＩＩの化合物の色形成残基
Ｒは、有利に電子富有の芳香族残基またはヘテロ芳香族
残基を表わし、この残基の電子は、一般式ＩＩ中のイミ
ン基を有する部分によってことに表わされるような電子
の場合により不十分である１つの系と共役することがで
き、したがって染料のポリメチンの一般的な型の着色さ
れた分子が形成される。
Ｒは、有利に電子富有の芳香族残基またはヘテロ芳香族
残基を表わし、この残基の電子は、一般式ＩＩ中のイミ
ン基を有する部分によってことに表わされるような電子
の場合により不十分である１つの系と共役することがで
き、したがって染料のポリメチンの一般的な型の着色さ
れた分子が形成される。
【００２０】数多くのこのような色形成残基Ｒは有用で
ある。従って、一般式ＩＩの着色されたキノンジイミン
は、極めてよく知られている：この化合物が生成される
別の方法は、色素原カップリング試薬Ｒ−Ｈをｐ−フェ
ニレンジアミン誘導体で酸化カップリングすることであ
る。この酸化カップリングは、殊にカラー写真により知
られている（例えば、T. H. James, The Theory of the
Photographic Process,第３版、McMillan, New York、
1966、第１７章（Principles and Chemistry of Color
Photography）第３８２〜３９６頁またはUlmann's Ency
clopedia of Industrial Chemistry 第５版、第Ａ２０
巻、第７２〜７４頁,“Verlag Chemie, Weinheim”）。
ある。従って、一般式ＩＩの着色されたキノンジイミン
は、極めてよく知られている：この化合物が生成される
別の方法は、色素原カップリング試薬Ｒ−Ｈをｐ−フェ
ニレンジアミン誘導体で酸化カップリングすることであ
る。この酸化カップリングは、殊にカラー写真により知
られている（例えば、T. H. James, The Theory of the
Photographic Process,第３版、McMillan, New York、
1966、第１７章（Principles and Chemistry of Color
Photography）第３８２〜３９６頁またはUlmann's Ency
clopedia of Industrial Chemistry 第５版、第Ａ２０
巻、第７２〜７４頁,“Verlag Chemie, Weinheim”）。
【００２１】
【化７】
【００２２】一般式ＩＩの着色されたキノンジイミンを
製造するためのｐ−フェニレンジアミン誘導体を用いる
色素原カップリング試薬の酸化カップリングの他の適用
法は、酸化物質、例えばＨ2Ｏ2またはペルオキシダーゼ
を検出するかまたは電子富有アニリン化合物を検出する
ための分析法である（例えば、欧州特許出願公開第１７
５２５０号明細書、参照）。最も常用されているこのよ
うな色形成カップリング試薬は、フェノール、フェノー
ル誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルア
ミン、ナフチルアミン誘導体、アニリン誘導体である。
また、活性メチレン化合物および複素環式化合物も常用
されている。
製造するためのｐ−フェニレンジアミン誘導体を用いる
色素原カップリング試薬の酸化カップリングの他の適用
法は、酸化物質、例えばＨ2Ｏ2またはペルオキシダーゼ
を検出するかまたは電子富有アニリン化合物を検出する
ための分析法である（例えば、欧州特許出願公開第１７
５２５０号明細書、参照）。最も常用されているこのよ
うな色形成カップリング試薬は、フェノール、フェノー
ル誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルア
ミン、ナフチルアミン誘導体、アニリン誘導体である。
また、活性メチレン化合物および複素環式化合物も常用
されている。
【００２３】一般式ＩＩの着色されたキノンジイミンを
製造するための公知の別の方法は、例えば３−アミノピ
ラゾロ複素環式化合物またはピラゾロン、例えば４−ア
ミノアンチピリンのようなヘテロ芳香族アミンＲ−ＮＨ
2のアミノ基を酸化カップリングしてアニリン誘導体に
変え、一般式ＩＩの着色されたキノンジイミンを形成さ
せることができる（欧州特許出願公開第０４３３８５４
号明細書、参照）。
製造するための公知の別の方法は、例えば３−アミノピ
ラゾロ複素環式化合物またはピラゾロン、例えば４−ア
ミノアンチピリンのようなヘテロ芳香族アミンＲ−ＮＨ
2のアミノ基を酸化カップリングしてアニリン誘導体に
変え、一般式ＩＩの着色されたキノンジイミンを形成さ
せることができる（欧州特許出願公開第０４３３８５４
号明細書、参照）。
【００２４】
【化８】
【００２５】また、酸化カップリング反応により式ＩＩ
の着色されたキノンジイミン化合物を導く前記の全ての
カップリング化合物ＲＨおよびＲ−ＮＨ2の色形成残基
Ｒは、本発明により使用することができる式Ｉのニトロ
ソアニリン化合物中の残基Ｒとしても適当である。唯一
の必要条件は、前記の残基が電子系により式ＩＩのイミ
ノ基と相互作用し、したがって可視光線範囲内で色を発
生させることである。当業者であれば、望ましい波長に
適当な残基を容易に見い出すことができ、かつ適当に置
換されたニトロソアニリン化合物を本発明による方法に
使用することができる。残基Ｒは、ニトロソアニリン部
分の酵素的還元に余り影響を及ぼさない。可能な残基の
多重度にも拘わらず、式Ｉのニトロソアニリン化合物
は、基質および電子受容体としてのベンジルアルコール
デヒドロゲナーゼによって受容される。
の着色されたキノンジイミン化合物を導く前記の全ての
カップリング化合物ＲＨおよびＲ−ＮＨ2の色形成残基
Ｒは、本発明により使用することができる式Ｉのニトロ
ソアニリン化合物中の残基Ｒとしても適当である。唯一
の必要条件は、前記の残基が電子系により式ＩＩのイミ
ノ基と相互作用し、したがって可視光線範囲内で色を発
生させることである。当業者であれば、望ましい波長に
適当な残基を容易に見い出すことができ、かつ適当に置
換されたニトロソアニリン化合物を本発明による方法に
使用することができる。残基Ｒは、ニトロソアニリン部
分の酵素的還元に余り影響を及ぼさない。可能な残基の
多重度にも拘わらず、式Ｉのニトロソアニリン化合物
は、基質および電子受容体としてのベンジルアルコール
デヒドロゲナーゼによって受容される。
【００２６】好ましい残基Ｒは、アニリン残基、ナフチ
ルアミン残基、付加的な置換基を有することができるフ
ェノール残基およびナフトール残基ならびに殊に一般式
ＩＩＩ：
ルアミン残基、付加的な置換基を有することができるフ
ェノール残基およびナフトール残基ならびに殊に一般式
ＩＩＩ：
【００２７】
【化９】
【００２８】〔式中、Ｒ2は水素原子、ヒドロキシ基、
ハロゲン原子、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリー
ルオキシ基またはアリールチオ基、必要に応じてカルボ
キシ、ＰＯ3Ｈ2もしくはＳＯ3Ｈによって置換されたア
ルキル基またはアルキレン基、必要に応じて１回または
２回アルキルによって置換され、さらに必要に応じてヒ
ドロキシ、ＰＯ3Ｈ2、ＳＯ3Ｈもしくはカルボキシによ
って置換されていてもよいかまたは残基Ｒ1と一緒に−
ＣＨ2−ＣＨ2、−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＲ12Ｒ13−、−Ｏ
−、−Ｓ−もしくは−ＮＨ−橋（但し、ＮＨは必要に応
じてアルキル残基によって置換されていてもよく、Ｒ12
およびＲ13は、必要に応じてヒドロキシ、カルボキシ、
ＰＯ3Ｈ2もしくはＳＯ3Ｈによって置換されていてもよ
いカルボキシ基またはアルキル基を表わすものとする）
を形成することができるアミノ基を表わし、Ｒ3はヒド
ロキシ基、アルキル残基がさらに必要に応じてヒドロキ
シ基、アルコキシ基、必要に応じて１回または数回アル
キル、ＰＯ3Ｈ2、ＳＯ3ＨもしくはＣＯ2Ｈによって置換
されたそれ自体としてかまたはアンモニウム塩、アルカ
リ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩としての塩の形の
アミノ基によって置換されているアルキル基、アルコキ
シ基、アリール基、アリールオキシ基、アリールチオ基
またはアルキルチオ基を表わすかまたはアミノ基ＮＲ4
Ｒ5を表わし、Ｒ4およびＲ5は、同一でも異なっていて
もよく、水素原子、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキ
シアルコキシによってさらに置換されていてもよいアル
キル基、必要に応じてヒドロキシ、ＰＯ3Ｈ2、ＳＯ
3Ｈ、ＣＯＯＨによって置換されているそれ自体として
かまたは塩の形のポリアルコキシ基または必要に応じて
１回または数回アルキルによって置換されたアミノ基に
よって必要に応じて置換されているポリアルコキシ基を
表わすか、或いはＲ4およびＲ5は、必要に応じて酸素原
子、硫黄原子もしくは窒素原子（但し、窒素原子は、ア
ルキル残基、ヒドロキシアルキル残基、ヒドロキシアル
コキシアルキル残基、アルコキシヒドロキシアルキル残
基、アルコキシカルボニルアルキル残基、ジオキサニリ
ルアルキル残基もしくはポリアルコキシアルキル残基に
よって置換されているものとする）によって中断されて
いるアルキレン残基を表わすことができ、これらのアル
キレン残基は、それぞれさらに必要に応じてアルキル部
分がヒドロキシ残基によって置換されていてもよいかま
たはＲ2がＮＲ4Ｒ5、Ｒ4もしくはＲ5に対してオルト位
にある場合には、Ｒ2と一緒になってアルキレン残基を
表わすこともできる〕で示される残基である。
ハロゲン原子、アルコキシ基、アルキルチオ基、アリー
ルオキシ基またはアリールチオ基、必要に応じてカルボ
キシ、ＰＯ3Ｈ2もしくはＳＯ3Ｈによって置換されたア
ルキル基またはアルキレン基、必要に応じて１回または
２回アルキルによって置換され、さらに必要に応じてヒ
ドロキシ、ＰＯ3Ｈ2、ＳＯ3Ｈもしくはカルボキシによ
って置換されていてもよいかまたは残基Ｒ1と一緒に−
ＣＨ2−ＣＨ2、−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＲ12Ｒ13−、−Ｏ
−、−Ｓ−もしくは−ＮＨ−橋（但し、ＮＨは必要に応
じてアルキル残基によって置換されていてもよく、Ｒ12
およびＲ13は、必要に応じてヒドロキシ、カルボキシ、
ＰＯ3Ｈ2もしくはＳＯ3Ｈによって置換されていてもよ
いカルボキシ基またはアルキル基を表わすものとする）
を形成することができるアミノ基を表わし、Ｒ3はヒド
ロキシ基、アルキル残基がさらに必要に応じてヒドロキ
シ基、アルコキシ基、必要に応じて１回または数回アル
キル、ＰＯ3Ｈ2、ＳＯ3ＨもしくはＣＯ2Ｈによって置換
されたそれ自体としてかまたはアンモニウム塩、アルカ
リ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩としての塩の形の
アミノ基によって置換されているアルキル基、アルコキ
シ基、アリール基、アリールオキシ基、アリールチオ基
またはアルキルチオ基を表わすかまたはアミノ基ＮＲ4
Ｒ5を表わし、Ｒ4およびＲ5は、同一でも異なっていて
もよく、水素原子、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキ
シアルコキシによってさらに置換されていてもよいアル
キル基、必要に応じてヒドロキシ、ＰＯ3Ｈ2、ＳＯ
3Ｈ、ＣＯＯＨによって置換されているそれ自体として
かまたは塩の形のポリアルコキシ基または必要に応じて
１回または数回アルキルによって置換されたアミノ基に
よって必要に応じて置換されているポリアルコキシ基を
表わすか、或いはＲ4およびＲ5は、必要に応じて酸素原
子、硫黄原子もしくは窒素原子（但し、窒素原子は、ア
ルキル残基、ヒドロキシアルキル残基、ヒドロキシアル
コキシアルキル残基、アルコキシヒドロキシアルキル残
基、アルコキシカルボニルアルキル残基、ジオキサニリ
ルアルキル残基もしくはポリアルコキシアルキル残基に
よって置換されているものとする）によって中断されて
いるアルキレン残基を表わすことができ、これらのアル
キレン残基は、それぞれさらに必要に応じてアルキル部
分がヒドロキシ残基によって置換されていてもよいかま
たはＲ2がＮＲ4Ｒ5、Ｒ4もしくはＲ5に対してオルト位
にある場合には、Ｒ2と一緒になってアルキレン残基を
表わすこともできる〕で示される残基である。
【００２９】この場合、ハロゲン原子は、弗素原子、塩
素原子、臭素原子または沃素原子を表わす。弗素原子お
よび塩素原子は、特に好ましい。
素原子、臭素原子または沃素原子を表わす。弗素原子お
よび塩素原子は、特に好ましい。
【００３０】アルキル基、アルコキシ基またはアルキル
チオ基中のアルキルは、１〜６個の炭素原子を有する炭
化水素残基を表わし、１〜３個の炭素原子を有する残基
は、特に好ましい。また、アルキルについて上記された
定義は、ヒドロキシアルキル残基、ジアルキルアミノア
ルキル残基、ヒドロキシアルコキシアルキル残基、アル
コキシアルキル残基、ポリアルコキシアルキル残基、ア
ルコキシヒドロキシアルキル残基およびジオキサニリル
アルキル残基中のアルキル部分に適用される。ジオキサ
ニリルアルキル残基は、ジオキサン環系がアルキル残基
に結合されている残基である。これは、有利には１，４
−ジオキサン環系、即ち次のものである：
チオ基中のアルキルは、１〜６個の炭素原子を有する炭
化水素残基を表わし、１〜３個の炭素原子を有する残基
は、特に好ましい。また、アルキルについて上記された
定義は、ヒドロキシアルキル残基、ジアルキルアミノア
ルキル残基、ヒドロキシアルコキシアルキル残基、アル
コキシアルキル残基、ポリアルコキシアルキル残基、ア
ルコキシヒドロキシアルキル残基およびジオキサニリル
アルキル残基中のアルキル部分に適用される。ジオキサ
ニリルアルキル残基は、ジオキサン環系がアルキル残基
に結合されている残基である。これは、有利には１，４
−ジオキサン環系、即ち次のものである：
【００３１】
【化１０】
【００３２】ポリアルコキシアルキル残基は、アルキル
−（アルコキシ）n−アルコキシ残基であり、この場合
ｎは、１〜１０である。ｎは、有利に１〜４である。ｎ
は、特に有利に１〜３である。アルキレン残基は、２個
の自由結合部位を有する炭素原子数２〜５、有利に２〜
４の直鎖状または分子鎖状、有利に直鎖状の飽和または
不飽和、有利に飽和の炭化水素鎖である。
−（アルコキシ）n−アルコキシ残基であり、この場合
ｎは、１〜１０である。ｎは、有利に１〜４である。ｎ
は、特に有利に１〜３である。アルキレン残基は、２個
の自由結合部位を有する炭素原子数２〜５、有利に２〜
４の直鎖状または分子鎖状、有利に直鎖状の飽和または
不飽和、有利に飽和の炭化水素鎖である。
【００３３】アリール残基およびアラルキル残基中のア
リールは、６〜１０個の炭素原子を有する芳香族環系で
あり、この場合には、フェニル基が好ましい。
リールは、６〜１０個の炭素原子を有する芳香族環系で
あり、この場合には、フェニル基が好ましい。
【００３４】アンモニウム塩は、アンモニウムイオンＮ
Ｈ4 +を含有するものであるかまたは１回または数回アル
キル残基、アリール残基もしくはアラルキル残基によっ
て置換されたアンモニウム陽イオンを含有するものであ
る。
Ｈ4 +を含有するものであるかまたは１回または数回アル
キル残基、アリール残基もしくはアラルキル残基によっ
て置換されたアンモニウム陽イオンを含有するものであ
る。
【００３５】アルカリ金属塩は、有利にリチウム、ナト
リウムまたはカリウムのものである。アルカリ土類金属
塩は、有利にマグネシウムまたはカルシウムのものであ
る。
リウムまたはカリウムのものである。アルカリ土類金属
塩は、有利にマグネシウムまたはカルシウムのものであ
る。
【００３６】酸素原子、硫黄原子または窒素原子によっ
て中断されたＲ2およびＲ4のアルキレン残基の意味にお
いて、一般式Ｉの窒素原子を配合することによって形成
されたモルホリン残基またはチオモルホリン残基または
ピペラジン残基は好ましい。ピペラジン残基は殊に好ま
しい。
て中断されたＲ2およびＲ4のアルキレン残基の意味にお
いて、一般式Ｉの窒素原子を配合することによって形成
されたモルホリン残基またはチオモルホリン残基または
ピペラジン残基は好ましい。ピペラジン残基は殊に好ま
しい。
【００３７】Ｒ2およびＲ4から形成されたアルキレン残
基の意味において、一般式Ｉの芳香環を配合することに
よって形成されたインドリン残基または１，２，３，４
−テトラヒドロキノリン残基は好ましい。
基の意味において、一般式Ｉの芳香環を配合することに
よって形成されたインドリン残基または１，２，３，４
−テトラヒドロキノリン残基は好ましい。
【００３８】本発明による一般式Ｉのニトロソアニリン
誘導体の好ましい塩は、殊に強酸、殊に鉱酸、例えば塩
酸、硫酸、硝酸、燐酸のものである。ヒドロクロリドが
殊に好ましく、これは、塩酸の塩である。
誘導体の好ましい塩は、殊に強酸、殊に鉱酸、例えば塩
酸、硫酸、硝酸、燐酸のものである。ヒドロクロリドが
殊に好ましく、これは、塩酸の塩である。
【００３９】水素原子は、Ｒ2にとって好ましいもので
あり、ヒドロキシ基、アルコキシ基またはジ置換アミノ
基ＮＲ4Ｒ5は、Ｒ3にとって好ましい。
あり、ヒドロキシ基、アルコキシ基またはジ置換アミノ
基ＮＲ4Ｒ5は、Ｒ3にとって好ましい。
【００４０】Ｎ，Ｎ−ジ置換アニリン残基、例えばＮ，
Ｎ−ジヒドロキシエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンは、式ＩＩＩの残基
Ｒとして特に好ましい。
Ｎ−ジヒドロキシエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンは、式ＩＩＩの残基
Ｒとして特に好ましい。
【００４１】色形成残基として適当である他の残基は、
カラー写真から知られたＣＨ酸化合物、例えば１，３−
インダンジオン、チオインドキシルまたはインドキシル
ならびにメチレン活性複素環式化合物、例えばピラゾロ
ン等である。好ましいヘテロ芳香族色素原残基は、ピラ
ゾール、ピラゾロンおよびピラゾロ化合物、例えばUlma
nn's Encyclopedia of Industrial Chemistry 第５版、
第Ａ２０巻、第７２〜７４頁,“Verlag Chemie, Weinhe
im”の記載から公知であるもの、ならびに殊にアンチピ
リン残基および式ＩＶの縮合環化されたピラゾロ残基、
ならびに必要に応じて相応する互変異形およびその塩で
あり、これらの中の大部分は、欧州特許出願公開第０４
３３８５４号明細書に３−アミノ置換化合物として記載
されている。
カラー写真から知られたＣＨ酸化合物、例えば１，３−
インダンジオン、チオインドキシルまたはインドキシル
ならびにメチレン活性複素環式化合物、例えばピラゾロ
ン等である。好ましいヘテロ芳香族色素原残基は、ピラ
ゾール、ピラゾロンおよびピラゾロ化合物、例えばUlma
nn's Encyclopedia of Industrial Chemistry 第５版、
第Ａ２０巻、第７２〜７４頁,“Verlag Chemie, Weinhe
im”の記載から公知であるもの、ならびに殊にアンチピ
リン残基および式ＩＶの縮合環化されたピラゾロ残基、
ならびに必要に応じて相応する互変異形およびその塩で
あり、これらの中の大部分は、欧州特許出願公開第０４
３３８５４号明細書に３−アミノ置換化合物として記載
されている。
【００４２】
【化１１】
【００４３】この場合、Ｘ−Ｙは、ＮＲ6−ＣＯまたは
Ｎ＝ＣＲ7を表わし、Ｒ6は、Ｈ原子、必要に応じてヒド
ロキシ、カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、ジアルキル
ホスフィニルによって置換されたアルキル基を表わし、
Ｒ7は、Ｈ原子、アルキル基、アルケニル基、アルコキ
シ基、アルキルチオ基、アリール基、アラルキル基（但
し、これらの基はそれぞれ必要に応じてヒドロキシ、ジ
アルキルホスフィニル、カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ
2、これらの酸残基の１つの塩および／またはアルコキ
シカルボニルによって置換されているものとする）を表
わすか、または必要に応じて１個または幾つかのヒドロ
キシ残基、カルボキシ残基および／またはアルコキシカ
ルボニル残基を有する必要に応じて１または２個のアル
キル残基によって置換されているアミノ基を表わし、こ
の場合アミノ基が２個のアルキル残基によって置換され
ている場合には、これらの残基は、アミノ基のＮ原子か
ら離れて酸素原子、硫黄原子または他の窒素原子によっ
て中断されていてもよいかまたは必要に応じて１または
２個のアシル基、アルコキシ基および／またはアラルコ
キシカルボニル基、Ｈ2Ｎ−ＣＯ基、アルキル基、アラ
ルキル基および／またはアリールカルバモイル基によっ
て置換されているアミノ基によって中断されていてもよ
い１つの環を形成するために結合していてもよいか；或
いは、水素原子、カルボキシ基、アルコキシカルボニル
基、カルボキサミド基またはハロゲン原子であり、Ｒ8
は、必要に応じてヒドロキシ、カルボキシ、ＳＯ3Ｈも
しくはＰＯ3Ｈ2によって置換されたアルキル基、チオア
ルキル基またはアラルキル基を表わすかまたは必要に応
じて１または２個のアルキル基によって置換され、さら
にヒドロキシ、カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ジアルキルホス
フィニルもしくはＰＯ3Ｈ2によって置換されていてもよ
いアミノ基を表わし、この場合少なくともＲ7および／
またはＲ8はアミノ基を表わし、Ｒ9は、必要に応じてヒ
ドロキシ、カルボキシ、ＳＯ3ＨもしくはＰＯ3Ｈ2によ
って置換されていてもよいアルキル基またはアラルキル
基を表わすか、或いはＲ8またはＲ9は一緒になって、必
要に応じて１個または幾つかの窒素原子または硫黄原子
を有する、窒素原子または炭素原子から構成された３ま
たは４員の飽和または不飽和の鎖を形成し、この場合炭
素原子は、必要に応じてアルキル、アルコキシ、アルキ
ルチオ、ヒドロキシ、アラルキル、アリール、カルボキ
シ、カルボキサミド、アルコキシカルボニル、シアノ、
ハロゲン、必要に応じて１個または幾つかのヒドロキシ
残基、カルボキシ残基および／またはアルコキシカルボ
ニル残基を有する必要に応じて１または２個のアルキル
残基によって置換されているアミノ基によって置換され
ており、かつ二重結合を介して結合されていない窒素原
子は、水素原子、必要に応じてヒドロキシ、ＳＯ3Ｈ、
ＰＯ3Ｈ2、カルボキシもしくはジアルキルホスフィニ
ル、またはアラルキルもしくは２個の隣接鎖置換基によ
って置換されており、必要に応じてアルキレン基を形成
し、さらに必要に応じてアリールによって置換されてい
るかまたは縮合環化されている。
Ｎ＝ＣＲ7を表わし、Ｒ6は、Ｈ原子、必要に応じてヒド
ロキシ、カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、ジアルキル
ホスフィニルによって置換されたアルキル基を表わし、
Ｒ7は、Ｈ原子、アルキル基、アルケニル基、アルコキ
シ基、アルキルチオ基、アリール基、アラルキル基（但
し、これらの基はそれぞれ必要に応じてヒドロキシ、ジ
アルキルホスフィニル、カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ
2、これらの酸残基の１つの塩および／またはアルコキ
シカルボニルによって置換されているものとする）を表
わすか、または必要に応じて１個または幾つかのヒドロ
キシ残基、カルボキシ残基および／またはアルコキシカ
ルボニル残基を有する必要に応じて１または２個のアル
キル残基によって置換されているアミノ基を表わし、こ
の場合アミノ基が２個のアルキル残基によって置換され
ている場合には、これらの残基は、アミノ基のＮ原子か
ら離れて酸素原子、硫黄原子または他の窒素原子によっ
て中断されていてもよいかまたは必要に応じて１または
２個のアシル基、アルコキシ基および／またはアラルコ
キシカルボニル基、Ｈ2Ｎ−ＣＯ基、アルキル基、アラ
ルキル基および／またはアリールカルバモイル基によっ
て置換されているアミノ基によって中断されていてもよ
い１つの環を形成するために結合していてもよいか；或
いは、水素原子、カルボキシ基、アルコキシカルボニル
基、カルボキサミド基またはハロゲン原子であり、Ｒ8
は、必要に応じてヒドロキシ、カルボキシ、ＳＯ3Ｈも
しくはＰＯ3Ｈ2によって置換されたアルキル基、チオア
ルキル基またはアラルキル基を表わすかまたは必要に応
じて１または２個のアルキル基によって置換され、さら
にヒドロキシ、カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ジアルキルホス
フィニルもしくはＰＯ3Ｈ2によって置換されていてもよ
いアミノ基を表わし、この場合少なくともＲ7および／
またはＲ8はアミノ基を表わし、Ｒ9は、必要に応じてヒ
ドロキシ、カルボキシ、ＳＯ3ＨもしくはＰＯ3Ｈ2によ
って置換されていてもよいアルキル基またはアラルキル
基を表わすか、或いはＲ8またはＲ9は一緒になって、必
要に応じて１個または幾つかの窒素原子または硫黄原子
を有する、窒素原子または炭素原子から構成された３ま
たは４員の飽和または不飽和の鎖を形成し、この場合炭
素原子は、必要に応じてアルキル、アルコキシ、アルキ
ルチオ、ヒドロキシ、アラルキル、アリール、カルボキ
シ、カルボキサミド、アルコキシカルボニル、シアノ、
ハロゲン、必要に応じて１個または幾つかのヒドロキシ
残基、カルボキシ残基および／またはアルコキシカルボ
ニル残基を有する必要に応じて１または２個のアルキル
残基によって置換されているアミノ基によって置換され
ており、かつ二重結合を介して結合されていない窒素原
子は、水素原子、必要に応じてヒドロキシ、ＳＯ3Ｈ、
ＰＯ3Ｈ2、カルボキシもしくはジアルキルホスフィニ
ル、またはアラルキルもしくは２個の隣接鎖置換基によ
って置換されており、必要に応じてアルキレン基を形成
し、さらに必要に応じてアリールによって置換されてい
るかまたは縮合環化されている。
【００４４】この場合、“アルキル”ならびにアルキル
チオ残基、ジアルキルホスフィニル残基、アルキルカル
バモイル残基およびアラルキル残基中のアルキルは、１
〜６個、有利に１〜４個の炭素原子を有する直鎖状また
は分子鎖状アルキル残基を表わす。例は、メチル基、エ
チル基、プロピル基、イソブチル基または第三ブチル基
である。
チオ残基、ジアルキルホスフィニル残基、アルキルカル
バモイル残基およびアラルキル残基中のアルキルは、１
〜６個、有利に１〜４個の炭素原子を有する直鎖状また
は分子鎖状アルキル残基を表わす。例は、メチル基、エ
チル基、プロピル基、イソブチル基または第三ブチル基
である。
【００４５】アミノ基が２個のアルキル残基によって置
換されている場合には、この残基は、全体的に窒素原子
によって中断された環を表わすように結合していてもよ
く、１つの環を形成する。この場合には、全体的にさら
に酸素原子、硫黄原子もしくは窒素原子によって中断さ
れている５員または６員の環を表わすようなアミノ基が
好ましい。モルホリノ残基は、特に好ましい。
換されている場合には、この残基は、全体的に窒素原子
によって中断された環を表わすように結合していてもよ
く、１つの環を形成する。この場合には、全体的にさら
に酸素原子、硫黄原子もしくは窒素原子によって中断さ
れている５員または６員の環を表わすようなアミノ基が
好ましい。モルホリノ残基は、特に好ましい。
【００４６】“アルコキシ”ならびにアルコキシ残基お
よびアラルコキシカルボニル残基中のアルコキシは、１
〜６個、有利に１〜４個の炭素原子を有する直鎖状また
は分子鎖状アルコキシ残基を表わす。例は、メトキシ
基、プロピルオキシ基、イソブチルオキシ基または第三
ブチルオキシ基である。
よびアラルコキシカルボニル残基中のアルコキシは、１
〜６個、有利に１〜４個の炭素原子を有する直鎖状また
は分子鎖状アルコキシ残基を表わす。例は、メトキシ
基、プロピルオキシ基、イソブチルオキシ基または第三
ブチルオキシ基である。
【００４７】“アリール”ならびにアリールカルバモイ
ル基中のアリールは、炭素芳香族残基またはヘテロ芳香
族残基、有利に６〜１０個の環原子を有するもの、殊に
付加的にアルキル、アルコキシおよび／またはハロゲン
によってさらに置換されていてもよいフェニル基および
ナフチル基を表わす。フェニル残基は、特に好ましい。
ル基中のアリールは、炭素芳香族残基またはヘテロ芳香
族残基、有利に６〜１０個の環原子を有するもの、殊に
付加的にアルキル、アルコキシおよび／またはハロゲン
によってさらに置換されていてもよいフェニル基および
ナフチル基を表わす。フェニル残基は、特に好ましい。
【００４８】“アラルキル”残基、ならびにアラルキル
カルバモイル基中のアラルキルは、上記に定義されたア
ルキレン基が上記に特徴付けられたアリール残基によっ
て置換されているような残基を表わす。ベンジル基は好
ましい。
カルバモイル基中のアラルキルは、上記に定義されたア
ルキレン基が上記に特徴付けられたアリール残基によっ
て置換されているような残基を表わす。ベンジル基は好
ましい。
【００４９】アラルコキシ残基、例えばアラルコキシカ
ルボニル基中のアラルコキシ残基は、上記したようなア
ルコキシ基が上記に定義されたようなアリール残基によ
って置換されているような残基を表わす。ベンジルオキ
シ基は好ましい。
ルボニル基中のアラルコキシ残基は、上記したようなア
ルコキシ基が上記に定義されたようなアリール残基によ
って置換されているような残基を表わす。ベンジルオキ
シ基は好ましい。
【００５０】“ハロゲン”は、残基の弗素原子、塩素原
子、臭素原子または沃素原子を表わす。弗素原子および
塩素原子は好ましい。
子、臭素原子または沃素原子を表わす。弗素原子および
塩素原子は好ましい。
【００５１】アシル基は、アルキル残基、アラルキル残
基またはアリール残基を有することができるカルボン酸
残基を表わす。アセチル残基、フェニルアセチル残基お
よびベンゾイル残基は、好ましい。
基またはアリール残基を有することができるカルボン酸
残基を表わす。アセチル残基、フェニルアセチル残基お
よびベンゾイル残基は、好ましい。
【００５２】アルキレン基は、２個の自由結合部位を有
する炭素原子数３〜４の直鎖状または分子鎖状の飽和ま
たは不飽和の炭化水素鎖として理解される。
する炭素原子数３〜４の直鎖状または分子鎖状の飽和ま
たは不飽和の炭化水素鎖として理解される。
【００５３】例は、
【００５４】
【化１２】
【００５５】である。
【００５６】ブタンジエニル残基（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ
＝ＣＨ−）及びテトラメチレン残基（−（ＣＨ2）4−）
は好ましい。
＝ＣＨ−）及びテトラメチレン残基（−（ＣＨ2）4−）
は好ましい。
【００５７】アルケニル基は、少なくとも１個の二重結
合を有する炭素原子数２〜５の直鎖状または分子鎖状の
炭化水素残基である。ビニル残基は例えば好ましい。ジ
アルキルホルフィニル基は、残基：
合を有する炭素原子数２〜５の直鎖状または分子鎖状の
炭化水素残基である。ビニル残基は例えば好ましい。ジ
アルキルホルフィニル基は、残基：
【００５８】
【化１３】
【００５９】〔但し、アルキル基は前記のものを表わ
す〕として理解される。ジメチルホスフィニル残基は好
ましい。
す〕として理解される。ジメチルホスフィニル残基は好
ましい。
【００６０】アルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属
塩またはアンモニウム塩は、ＳＯ3Ｈ残基、ＰＯ3Ｈ2残
基およびカルボキシ残基として使用することができる。
アルカリ金属塩は、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウ
ム塩、ルビジウム塩またはセシウム塩として理解され、
これらの中、リチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム
塩、特にナトリウム塩およびカリウム塩は好ましい。ア
ルカリ土類金属塩は、ベリリウム、マグネシウム、カル
シウム、ストロンチウムまたはバリウムのものである。
マグネシウム塩およびカルシウム塩は好ましく、カルシ
ウム塩は特に好ましい。非置換アンモニウム塩、ＮＨ4 +
はアンモニウム塩として使用することができる。しか
し、アンモニウムイオンが１〜４個のアルキル残基、ア
リール残基またはアラルキル残基によって置換されてい
るようなアンモニウム塩を使用することも可能である。
上記の定義は前記の残基に適用され、この場合メチル
基、エチル基およびｎ−プロピル基は、特にアルキル残
基として好ましく、フェニル基は、アリール残基として
好ましく、ベンジル基は、アラルキル残基として好まし
い。
塩またはアンモニウム塩は、ＳＯ3Ｈ残基、ＰＯ3Ｈ2残
基およびカルボキシ残基として使用することができる。
アルカリ金属塩は、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウ
ム塩、ルビジウム塩またはセシウム塩として理解され、
これらの中、リチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム
塩、特にナトリウム塩およびカリウム塩は好ましい。ア
ルカリ土類金属塩は、ベリリウム、マグネシウム、カル
シウム、ストロンチウムまたはバリウムのものである。
マグネシウム塩およびカルシウム塩は好ましく、カルシ
ウム塩は特に好ましい。非置換アンモニウム塩、ＮＨ4 +
はアンモニウム塩として使用することができる。しか
し、アンモニウムイオンが１〜４個のアルキル残基、ア
リール残基またはアラルキル残基によって置換されてい
るようなアンモニウム塩を使用することも可能である。
上記の定義は前記の残基に適用され、この場合メチル
基、エチル基およびｎ−プロピル基は、特にアルキル残
基として好ましく、フェニル基は、アリール残基として
好ましく、ベンジル基は、アラルキル残基として好まし
い。
【００６１】カルボキサミド残基は、ＣＯＮＨ2残基と
して理解され、かつならびにアミノ基が必要に応じて１
個または幾つかのヒドロキシ残基、カルボキシ残基およ
び／またはアルコキシカルボニル残基を有する１個また
は２個のアルキル残基によって置換されているような残
基として理解される。
して理解され、かつならびにアミノ基が必要に応じて１
個または幾つかのヒドロキシ残基、カルボキシ残基およ
び／またはアルコキシカルボニル残基を有する１個また
は２個のアルキル残基によって置換されているような残
基として理解される。
【００６２】本発明により使用される一般式Ｉのニトロ
ソ化合物の場合には、Ｒ8およびＲ9は、有利に飽和また
は不飽和環を形成する。この場合には、二重結合電子お
よび不飽和鎖の自由窒素電子対が一般式Ｉの二重結合ま
たは橋の窒素原子と共役結合しているような環が特に好
ましく、したがって縮合環化された芳香環が生じる。
ソ化合物の場合には、Ｒ8およびＲ9は、有利に飽和また
は不飽和環を形成する。この場合には、二重結合電子お
よび不飽和鎖の自由窒素電子対が一般式Ｉの二重結合ま
たは橋の窒素原子と共役結合しているような環が特に好
ましく、したがって縮合環化された芳香環が生じる。
【００６３】必要に応じて、一般式ＩＶの色形成残基に
とって互変異形も可能である。この互変異形は、一般式
ＩＶによって包含されるものと見なすこともできる。
とって互変異形も可能である。この互変異形は、一般式
ＩＶによって包含されるものと見なすこともできる。
【００６４】一般式Ｖ〜ＸＩＶの色形成残基ならびに相
応する互変異形およびその塩は、本発明によれば、好ま
しい。
応する互変異形およびその塩は、本発明によれば、好ま
しい。
【００６５】
【化１４】
【００６６】この場合、Ｘ−Ｙは、上記のものと同じも
のを表わす。Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、同一であ
るかまたは異なり、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル
基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アラルキル基、ア
リール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カ
ルボキサミド基、シアノ基、必要に応じて１個または幾
つかのヒドロキシ残基、カルボキシ残基および／または
アルコキシカルボニル残基を有する必要に応じて１個ま
たは２個のアルキル残基によって置換されているアミノ
基を表わすかまたはハロゲン原子を表わし、この場合２
つの隣接した残基は、必要に応じてアリールによってさ
らに置換されているアルキレン基を形成するかまたは縮
合環化されており、Ｒ14は、必要に応じてヒドロキシ、
カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2もしくはジアルキルホ
スフィニルによって置換されているアルキル基またはア
ラルキル基を表わす。残基の定義は、一般式ＩＶの残基
に対して記載されたものに相応する。
のを表わす。Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、同一であ
るかまたは異なり、水素原子、ヒドロキシ基、アルキル
基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アラルキル基、ア
リール基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カ
ルボキサミド基、シアノ基、必要に応じて１個または幾
つかのヒドロキシ残基、カルボキシ残基および／または
アルコキシカルボニル残基を有する必要に応じて１個ま
たは２個のアルキル残基によって置換されているアミノ
基を表わすかまたはハロゲン原子を表わし、この場合２
つの隣接した残基は、必要に応じてアリールによってさ
らに置換されているアルキレン基を形成するかまたは縮
合環化されており、Ｒ14は、必要に応じてヒドロキシ、
カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2もしくはジアルキルホ
スフィニルによって置換されているアルキル基またはア
ラルキル基を表わす。残基の定義は、一般式ＩＶの残基
に対して記載されたものに相応する。
【００６７】一般式Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘおよび
ＸＩの残基は、本発明により使用するために特に好まし
く、必要に応じて互変異形およびその塩に相応する。殊
に好ましいのは、Ｘ−ＹがＮ＝ＣＲ6（但し、Ｒ6は一般
式ＩＶに記載されたものを表わすことができる）を表わ
すような物質である。次の化合物は、殊に本発明により
使用するために殊に好適であることが証明された。
ＸＩの残基は、本発明により使用するために特に好まし
く、必要に応じて互変異形およびその塩に相応する。殊
に好ましいのは、Ｘ−ＹがＮ＝ＣＲ6（但し、Ｒ6は一般
式ＩＶに記載されたものを表わすことができる）を表わ
すような物質である。次の化合物は、殊に本発明により
使用するために殊に好適であることが証明された。
【００６８】１）（２−メチル−ピラゾロ−［１．５
ａ］−ピリジン−３−イル）−（４´ニトロソフェニ
ル）−アミン ２）（ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジン−３−イル）
−（４´ニトロソフェニル）−アミン ３）（２−メトキシ−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジ
ン−３−イル）−（４´ニトロソフェニル）−アミン ４）（２−ヒドロキシエチル−ピラゾロ−［１．５ａ］
−ピリジン−３−イル）−（４´ニトロソフェニル）−
アミン ５）（２，４−ジメチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イ
ミダゾール−３−イル）−（４´ニトロソフェニル）−
アミン ６）（４−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾ
ール−３−イル）−（４´ニトロソフェニル）−アミン ７）（２−メチル−４−ジメチルホスフィニルメチル−
ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール−３−イル）−
（４´ニトロソフェニル）−アミン ８）（２−メチル−４−スルホプロピル−ピラゾロ−
［１．５ａ］−イミダゾール−３−イル）−（４´ニト
ロソフェニル）−アミン ９）（２−スルホプロピル−ピラゾロ−［１．５ａ］−
ピリジン−３−イル）−（４´ニトロソフェニル）−ア
ミン １０）（ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリミジン−３−イ
ル）−（４´ニトロソフェニル）−アミン １１）（２−メチル−４−ジメチルホスフィニルメチル
−ピラゾロ−［１．５ａ］−ベンズイミダゾール−３−
イル）−（４−ニトロソフェニル）−アミン １２）（２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジ
ン−３−イル）−４−（ニトロソ−２−スルホプロピル
−フェニル）−アミン １３）（２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジ
ン−３−イル）−４−（ニトロソ−２−ヒドロキシプロ
ピル−フェニル）−アミン １４）（２−メチル−５，６−ジヒドロ−４−ジメチル
ホスフィニルメチルピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾ
ール−３−イル）−（４´ニトロソフェニル）−アミン 化合物Ｎｏ．２、３、６、７、８、９、１２および１３
は特に好ましい。
ａ］−ピリジン−３−イル）−（４´ニトロソフェニ
ル）−アミン ２）（ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジン−３−イル）
−（４´ニトロソフェニル）−アミン ３）（２−メトキシ−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジ
ン−３−イル）−（４´ニトロソフェニル）−アミン ４）（２−ヒドロキシエチル−ピラゾロ−［１．５ａ］
−ピリジン−３−イル）−（４´ニトロソフェニル）−
アミン ５）（２，４−ジメチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イ
ミダゾール−３−イル）−（４´ニトロソフェニル）−
アミン ６）（４−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾ
ール−３−イル）−（４´ニトロソフェニル）−アミン ７）（２−メチル−４−ジメチルホスフィニルメチル−
ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール−３−イル）−
（４´ニトロソフェニル）−アミン ８）（２−メチル−４−スルホプロピル−ピラゾロ−
［１．５ａ］−イミダゾール−３−イル）−（４´ニト
ロソフェニル）−アミン ９）（２−スルホプロピル−ピラゾロ−［１．５ａ］−
ピリジン−３−イル）−（４´ニトロソフェニル）−ア
ミン １０）（ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリミジン−３−イ
ル）−（４´ニトロソフェニル）−アミン １１）（２−メチル−４−ジメチルホスフィニルメチル
−ピラゾロ−［１．５ａ］−ベンズイミダゾール−３−
イル）−（４−ニトロソフェニル）−アミン １２）（２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジ
ン−３−イル）−４−（ニトロソ−２−スルホプロピル
−フェニル）−アミン １３）（２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジ
ン−３−イル）−４−（ニトロソ−２−ヒドロキシプロ
ピル−フェニル）−アミン １４）（２−メチル−５，６−ジヒドロ−４−ジメチル
ホスフィニルメチルピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾ
ール−３−イル）−（４´ニトロソフェニル）−アミン 化合物Ｎｏ．２、３、６、７、８、９、１２および１３
は特に好ましい。
【００６９】使用されたベンジルアルコールデヒドロゲ
ナーゼは、種々の微生物から得ることができる（アシネ
トバクター(Acinetobacter)菌株、シュードモナス(Pseu
domonas)菌株、ロドシュードモナス(Rhodopseudemonas)
菌株等）。
ナーゼは、種々の微生物から得ることができる（アシネ
トバクター(Acinetobacter)菌株、シュードモナス(Pseu
domonas)菌株、ロドシュードモナス(Rhodopseudemonas)
菌株等）。
【００７０】上記したように、式Ｉのニトロソアニリン
化合物は、本発明による方法のために、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
含量およびベンジルアルコールデヒドロゲナーゼについ
て試験すべき試料と接触される。試料がＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
または分析物を含有し、これらのＮＡＤ依存形デヒドロ
ゲナーゼによる変換によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈの形成が導か
れる場合には、ニトロソアニリン化合物は、ベンジルア
ルコールデヒドロゲナーゼの存在下に反応し、一般式Ｉ
Ｉの相応する着色されたキノンジイミンを形成し、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈは再酸化されてＮＡＤ（Ｐ）+に変わる。キ
ノンジイミン化合物の色は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の測定
量として役立ち、したがって必要に応じて分析物の量の
測定値としても役立つ。色の測定は、恐らく参照色を介
して目で見る手段によって直接に実施することができる
かまたは測光分析法により実施することができる。
化合物は、本発明による方法のために、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
含量およびベンジルアルコールデヒドロゲナーゼについ
て試験すべき試料と接触される。試料がＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
または分析物を含有し、これらのＮＡＤ依存形デヒドロ
ゲナーゼによる変換によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈの形成が導か
れる場合には、ニトロソアニリン化合物は、ベンジルア
ルコールデヒドロゲナーゼの存在下に反応し、一般式Ｉ
Ｉの相応する着色されたキノンジイミンを形成し、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈは再酸化されてＮＡＤ（Ｐ）+に変わる。キ
ノンジイミン化合物の色は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の測定
量として役立ち、したがって必要に応じて分析物の量の
測定値としても役立つ。色の測定は、恐らく参照色を介
して目で見る手段によって直接に実施することができる
かまたは測光分析法により実施することができる。
【００７１】本発明による方法の１つの利点は、酵素触
媒反応によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈを１工程で迅速かつ特異的
に検出することができることにある。殊に、使用される
色素原酸化還元指示薬は、塩基および光に対して安定性
であり、還元の際に直接に強力な色を発生し、この色
は、可視光線の波長の全範囲内に亘って選択することが
できる。非特異的酸化還元触媒、例えばジアホラーゼま
たはＮ−メチルフェナジニウムスルフェートは、不必要
である。
媒反応によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈを１工程で迅速かつ特異的
に検出することができることにある。殊に、使用される
色素原酸化還元指示薬は、塩基および光に対して安定性
であり、還元の際に直接に強力な色を発生し、この色
は、可視光線の波長の全範囲内に亘って選択することが
できる。非特異的酸化還元触媒、例えばジアホラーゼま
たはＮ−メチルフェナジニウムスルフェートは、不必要
である。
【００７２】勿論、本発明によるニトロソアニリン化合
物は、ＮＡＤ（Ｐ）+依存形デヒドロゲナーゼまたはベ
ンジルアルコールデヒドロゲナーゼの存在または活性を
測定するために好適でもある。
物は、ＮＡＤ（Ｐ）+依存形デヒドロゲナーゼまたはベ
ンジルアルコールデヒドロゲナーゼの存在または活性を
測定するために好適でもある。
【００７３】ベンジルアルコールデヒドロゲナーゼを検
出しようとする場合には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび式Ｉの
色素原ニトロソアニリン化合物は、ベンジルアルコール
デヒドロゲナーゼを含有する試料と反応され、形成され
るキノンジイミン化合物の色が測定される。色の変化
は、時間とともに酵素活性で補正することができる。
出しようとする場合には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび式Ｉの
色素原ニトロソアニリン化合物は、ベンジルアルコール
デヒドロゲナーゼを含有する試料と反応され、形成され
るキノンジイミン化合物の色が測定される。色の変化
は、時間とともに酵素活性で補正することができる。
【００７４】ＮＡＤ（Ｐ）+依存形デヒドロゲナーゼを
測定しようとする場合には、このデヒドロゲナーゼにと
って試験されることができる試料は、このデヒドロゲナ
ーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ベンジルアルコールデヒドロゲ
ナーゼおよび式Ｉの色素原ニトロソアニリン化合物と反
応され、形成されるキノンジイミンの色が測定される。
測定しようとする場合には、このデヒドロゲナーゼにと
って試験されることができる試料は、このデヒドロゲナ
ーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ベンジルアルコールデヒドロゲ
ナーゼおよび式Ｉの色素原ニトロソアニリン化合物と反
応され、形成されるキノンジイミンの色が測定される。
【００７５】更に、本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素
および直接色素原電子受容体からなる、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
を比色検出する薬剤に関し、この薬剤は、この薬剤は、
ベンジルアルコールおよび一般式Ｉのニトロソアニリン
化合物を含有することによって特徴付けられる。
および直接色素原電子受容体からなる、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
を比色検出する薬剤に関し、この薬剤は、この薬剤は、
ベンジルアルコールおよび一般式Ｉのニトロソアニリン
化合物を含有することによって特徴付けられる。
【００７６】更に、本発明は、分析物の比色検出のため
の薬剤に関し、この分析物の酵素的酸化により、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの形成を導き、このＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、ベンジ
ルアルコールデヒドロゲナーゼおよび一般式Ｉのニトロ
ソアニリン化合物以外に分析物特異性のＮＡＤ（Ｐ）+
依存形デヒドロゲナーゼをその共因子とともに含有す
る。
の薬剤に関し、この分析物の酵素的酸化により、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈの形成を導き、このＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、ベンジ
ルアルコールデヒドロゲナーゼおよび一般式Ｉのニトロ
ソアニリン化合物以外に分析物特異性のＮＡＤ（Ｐ）+
依存形デヒドロゲナーゼをその共因子とともに含有す
る。
【００７７】本発明による方法に対して上記された物質
は、ベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、ニトロソア
ニリン化合物および必要に応じて分析物特異性のデヒド
ロゲナーゼとして使用される。
は、ベンジルアルコールデヒドロゲナーゼ、ニトロソア
ニリン化合物および必要に応じて分析物特異性のデヒド
ロゲナーゼとして使用される。
【００７８】本発明による薬剤は、最初に使用されるべ
きベンジルアルコールデヒドロゲナーゼに依存しかつ第
２に使用されるＮＡＤ依存形デヒドロゲナーゼに対して
も恐らく依存する方法を実施するのに適当なｐＨ値を維
持するために緩衝液系を含有する。この薬剤は、有利に
６〜９の試験溶液中のｐＨ値を設定する緩衝液系を含有
する。７〜８．５のｐＨ値は、特に好ましい。
きベンジルアルコールデヒドロゲナーゼに依存しかつ第
２に使用されるＮＡＤ依存形デヒドロゲナーゼに対して
も恐らく依存する方法を実施するのに適当なｐＨ値を維
持するために緩衝液系を含有する。この薬剤は、有利に
６〜９の試験溶液中のｐＨ値を設定する緩衝液系を含有
する。７〜８．５のｐＨ値は、特に好ましい。
【００７９】本発明による薬剤は、溶液の形で存在する
ことができるかまたは吸着性または膨潤性の担体上に存
在することができる。溶液の形である場合には、薬剤
は、有利に本発明による方法に必要とされる全ての試薬
を含有する。水または水と水溶性有機溶剤、例えばメタ
ノール、エタノール、アセトンまたはジメチルホルムア
ミドとの混合物は、溶剤として考慮される。この溶剤
は、安定性のために、試験まで混合されない２つまたは
幾つかの溶液の中で試験に必要とされる試薬を分配させ
るために有利であることができる。
ことができるかまたは吸着性または膨潤性の担体上に存
在することができる。溶液の形である場合には、薬剤
は、有利に本発明による方法に必要とされる全ての試薬
を含有する。水または水と水溶性有機溶剤、例えばメタ
ノール、エタノール、アセトンまたはジメチルホルムア
ミドとの混合物は、溶剤として考慮される。この溶剤
は、安定性のために、試験まで混合されない２つまたは
幾つかの溶液の中で試験に必要とされる試薬を分配させ
るために有利であることができる。
【００８０】使用される芳香族ニトロソ化合物の濃度
は、測定すべきＮＡＤＨの濃度または測定すべき分析物
に依存する。本発明による方法に使用されるニトロソ化
合物にとって典型的な濃度は、０．０１〜１００ミリモ
ル／ｌ、有利に０．１〜２５ミリモル／ｌである。使用
されるベンジルアルコールデヒドロゲナーゼの濃度は、
分析物の濃度および望ましい分析時間に依存する。酵素
の濃度にとって典型的な値は、キュベット試験において
１ｍＵ〜１０Ｕ／ｍｌである。
は、測定すべきＮＡＤＨの濃度または測定すべき分析物
に依存する。本発明による方法に使用されるニトロソ化
合物にとって典型的な濃度は、０．０１〜１００ミリモ
ル／ｌ、有利に０．１〜２５ミリモル／ｌである。使用
されるベンジルアルコールデヒドロゲナーゼの濃度は、
分析物の濃度および望ましい分析時間に依存する。酵素
の濃度にとって典型的な値は、キュベット試験において
１ｍＵ〜１０Ｕ／ｍｌである。
【００８１】また、本発明による薬剤は、試験ストリッ
プの形で存在していてもよい。このような試験ストリッ
プは、欧州特許出願公開第００１６３８７号明細書、ド
イツ連邦共和国特許出願公開第３２４７６０８号明細
書、欧州特許出願公開第０２６２４４５号明細書または
欧州特許出願公開第０２５６８０６号明細書の記載から
種々の実施態様で公知である。試験ストリップの場合に
は、検出方法を実施するために必要とされる試薬は、固
体の担体層上に存在しており；吸着剤および／または膨
潤可能な物質は、試験すべき液体試料によって湿潤され
ている担体層として特に考慮される。例は、ゼラチン、
セルロースまたは合成繊維フリースである。試薬は、こ
の担体材料中または上に存在する。液体試料を試験スト
リップに塗布するかまたは試験ストリップを液体試料中
に含浸させる場合には、液体環境がストリップ中に形成
され、このストリップ内で検出反応が生じる。反応によ
って引き起こされた色形成は、目で見て評価することが
できるかまたは測光分析法、例えば反射測光分析法によ
って評価することができる。
プの形で存在していてもよい。このような試験ストリッ
プは、欧州特許出願公開第００１６３８７号明細書、ド
イツ連邦共和国特許出願公開第３２４７６０８号明細
書、欧州特許出願公開第０２６２４４５号明細書または
欧州特許出願公開第０２５６８０６号明細書の記載から
種々の実施態様で公知である。試験ストリップの場合に
は、検出方法を実施するために必要とされる試薬は、固
体の担体層上に存在しており；吸着剤および／または膨
潤可能な物質は、試験すべき液体試料によって湿潤され
ている担体層として特に考慮される。例は、ゼラチン、
セルロースまたは合成繊維フリースである。試薬は、こ
の担体材料中または上に存在する。液体試料を試験スト
リップに塗布するかまたは試験ストリップを液体試料中
に含浸させる場合には、液体環境がストリップ中に形成
され、このストリップ内で検出反応が生じる。反応によ
って引き起こされた色形成は、目で見て評価することが
できるかまたは測光分析法、例えば反射測光分析法によ
って評価することができる。
【００８２】試験ストリップ上の濃度に対する典型的な
値は次の通りである： 分析物 １０~4〜１０~1Ｍ ニトロソ化合物 １０~3〜１Ｍ 酵素 試験帯域１個につ
き０．１〜１００Ｕ 式Ｉの色素原ニトロソアニリン化合物は新規のものであ
る。従って、式Ｉのニトロソアニリン化合物は、本発明
の対象である：
値は次の通りである： 分析物 １０~4〜１０~1Ｍ ニトロソ化合物 １０~3〜１Ｍ 酵素 試験帯域１個につ
き０．１〜１００Ｕ 式Ｉの色素原ニトロソアニリン化合物は新規のものであ
る。従って、式Ｉのニトロソアニリン化合物は、本発明
の対象である：
【００８３】
【化１５】
【００８４】上記式中、Ｒ1は、水素原子、ヒドロキシ
基、ハロゲン原子、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ基またはＣ1
〜Ｃ6−アルキルチオ基、Ｃ6〜Ｃ10−アリールオキシ基
またはＣ6〜Ｃ10−アリールチオ基、必要に応じてカル
ボキシ、ＰＯ3Ｈ2、ジアルキルホスフィニルもしくはＳ
Ｏ3Ｈによって置換されたＣ1〜Ｃ6−アルキル基または
Ｃ1〜Ｃ6−アルキレン基、必要に応じて１回または２回
Ｃ1〜Ｃ6−アルキルによって置換され、さらに必要に応
じてヒドロキシ、カルボキシ、ＰＯ3Ｈ2もしくはＳＯ3
Ｈによって置換されていてもよいアミノ基を表わし、Ｒ
は、キノンジイミン系との電子共役によって色を形成す
る残基を表わす。
基、ハロゲン原子、Ｃ1〜Ｃ6−アルコキシ基またはＣ1
〜Ｃ6−アルキルチオ基、Ｃ6〜Ｃ10−アリールオキシ基
またはＣ6〜Ｃ10−アリールチオ基、必要に応じてカル
ボキシ、ＰＯ3Ｈ2、ジアルキルホスフィニルもしくはＳ
Ｏ3Ｈによって置換されたＣ1〜Ｃ6−アルキル基または
Ｃ1〜Ｃ6−アルキレン基、必要に応じて１回または２回
Ｃ1〜Ｃ6−アルキルによって置換され、さらに必要に応
じてヒドロキシ、カルボキシ、ＰＯ3Ｈ2もしくはＳＯ3
Ｈによって置換されていてもよいアミノ基を表わし、Ｒ
は、キノンジイミン系との電子共役によって色を形成す
る残基を表わす。
【００８５】本発明は、殊に式Ｉの色素原ニトロソアニ
リン化合物に関し、この式Ｉ中で色素原残基Ｒは、一般
式ＩＩＩまたはＩＶの残基を表わす。
リン化合物に関し、この式Ｉ中で色素原残基Ｒは、一般
式ＩＩＩまたはＩＶの残基を表わす。
【００８６】更に、本発明は、式Ｉのニトロソ化合物の
製造法に関する。
製造法に関する。
【００８７】本発明による化合物の製造は、ヘイズ（J.
T. Hays他）によって“J. Org. Chemie”32,158(1967)
に記載されているような方法のようによく知られた方法
により実施される。このために、式ＸＶＩＩのｐ−ニト
ロソフェノールのエーテルおよび殊にメチルエーテル
は、式ＸＶＩＩＩのアミノ化合物と有利にプロトン触媒
反応下に反応される。式Ｉの第二級アミンは、メトキシ
基の置換を伴なって形成される。
T. Hays他）によって“J. Org. Chemie”32,158(1967)
に記載されているような方法のようによく知られた方法
により実施される。このために、式ＸＶＩＩのｐ−ニト
ロソフェノールのエーテルおよび殊にメチルエーテル
は、式ＸＶＩＩＩのアミノ化合物と有利にプロトン触媒
反応下に反応される。式Ｉの第二級アミンは、メトキシ
基の置換を伴なって形成される。
【００８８】
【化１６】
【００８９】このために必要なアリールまたはヘテロア
リールアミンは、記載されているかまたは公知方法によ
り製造することができる。ピラゾロ複素環式化合物を塩
基性構造単位として含有するアミノ化合物は、欧州特許
出願公開第０４３３８５４号明細書に記載されている。
リールアミンは、記載されているかまたは公知方法によ
り製造することができる。ピラゾロ複素環式化合物を塩
基性構造単位として含有するアミノ化合物は、欧州特許
出願公開第０４３３８５４号明細書に記載されている。
【００９０】中間体生成物として必要とされるアミノ化
合物は、通常安定性のために強酸、例えば鉱酸の塩の形
である。ｐ−ニトロソアニソールとの反応のために、ア
ミノ化合物の遊離塩基は、有利に使用され、これは、常
法により、例えば塩を水中に溶解し、塩基を８〜１０の
ｐＨになるまで添加し、かつこの遊離塩基を有機溶剤、
例えば酢酸エチルまたは塩化メチレンで抽出することに
よって得られる。また、選択的には、抽出が困難なアミ
ノ化合物については、次の方法を使用することができ
る：アミノ化合物をメタノールに溶解し、次に塩基、例
えばＮａＨＣＯ3溶液、トリエチルアミン等をメタノー
ル溶液のｐＨ値が湿ったｐＨ試験紙上で５〜６の値にな
るまで添加する。その後に、第２の反応成分、ｐ−ニト
ロソアニソールを添加する。
合物は、通常安定性のために強酸、例えば鉱酸の塩の形
である。ｐ−ニトロソアニソールとの反応のために、ア
ミノ化合物の遊離塩基は、有利に使用され、これは、常
法により、例えば塩を水中に溶解し、塩基を８〜１０の
ｐＨになるまで添加し、かつこの遊離塩基を有機溶剤、
例えば酢酸エチルまたは塩化メチレンで抽出することに
よって得られる。また、選択的には、抽出が困難なアミ
ノ化合物については、次の方法を使用することができ
る：アミノ化合物をメタノールに溶解し、次に塩基、例
えばＮａＨＣＯ3溶液、トリエチルアミン等をメタノー
ル溶液のｐＨ値が湿ったｐＨ試験紙上で５〜６の値にな
るまで添加する。その後に、第２の反応成分、ｐ−ニト
ロソアニソールを添加する。
【００９１】
例１ 色素原ｐ−ニトロソアニリンを用いてのＮＡＤＨ検出 次の混合物を１ｃｍのキュベット中に入れた： 燐酸塩緩衝液ｐＨ７ １００ｍ
Ｍ、 第１表からの式２のｐ−ニトロソアニリン １００μ
Ｍ、 アシネトバクター（Acinetobacter）からのベンジルア
ルコールデヒドロゲナーゼ
１Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＨの種々の量を、キュベット溶液が反応の開始
１．５分後にＮＡＤＨ濃度１０μモル／ｌ〜５０μモル
／ｌを含有するように添加し、今や着色されている溶液
の吸着性を６４０ｎｍで測定する（図１）。この方法で
得られた機能曲線は、未知のＮＡＤＨ量を吸着測定によ
り検出することができる。
Ｍ、 第１表からの式２のｐ−ニトロソアニリン １００μ
Ｍ、 アシネトバクター（Acinetobacter）からのベンジルア
ルコールデヒドロゲナーゼ
１Ｕ／ｍｌ ＮＡＤＨの種々の量を、キュベット溶液が反応の開始
１．５分後にＮＡＤＨ濃度１０μモル／ｌ〜５０μモル
／ｌを含有するように添加し、今や着色されている溶液
の吸着性を６４０ｎｍで測定する（図１）。この方法で
得られた機能曲線は、未知のＮＡＤＨ量を吸着測定によ
り検出することができる。
【００９２】例２ グルコースの検出 次の混合物を１ｃｍのキュベット中に入れる： 燐酸塩緩衝液ｐＨ７ １００ｍ
Ｍ、 第１表からの式２のｐ−ニトロソアニリン １００μ
Ｍ、 ＮＡＤ■ １ｍＭ、 アシネトバクター（Acinetobacter）からのベンジルア
ルコールデヒドロゲナーゼ
１Ｕ／ｍｌ、 グルコースデヒドロゲナーゼ（Merck社,Darmstadt在、
ドイツ連邦共和国）５Ｕ／ｍｌ グルコースの種々の量を、キュベット中の溶液がグルコ
ースを１０〜５０μモル／ｌの濃度で反応の開始１．５
分後に含有するように添加し、今や着色されている溶液
の吸着性を６４０ｎｍで検出する（図２）。未知のグル
コースの濃度は、こうして得られた機能曲線で吸着性の
測定により検出することができる。
Ｍ、 第１表からの式２のｐ−ニトロソアニリン １００μ
Ｍ、 ＮＡＤ■ １ｍＭ、 アシネトバクター（Acinetobacter）からのベンジルア
ルコールデヒドロゲナーゼ
１Ｕ／ｍｌ、 グルコースデヒドロゲナーゼ（Merck社,Darmstadt在、
ドイツ連邦共和国）５Ｕ／ｍｌ グルコースの種々の量を、キュベット中の溶液がグルコ
ースを１０〜５０μモル／ｌの濃度で反応の開始１．５
分後に含有するように添加し、今や着色されている溶液
の吸着性を６４０ｎｍで検出する（図２）。未知のグル
コースの濃度は、こうして得られた機能曲線で吸着性の
測定により検出することができる。
【００９３】例３ ＮＡＤＨまたはグルコースを、第１表中の式１〜１８の
ｐ−ニトロソアニリン化合物を使用して例１または例２
と同様にして検出する。第１表は、形成される着色され
たキノンジイミンの吸着最大を示す。
ｐ−ニトロソアニリン化合物を使用して例１または例２
と同様にして検出する。第１表は、形成される着色され
たキノンジイミンの吸着最大を示す。
【００９４】
【表１】
【００９５】
【表２】
【００９６】例４ （２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジン−３
−イル）−（４´ニトロソフェニル）−アミン ３−アミノ−２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピ
リジン塩酸塩０．８ｇを重炭酸ナトリウム水溶液を使用
して遊離塩基に変換し、これを塩化メチレンで抽出す
る。蒸発された抽出物の残分をメタノール２０ｍｌに溶
解し、ｐ−トルエンスルホン酸３０ｍｇを添加する。次
に、メタノール１０ｍｌ中のｐ−ニトロソアニソール
０．５４ｇの溶液を０〜５℃で添加する。この反応混合
物を室温で３時間撹拌し、かつ蒸発によって濃縮する。
粗製生成物を移動相溶剤ヘプタン／メチルエチルケトン
２：１を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィー処理
することによって精製する。融点１４６℃の褐色の結晶
物０．７ｇが得られる。
−イル）−（４´ニトロソフェニル）−アミン ３−アミノ−２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピ
リジン塩酸塩０．８ｇを重炭酸ナトリウム水溶液を使用
して遊離塩基に変換し、これを塩化メチレンで抽出す
る。蒸発された抽出物の残分をメタノール２０ｍｌに溶
解し、ｐ−トルエンスルホン酸３０ｍｇを添加する。次
に、メタノール１０ｍｌ中のｐ−ニトロソアニソール
０．５４ｇの溶液を０〜５℃で添加する。この反応混合
物を室温で３時間撹拌し、かつ蒸発によって濃縮する。
粗製生成物を移動相溶剤ヘプタン／メチルエチルケトン
２：１を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィー処理
することによって精製する。融点１４６℃の褐色の結晶
物０．７ｇが得られる。
【００９７】ＴＬＣ（シリカゲル、ヘプタン／メチルエ
チルケトン２：１） Ｒｆ＝０．２２ 例５ 第２表に記載されたニトロソ化合物は、例４と同様にし
て得られる。
チルケトン２：１） Ｒｆ＝０．２２ 例５ 第２表に記載されたニトロソ化合物は、例４と同様にし
て得られる。
【００９８】
【表３】
【００９９】化合物９のためのニトロソ出発化合物の製
造： ６−ニトロソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ベンゾ
ピラン ２−（３−ヒドロキシ−プロピル）フェノール７ｇを水
中で硫酸アルミニウム１８Ｈ2Ｏの存在下に亜硝酸ナト
リウム３．５ｇを使用してBull. Soc. Chim Fr.３３７
（１９５７）の記載と同様にしてニトロシル化する。懸
濁液を十分に撹拌し、かつ３０分後に酢酸エチルで抽出
する。酢酸抽出物からの残分を酢酸エチル／リグロイン
７：３を使用してシリカゲルによりクロマトグラフィー
処理する。相応するｐ−ニトロソ化合物３．８ｇが得ら
れる。（ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／リグロイン
７：３）Ｒｆ＝０．３４）。この化合物２．６ｇをメタ
ノールに溶解し、かつ還流下にｐ−トルエンスルホン酸
約１００ｍｇを添加しながら２時間煮沸する。この反応
混合物を蒸発によって濃縮し、かつ酢酸エチル／リグロ
インを用いてシリカゲル上でクロマトグラフィー処理す
ることによって精製する。目的化合物１ｇは、緑色の粉
末として得られる。ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／
リグロイン１：１）Ｒｆ＝０．９２ 例６ （４−（ジメチルホスフィニルメチル）−２−メチル−
ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール−３−イル）−
（４−ニトロソフェニル）−アミン（１１） ３−アミノ−２−メチル−４−（ジメチルホスフィニル
メチル）−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール塩酸
塩１３．７ｇをメタノール３５０ｍｌに溶解する。この
溶液を約５℃に冷却し、濃縮された炭酸ナトリウム水溶
液を、約６のｐＨ値が湿ったｐＨ試験紙によって呈色さ
れるまで添加する。メタノール３５ｍｌ中のｐ−ニトロ
ソアニソール７．８ｇの溶液を３０分間で滴加する。こ
の混合物を室温で４時間撹拌し、ｐＨ値をさらにＮａＨ
ＣＯ3溶液の添加によって６に維持する。
造： ６−ニトロソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ベンゾ
ピラン ２−（３−ヒドロキシ−プロピル）フェノール７ｇを水
中で硫酸アルミニウム１８Ｈ2Ｏの存在下に亜硝酸ナト
リウム３．５ｇを使用してBull. Soc. Chim Fr.３３７
（１９５７）の記載と同様にしてニトロシル化する。懸
濁液を十分に撹拌し、かつ３０分後に酢酸エチルで抽出
する。酢酸抽出物からの残分を酢酸エチル／リグロイン
７：３を使用してシリカゲルによりクロマトグラフィー
処理する。相応するｐ−ニトロソ化合物３．８ｇが得ら
れる。（ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／リグロイン
７：３）Ｒｆ＝０．３４）。この化合物２．６ｇをメタ
ノールに溶解し、かつ還流下にｐ−トルエンスルホン酸
約１００ｍｇを添加しながら２時間煮沸する。この反応
混合物を蒸発によって濃縮し、かつ酢酸エチル／リグロ
インを用いてシリカゲル上でクロマトグラフィー処理す
ることによって精製する。目的化合物１ｇは、緑色の粉
末として得られる。ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／
リグロイン１：１）Ｒｆ＝０．９２ 例６ （４−（ジメチルホスフィニルメチル）−２−メチル−
ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール−３−イル）−
（４−ニトロソフェニル）−アミン（１１） ３−アミノ−２−メチル−４−（ジメチルホスフィニル
メチル）−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール塩酸
塩１３．７ｇをメタノール３５０ｍｌに溶解する。この
溶液を約５℃に冷却し、濃縮された炭酸ナトリウム水溶
液を、約６のｐＨ値が湿ったｐＨ試験紙によって呈色さ
れるまで添加する。メタノール３５ｍｌ中のｐ−ニトロ
ソアニソール７．８ｇの溶液を３０分間で滴加する。こ
の混合物を室温で４時間撹拌し、ｐＨ値をさらにＮａＨ
ＣＯ3溶液の添加によって６に維持する。
【０１００】反応混合物を濾過し、シリカゲル約１５０
ｍｌと混合し、かつ蒸発させて乾燥する。シリカゲルを
シリカゲルカラム上に詰め、生成物をトルエン／メタノ
ール２：１を用いて溶離することによって分離する。黒
褐色の物質１０．３ｇが得られ、これを再び塩化メチレ
ン／メタノール１２：１を用いてシリカゲルによりクロ
マトグラフィー処理する。融点２０４℃（分解下）の目
的化合物４．９ｇが得られる。
ｍｌと混合し、かつ蒸発させて乾燥する。シリカゲルを
シリカゲルカラム上に詰め、生成物をトルエン／メタノ
ール２：１を用いて溶離することによって分離する。黒
褐色の物質１０．３ｇが得られ、これを再び塩化メチレ
ン／メタノール１２：１を用いてシリカゲルによりクロ
マトグラフィー処理する。融点２０４℃（分解下）の目
的化合物４．９ｇが得られる。
【０１０１】Ｒｆ（シリカゲル）トルエン／メタノール
２：１＝０．３ ＣＨ2Ｃｌ2／メタノール１２：１＝０．２１
２：１＝０．３ ＣＨ2Ｃｌ2／メタノール１２：１＝０．２１
【０１０２】
【化１７】
【０１０３】出発生成物の製造 ａ）４−ジメチルホスフィニルメチル−２−メチル−ピ
ラゾロ［１．５ａ］−イミダゾール ２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール３
７ｇ（J. Het. Chem.10441(1973)）を無水ジメチルホ
ルムアミド３７０ｍｌに溶解し、かつクロロメチルジメ
チル−ホスファンオキシド５４．２ｇおよび炭酸カリウ
ム１１９ｇと混合する。この混合物を１１５℃（浴温）
で１０時間撹拌する。沈殿物を吸引濾過し、濾液を蒸発
によって濃縮する。残分をシリカゲル（移動相溶剤酢酸
エチル／メタノール２：１）でクロマトグラフィー処理
する。目的生成物３６．６ｇの全部が褐色の結晶物と褐
色の油との混合物として得られる。ＴＬＣ（シリカゲ
ル、酢酸エチル／メタノール２：１）。
ラゾロ［１．５ａ］−イミダゾール ２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール３
７ｇ（J. Het. Chem.10441(1973)）を無水ジメチルホ
ルムアミド３７０ｍｌに溶解し、かつクロロメチルジメ
チル−ホスファンオキシド５４．２ｇおよび炭酸カリウ
ム１１９ｇと混合する。この混合物を１１５℃（浴温）
で１０時間撹拌する。沈殿物を吸引濾過し、濾液を蒸発
によって濃縮する。残分をシリカゲル（移動相溶剤酢酸
エチル／メタノール２：１）でクロマトグラフィー処理
する。目的生成物３６．６ｇの全部が褐色の結晶物と褐
色の油との混合物として得られる。ＴＬＣ（シリカゲ
ル、酢酸エチル／メタノール２：１）。
【０１０４】Ｒｆ＝０．２ ｂ）３−アミノ−４−ジメチルホスフィニル−２−メチ
ル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール×２ＨＣｌ 上記で得られた化合物１８ｇを濃塩酸２５ｍｌおよび水
５０ｍｌに溶解する。水２５ｍｌ中の亜硝酸ナトリウム
６．２ｇの溶液を０℃で滴加する。０℃で３０分後、こ
の溶液は、重炭酸ナトリウム溶液の添加によって僅かに
アルカリ性になり、次に亜二チオン酸ナトリウム２１．
４ｇを少量ずつ添加する。この混合物をさらに３０分間
撹拌し、ジオキサン１００ｍｌ中のジ第三ブチル重炭酸
塩１７ｇの溶液を添加する。この反応混合物を室温で一
晩中撹拌し、ジオキサンを蒸留によって除去し、残留物
を数回ｎ−ブタノール／酢酸エチル３：１で抽出する。
乾燥後および有機相の蒸発後に残留する残留物をＨＣｌ
で飽和されたメタノール３２０ｍｌに溶解する。この混
合物をさらに２時間撹拌し、氷浴中で冷却し、沈殿され
た結晶物を濾過する。全部で目的化合物１８．１ｇが得
られる。ＴＬＣ（シリカゲル、トルエン／メタノール
３：１）Ｒｆ＝０．１ 例７ （４−ニトロソフェニル）−（４−スルホプロピル−ピ
ラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール−３−イル）−ア
ミン ３−アミノ−４−スルホプロピル−ピラゾロ−［１．５
ａ］−イミダゾールを例４と同様にしてメタノール中の
ｐ−ニトロソアニソールと反応させる。この反応混合物
を濾過し、濾液を蒸発によって濃縮する。残留物をトル
エン／メタノール２：１を使用してシリカゲルでクロマ
トグラフィー処理する。次に、この生成物をさらに精製
するために吸着剤樹脂ＨＰ ２０ＳＳ（Mitsubishi C
o.）のカラムに供給し、かつメタノール／水１：９〜
２：８の段階的勾配を用いて溶離する。画分を含有する
生成物を貯蔵し、蒸発によって濃縮し、少量のエタノー
ル中に入れ、生成物をエーテルの添加によって沈殿させ
る。目的化合物は、褐色の粉末の形で得られる。
ル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール×２ＨＣｌ 上記で得られた化合物１８ｇを濃塩酸２５ｍｌおよび水
５０ｍｌに溶解する。水２５ｍｌ中の亜硝酸ナトリウム
６．２ｇの溶液を０℃で滴加する。０℃で３０分後、こ
の溶液は、重炭酸ナトリウム溶液の添加によって僅かに
アルカリ性になり、次に亜二チオン酸ナトリウム２１．
４ｇを少量ずつ添加する。この混合物をさらに３０分間
撹拌し、ジオキサン１００ｍｌ中のジ第三ブチル重炭酸
塩１７ｇの溶液を添加する。この反応混合物を室温で一
晩中撹拌し、ジオキサンを蒸留によって除去し、残留物
を数回ｎ−ブタノール／酢酸エチル３：１で抽出する。
乾燥後および有機相の蒸発後に残留する残留物をＨＣｌ
で飽和されたメタノール３２０ｍｌに溶解する。この混
合物をさらに２時間撹拌し、氷浴中で冷却し、沈殿され
た結晶物を濾過する。全部で目的化合物１８．１ｇが得
られる。ＴＬＣ（シリカゲル、トルエン／メタノール
３：１）Ｒｆ＝０．１ 例７ （４−ニトロソフェニル）−（４−スルホプロピル−ピ
ラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾール−３−イル）−ア
ミン ３−アミノ−４−スルホプロピル−ピラゾロ−［１．５
ａ］−イミダゾールを例４と同様にしてメタノール中の
ｐ−ニトロソアニソールと反応させる。この反応混合物
を濾過し、濾液を蒸発によって濃縮する。残留物をトル
エン／メタノール２：１を使用してシリカゲルでクロマ
トグラフィー処理する。次に、この生成物をさらに精製
するために吸着剤樹脂ＨＰ ２０ＳＳ（Mitsubishi C
o.）のカラムに供給し、かつメタノール／水１：９〜
２：８の段階的勾配を用いて溶離する。画分を含有する
生成物を貯蔵し、蒸発によって濃縮し、少量のエタノー
ル中に入れ、生成物をエーテルの添加によって沈殿させ
る。目的化合物は、褐色の粉末の形で得られる。
【０１０５】ＴＬＣ（シリカゲル、エタノール：Ｒｆ＝
０．６、イソプロパノール／酢酸ブチル／水５：３：２
Ｒｆ＝０．４８）
０．６、イソプロパノール／酢酸ブチル／水５：３：２
Ｒｆ＝０．４８）
【０１０６】
【化１８】
【０１０７】例８ 第３表中に記載された化合物は、例６と同様にして得ら
れる。
れる。
【０１０８】
【表４】
【０１０９】１）化合物１７のための出発化合物の製造 ３−アミノ−５，６−ジヒドロ−２，４−ジメチルホス
フィニルメチル−２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］
−イミダゾール ２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾリン
３．９ｇ、酢酸ナトリウム２．７ｇおよびｐ−メトキシ
−ベンゼンジアゾニウム−テトラフルオロボレート７．
４ｇを氷酢酸４０ｍｌに溶解し、この溶液を１時間４０
〜５０℃に加熱する。この反応混合物を蒸発によって濃
縮し、残留物をＮａＨＣＯ3溶液および酢酸エチル中に
入れる。この混合物を酢酸エチルで抽出し、乾燥し、か
つ蒸発によって濃縮する。残留物をシリカゲル（移動相
溶剤：酢酸エチル／リグロイン１：１〜２：１；酢酸エ
チル；酢酸エチル／メタノール９５：５）でクロマトグ
ラフィー処理することによって精製する。相応する３−
アゾ化合物４．２１ｇが得られ（ＴＬＣ：シリカゲル、
酢酸エチル／メタノール９５：５、Ｒｆ＝０．５）、こ
れをクロロメチルジメチル−ホスファンオキシドを使用
して例６ａと同様にしてイミダゾリン環の窒素上でアル
キル化する。３−アミノ化合物への変換は、例６ｂと同
様にしてアゾ基の還元によって達成される。
フィニルメチル−２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］
−イミダゾール ２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾリン
３．９ｇ、酢酸ナトリウム２．７ｇおよびｐ−メトキシ
−ベンゼンジアゾニウム−テトラフルオロボレート７．
４ｇを氷酢酸４０ｍｌに溶解し、この溶液を１時間４０
〜５０℃に加熱する。この反応混合物を蒸発によって濃
縮し、残留物をＮａＨＣＯ3溶液および酢酸エチル中に
入れる。この混合物を酢酸エチルで抽出し、乾燥し、か
つ蒸発によって濃縮する。残留物をシリカゲル（移動相
溶剤：酢酸エチル／リグロイン１：１〜２：１；酢酸エ
チル；酢酸エチル／メタノール９５：５）でクロマトグ
ラフィー処理することによって精製する。相応する３−
アゾ化合物４．２１ｇが得られ（ＴＬＣ：シリカゲル、
酢酸エチル／メタノール９５：５、Ｒｆ＝０．５）、こ
れをクロロメチルジメチル−ホスファンオキシドを使用
して例６ａと同様にしてイミダゾリン環の窒素上でアル
キル化する。３−アミノ化合物への変換は、例６ｂと同
様にしてアゾ基の還元によって達成される。
【０１１０】分離および精製のために、粗製アミノ化合
物を少量の水に溶解し、固体の重炭酸ナトリウムを添加
し、ジオキサン中の３倍モル量のジ第三ブチル重炭酸塩
の溶液を添加する。この混合物を一晩中撹拌し、蒸発に
よって濃縮し、まず副生成物の除去のためにエーテルで
抽出し、次に生成物の分離のために５回塩化メチレンで
抽出する。結晶性の第三ブトキシカルボニル化合物（Ｔ
ＬＣ：酢酸エチル／アセトン／氷酢酸／水５０：２５：
１２．５、Ｒｆ＝０．５）が得られ、これを第三ブトキ
シカルボニル基を解離するためにメタノール性塩酸５０
ｍｌに溶解する。室温で１時間後、この溶液を半分の容
量に濃縮し、生成物をエーテルで沈殿させる。目的化合
物は、塩酸塩として得られる。
物を少量の水に溶解し、固体の重炭酸ナトリウムを添加
し、ジオキサン中の３倍モル量のジ第三ブチル重炭酸塩
の溶液を添加する。この混合物を一晩中撹拌し、蒸発に
よって濃縮し、まず副生成物の除去のためにエーテルで
抽出し、次に生成物の分離のために５回塩化メチレンで
抽出する。結晶性の第三ブトキシカルボニル化合物（Ｔ
ＬＣ：酢酸エチル／アセトン／氷酢酸／水５０：２５：
１２．５、Ｒｆ＝０．５）が得られ、これを第三ブトキ
シカルボニル基を解離するためにメタノール性塩酸５０
ｍｌに溶解する。室温で１時間後、この溶液を半分の容
量に濃縮し、生成物をエーテルで沈殿させる。目的化合
物は、塩酸塩として得られる。
【０１１１】ＴＬＣ：ｎ−ブタノール／氷酢酸／水２：
１：１ Ｒｆ＝０．３ ２）化合物１６のための出発化合物の製造 ３−アミノ−４−ジメチルホスフィニルメチル−２−メ
チル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ベンズイミダゾール 目的化合物を５．１と同様にして２−メチル−ピラゾロ
−［１．５ａ］−ベンズイミダゾール（J. prakt. Che
m.326,829(1984)）をフェニルジアゾニウム塩と反応さ
せ、クロロメチル−ジメチルホスファンオキシドでＮ−
アルキル化し、かつアゾ基を亜鉛で氷酢酸中で還元する
ことによって得る。目的化合物は、融点１９２℃（分
解）の三塩酸塩二水和物として得られる。
１：１ Ｒｆ＝０．３ ２）化合物１６のための出発化合物の製造 ３−アミノ−４−ジメチルホスフィニルメチル−２−メ
チル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ベンズイミダゾール 目的化合物を５．１と同様にして２−メチル−ピラゾロ
−［１．５ａ］−ベンズイミダゾール（J. prakt. Che
m.326,829(1984)）をフェニルジアゾニウム塩と反応さ
せ、クロロメチル−ジメチルホスファンオキシドでＮ−
アルキル化し、かつアゾ基を亜鉛で氷酢酸中で還元する
ことによって得る。目的化合物は、融点１９２℃（分
解）の三塩酸塩二水和物として得られる。
【０１１２】ＴＬＣ：シリカゲル、 イソプロパノール／酢酸ブチル／水５０：３０：２０ Ｒｆ＝０．３８ ３）化合物８のための出発化合物の製造 ３−アミノ−２，６−ジメチル−４−ジメチルホスフィ
ニル−ピラゾロ−［３，２ｃ］−ｓ−トリアゾール ３．１ ２，６−ジメチル−ピラゾロ−［３，２ｃ］−ｓ−トリ
アゾール６ｇをジメチルホルムアミド６５ｍｌに溶解
し、溶液をクロロメチルジメチルホスファンオキシド
３．０ｇおよび炭酸カリウム８ｇと混合する。この混合
物を１００℃で２時間撹拌し、熱い間に吸引濾過し、濾
液を蒸発によって濃縮する。残留物をシリカゲル（移動
相溶剤：酢酸エチル／メタノール４：１）でクロマトグ
ラフィー処理する。鹸化および脱カルボキシル化のため
に、生成物を還流下に濃塩酸中で７時間加熱する。反応
混合物を蒸発によって濃縮する。明褐色の油が得られ
る。
ニル−ピラゾロ−［３，２ｃ］−ｓ−トリアゾール ３．１ ２，６−ジメチル−ピラゾロ−［３，２ｃ］−ｓ−トリ
アゾール６ｇをジメチルホルムアミド６５ｍｌに溶解
し、溶液をクロロメチルジメチルホスファンオキシド
３．０ｇおよび炭酸カリウム８ｇと混合する。この混合
物を１００℃で２時間撹拌し、熱い間に吸引濾過し、濾
液を蒸発によって濃縮する。残留物をシリカゲル（移動
相溶剤：酢酸エチル／メタノール４：１）でクロマトグ
ラフィー処理する。鹸化および脱カルボキシル化のため
に、生成物を還流下に濃塩酸中で７時間加熱する。反応
混合物を蒸発によって濃縮する。明褐色の油が得られ
る。
【０１１３】ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／メタノ
ール２：１） Ｒｆ＝０．３７ ３．２ ３−アミノ化合物への上記で得られた生成物の変換は、
例３に記載された方法（３ｂ）と同様にして相応する３
−アミノピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾールのため
に実施される。目的化合物は融点２２５℃（分解）の塩
酸塩として得られる。
ール２：１） Ｒｆ＝０．３７ ３．２ ３−アミノ化合物への上記で得られた生成物の変換は、
例３に記載された方法（３ｂ）と同様にして相応する３
−アミノピラゾロ−［１．５ａ］−イミダゾールのため
に実施される。目的化合物は融点２２５℃（分解）の塩
酸塩として得られる。
【０１１４】ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／メタノ
ール３：１）Ｒｆ＝０．２ 例９ ３−ニトロソ−フェノキサジン（１９） ２−アミノ−２´−ヒドロキシジフェニルエーテル２．
８ｇ（J. Chem. Soc.716(1934)）を塩化メチレン３５ｍ
ｌに溶解し、かつトリエチルアミン３．４ｍｌと混合す
る。トリフルオロ酢酸無水物３．４ｍｌを氷で冷却する
間に滴加し、室温に昇温させ、かつさらに１時間撹拌す
る。反応混合物を蒸発によって濃縮し、残留物をシリカ
ゲルで酢酸エチル／リグロイン３：７を用いてクロマト
グラフィー処理する。相応するＮ−トリフルオロアセチ
ル化合物３．８ｇが粘稠な油として得られる。
ール３：１）Ｒｆ＝０．２ 例９ ３−ニトロソ−フェノキサジン（１９） ２−アミノ−２´−ヒドロキシジフェニルエーテル２．
８ｇ（J. Chem. Soc.716(1934)）を塩化メチレン３５ｍ
ｌに溶解し、かつトリエチルアミン３．４ｍｌと混合す
る。トリフルオロ酢酸無水物３．４ｍｌを氷で冷却する
間に滴加し、室温に昇温させ、かつさらに１時間撹拌す
る。反応混合物を蒸発によって濃縮し、残留物をシリカ
ゲルで酢酸エチル／リグロイン３：７を用いてクロマト
グラフィー処理する。相応するＮ−トリフルオロアセチ
ル化合物３．８ｇが粘稠な油として得られる。
【０１１５】ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／リグロ
イン３：７）Ｒｆ＝０．５２ Ａｌ2（ＳＯ4）3１８Ｈ2Ｏ ２．２ｇを水に溶解し、ジ
オキサン１０ｍｌ中の上記で得られた化合物１ｇの溶液
を添加する。この反応混合物を４５℃に加熱し、亜硝酸
ナトリウム０．２４ｇを１回で添加する。１．５時間
後、同量のＡｌ2（ＳＯ4）3、亜硝酸ナトリウムおよび
水１０ｍｌを再び添加し、さらに数時間約６０℃に加熱
する。未だ完結していない反応が終結した後、生成物を
酢酸エチルで抽出する。乾燥した有機相をシリカゲルで
酢酸エチル／リグロイン１：１でクロマトグラフィー処
理することによって精製する。オレンジ色のｐ−ニトロ
ソフェノール誘導体４００ｍｇが得られる。
イン３：７）Ｒｆ＝０．５２ Ａｌ2（ＳＯ4）3１８Ｈ2Ｏ ２．２ｇを水に溶解し、ジ
オキサン１０ｍｌ中の上記で得られた化合物１ｇの溶液
を添加する。この反応混合物を４５℃に加熱し、亜硝酸
ナトリウム０．２４ｇを１回で添加する。１．５時間
後、同量のＡｌ2（ＳＯ4）3、亜硝酸ナトリウムおよび
水１０ｍｌを再び添加し、さらに数時間約６０℃に加熱
する。未だ完結していない反応が終結した後、生成物を
酢酸エチルで抽出する。乾燥した有機相をシリカゲルで
酢酸エチル／リグロイン１：１でクロマトグラフィー処
理することによって精製する。オレンジ色のｐ−ニトロ
ソフェノール誘導体４００ｍｇが得られる。
【０１１６】ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／リグロ
イン１：１）Ｒｆ＝０．２９ 上記で得られたｐ−ニトロソフェノール誘導体３２０ｍ
ｇを還流下にメタノール１５ｍｌ中のナトリウムメチラ
ート６０ｍｇと一緒に３時間煮沸する。トリフルオロア
セチル基を前記条件下で解離し、中間体生成物は環化し
て望ましいオキサジン化合物を形成する。蒸発した反応
混合物の残留物をシリカゲルで酢酸エチル／リグロイン
３：７を使用してクロマトグラフィー処理することによ
って精製する。目的化合物５０ｍｇは、オレンジ色の物
質として得られ、これは、２００℃以上で分解する。
イン１：１）Ｒｆ＝０．２９ 上記で得られたｐ−ニトロソフェノール誘導体３２０ｍ
ｇを還流下にメタノール１５ｍｌ中のナトリウムメチラ
ート６０ｍｇと一緒に３時間煮沸する。トリフルオロア
セチル基を前記条件下で解離し、中間体生成物は環化し
て望ましいオキサジン化合物を形成する。蒸発した反応
混合物の残留物をシリカゲルで酢酸エチル／リグロイン
３：７を使用してクロマトグラフィー処理することによ
って精製する。目的化合物５０ｍｇは、オレンジ色の物
質として得られ、これは、２００℃以上で分解する。
【０１１７】ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／リグロ
イン３：７）Ｒｆ＝０．３４ 例１０ （２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジン−３
−イル）−（４−ニトロソ−２−スルホプロピル−フェ
ニル）アミン（２０） ２−（３´−ヒドロキシプロピル）−フェノール１０ｇ
およびメタノール中のテトラメチルアンモニウムヒドロ
キシドの２０％の溶液３７ｍｌをジメチルホルムアミド
８０ｍｌに溶解し、臭化ベンジル８．５ｍｌを室温で滴
加する。混合物を室温でさらに２時間撹拌し、蒸発によ
って濃縮し、残留物を酢酸エチルと弱酸性にした水との
間に分配する。
イン３：７）Ｒｆ＝０．３４ 例１０ （２−メチル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジン−３
−イル）−（４−ニトロソ−２−スルホプロピル−フェ
ニル）アミン（２０） ２−（３´−ヒドロキシプロピル）−フェノール１０ｇ
およびメタノール中のテトラメチルアンモニウムヒドロ
キシドの２０％の溶液３７ｍｌをジメチルホルムアミド
８０ｍｌに溶解し、臭化ベンジル８．５ｍｌを室温で滴
加する。混合物を室温でさらに２時間撹拌し、蒸発によ
って濃縮し、残留物を酢酸エチルと弱酸性にした水との
間に分配する。
【０１１８】有機相を分離し、かつ乾燥する。Ｏ−ベン
ジル−２−（３´ヒドロキシプロピル）−フェノール１
６．０ｇが淡黄色の油の形で得られる。
ジル−２−（３´ヒドロキシプロピル）−フェノール１
６．０ｇが淡黄色の油の形で得られる。
【０１１９】ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／リグロ
イン６５：３５）Ｒｆ＝０．５４ 上記で得られた化合物をOrganic Synthesis Coll.第
Ｖ巻、第２４９頁の記載と同様にトリフェニルホスフィ
ン臭素アダクトを用いて（３−ブロモプロピル）−フェ
ノールに変換する。この化合物をシリカゲルでリグロイ
ン／エタノール９：１を用いて精製する。生成物を水／
メタノール２０：７に溶解し、かつ２．５倍のモル量の
亜硫酸ナトリウム７Ｈ2Ｏおよびテトラブチルアンモニ
ウムブロミド約９０モル％と混合する。この反応混合物
を還流下に２時間加熱し、蒸発によって濃縮し、水を添
加する。生成物を酢酸エチルで抽出する。２−ベンジル
オキシフェニル−プロパンスルホン酸がテトラブチルア
ンモニウム塩の形の無色の油として得られる。
イン６５：３５）Ｒｆ＝０．５４ 上記で得られた化合物をOrganic Synthesis Coll.第
Ｖ巻、第２４９頁の記載と同様にトリフェニルホスフィ
ン臭素アダクトを用いて（３−ブロモプロピル）−フェ
ノールに変換する。この化合物をシリカゲルでリグロイ
ン／エタノール９：１を用いて精製する。生成物を水／
メタノール２０：７に溶解し、かつ２．５倍のモル量の
亜硫酸ナトリウム７Ｈ2Ｏおよびテトラブチルアンモニ
ウムブロミド約９０モル％と混合する。この反応混合物
を還流下に２時間加熱し、蒸発によって濃縮し、水を添
加する。生成物を酢酸エチルで抽出する。２−ベンジル
オキシフェニル−プロパンスルホン酸がテトラブチルア
ンモニウム塩の形の無色の油として得られる。
【０１２０】ＴＬＣ（シリカゲル、トルエン／メタノー
ル／氷酢酸８：１５：５）Ｒｆ＝０．２９ ベンジル残基を解離するために、この物質をメタノール
中でＰｄ／Ｃ上で水素化する。水素化混合物の濾液を蒸
発によって濃縮し、かつスルホン酸を除去するために強
酸イオン交換体（ＤＯＷＥＸ５０Ｗｘ４）により水と一
緒に濾過する。遊離スルホン酸が適当な画分の蒸発によ
って部分結晶性の物質として得られる。上記で得られた
スルホン酸０．５ｇを水１７ｍｌに溶解し、亜硝酸ナト
リウム１６０ｍｇを添加する。この反応混合物を室温で
４時間撹拌し、蒸発によって濃縮し、少量のメタノール
に溶解し、生成物をエーテルで沈殿させる。２−ヒドロ
キシ−５−ニトロソ−プロパンスルホン酸ナトリウム塩
３７０ｍｇが得られる。
ル／氷酢酸８：１５：５）Ｒｆ＝０．２９ ベンジル残基を解離するために、この物質をメタノール
中でＰｄ／Ｃ上で水素化する。水素化混合物の濾液を蒸
発によって濃縮し、かつスルホン酸を除去するために強
酸イオン交換体（ＤＯＷＥＸ５０Ｗｘ４）により水と一
緒に濾過する。遊離スルホン酸が適当な画分の蒸発によ
って部分結晶性の物質として得られる。上記で得られた
スルホン酸０．５ｇを水１７ｍｌに溶解し、亜硝酸ナト
リウム１６０ｍｇを添加する。この反応混合物を室温で
４時間撹拌し、蒸発によって濃縮し、少量のメタノール
に溶解し、生成物をエーテルで沈殿させる。２−ヒドロ
キシ−５−ニトロソ−プロパンスルホン酸ナトリウム塩
３７０ｍｇが得られる。
【０１２１】ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／アセト
ン／氷酢酸／水５０：２５：１２：５：１２）Ｒｆ＝
０．５４ 上記で得られたニトロソフェノールをメタノール中で還
流下に７時間加熱する。出発生成物と相応するニトロソ
アニソールとの間に平衡が確立される。
ン／氷酢酸／水５０：２５：１２：５：１２）Ｒｆ＝
０．５４ 上記で得られたニトロソフェノールをメタノール中で還
流下に７時間加熱する。出発生成物と相応するニトロソ
アニソールとの間に平衡が確立される。
【０１２２】この反応混合物を蒸発によって濃縮し、か
つ例３と同様にして後精製なしに３−アミノ−２−メチ
ル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジンと反応させる。
目的化合物は、融点＞１７０（分解）の黄緑色の物質と
して得られる。
つ例３と同様にして後精製なしに３−アミノ−２−メチ
ル−ピラゾロ−［１．５ａ］−ピリジンと反応させる。
目的化合物は、融点＞１７０（分解）の黄緑色の物質と
して得られる。
【０１２３】ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／メタノ
ール７５：２５）Ｒｆ＝０．３８
ール７５：２５）Ｒｆ＝０．３８
【図１】図１は、ＮＡＤＨの吸着性を示す線図である。
【図２】図２は、グルコ−スの吸着性を示す線図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フォルカー ウンクリッヒ ドイツ連邦共和国 ラーデンブルク シュ タールビュールリング 27
Claims (6)
- 【請求項１】 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、または反応してＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを形成させる酵素の基質である分析物を、直接
色素原電子受容体の存在下でのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素
の酸化およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量の測定値としての還元
された電子受容体の検出により比色検出するための方法
において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを酵素ベンジルアルコールデ
ヒドロゲナーゼと、電子受容体としての一般式Ｉ： 【化１】 〔式中、Ｒ1は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ
基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基
またはアリールチオ基、必要に応じてカルボキシ、ＰＯ
3Ｈ2、ジアルキルホスフィニルもしくはＳＯ3Ｈによっ
て置換されたアルキル基またはアルキレン基、必要に応
じて１回または２回アルキルによって置換され、さらに
必要に応じてヒドロキシ、ＰＯ3Ｈ2、ＳＯ3Ｈもしくは
カルボキシによって置換されていてもよいアミノ基を表
わし、Ｒはキノンジイミン系との電子共役によって色を
形成する残基を表わす〕で示されるニトロソアニリン化
合物の存在下に反応させ、この場合、このニトロソアニ
リン化合物は、この方法で着色されたキノンジイミンに
酵素的に還元され、キノンジイミンをＮＡＤ（Ｐ）Ｈの
量の測定値として測定することを特徴とする、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを比色検出するための方法。 - 【請求項２】 式Ｉ： 【化２】 〔式中、Ｒ1は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ
基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基
またはアリールチオ基、必要に応じてカルボキシ、ＰＯ
3Ｈ2、ジアルキルホスフィニルもしくはＳＯ3Ｈによっ
て置換されたアルキル基またはアルキレン基、必要に応
じて１回または２回アルキルによって置換され、さらに
必要に応じてヒドロキシ、ＰＯ3Ｈ2、ＳＯ3Ｈもしくは
カルボキシによって置換されていてもよいアミノ基を表
わし、Ｒはキノンジイミン系との電子共役によって色を
形成する残基を表わす〕で示されるニトロソアニリン化
合物。 - 【請求項３】 Ｒが一般式ＩＩＩ： 【化３】 〔式中、Ｒ2は水素原子、ヒドロキシ基、ハロゲン原
子、アルコキシ基またはアルキルチオ基、アリールオキ
シ基またはアリールチオ基、必要に応じてカルボキシ、
ＰＯ3Ｈ2もしくはＳＯ3Ｈによって置換されたアルキル
基またはアルキレン基、必要に応じて１回または２回ア
ルキルによって置換され、さらに必要に応じてヒドロキ
シ、ＰＯ3Ｈ2、ＳＯ3Ｈもしくはカルボキシによって置
換されていてもよいかまたは残基Ｒ1と一緒に−ＣＨ2−
ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＲ12Ｒ13−、−Ｏ−、−
Ｓ−もしくは−ＮＨ−橋（但し、ＮＨは必要に応じてア
ルキルによって置換されていてもよく、Ｒ12およびＲ13
は、必要に応じてヒドロキシ、カルボキシ、ＰＯ3Ｈ2も
しくはＳＯ3Ｈによって置換されていてもよいカルボキ
シ基またはアルキル基を表わすものとする）を形成する
ことができるアミノ基を表わし、Ｒ3はヒドロキシ基、
アルキル残基がさらに必要に応じてヒドロキシ基、アル
コキシ基、必要に応じて１回または数回アルキル、ＰＯ
3Ｈ2、ＳＯ3ＨもしくはＣＯ2Ｈによって置換されたそれ
自体としてかまたはアンモニウム塩、アルカリ金属塩も
しくはアルカリ土類金属塩としての塩の形のアミノ基に
よって置換されているアルキル基、アルコキシ基、アリ
ール基、アリールオキシ基、アリールチオ基またはアル
キルチオ基を表わすかまたはアミノ基ＮＲ4Ｒ5を表わ
し、Ｒ4およびＲ5は、同一でも異なっていてもよく、水
素原子、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアルコキ
シによってさらに置換されていてもよいアルキル基、必
要に応じてヒドロキシ、ＰＯ3Ｈ2、ＳＯ3Ｈ、ＣＯＯＨ
によって置換されているそれ自体としてかまたは塩の形
のポリアルコキシ基または必要に応じて１回または数回
アルキルによって置換されたアミノ基によって必要に応
じて置換されているポリアルコキシ基を表わすか、或い
はＲ4およびＲ5は、必要に応じて酸素原子、硫黄原子も
しくは窒素原子（但し、窒素原子は、アルキル残基、ヒ
ドロキシアルキル残基、ヒドロキシアルコキシアルキル
残基、アルコキシヒドロキシアルキル残基、アルコキシ
カルボニルアルキル残基、ジオキサニリルアルキル残基
もしくはポリアルコキシアルキル残基によって置換され
ているものとする）によって中断されているアルキレン
残基を表わすことができ、これらのアルキレン残基は、
それぞれさらに必要に応じてアルキル部分がヒドロキシ
残基によって置換されていてもよいかまたはＲ2がＮＲ4
Ｒ5、Ｒ4もしくはＲ5に対してオルト位にある場合に
は、Ｒ2と一緒になってアルキレン残基を表わすことも
できる〕で示される１つの残基を表わす、請求項２記載
のニトロソアニリン化合物。 - 【請求項４】 Ｒが一般式ＩＶ： 【化４】 〔式中、Ｘ−ＹはＮＲ6−ＣＯまたはＮ＝ＣＲ7を表わ
し、Ｒ6はＨ原子、必要に応じてヒドロキシ、カルボキ
シ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、ジアルキルホスフィニルによ
って置換されたアルキル基を表わし、Ｒ7はＨ原子、ア
ルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、アルキルチオ
基、アリール基、アラルキル基（但し、これらの基はそ
れぞれ必要に応じてヒドロキシ、ジアルキルホスフィニ
ル、カルボキシ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、これらの酸残基
の１つの塩および／またはアルコキシカルボニルによっ
て置換されているものとする）を表わすか、または必要
に応じて１個または幾つかのヒドロキシ残基、カルボキ
シ残基および／またはアルコキシカルボニル残基を有す
る必要に応じて１または２個のアルキル残基によって置
換されているアミノ基を表わし、この場合アミノ基が２
個のアルキル残基によって置換されている場合には、こ
れらの残基は、アミノ基のＮ原子から離れて酸素原子、
硫黄原子によって中断されていてもよいかまたは必要に
応じて１または２個のアシル基、アルコキシ基および／
またはアラルコキシカルボニル基、Ｈ2Ｎ−ＣＯ基、ア
ルキル基、アラルキル基および／またはアリールカルバ
モイル基によって置換されている他の窒素原子またはア
ミノ基によって中断されていてもよい１つの環を形成す
るために結合していてもよいか；或いは、水素原子、カ
ルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルボキサミド
基またはハロゲン原子であり、Ｒ8は必要に応じてヒド
ロキシ、カルボキシ、ＳＯ3ＨもしくはＰＯ3Ｈ2によっ
て置換されたアルキル基、チオアルキル基またはアラル
キル基を表わすかまたは必要に応じて１または２個のア
ルキル基によって置換され、さらにヒドロキシ、カルボ
キシ、ＳＯ3Ｈ、ジアルキルホスフィニルもしくはＰＯ3
Ｈ2によって置換されていてもよいアミノ基を表わし、
この場合少なくともＲ7および／またはＲ8はアミノ基を
表わし、Ｒ9は必要に応じてヒドロキシ、カルボキシ、
ＳＯ3ＨもしくはＰＯ3Ｈ2によって置換されていてもよ
いアルキル基またはアラルキル基を表わすか、或いはＲ
8またはＲ9は、必要に応じて１個または幾つかの窒素原
子または硫黄原子を有する、窒素原子または炭素原子か
ら構成された３または４員の飽和または不飽和の鎖を表
わし、この場合炭素原子は、必要に応じてアルキル、ア
ルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、アラルキル、ア
リール、カルボキシ、カルボキサミド、アルコキシカル
ボニル、シアノ、ハロゲン、必要に応じて１個または幾
つかのヒドロキシ残基、カルボキシ残基および／または
アルコキシカルボニル残基を有する必要に応じて１また
は２個のアルキル残基によって置換されているアミノ基
によって置換されており、かつ二重結合を介して結合さ
れていない窒素原子は、水素原子、必要に応じてＳＯ3
Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、ＣＯＯＨもしくはジアルキルホスフィニ
ル、またはアラルキルもしくは２個の隣接鎖置換基によ
って置換されており、必要に応じてアルキレン基を形成
し、さらに必要に応じてアリールによって置換されてい
るかまたは縮合環化されている〕で示される残基、なら
びに必要に応じて相応する互変異形およびその塩を表わ
す、請求項２記載のニトロソアニリン化合物。 - 【請求項５】 酸化酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび直接色素
原電子受容体から構成されているＮＡＤ（Ｐ）Ｈを比色
検出するための薬剤において、ベンジルアルコールデヒ
ドロゲナーゼおよび請求項２から４までのいずれか１項
に記載のニトロソアニリン化合物を含有することを特徴
とする、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを比色検出するための薬剤。 - 【請求項６】 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび直接色素原電子受
容体を含有するベンジルアルコールデヒドロゲナーゼを
比色検出するための薬剤において、電子受容体が請求項
２から４までのいずれか１項に記載のニトロソアニリン
化合物であることを特徴とする、ベンジルアルコールデ
ヒドロゲナーゼを比色検出するための薬剤。
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