JPS6399083A - レゾルフイン誘導体の燐酸塩、その製法及びこの塩を含有するホスフアタ−ゼ検出用診断薬 - Google Patents
レゾルフイン誘導体の燐酸塩、その製法及びこの塩を含有するホスフアタ−ゼ検出用診断薬Info
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- JPS6399083A JPS6399083A JP61230215A JP23021586A JPS6399083A JP S6399083 A JPS6399083 A JP S6399083A JP 61230215 A JP61230215 A JP 61230215A JP 23021586 A JP23021586 A JP 23021586A JP S6399083 A JPS6399083 A JP S6399083A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はレゾルフィン誘導体の燐酸塩、該製法及び該塩
を含有するホスファターゼ検出用診断薬に関する。
を含有するホスファターゼ検出用診断薬に関する。
従来の技術
ホスファターゼの活性の測定は近年臨床化学及び診断学
においてますます重要となってきている。例えばアルカ
リ性ホスファターゼは酵素免疫測定法用の標識酵素とし
てますます頻繁に使用されている。酸性ホスファターゼ
の活性測定は前立腺癌の早期診断用の貴重な手段である
。
においてますます重要となってきている。例えばアルカ
リ性ホスファターゼは酵素免疫測定法用の標識酵素とし
てますます頻繁に使用されている。酸性ホスファターゼ
の活性測定は前立腺癌の早期診断用の貴重な手段である
。
測定するために一般にホスファターゼ含有試料に好適な
基質を加え、これから次いで酵素を分離する。一般に該
基質にはオルト燐酸モノエステルが該当する。酵素の作
用により遊離したアルコール性成分を測定する。このた
めに百利には、分光学的に可視性の範囲又はσｖＢ囲で
並びに螢光分析法によって検出することができる化合物
を使用する。
基質を加え、これから次いで酵素を分離する。一般に該
基質にはオルト燐酸モノエステルが該当する。酵素の作
用により遊離したアルコール性成分を測定する。このた
めに百利には、分光学的に可視性の範囲又はσｖＢ囲で
並びに螢光分析法によって検出することができる化合物
を使用する。
従って例えば臨床分析で、ホスファターゼによって４−
二トロフェノールと燐酸塩に分離さｆｌる４−ニトロフ
ェニルホスフェートが既ニ長い間及び頻繁に使用されて
いる。その際黄色のフェノレートイオンの生成はアルカ
リの添加によって達成され５、このことは酸性ホスファ
ターゼを測定する場合には付加的な緩衝工程を意味する
。
二トロフェノールと燐酸塩に分離さｆｌる４−ニトロフ
ェニルホスフェートが既ニ長い間及び頻繁に使用されて
いる。その際黄色のフェノレートイオンの生成はアルカ
リの添加によって達成され５、このことは酸性ホスファ
ターゼを測定する場合には付加的な緩衝工程を意味する
。
その他の方法では、１−す７チルホス７エートを使用す
る。遊離するナフトールを可視性にするためにジアゾニ
ウム塩と反応させてアゾ色素に変えねばならない〔パデ
ソン（Ｂａｂｓｏｎ ）Ａ、 、Ｃ］、ｉｎ、 Ｃｈｅ
ｍ、第３０巻、１４１８頁（１９Ｂ’４年）〕。
る。遊離するナフトールを可視性にするためにジアゾニ
ウム塩と反応させてアゾ色素に変えねばならない〔パデ
ソン（Ｂａｂｓｏｎ ）Ａ、 、Ｃ］、ｉｎ、 Ｃｈｅ
ｍ、第３０巻、１４１８頁（１９Ｂ’４年）〕。
発螢光性基質を用いる酵素活性の測定は十分普及してい
る。光度測定法に対する感度はしばしば１０倍も高まる
。多くの場合に、例えば自動的装置を用いる細胞中の酵
素による活性を検査する場合に、細胞分化（細胞螢光分
析法）用に又は貫流マイクロ螢光分析法（Ｄｕｒｃｈｆ
ｌｕＢｍｉ −ｋｒｏｆｌｏｒｏｍｅｔｒｉｅ ）を用
いる不動化された酵素の分析の場合に、発螢光性基質を
用いて操作せねばならなり、その他の場合には例えば試
薬系の酵素ｉ識付けの測定（酵素免疫測定法）の場合に
は酵素触媒の増倍効果は発螢光性基質の使用によって著
しく増強される。
る。光度測定法に対する感度はしばしば１０倍も高まる
。多くの場合に、例えば自動的装置を用いる細胞中の酵
素による活性を検査する場合に、細胞分化（細胞螢光分
析法）用に又は貫流マイクロ螢光分析法（Ｄｕｒｃｈｆ
ｌｕＢｍｉ −ｋｒｏｆｌｏｒｏｍｅｔｒｉｅ ）を用
いる不動化された酵素の分析の場合に、発螢光性基質を
用いて操作せねばならなり、その他の場合には例えば試
薬系の酵素ｉ識付けの測定（酵素免疫測定法）の場合に
は酵素触媒の増倍効果は発螢光性基質の使用によって著
しく増強される。
従来公知のホスファターゼ開発螢光性基質は、団
螢光性として例えばインドキシルの誘導体〔ポルウイツ
ツ（ａｏｒｖｉｔｚ ） 、：ｒ＊ｐその他著１ジャー
ナル・オデ・メディカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）”
第９巻４４７頁（１９＜５６年）〕又は〕４−メチルウ
ンベリフェロの誘導体〔７エルンレイ（’Ｆｅｒｎｌｓ
ｙ）Ｈ，Ｎ、及びフォルケル（Ｗａｌｋｅｒ ） 、Ｐ
、Ｅｆ、 ”バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ。
ツ（ａｏｒｖｉｔｚ ） 、：ｒ＊ｐその他著１ジャー
ナル・オデ・メディカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）”
第９巻４４７頁（１９＜５６年）〕又は〕４−メチルウ
ンベリフェロの誘導体〔７エルンレイ（’Ｆｅｒｎｌｓ
ｙ）Ｈ，Ｎ、及びフォルケル（Ｗａｌｋｅｒ ） 、Ｐ
、Ｅｆ、 ”バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ。
Ｊｏｕｒｎａｌ ）”第９７巻、９５頁（１９６５年）
〕を有する。しかしながらこれらの化合物は錯体系の動
力学的分析用には欠点を有する。インドキシル誘導体は
酵素による分割後に一連の化学反応を受け、それによっ
て分析が複雑になる。
〕を有する。しかしながらこれらの化合物は錯体系の動
力学的分析用には欠点を有する。インドキシル誘導体は
酵素による分割後に一連の化学反応を受け、それによっ
て分析が複雑になる。
４−メチルクンベリフエロン誘導体はＵｖ範囲で励起さ
れ、その際同時に存在する生物学的又は合成物質の固有
の螢光が邪魔する。
れ、その際同時に存在する生物学的又は合成物質の固有
の螢光が邪魔する。
従って種々のホスファターゼ（ホスホモノエステル−ヒ
ドロラーゼ）ｔ−簡単に、迅速かつ確実に測定すること
ができかつ恐らくは光度測定法並びに螢光分析法による
測定法を使用することのできる基質が必要とされていた
。この要求を満すことが本発明の課題である。
ドロラーゼ）ｔ−簡単に、迅速かつ確実に測定すること
ができかつ恐らくは光度測定法並びに螢光分析法による
測定法を使用することのできる基質が必要とされていた
。この要求を満すことが本発明の課題である。
問題点を解決するための手段
該課題は、ホスファターゼによって燐酸分とレゾルフィ
ン゛誘導体に分離されるレゾルフィン誘導体の新規燐酸
塩によって解決される。後者レゾルフィン誘導体は、可
視筒口で良好に測定可能な吸収を有しかつ更に螢光で容
易に励起させられる良好に水溶性の化合物である。
ン゛誘導体に分離されるレゾルフィン誘導体の新規燐酸
塩によって解決される。後者レゾルフィン誘導体は、可
視筒口で良好に測定可能な吸収を有しかつ更に螢光で容
易に励起させられる良好に水溶性の化合物である。
従って本発明の目的は、一般式ｉａ又はＩｂ：ＨＡ
Ｒ６ 〔式中Ｒ２及びＲδは同−又は異なるもρであって良く
、水素、ハロゲン又は低級アルキル基を表わし Ｒ１、
Ｒ３、Ｒ４及びＲ６は同−又は異なるものであって良く
、水素、ハロゲン、シアノ−１低級アルキルー１低級ア
ルコキシ−、カルざキシ−１低級アルコキシカルざニル
、カルボキシ低級アルキル−１低級アルコキシカルボニ
ルー低級アルキル又は１個又は２個の置換分を有してい
てよいカルボキサミド基又は２ＩｉニーＣｏｏ−（ＣＨ
ＲＯＨ２０）ｔｌ−Ｒフ（式中Ｒ）は水素又は低級アル
キル基を表わしかつｎは１〜４の整数を表わす）を表わ
すがその際Ｒ６は付加的にスルホニル−又はニトロ基を
表わしていても良（、Ｙは窒素又は基Ｎｏを表わしかつ
Ｍ及びｙは同−又は異なるものであって良く、水素、ア
ルカリ金属−又はアルカリ土類金属−又はアンモニウム
イオンを表わす〕のレゾルフィン誘導体の燐酸塩である
。
Ｒ６ 〔式中Ｒ２及びＲδは同−又は異なるもρであって良く
、水素、ハロゲン又は低級アルキル基を表わし Ｒ１、
Ｒ３、Ｒ４及びＲ６は同−又は異なるものであって良く
、水素、ハロゲン、シアノ−１低級アルキルー１低級ア
ルコキシ−、カルざキシ−１低級アルコキシカルざニル
、カルボキシ低級アルキル−１低級アルコキシカルボニ
ルー低級アルキル又は１個又は２個の置換分を有してい
てよいカルボキサミド基又は２ＩｉニーＣｏｏ−（ＣＨ
ＲＯＨ２０）ｔｌ−Ｒフ（式中Ｒ）は水素又は低級アル
キル基を表わしかつｎは１〜４の整数を表わす）を表わ
すがその際Ｒ６は付加的にスルホニル−又はニトロ基を
表わしていても良（、Ｙは窒素又は基Ｎｏを表わしかつ
Ｍ及びｙは同−又は異なるものであって良く、水素、ア
ルカリ金属−又はアルカリ土類金属−又はアンモニウム
イオンを表わす〕のレゾルフィン誘導体の燐酸塩である
。
一般式Ｉのレゾルフィン誘導体の燐酸塩は新規化合物で
ある。該塩は自体公知の方法でフェノール性官能基のホ
スホリル化によって製造することができる。
ある。該塩は自体公知の方法でフェノール性官能基のホ
スホリル化によって製造することができる。
有利には互変具性の一般式１ａ及び■ｂ＝〔式中Ｒ１か
らＲ６及びＹは前記のものを表わす〕のレゾルフィン誘
導体を自体公知の方法で５価の燐のハロゲン化物と〔有
利には無機又μ有機酸結合剤（Ｅｌａｅｕｒｅｆａａｑ
ｅｒ ）の存在で〕反応させ、７尋られたジハロゲンホ
スホニルオキシ化合物を引続き加水分解する。
らＲ６及びＹは前記のものを表わす〕のレゾルフィン誘
導体を自体公知の方法で５価の燐のハロゲン化物と〔有
利には無機又μ有機酸結合剤（Ｅｌａｅｕｒｅｆａａｑ
ｅｒ ）の存在で〕反応させ、７尋られたジハロゲンホ
スホニルオキシ化合物を引続き加水分解する。
一般式ｆｆａ又は式Ｈ′ｂのレゾルフィン誘導体は欧州
特許出［第０ １５６ ３４７号明細書の目的物である
。
特許出［第０ １５６ ３４７号明細書の目的物である
。
５価の燐のハロゲン化物としては例えばオキシ塩化燐（
ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｘｉｔｒｉｃｈｌｏｒｌ ） 、二
基北隣又はピロ燐酸テトラクロリドが挙げられる。
ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｘｉｔｒｉｃｈｌｏｒｌ ） 、二
基北隣又はピロ燐酸テトラクロリドが挙げられる。
最後に記載し念ものが有利に使用される。
酸結合剤としては無機及び有機塩基、例えばアルカリ金
属炭酸塩及びトリアルキルアミンが好適である。相応す
るアンモニウム塩の生成によって反応に使用される溶剤
及び希釈剤中でのレゾルフィン誘導体の特に良好な可溶
性を生じる環式ジアミン、例えばシアデービシクロ−ウ
ンデセン（ＤＢのを使用することが特に有利であると判
明する。
属炭酸塩及びトリアルキルアミンが好適である。相応す
るアンモニウム塩の生成によって反応に使用される溶剤
及び希釈剤中でのレゾルフィン誘導体の特に良好な可溶
性を生じる環式ジアミン、例えばシアデービシクロ−ウ
ンデセン（ＤＢのを使用することが特に有利であると判
明する。
溶剤及び希釈剤としては反応条件下で特に有機液体、例
えばクロロホルム、ジクロルメタン又はアセトニトリル
が好適である。
えばクロロホルム、ジクロルメタン又はアセトニトリル
が好適である。
反応は有利には溶剤又は希釈剤の存在で温度−３０〜＋
２０℃で実施する。
２０℃で実施する。
中間に生成し念ゾクロルホスホニルオキシ化合物の加水
分解は注意深く温度０〜２０℃でアルカリ金属炭酸塩水
溶液、アルカリ土類金属水酸化物水溶液、トリエチルア
ミン又は重炭酸トリエｆｋ７７％ニウＡ （Ｔｒｉｅｔ
ｈｙｌａｍｍａｎｉｕｍｂｉｃ−ａｒｂｏｕａｔ ）を
用いて中和することによって行なわれる。得られるアル
カリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩を
真空中で濃縮しかつそれから好適なりａマドグラフィー
法によって所望の燐酸−レゾルフィン誘導体モノエステ
ルが得られる。その他の方法は、ｆＩｋ１ｍシたアルカ
リ金属、アルカリ土類金属又はアンモニウム塩水溶液か
ら鉱酸例えば塩酸を用いて酸性にすることによって比較
的難溶性の遊離燐酸エステルを沈澱させることである。
分解は注意深く温度０〜２０℃でアルカリ金属炭酸塩水
溶液、アルカリ土類金属水酸化物水溶液、トリエチルア
ミン又は重炭酸トリエｆｋ７７％ニウＡ （Ｔｒｉｅｔ
ｈｙｌａｍｍａｎｉｕｍｂｉｃ−ａｒｂｏｕａｔ ）を
用いて中和することによって行なわれる。得られるアル
カリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩を
真空中で濃縮しかつそれから好適なりａマドグラフィー
法によって所望の燐酸−レゾルフィン誘導体モノエステ
ルが得られる。その他の方法は、ｆＩｋ１ｍシたアルカ
リ金属、アルカリ土類金属又はアンモニウム塩水溶液か
ら鉱酸例えば塩酸を用いて酸性にすることによって比較
的難溶性の遊離燐酸エステルを沈澱させることである。
一般式Ｈのレゾルフィン誘導体の燐酸塩の合成でアルカ
リ金属塩又はアンモニウム塩の形で、一般式■の良好に
水溶性の、非螢光性化合物が生じ、該化合物からホスフ
ァターゼを用いる酵素による分離によって再び螢光性レ
ゾルフィン誘導体が遊離する。
リ金属塩又はアンモニウム塩の形で、一般式■の良好に
水溶性の、非螢光性化合物が生じ、該化合物からホスフ
ァターゼを用いる酵素による分離によって再び螢光性レ
ゾルフィン誘導体が遊離する。
Ｒ１〜Ｒ’Ｆの定義でハロゲンとは弗素、塩素、臭素及
び沃素、有利くは塩素及び臭素である。
び沃素、有利くは塩素及び臭素である。
Ｈ１〜Ｈ７の定義で「低級アルキル基」は炭素原子１〜
５個、有利には１〜３個を有し、その際メチル基が特に
有利である。
５個、有利には１〜３個を有し、その際メチル基が特に
有利である。
Ｒ４及びＲ６の定義で「低級アルコキシ基」は炭素原子
１〜５個、有利には１〜３個を有し、その際メトキシ基
が特に有利である。
１〜５個、有利には１〜３個を有し、その際メトキシ基
が特に有利である。
置換分Ｒ４及びＲ６の定義で低級アルコキシカルざニル
−、カルボキシ−低級アルキル−並びに低Ｍフルコキシ
カルポニルー低級アルキル基の「低級アルコキシ−」又
は「低級アルキル−」基は同様に炭素原子１〜５個有利
には１〜６個を有し、その際メトキシ基又はメチル基が
有利である。
−、カルボキシ−低級アルキル−並びに低Ｍフルコキシ
カルポニルー低級アルキル基の「低級アルコキシ−」又
は「低級アルキル−」基は同様に炭素原子１〜５個有利
には１〜６個を有し、その際メトキシ基又はメチル基が
有利である。
カルざキサミド基の置換分としてはアルキル−、アルコ
キシアルキル−、カルざキシアルキル−及びアルコキシ
カルボニルアルキル基が挙げられるが、その際アルキル
基又はアルコキシ基は各々炭素原子１〜５個、有利には
１〜３個を有する。２個置換され九カルがキサミド官能
基の場合には、２個の置換分はへテロ原子、例えば酸素
、窒素゛及び硫黄によって中断されていて良い環に結合
していて良い。
キシアルキル−、カルざキシアルキル−及びアルコキシ
カルボニルアルキル基が挙げられるが、その際アルキル
基又はアルコキシ基は各々炭素原子１〜５個、有利には
１〜３個を有する。２個置換され九カルがキサミド官能
基の場合には、２個の置換分はへテロ原子、例えば酸素
、窒素゛及び硫黄によって中断されていて良い環に結合
していて良い。
Ｍ及びゾの定義でアルカリ金属イオンとは特にリチウム
−、ナトリウム−及びカリウムイオンである。アルカリ
土類金属イオンは特にマグネシウム−、カルシウム−又
はバリウムイオンである。
−、ナトリウム−及びカリウムイオンである。アルカリ
土類金属イオンは特にマグネシウム−、カルシウム−又
はバリウムイオンである。
Ｍ及びＭ′の定義でアンモニウムイオンは置換されてい
ないアンモニウムイオン又はアルキル基又はアラルキル
基によって１個又は数個置換されているアンモニウムイ
オンであって良い。
ないアンモニウムイオン又はアルキル基又はアラルキル
基によって１個又は数個置換されているアンモニウムイ
オンであって良い。
その際アルキル基とは炭素原子１〜５個から成る基であ
る。有利にはメチα−又はエチル基である。アラルキル
基とは特にベンジル基である。
る。有利にはメチα−又はエチル基である。アラルキル
基とは特にベンジル基である。
置換され九アンモニウムイオンの置換分は同じであって
も異なるものであっても良い。
も異なるものであっても良い。
本発明による生成物の励起及び放射は十分な量子収率で
可視スペクトル範囲にある。レゾルフィンの最高螢光強
度は７．０以上の…値で達せられかつこれより一億が低
くなると徐々に低下する。しφルフィンの配糖体は水溶
液中で大抵は黄色に着色する（約４７０ ｎｍでλｗａ
ｘ ）。酵素による反応後生酸物は大抵は赤色を有する
（約５７０でλｗａｘ ）ので、基質は同様に光度測定
法的測定及び器具を用いない可視法に特に好適であ石。
可視スペクトル範囲にある。レゾルフィンの最高螢光強
度は７．０以上の…値で達せられかつこれより一億が低
くなると徐々に低下する。しφルフィンの配糖体は水溶
液中で大抵は黄色に着色する（約４７０ ｎｍでλｗａ
ｘ ）。酵素による反応後生酸物は大抵は赤色を有する
（約５７０でλｗａｘ ）ので、基質は同様に光度測定
法的測定及び器具を用いない可視法に特に好適であ石。
更に一般式■のレゾルフィン誘導体の新規燐酸塩を含有
するホスファターゼの活性の測定用の診断薬も本発明の
目的である。一般式Ｉのレゾルフィン誘導体の燐酸塩を
ホスファターゼ用の基質として使用することによって、
従来公知であるものよシ著しく鋭敏な試薬系が得られる
。
するホスファターゼの活性の測定用の診断薬も本発明の
目的である。一般式Ｉのレゾルフィン誘導体の燐酸塩を
ホスファターゼ用の基質として使用することによって、
従来公知であるものよシ著しく鋭敏な試薬系が得られる
。
新規基質は生化学的、人間工学的並びに臨床化学的筒口
でホスファターゼの活性を測定するために有利に使用さ
れる。該基質はより鋭敏である。このことから多くの利
点が生じる：（＆） より僅少な酵素活性を測定する
ことができる。
でホスファターゼの活性を測定するために有利に使用さ
れる。該基質はより鋭敏である。このことから多くの利
点が生じる：（＆） より僅少な酵素活性を測定する
ことができる。
伽） より少ない優の試料を使用することができる。
（ｃ） 活性の測定は著しく短い時間で行なうことが
できる。
できる。
Ｇｉ）僅かな試料の使用及び有利な測定波長によって更
にその他の試料成分による方法の妨害発生が減少する。
にその他の試料成分による方法の妨害発生が減少する。
船 不動化酵素を用いるキャリアマトリックス中の反応
を測定することができる。
を測定することができる。
前記基質は全ての由来のホスファターゼの活性を測定す
るために好適であることが判明した一般式Ｉの基質を用
いる本発明による診断薬は、従来公知の試薬に比して著
しく鋭敏である。
るために好適であることが判明した一般式Ｉの基質を用
いる本発明による診断薬は、従来公知の試薬に比して著
しく鋭敏である。
式■のレゾルフィン誘導体の燐酸塩は免疫学的反応の実
施により該活性を測定すべきである標識酵素としてホス
ファターゼを使用する免疫学的測定法にも好適である。
施により該活性を測定すべきである標識酵素としてホス
ファターゼを使用する免疫学的測定法にも好適である。
酵素による標識反応を用いるこの種の免疫学的測定法は
専門家に雰素免疫測定法として公知である。該方法は、
１０″″５〜１Ｏ−Ｘｉモル／ｌの範囲で蛋白質、多糖
類、ホルモン、薬物及びその他の低分子物質の濃度の測
定に役立つ。相分離工程の必要性に応じて同質的と異質
的試験実施に分ける。更に細分は競争的と非競争的試験
原理で行なわれる。
専門家に雰素免疫測定法として公知である。該方法は、
１０″″５〜１Ｏ−Ｘｉモル／ｌの範囲で蛋白質、多糖
類、ホルモン、薬物及びその他の低分子物質の濃度の測
定に役立つ。相分離工程の必要性に応じて同質的と異質
的試験実施に分ける。更に細分は競争的と非競争的試験
原理で行なわれる。
しかしながら全ての試薬原理は、酵素抗原−又は酵素抗
体接合体で作動する。酵素による標識反応は全ての酵素
免疫測定法で共通である。
体接合体で作動する。酵素による標識反応は全ての酵素
免疫測定法で共通である。
この種の目的に好適な標識酵素は例えばホスファターゼ
である。この種の酵素免疫測定法のホスファターゼの測
定は一般に、酵素により分離されかつ常法で光度測定法
又は螢光分析法により測定される好適な基質を添加して
行なわれる。
である。この種の酵素免疫測定法のホスファターゼの測
定は一般に、酵素により分離されかつ常法で光度測定法
又は螢光分析法により測定される好適な基質を添加して
行なわれる。
従ってホスファターゼ試薬系の改良は同様にこの種の酵
素免疫測定法において著しい利点をもたらせる： １、 より高度の感度によって検出限度を更に低下させ
、反応時間を短かくしかつより少ない試料使用を可能に
しかつそれによってその他の試料成分による妨害をより
少なくすることができる。
素免疫測定法において著しい利点をもたらせる： １、 より高度の感度によって検出限度を更に低下させ
、反応時間を短かくしかつより少ない試料使用を可能に
しかつそれによってその他の試料成分による妨害をより
少なくすることができる。
２ 有利な測定波長は、特定の反応実施で、例えば混濁
による、不溶性成分によるこの方法の妨害発生を減少さ
せる。
による、不溶性成分によるこの方法の妨害発生を減少さ
せる。
診断薬は１種又は多種の本発明による一般式■の基質の
他に好適な緩衝系並びに場合によりその他の好適な、こ
の種の診断薬に常用の添加物、例えば湿潤剤、安定剤等
を含有する。診断薬は溶液、凍結乾燥物、粉末混合物、
反応錠剤として又は吸収性の担持材上に貼付けた形で存
在しうる。
他に好適な緩衝系並びに場合によりその他の好適な、こ
の種の診断薬に常用の添加物、例えば湿潤剤、安定剤等
を含有する。診断薬は溶液、凍結乾燥物、粉末混合物、
反応錠剤として又は吸収性の担持材上に貼付けた形で存
在しうる。
溶液の形の本発明による診断薬は有利には試験に必要な
全ての試薬を含有する。溶剤としては、水又は水と水溶
性有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、アセトン
又はジメチルホルムアミドとの混合物が挙げられる。保
存性の理由から、試薬に必要な試薬を２個又はそれ以上
の溶液に分は個々の検査の際にはじめて混合するのが有
利である。
全ての試薬を含有する。溶剤としては、水又は水と水溶
性有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、アセトン
又はジメチルホルムアミドとの混合物が挙げられる。保
存性の理由から、試薬に必要な試薬を２個又はそれ以上
の溶液に分は個々の検査の際にはじめて混合するのが有
利である。
総重量が各々約５〜２０１１Ｉｇ、有利には約１０■の
凍結乾燥物の形の診断薬を製造するために、試験に必要
な全ての試薬の他に常用の賦形剤（Ｇｅｒｕｅｓｔｂｉ
ｌｎｅｒ ）、例えばポリビニルピロリドン、及び場合
によりその他の填料、例えばマンニット、ソルビット又
はキシリットを含有する溶液を乾燥する。
凍結乾燥物の形の診断薬を製造するために、試験に必要
な全ての試薬の他に常用の賦形剤（Ｇｅｒｕｅｓｔｂｉ
ｌｎｅｒ ）、例えばポリビニルピロリドン、及び場合
によりその他の填料、例えばマンニット、ソルビット又
はキシリットを含有する溶液を乾燥する。
粉末混合物又は試薬錠剤の形の診断薬は、試薬の成分に
常用のがレヌス添加剤を加えて顆粒状にすることによっ
て製造される。この種の添加物は例えば糖アルコール、
例えばマンニット、ツルビット又はキシリット又はその
他の常用の不活性化合物、例えばポリエチレングリコー
ル又はポリビニルピロリドンである。粉末混合物及び試
薬錠剤は一般に最終重量約３０〜２００ダ、有利には５
０〜８０■を有する。
常用のがレヌス添加剤を加えて顆粒状にすることによっ
て製造される。この種の添加物は例えば糖アルコール、
例えばマンニット、ツルビット又はキシリット又はその
他の常用の不活性化合物、例えばポリエチレングリコー
ル又はポリビニルピロリドンである。粉末混合物及び試
薬錠剤は一般に最終重量約３０〜２００ダ、有利には５
０〜８０■を有する。
試薬条片の形の診断薬、を製造するためには、吸収性担
持材、有利には濾紙、セルロース又はステープルファイ
バー７リースを、易揮発性溶剤、例えば水、メタノール
、エタノール又ハ７セトン中の試薬条片の製造に必要な
常用の試薬の溶液で含浸する。これは１回の含浸工程で
行なうことができる。しかしながら含浸を多工程で実施
することがしばしば有利であり、その際診断薬の成分の
一部を各々含−有する溶剤を使用する。従って例えば第
一工程で緩衝剤及びその他の水溶性添加物を含有する水
溶液で含浸し、次いで第二工程でホスファターゼ基質を
含有する溶液で含浸することができる。完成した試験紙
はそのマま使用しても良いし又は自体公知の方法で柄に
貼付けるか又は有利には西ドイツ特許第２１１８４５５
号明細書によりプラスチックと目の細かい網状物の間に
封入しても良い。
持材、有利には濾紙、セルロース又はステープルファイ
バー７リースを、易揮発性溶剤、例えば水、メタノール
、エタノール又ハ７セトン中の試薬条片の製造に必要な
常用の試薬の溶液で含浸する。これは１回の含浸工程で
行なうことができる。しかしながら含浸を多工程で実施
することがしばしば有利であり、その際診断薬の成分の
一部を各々含−有する溶剤を使用する。従って例えば第
一工程で緩衝剤及びその他の水溶性添加物を含有する水
溶液で含浸し、次いで第二工程でホスファターゼ基質を
含有する溶液で含浸することができる。完成した試験紙
はそのマま使用しても良いし又は自体公知の方法で柄に
貼付けるか又は有利には西ドイツ特許第２１１８４５５
号明細書によりプラスチックと目の細かい網状物の間に
封入しても良い。
次に本発明による化合物を合成するなめに使用される多
数の実施例のうちのいくつか並びにホスファターゼの活
性測定用のレールフィン誘導体の新規燐酸塩の使用を実
施例につき詳説する。しかしながら本発明はこれにのみ
限定されるものではない。
数の実施例のうちのいくつか並びにホスファターゼの活
性測定用のレールフィン誘導体の新規燐酸塩の使用を実
施例につき詳説する。しかしながら本発明はこれにのみ
限定されるものではない。
例 ル
ゾルフインー燐酸
レゾルフィン５ ！ｉ（２３，５ミリモル）をジクロル
メタン２００１ｊＫｆｆ！濁し、１，８−ジアゾビシク
ロ−（５，４，０）−ウンデシー７−エン７．５ ｙｔ
ｌ （４９，３ミリモル）ｔ−加える。混合物を室温で
完全に溶解するまで攪拌し、次いで該溶液を攪拌下に約
１時間以内に、ジクロルメタン５００ゴ中のピロ燐酸ク
ロリド１５ｍ（９５ミリモル）から成る約−１５℃に冷
却した混合物に滴加する。
メタン２００１ｊＫｆｆ！濁し、１，８−ジアゾビシク
ロ−（５，４，０）−ウンデシー７−エン７．５ ｙｔ
ｌ （４９，３ミリモル）ｔ−加える。混合物を室温で
完全に溶解するまで攪拌し、次いで該溶液を攪拌下に約
１時間以内に、ジクロルメタン５００ゴ中のピロ燐酸ク
ロリド１５ｍ（９５ミリモル）から成る約−１５℃に冷
却した混合物に滴加する。
反応混合物を引続き飽和炭酸水素す） ＩＪウム水溶液
５００ゴ中で攪拌しかつ二酸化炭素生成がもはや認めら
れなくなるまで付加的な炭酸水素ナトリウムを加え・る
。水相を分離しこれを真空中で濃縮して容量的２００−
にした後に、５Ｎの塩酸を用いてβ値２．５に調整する
。この−値で遊離レゾルフィン燐酸が微細な黄橙色に着
色した沈澱物として析出する。真空中で塩化カルシウム
上で乾燥した後にレゾルフィン燐酸１．２５ ｇ（理論
値の１８チ）が得られる。
５００ゴ中で攪拌しかつ二酸化炭素生成がもはや認めら
れなくなるまで付加的な炭酸水素ナトリウムを加え・る
。水相を分離しこれを真空中で濃縮して容量的２００−
にした後に、５Ｎの塩酸を用いてβ値２．５に調整する
。この−値で遊離レゾルフィン燐酸が微細な黄橙色に着
色した沈澱物として析出する。真空中で塩化カルシウム
上で乾燥した後にレゾルフィン燐酸１．２５ ｇ（理論
値の１８チ）が得られる。
元素分析： ｃｌ、’Ｈ８Ｎｏ、Ｐ Ｘ ）！２０、分
子量３１１．２０（計算値） ： ４６．３１ｉ Ｃ
（実測値） ： ４４．８チＨ（計算ｆ［）：３．２％
、Ｈ（実測値）：２．８％Ｎ（計算［）：４．５％、Ｎ
（実測値）：４．５１Ｐ（計算値） ２１０．０１％
！’ （実ｉ１１ｍ） ： ９．６％電気泳動移−動
度（濾紙、ｏ、０５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム緩
衝剤７．５）、 レゾルフィン（＝１）Ｋ対する比：４．ＳＲｆ値（ＤＣ
４ル０−ｔ” （ｃｅｘｌｕｘｏｓｅ ） ｃＢｒ。
子量３１１．２０（計算値） ： ４６．３１ｉ Ｃ
（実測値） ： ４４．８チＨ（計算ｆ［）：３．２％
、Ｈ（実測値）：２．８％Ｎ（計算［）：４．５％、Ｎ
（実測値）：４．５１Ｐ（計算値） ２１０．０１％
！’ （実ｉ１１ｍ） ： ９．６％電気泳動移−動
度（濾紙、ｏ、０５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム緩
衝剤７．５）、 レゾルフィン（＝１）Ｋ対する比：４．ＳＲｆ値（ＤＣ
４ル０−ｔ” （ｃｅｘｌｕｘｏｓｅ ） ｃＢｒ。
Ｒｌｏｔｅｄ ａ＠Ｈａｅｔｈ、展開剤：１Ｍ酢酸アン
モニウム水溶液／エタノール−５： ２ ） ： ０．
１８例 ２ レサズリンー燐酸 レサズリン２５１ダ（ｉｆリモル）を無水ニー？ ル２
！ＭＫ＠濁し、混合物を一３０’ｌＯＫ冷却する。こ九
忙約２０分間以内にピロ燐酸クロリ ド （Ｐｙｒｏ
ｐｈｏａｐｈｏｒ＊ａｅｕｒ＠ａｈｌｏｒｉＬ ）
２．５ １（１０ミリモル）ｔ−滴加し、その後頁
に６０分間冷洛中で攪拌する。引続き反応混合物にエー
テル約５０ゴを添加し、その際黄褐色の沈澱物が析出す
る。これを数回新鮮なエーテルで湿潤し、次いでトリエ
チルアミン０．５Ｍを添加し九氷の添加によって加水分
解する。
モニウム水溶液／エタノール−５： ２ ） ： ０．
１８例 ２ レサズリンー燐酸 レサズリン２５１ダ（ｉｆリモル）を無水ニー？ ル２
！ＭＫ＠濁し、混合物を一３０’ｌＯＫ冷却する。こ九
忙約２０分間以内にピロ燐酸クロリ ド （Ｐｙｒｏ
ｐｈｏａｐｈｏｒ＊ａｅｕｒ＠ａｈｌｏｒｉＬ ）
２．５ １（１０ミリモル）ｔ−滴加し、その後頁
に６０分間冷洛中で攪拌する。引続き反応混合物にエー
テル約５０ゴを添加し、その際黄褐色の沈澱物が析出す
る。これを数回新鮮なエーテルで湿潤し、次いでトリエ
チルアミン０．５Ｍを添加し九氷の添加によって加水分
解する。
反応しなかったレサズリンを分離するために水溶液を炭
酸塩の形でイオン交換体ＤＭＡ１！Ｊ−セワアデックス
（８ｓｐｈａｄｅｘ ） Ａ −２５に入れ（カラム容
量２０１１！Ｊ）０．５Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム
水溶液に対する水の直線的傾斜濃度液で溶出する。
酸塩の形でイオン交換体ＤＭＡ１！Ｊ−セワアデックス
（８ｓｐｈａｄｅｘ ） Ａ −２５に入れ（カラム容
量２０１１！Ｊ）０．５Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム
水溶液に対する水の直線的傾斜濃度液で溶出する。
生成物を含有するフラクションを合し、真空中で蒸発濃
縮し、残渣をメタノールで数回取りかつ再濃縮する。最
後に水に溶解して凍結乾燥した後にレサズリンー燐酸４
０ダがトリエチルアンモニウム塩の形で得られる。
縮し、残渣をメタノールで数回取りかつ再濃縮する。最
後に水に溶解して凍結乾燥した後にレサズリンー燐酸４
０ダがトリエチルアンモニウム塩の形で得られる。
電気泳動移動度（濾紙、０．０５Ｍ、を炭酸トリエチル
アンモニウム緩衝剤、ＰＨ７，５）レサズリン（＝１）
に対する比：４．１Ｍ厘：（ＤＣセルローゼＣＩ？、Ｒ
ｌｅｄｅｌ（１％ｍｅｎ。
アンモニウム緩衝剤、ＰＨ７，５）レサズリン（＝１）
に対する比：４．１Ｍ厘：（ＤＣセルローゼＣＩ？、Ｒ
ｌｅｄｅｌ（１％ｍｅｎ。
展開剤１１１ｍアンモニウム溶液／エタノール＝５：２
）０．２ 例 ３ レゾルフィン−４−カルボンｒ！Ｒ−ｅルホリドーホス
７エート 二トロツレ・グルシン１．６０ ｇ（１０，５ミリモル
）、２．６−ジヒドロキシ安息香酸１．５５ｇ（１０，
０ミリモル）及び褐色軟マンガン鉱Ｑ・８６．９（１０
ミリモル）をメ、タノール２０７ｄに取り、０℃に冷却
する。これに濃硫酸１．０６１ｄｔ−滴加する。冷却せ
ずになお２時間引続き攪拌する。
）０．２ 例 ３ レゾルフィン−４−カルボンｒ！Ｒ−ｅルホリドーホス
７エート 二トロツレ・グルシン１．６０ ｇ（１０，５ミリモル
）、２．６−ジヒドロキシ安息香酸１．５５ｇ（１０，
０ミリモル）及び褐色軟マンガン鉱Ｑ・８６．９（１０
ミリモル）をメ、タノール２０７ｄに取り、０℃に冷却
する。これに濃硫酸１．０６１ｄｔ−滴加する。冷却せ
ずになお２時間引続き攪拌する。
沈澱した赤色生成物を濾別し、メタノールで洗浄し、乾
燥する。収ｆｉ：レサズリンー４−カルｅン酸２．３
、Ｆ （理論値の８５％）。
燥する。収ｆｉ：レサズリンー４−カルｅン酸２．３
、Ｆ （理論値の８５％）。
ＵＶ７’ＶＸＢ （［］、１Ｍ燐酸カリｌｌ’ＦＡ緩衝
剤ｐＨ７，５）：λｍａｘ＝６１４ ｎｍ （ａ＝４８
ｃ！ｆＬ” ｍｏｌ−” ）酸性化後；λｗａｘ ＝
５２２ ａｍ （ｇ＝３２ｃＷＬ” ｍｏｌ−１）（１
））レゾルフィン−４−カルざン酸しサズリンー４−カ
ルボン酸２．３Ｉを水２０ゴ及び２５チのアンモニア５
Ｍに溶解する。青色溶液に水冷下に亜鉛末５Ｉを加える
。その後水冷を除去すると、溶液は徐々に室温に温まる
。
剤ｐＨ７，５）：λｍａｘ＝６１４ ｎｍ （ａ＝４８
ｃ！ｆＬ” ｍｏｌ−” ）酸性化後；λｗａｘ ＝
５２２ ａｍ （ｇ＝３２ｃＷＬ” ｍｏｌ−１）（１
））レゾルフィン−４−カルざン酸しサズリンー４−カ
ルボン酸２．３Ｉを水２０ゴ及び２５チのアンモニア５
Ｍに溶解する。青色溶液に水冷下に亜鉛末５Ｉを加える
。その後水冷を除去すると、溶液は徐々に室温に温まる
。
反応は青から暗紫色への色変化により容易に認ｍされる
か又は薄層クロマトグラフィー（展開剤：メタノール／
酢酸エステル１：１）により観察される。過剰の亜鉛末
を濾別する。反応混合物を氷酢酸及び濃塩酸５ｄで酸性
にする。沈澱した生成物を濾別し、希塩酸で洗浄しかつ
真空中で塩化カルシウム上で乾燥する。収量ニレゾルフ
ィン−４−カルボン酸１．８．９（理論値の８２チ） σψ工１３：（０，１Ｍ燐酸カリウム緩衝剤、ｔＪ（７
，５）：λｍａｘ ＝ ５７９．４ ｎｍ （ｔ ＝
４８．６ ｃｍ” ｍｏｌ−リ；酸性後；λｍａｘ＝
４８５．９ ｎｍ （ｇ＝３４．７ｄ ｍｏｌｌ）螢光
：吸収：λｒｒｍＸ ＝ ５７９ ｎｍ放射：λｗａｘ
＝ ５９３ ｎｍ レゾルフィン−４−カルざン酸５＃（１９，４ミリモル
）又はレサズリンー４−カルビン酸ｓ、３９ （１９，
４ミリモル）を１０％の塩酸１００ｄ中で０．５時間塩
化亜鉛７＃（３８ミ！Ｊモル）と共に還流下に加熱する
。その際溶液は緑色に着色する。冷却し、沈澱したジヒ
ドロレゾルフィン−４−カルざン酸を窒素下に濾別し、
真空中で五酸化燐上で乾燥する。こうして得た粗生成物
を３０分間無水酢酸３Ｑｄ及び酢酸す） ＩＪウム２０
ｍｇと共に還流下に加熱する。反応混合物を氷水２００
ゴ上に注ぎ、１４時間攪拌する。
か又は薄層クロマトグラフィー（展開剤：メタノール／
酢酸エステル１：１）により観察される。過剰の亜鉛末
を濾別する。反応混合物を氷酢酸及び濃塩酸５ｄで酸性
にする。沈澱した生成物を濾別し、希塩酸で洗浄しかつ
真空中で塩化カルシウム上で乾燥する。収量ニレゾルフ
ィン−４−カルボン酸１．８．９（理論値の８２チ） σψ工１３：（０，１Ｍ燐酸カリウム緩衝剤、ｔＪ（７
，５）：λｍａｘ ＝ ５７９．４ ｎｍ （ｔ ＝
４８．６ ｃｍ” ｍｏｌ−リ；酸性後；λｍａｘ＝
４８５．９ ｎｍ （ｇ＝３４．７ｄ ｍｏｌｌ）螢光
：吸収：λｒｒｍＸ ＝ ５７９ ｎｍ放射：λｗａｘ
＝ ５９３ ｎｍ レゾルフィン−４−カルざン酸５＃（１９，４ミリモル
）又はレサズリンー４−カルビン酸ｓ、３９ （１９，
４ミリモル）を１０％の塩酸１００ｄ中で０．５時間塩
化亜鉛７＃（３８ミ！Ｊモル）と共に還流下に加熱する
。その際溶液は緑色に着色する。冷却し、沈澱したジヒ
ドロレゾルフィン−４−カルざン酸を窒素下に濾別し、
真空中で五酸化燐上で乾燥する。こうして得た粗生成物
を３０分間無水酢酸３Ｑｄ及び酢酸す） ＩＪウム２０
ｍｇと共に還流下に加熱する。反応混合物を氷水２００
ゴ上に注ぎ、１４時間攪拌する。
沈澱物をエタノール／水から再結晶する。
Ｎ、Ｏ，Ｏ−ドリアセチルジヒドロレデルフイｙ−４−
カルｅンＷ＆４．８ｇ（６５％ ）が得うｔＬる。
カルｅンＷ＆４．８ｇ（６５％ ）が得うｔＬる。
融点＝１９７〜１９９℃
ＤＣ（珪酸グル、展開剤クロロホルム／メタノール／氷
酢酸９ ： １ ： ０．１ ）Ｒｔ ＝ ［１，３５ Ｎ、Ｏ，Ｏ−）！Ｊアセチル°ジヒドロレゾルフィン−
４−カルざン酸３．８５ ｇ（１０ミリモル）に塩化オ
キサリル５．４ｍ（６Ｑミリモル）ｔ−加え、−１０℃
に冷却する。これにジメチルホルムアミドを滴加し、反
応混合物を攪拌下に室温に温める。その際抽出物はガス
発生下に溶解する。ガス発生終了後なお０．５時間攪拌
し、蒸発濃縮し、各々３回無水塩化メチレン２０−に取
り、蒸発乾固する。こうして粗酸塩化物４ｇが得られ、
これを更に精製しないで更に操作する。
酢酸９ ： １ ： ０．１ ）Ｒｔ ＝ ［１，３５ Ｎ、Ｏ，Ｏ−）！Ｊアセチル°ジヒドロレゾルフィン−
４−カルざン酸３．８５ ｇ（１０ミリモル）に塩化オ
キサリル５．４ｍ（６Ｑミリモル）ｔ−加え、−１０℃
に冷却する。これにジメチルホルムアミドを滴加し、反
応混合物を攪拌下に室温に温める。その際抽出物はガス
発生下に溶解する。ガス発生終了後なお０．５時間攪拌
し、蒸発濃縮し、各々３回無水塩化メチレン２０−に取
り、蒸発乾固する。こうして粗酸塩化物４ｇが得られ、
これを更に精製しないで更に操作する。
ＤＣ（珪酸グル、展開剤クロロホルム／メタノール／氷
酢酸９ ： １ ： ０．１ ）ｎｔ＝ ０．４２ ； 無色の斑点、これは数時間後に赤色に変色する。
酢酸９ ： １ ： ０．１ ）ｎｔ＝ ０．４２ ； 無色の斑点、これは数時間後に赤色に変色する。
粗酸塩化物１１．３ ！ｉ（３１，４ミリモル）を無水
塩化メチレン１５０Ｍに溶解する。これにトリエチルア
ミン８．７ｆｆｉｊ（６３ミリモル）、次いでモルホリ
ン３．３７ｄ （３７，７ミリモル）を滴加する。なシ
２時間攪拌後、溶液ｔ−１１のクエン酸、炭酸水素す）
ＩＪウム溶液及び水で洗浄し、有機相を硫酸マグネシ
ウム上で乾燥して蒸発乾固する。残渣をエタノールから
再結晶する。
塩化メチレン１５０Ｍに溶解する。これにトリエチルア
ミン８．７ｆｆｉｊ（６３ミリモル）、次いでモルホリ
ン３．３７ｄ （３７，７ミリモル）を滴加する。なシ
２時間攪拌後、溶液ｔ−１１のクエン酸、炭酸水素す）
ＩＪウム溶液及び水で洗浄し、有機相を硫酸マグネシ
ウム上で乾燥して蒸発乾固する。残渣をエタノールから
再結晶する。
収ｆ：８．１．Ｆｉ３慢）、融点：１３３〜１３５°Ｃ
（分解） （ｆ）レゾルフィン−４−カルボン酸−モルホリトトリ
アセチルジヒドロレゾルフイ７−４−カルざン酸−七ル
ホリド５．７１Ｃ９ミリモル）をメタノール２５０ｍ１
及び水２５０Ｍに取る。これに１Ｎ水酸化ナトリウム゛
溶液３６ゴ及びヘキサシアノ鉄（Ｉｌｌ）カリウム６．
０１１ （１８ミリモル）を加えて１４時間室温で攪拌
する。塩酸でｐＨ３に酸性にした後、蒸発乾固し、アセ
トンで温浸する。色素溶液を珪酸グル５００Ｍ上で展開
剤としてアセトンを用いて濾過する。色素を含有する溶
離物を蒸発濃縮した後レゾルフィン−４−′カルボン酸
−モルホリド２．６１１Ｃ８０’４）が得られる。
（分解） （ｆ）レゾルフィン−４−カルボン酸−モルホリトトリ
アセチルジヒドロレゾルフイ７−４−カルざン酸−七ル
ホリド５．７１Ｃ９ミリモル）をメタノール２５０ｍ１
及び水２５０Ｍに取る。これに１Ｎ水酸化ナトリウム゛
溶液３６ゴ及びヘキサシアノ鉄（Ｉｌｌ）カリウム６．
０１１ （１８ミリモル）を加えて１４時間室温で攪拌
する。塩酸でｐＨ３に酸性にした後、蒸発乾固し、アセ
トンで温浸する。色素溶液を珪酸グル５００Ｍ上で展開
剤としてアセトンを用いて濾過する。色素を含有する溶
離物を蒸発濃縮した後レゾルフィン−４−′カルボン酸
−モルホリド２．６１１Ｃ８０’４）が得られる。
［７７−７１日（［１，１Ｍ燐酸カリウム緩衝剤、ｐＨ
７，５）：λｍａｚ＝ ５７５ ｔｌｍ、 ｇ＝５５
００００！ｎ” ｍｏｌ−１６ＤＣ（展開剤、ｄ参照） 七＝０．５２ ”Ｈ−ＮＭＲ（（Ｄ）、−ＤＭＭｏ２） ： δ ＝
３．３ − ３．８ （ｍ。
７，５）：λｍａｚ＝ ５７５ ｔｌｍ、 ｇ＝５５
００００！ｎ” ｍｏｌ−１６ＤＣ（展開剤、ｄ参照） 七＝０．５２ ”Ｈ−ＮＭＲ（（Ｄ）、−ＤＭＭｏ２） ： δ ＝
３．３ − ３．８ （ｍ。
８Ｈ）； ６．５０ （ｄ、、Ｔ＝２ジ、 １１り ；
６．６４（ａｓ ：ｒ＝ １０七、 Ｉ Ｈ） ；６
．７６Ｃｄｄｅ 、Ｔ＝ニレゾルフィン４−カルボン酸
モルホＩＪ）’−ｙｈｘ７ｘ−トは例１と同様にレゾル
フィン−４−カルざン酸モルホリドとピロ燐酸クロリド
との反応によって製造した。精製はインプロパツール／
酢酸トリエチルアンモニウム傾斜濃度液を用いてＲＰ−
ＣＩ８カラムで調製高圧液体クロマトグラフィー（ＨＩ
’ＬＣ）によって行なった。
６．６４（ａｓ ：ｒ＝ １０七、 Ｉ Ｈ） ；６
．７６Ｃｄｄｅ 、Ｔ＝ニレゾルフィン４−カルボン酸
モルホＩＪ）’−ｙｈｘ７ｘ−トは例１と同様にレゾル
フィン−４−カルざン酸モルホリドとピロ燐酸クロリド
との反応によって製造した。精製はインプロパツール／
酢酸トリエチルアンモニウム傾斜濃度液を用いてＲＰ−
ＣＩ８カラムで調製高圧液体クロマトグラフィー（ＨＩ
’ＬＣ）によって行なった。
電気泳動移動度（濾紙、０．０５Ｍ重炭酸トリエチルア
ンモニウム緩衝剤、ｐ）１７．５）レゾルフィン−４−
カルざン酸モルホリド（＝１）に対する比：１．９ Ｒｆ値：（ＤＣ，セルローゼＣＪ！：Ｆ、 ｍｅｄｅｌ
ｄ。
ンモニウム緩衝剤、ｐ）１７．５）レゾルフィン−４−
カルざン酸モルホリド（＝１）に対する比：１．９ Ｒｆ値：（ＤＣ，セルローゼＣＪ！：Ｆ、 ｍｅｄｅｌ
ｄ。
Ｈａｅｎ、展開剤１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液／エタノ
ール＝５ ： ２） ： ０．５例 ４ − 生成物は例１と同様に２，８−ジデロムーレデルフイン
〔アフアナシーヴア（ムｆａｎａｓｉｅｖａ ）、Ｇ、
Ｂ、その他著Ｋｈｉｍ、 Ｇａｔｅｒｏｔｓｉｋ Ｌ、
５ｏａ４１ｎ。
ール＝５ ： ２） ： ０．５例 ４ − 生成物は例１と同様に２，８−ジデロムーレデルフイン
〔アフアナシーヴア（ムｆａｎａｓｉｅｖａ ）、Ｇ、
Ｂ、その他著Ｋｈｉｍ、 Ｇａｔｅｒｏｔｓｉｋ Ｌ、
５ｏａ４１ｎ。
３４８〜３５６頁（１９７４年）〕とピロ燐酸クロリド
との反応によって得られた。
との反応によって得られた。
電気泳動移動度（濾紙、０．０５Ｍ重炭酸トリエチルア
ンモニウム緩衝剤、ｐＨ７，５）２．８−ジブロム−レ
ゾルフィン（＝１ ）に対する比：３．２ Ｒｆ１直”（ＤＣ！、セルｏ−ゼＣＩＣＦ 、 Ｒｌｅ
ｄｅｌ ｄｅＨａｅｎ、展開剤１Ｍ酢酸アンモニウム水
溶液／エタノール＝５：２）：０．２８ 例 ５ ４−メチル−レゾルフィン−ホスフェート４−メチル−
レゾルフィン 水酸化カリウム３２．５ 、！ｉｉ＋ （０，６そル）
をエタノール３００Ｍに溶解し、２−メチル−レゾルシ
ン５０１ （０，４モル）を加えて完全に溶解するまで
攪拌する。氷−食塩で冷却した溶液にゆつくフ亜硝酸イ
ンペンチル６３．５＋＋ｊ （０，４３モル）を滴加す
るので、内部温度＋１０℃は越えない。滴加した後なお
更に２時間水浴中で攪拌する。析出した色素を吸引濾過
し、エタノ・−ルで洗浄し、引続き水２７０ゴに溶解し
かっ濃塩酸を添加することによって再び沈澱させる。得
られた黄色沈澱物を吸引濾過し、水で洗浄する。
ンモニウム緩衝剤、ｐＨ７，５）２．８−ジブロム−レ
ゾルフィン（＝１ ）に対する比：３．２ Ｒｆ１直”（ＤＣ！、セルｏ−ゼＣＩＣＦ 、 Ｒｌｅ
ｄｅｌ ｄｅＨａｅｎ、展開剤１Ｍ酢酸アンモニウム水
溶液／エタノール＝５：２）：０．２８ 例 ５ ４−メチル−レゾルフィン−ホスフェート４−メチル−
レゾルフィン 水酸化カリウム３２．５ 、！ｉｉ＋ （０，６そル）
をエタノール３００Ｍに溶解し、２−メチル−レゾルシ
ン５０１ （０，４モル）を加えて完全に溶解するまで
攪拌する。氷−食塩で冷却した溶液にゆつくフ亜硝酸イ
ンペンチル６３．５＋＋ｊ （０，４３モル）を滴加す
るので、内部温度＋１０℃は越えない。滴加した後なお
更に２時間水浴中で攪拌する。析出した色素を吸引濾過
し、エタノ・−ルで洗浄し、引続き水２７０ゴに溶解し
かっ濃塩酸を添加することによって再び沈澱させる。得
られた黄色沈澱物を吸引濾過し、水で洗浄する。
生成物を５０℃で塩化カルシウム上で真空中で乾燥ｆ；
Ｅ、。４−ニトロン−２−メチル−レゾルシン７５．９
が得られる。
Ｅ、。４−ニトロン−２−メチル−レゾルシン７５．９
が得られる。
４−ニトロソ−２−１チル−レゾルシン７５Ｉ及びレゾ
ルシン４２ ＩｉＣ０，３８モル）ｔ−メタノール７５
０ゴに溶解する。該溶液に水冷下二酸化マンガン５６１
１ｔ−添加する。引続１！−濃硫酸４３ｒｌｌを滴加し
て２時間攪拌する。次いで不溶物を吸引濾過して濾液を
真空中で約外の容量に濃縮する。濃縮物を水１．５１に
混入する。その際固体が析出する。該固体を吸引濾過し
て水で後洗浄する。引続き固体を水７５０１１ｔに溶解
し２５ｔｓアンモニア溶液１８０Ｍ及び亜鉛末４０Ｉを
加える。３０分間攪拌した後４−メチルーレゾルフイン
ｆ：濃塩酸を用いて沈澱させ、吸引濾過しかつ５０°Ｃ
で塩化カルシウム上で真空中で乾燥する。こうして生成
物４５ｇ（理論値の５２ｇ６）が得られる。
ルシン４２ ＩｉＣ０，３８モル）ｔ−メタノール７５
０ゴに溶解する。該溶液に水冷下二酸化マンガン５６１
１ｔ−添加する。引続１！−濃硫酸４３ｒｌｌを滴加し
て２時間攪拌する。次いで不溶物を吸引濾過して濾液を
真空中で約外の容量に濃縮する。濃縮物を水１．５１に
混入する。その際固体が析出する。該固体を吸引濾過し
て水で後洗浄する。引続き固体を水７５０１１ｔに溶解
し２５ｔｓアンモニア溶液１８０Ｍ及び亜鉛末４０Ｉを
加える。３０分間攪拌した後４−メチルーレゾルフイン
ｆ：濃塩酸を用いて沈澱させ、吸引濾過しかつ５０°Ｃ
で塩化カルシウム上で真空中で乾燥する。こうして生成
物４５ｇ（理論値の５２ｇ６）が得られる。
Ｒｆ１直（ＤＣセルローゼＣＫｉＦ、Ｒｌｅｄｅｌ ｄ
ｅ Ｈａｅｎ。
ｅ Ｈａｅｎ。
展開剤１Ｍ酢酸アンモニア水溶液／エタノール＝５：２
）：０．７１ ４−メチル−レゾルフィン−ホス７工−トヲ例１と同様
に４−メチル−レゾルフィンとピロ燐酸クロリドとの反
応により製造する。
）：０．７１ ４−メチル−レゾルフィン−ホス７工−トヲ例１と同様
に４−メチル−レゾルフィンとピロ燐酸クロリドとの反
応により製造する。
電気泳動移動度（濾紙、０．０５ＭＸＲ＃Ｒ）リエチル
アンモニウム緩衝剤、Ｈ７，５） ４−メチル−レゾルフィン（＝１）に対する比：３．４ Ｒｆｌ直（ＤＣ，セルローゼＣＥｔＦ、 Ｒｌｅｄｅｌ
ｄ。
アンモニウム緩衝剤、Ｈ７，５） ４−メチル−レゾルフィン（＝１）に対する比：３．４ Ｒｆｌ直（ＤＣ，セルローゼＣＥｔＦ、 Ｒｌｅｄｅｌ
ｄ。
Ｈａｅｎ、展開剤１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液／エタノ
ール＝５：２）：０．２ 例６ アルカリ性ホスファターゼの活性測定 レゾルフィン−４−カルざン酸モルホリドーホスフェー
トを濃度１ｍ９７ＩＲＩで０．１ Ｍグリシン緩衝剤、
Ｐ）（１０，５に溶解する。アルカリ性ホスホターゼを
含有する溶液を添加する際に橙黄色から青紫色への色変
化が起こる。
ール＝５：２）：０．２ 例６ アルカリ性ホスファターゼの活性測定 レゾルフィン−４−カルざン酸モルホリドーホスフェー
トを濃度１ｍ９７ＩＲＩで０．１ Ｍグリシン緩衝剤、
Ｐ）（１０，５に溶解する。アルカリ性ホスホターゼを
含有する溶液を添加する際に橙黄色から青紫色への色変
化が起こる。
青紫色着色の強度は試料中のアルカリ性ホスファターゼ
の濃度に比例する。
の濃度に比例する。
アルカリ性ホスファターゼの公知濃度を有する試料を用
いて検量線を求め、該検量線に従って試料の未知のアル
カリ性ホスファターゼ含量を測定することができる。
いて検量線を求め、該検量線に従って試料の未知のアル
カリ性ホスファターゼ含量を測定することができる。
例７
クロマトグラフィー濾紙片ｔ Ｏ，Ｉ Ｍクエン酸中の
濃度１９７ｄの２，８−ジブロム−レゾルフィン−ホス
フェート溶液ｐＨ５，０で含浸して乾燥する。酸性ホス
ファターゼを有する溶液を満願する際に、青赤への色変
化が生じる・背広着色の強度は試料中の酸性ホスファタ
ーゼ濃度に比例する。
濃度１９７ｄの２，８−ジブロム−レゾルフィン−ホス
フェート溶液ｐＨ５，０で含浸して乾燥する。酸性ホス
ファターゼを有する溶液を満願する際に、青赤への色変
化が生じる・背広着色の強度は試料中の酸性ホスファタ
ーゼ濃度に比例する。
酸性ホスファターゼの公知濃度を有する試料を用りて検
量線を求め、該検量線に従って試料の未知の酸性ホスフ
ァターゼ含量を測定することができる。
量線を求め、該検量線に従って試料の未知の酸性ホスフ
ァターゼ含量を測定することができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、一般式 I ａ又は I ｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ａ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ｂ） 〔式中Ｒ＾２及びＲ＾３は同一又は異なるものであつて
良く、水素、ハロゲン又は低級アルキル基を表わし、Ｒ
＾１、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾６は同一又は異なるもの
であつて良く、水素、ハロゲン、シアノ−、低級アルキ
ル−、低級アルコキシ−、カルボキシ−、低級アルコキ
シカルボニル−、カルボキシ低級アルキル−、低級アル
コキシカルボニル−低級アルキル又は１個又は２個の置
換分を有していてよいカルボキサミド基又は基：−ＣＯ
Ｏ−（ＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｏ）＿ｎ−Ｒ＾７（式中Ｒ＾７
は水素又は低級アルキル基を表わし、ｎは１〜４の整数
を表わす）を表わすが、その際Ｒ＾６は付加的にスルホ
ニル−又はニトロ基を表わしていても良く、Ｙは窒素又
は基ＮＯを表わし、Ｍ及びＭ′は同一又は異なるもので
あつて良く、水素、アルカリ金属−又はアルカリ土類金
属−又はアンモニウムイオンを表わす〕のレゾルフイン
誘導体の燐酸塩。 ２、一般式 I ａ又は I ｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ａ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ｂ） 〔式中Ｒ＾２及びＲ＾５は同一又は異なるものであつて
良く、水素、ハロゲン又は低級アルキル基を表わし、Ｒ
＾１、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾６は同一又は異なるもの
であつて良く、水素、ハロゲン、シアノ−、低級アルキ
ル−、低級アルコキシ−、カルボキシ−、低級アルコキ
シカルボニル−、カルボキシ低級アルキル−、低級アル
コキシカルボニル−低級アルキル又は１個又は２個の置
換分を有していてよいカルボキサミド基又は基：−ＣＯ
Ｏ−（ＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｏ）＿ｎ−Ｒ＾７（式中Ｒ＾７
は水素又は低級アルキル基を表わし、ｎは１〜４の整数
を表わす）を表わすがその際Ｒ＾６は付加的にスルホニ
ル−又はニトロ基を表わしていても良く、Ｙは窒素又は
基ＮＯを表わしかつＭ及びＭ′は同一又は異なるもので
あつて良く、水素、アルカリ金属−又はアルカリ土類金
属−又はアンモニウムイオンを表わす〕のレゾルフイン
誘導体の燐酸塩を製造するに当り、互変異性の一般式I
Iａ及びIIｂ ▲数式、化学式、表等があります▼（IIａ） ▲数式、化学式、表等があります▼（IIｂ） 〔式中Ｒ＾１からＲ＾６及びＹは前記のものを表わす〕
の化合物を自体公知の方法で５価の燐のハロゲン化物と
反応させ、中間生成物として得られるジハロゲンホスホ
ニルオキシ化合物を引続き加水分解することを特徴とす
る、レゾルフイン誘導体の燐酸塩の製法。 ３、１種又は多種の発色性の又は／及び発螢光性の基質
、好適な緩衝物質及び場合によつてはその他の常用の助
剤を含有する、フォスファターゼ検出用診断薬において
、発色性及び発螢光性の基質として一般式 I ａ又は I
ｂ ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ａ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ｂ） 〔式中Ｒ＾２及びＲ＾３は同一又は異なるものであつて
良く、水素、ハロゲン又は低級アルキル基を表わし、Ｒ
＾１、Ｒ＾３、Ｒ＾４及びＲ＾６は同一又は異なるもの
であつて良く、水素、ハロゲン、シアノ−、低級アルキ
ル−、低級アルコキシ−、カルボキシ−、低級アルコキ
シカルボニル−、カルボキシ低級アルキル−、低級アル
コキシカルボニル−低級アルキル又は１個又は２個の置
換分を有していてよいカルボキサミド基又は基：−ＣＯ
Ｏ−（ＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｏ）＿ｎ−Ｒ＾７（式中Ｒ＾７
は水素又は低級アルキル基を表わし、ｎは１〜４の整数
を表わす）を表わすがその際Ｒ＾６は付加的にスルホニ
ル−又はニトロ基を表わしていても良く、Ｙは窒素又は
基ＮＯを表わしかつＭ及びＭ′は同一又は異なるもので
あつて良く、水素、アルカリ金属−又はアルカリ土類金
属−又はアンモニウムイオンを表わす〕のレゾルフイン
誘導体の燐酸塩を使用することを特徴とする、レゾルフ
イン誘導体の燐酸塩を含有するホスファターゼ検出用診
断薬。 ４、付加的な助剤として湿潤剤、ガレヌス添加物又は／
及び賦形剤を使用する、特許請求の範囲第４項記載の診
断薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3534927.1 | 1985-10-01 | ||
| DE19853534927 DE3534927A1 (de) | 1985-10-01 | 1985-10-01 | Phosphate von resorufin-derivaten, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der aktivitaet von phosphatasen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6399083A true JPS6399083A (ja) | 1988-04-30 |
Family
ID=6282423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61230215A Pending JPS6399083A (ja) | 1985-10-01 | 1986-09-30 | レゾルフイン誘導体の燐酸塩、その製法及びこの塩を含有するホスフアタ−ゼ検出用診断薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4719097A (ja) |
| EP (1) | EP0217371A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6399083A (ja) |
| DE (1) | DE3534927A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3644401A1 (de) * | 1986-12-24 | 1988-07-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue hydrolase-substrate |
| US5081274A (en) * | 1988-09-19 | 1992-01-14 | Nitto Boseki Co., Ltd. | 4-acyl-2,6-dihalophenyl-phosphoric acid derivatives useful in the determination of acid phosphatase activity |
| US5227291A (en) * | 1988-09-19 | 1993-07-13 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method for determination of acid phosphatase activity using 4-acyl-2, 6-dihalophenyl phosphoric acid derivatives |
| EP0401813A3 (en) * | 1989-06-08 | 1991-10-16 | Advanced Instruments, Inc. | Method and device for the assay of alkaline phosphatase in dairy products |
| WO2005042504A1 (en) * | 2003-10-31 | 2005-05-12 | Molecular Probes, Inc. | Fluorinated resorufin compounds and their application in detecting hydrogen peroxide |
| WO2014207515A1 (en) | 2013-06-25 | 2014-12-31 | Tubitak (Turkiye Bilimsel Ve Teknolojik Arastirma Kurumu) | Fluorescence method for detecting nuclease activity |
| WO2018167666A1 (en) | 2017-03-14 | 2018-09-20 | Tubitak | Method for rapid identification of microorganisms producing nuclease enzymes |
| EP4055023A4 (en) | 2019-11-07 | 2024-01-03 | Singular Genomics Systems, Inc. | SILICON-CONTAINING DETECTED COMPOUNDS AND USES THEREOF |
| EP3932995A1 (en) | 2020-07-04 | 2022-01-05 | Emulseo SAS | Novel fluorescent substrates and uses thereof in microfluidics |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3378463A (en) * | 1965-06-22 | 1968-04-16 | Army Usa | Method of measuring enzyme activity |
| DE3248043A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Fluorogene phosphorsaeureester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur fluorometrischen bestimmung von phosphaten |
| JPS60252464A (ja) * | 1984-04-06 | 1985-12-13 | クルト・ヴアレンフエルス | ヒドロラ−ゼ用の基質およびそれらの製法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3411574A1 (de) * | 1984-03-29 | 1985-10-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Glycoside von resorufin-derivaten, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der aktivitaet von glycosidasen |
-
1985
- 1985-10-01 DE DE19853534927 patent/DE3534927A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-09-26 US US06/912,395 patent/US4719097A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-30 JP JP61230215A patent/JPS6399083A/ja active Pending
- 1986-10-01 EP EP86113482A patent/EP0217371A3/de not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3378463A (en) * | 1965-06-22 | 1968-04-16 | Army Usa | Method of measuring enzyme activity |
| DE3248043A1 (de) * | 1982-12-24 | 1984-06-28 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Fluorogene phosphorsaeureester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur fluorometrischen bestimmung von phosphaten |
| JPS60252464A (ja) * | 1984-04-06 | 1985-12-13 | クルト・ヴアレンフエルス | ヒドロラ−ゼ用の基質およびそれらの製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0217371A3 (de) | 1988-03-02 |
| EP0217371A2 (de) | 1987-04-08 |
| DE3534927A1 (de) | 1987-04-02 |
| US4719097A (en) | 1988-01-12 |
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