JPH10504968A

JPH10504968A - 植物に導入された遺伝子の発現のためのアセトヒドロキシ酸シンターゼプロモーター

Info

Publication number: JPH10504968A
Application number: JP8509617A
Authority: JP
Inventors: ガブリーレデイートリヒ，; ジエーンスミス，; ジアニイングペング，
Original assignee: アメリカン・サイアナミド・カンパニー
Priority date: 1994-09-08
Filing date: 1995-09-05
Publication date: 1998-05-19
Anticipated expiration: 2015-09-05
Also published as: ES2240978T3; DE69534101T2; NO971069D0; EE03933B1; DE69534101D1; MX9701684A; BR9509202A; CN1210404C; BG64062B1; HU221795B1; HUT77109A; EE9700213A; US6025541A; CA2198497C; MD2312B2; WO1996007746A1; BG101270A; FI970958A0; ATE291631T1; NZ293093A

Abstract

(57)【要約】本発明は、異種遺伝子発現性植物のためのプロモーターとして有用な単離された非コーディングヌクレオチド配列に関する。本発明は更に、その単離されたヌクレオチド配列を含むベクターおよび植物細胞にも関する。トウモロコシからのＡＨＡＳプロモーターを用いて、高レベルかつ様々な植物組織内で、組込み遺伝子が発現される。トウモロコシのａｌｓ１およびａｌｓ２の遺伝子からのプロモーターのクローン化および配列決定を行い、その後にそれらの遺伝子からのプロモーター領域を、あるプラスミドの５’端に組込ませ、その後にはレポーター遺伝子であるベーターグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が続くようにさせる。両プロモーター断片共ＸＩ１２トウモロコシ株からのものである。ａｌｓ１プロモーター断片は約１４００塩基対の長さである一方で、ａｌｓ２プロモーター断片は８１９塩基対を含む。

Description

【発明の詳細な説明】植物に導入された遺伝子の発現のためのアセドヒドロキシ酸シンターゼプロモーター発明の分野本発明は、植物における異種遺伝子発現のためのプロモーターとして有用な単離された非コーディングヌクレオチド配列に関する。本発明は更に、その単離されたヌクレオチド配列を含むベクターおよび植物細胞にも関する。発明の背景植物界は２つの門、すなわちコケ植物（Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ）および維管束植物（Ｔｒａｃｈｅｏｐｈｙｔａ）に分類される。維管束植物門には２６６，０００を越える種が含まれており、それらは４つの亜門に大別される。亜門シダ類には被子植物（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ）綱が含まれる。この綱は２つの亜綱、すなわち双子葉類（ｄｉｃｏｔｓ）および単子葉類（ｍｏｎｏｃｏｔｓ）に分類される。単子葉類には多くの重要な穀類および飼料作物が含まれるため、植物遺伝学者はトランスジェニック単子葉類を産生することを可能にすることに興味の的を集中させている。約５０，０００種の単子葉類が知られている。これらには、ユリ、ヤシ、ラン、アヤメ、チューリップ、スゲ、および牧草類が含まれる。牧草類には、トウモロコシ、小麦、イネ、および他の全ての穀物食品作物が含まれる。不幸なことに単子葉類を遺伝子工学的に作製することには極度な困難が伴い、その結果、植物を用いる大半の研究は双子葉類について実施されている。双子葉類は前記２群の内では大きいほうのものであり、約２００，０００種が知られている。キンポウゲ、キンギョソウ、カーネーション、モクレン、ケシ、キャベツ、バラ、エンドウ、ポインセチア、ワタ、サボテン、ニンジン、コケモモ、ハッカ、トマト、ヒマワリ、ニレ、オーク、およびカエデは２５０科の双子葉類の内の代表的な１９科である。ＤＮＡ分子内に含まれる遺伝子情報が多数の短めのＲＮＡ分子の合成のための鋳型として通常は作用し、それらＲＮＡ分子の内の大半のものが次には特定のポリペプチド鎖の合成のための鋳型として作用する。特定のヌクレオチドセグメント（プロモーターと称されることが良くある）はＲＮＡポリメラーゼ分子により認識され、このＲＮＡポリメラーゼ分子がＲＮＡ合成を開始させる。機能的ＲＮＡ鎖の転写が終了した後には第２種類目のシグナルによりＲＮＡ合成の停止、ならびに各ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡポリメラーゼ分子の脱離がもたらされる。多数の共通プロモーターが存在し、それらは最近は単子葉類植物における異種遺伝子発現を誘導させるのに用いられている。ＤａｖｉｄＭｃＥｌｒｏｙら（１９９０）は、イネアクチン１遺伝子（Ａｃｔ１）からのプロモーターが細菌性β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）に融合させてある構築物の形質転換イネ原形質体内での一過性発現アッセイにより、そのアクチンプロモーターが高レベルの遺伝子発現を誘導させることが示されたことを記載した。この発現はトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（Ａｄｈ１）プロモーターに関して観察されるものの約６倍大きいものであった上に、完全なＡｃｔ１５’イントロンの存在に依存する。ＤａｖｉｄＭｃＥｌｒｏｙら（１９９１）は、単子葉類の形質転換のために至適化させたベクターを、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ）（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターかＡｃｔ１プロモーターかのいずれかを用いて構築したことを記述した。一過性発現アッセイは、形質転換させたイネとトウモロコシの原形質体の両方について実施された。Ａｃｔ１イントロンおよび至適化させたＧＵＳ翻訳開始部位をいずれかのプロモーター配列に添加することにより遺伝子発現が有意に増大した。アクチンプロモーターは、小麦、カラス麦、大麦、およびモロコシの原型質体の一過性アッセイにおいてＧＵＳ発現を誘導させることが示されたことが非公開結果として記載されてもいる。ＷａｎｇｇｅｎＺｈａｎｇら（１９９１）は、Ａｃｔ１−ＧＵＳ遺伝子融合体を保持するトランスジェニックイネ植物のインサイチュウーハイブリダイゼーション調査により、Ａｃｔ１プロモーターが無性栄養性かつ再生性の両方を兼ね備えた組織では構成性発現パターンを有することが示されたことを記載した。ＪｕｎＣａｏら（１９９２）は、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターもしくはイネのＡｃｔ１プロモーターのいずれかの制御下で発現されるｂａｒ遺伝子での形質転換の後にトランスジェニックイネ植物をバイアロフォス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）上で選択した。ＡｌｅｎＨ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２）は、トウモロコシのＵｂｉ−１−ＣＡＴ遺伝子融合物で形質転換させたトウモロコシ原形質体は、一過性発現アッセイではＣａＭＶ−３５Ｓ−ＧＵＳ遺伝子融合物で形質転換させたトウモロコシ細胞より約１０倍高いレベルのＣＡＴ活性を示すことを記載した。トウモロコシ苗木の熱ショックの後のＵｂｉ− １およびＵｂｉ−２の転写レベルのノザンブロット分析により、両遺伝子共２５ ℃では構造的に発現されたが、熱ショック後には誘導を受けることが示された。ＳｅｉｉｃｈｉＴｏｋｉら（１９９２）は、安定に形質転換されたトランスジェニックイネ植物が、トウモロコシＵｂｉ−１プロモーターの制御下で発現されるｂａｒ遺伝子の電気穿孔法媒介性形質転換、およびバイアロフォス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）上での選択の後に取得されたことを記載した。この結果により、Ｕｂｉ−１プロモーターを用いてイネにおける効率的な高レベル遺伝子発現を誘導させて、結実能力のあるトランスジェニックイネ植物の選択および再生を可能にすることができることが示される。Ｊ．Ｔｒｏｙら（１９９３）は、安定に形質転換された小麦植物が、未成熟胚芽に由来するカルスの、ｂａｒ遺伝子およびＧＵＳ（これら各々はトウモロコシＵｂｉ−１プロモーターの制御下で発現される）の両方での衝撃法、ならびにそれに続くバイアロフォス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）上での選択の後に取得されたことを記載した。この結果により、Ｕｂｉ−１プロモーターを用いて小麦における効率的な高レベル遺伝子発現を誘導させて、結実能力のあるトランスジェニック植物の選択および再生を可能にすることができることが示される。ＹｕｅｃｈｅｎＷａｎおよびＰｅｇｇｙＧ．Ｌｅｍａｕｘ（１９９４）は、胚芽性大麦組織の、ｂａｒ遺伝子およびＧＵＳ（これら各々はトウモロコシＵｂｉ−１プロモーターの制御下で発現される）の両方での微小砲弾衝撃法、ならびにそれに続くバイアロフォス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）上での選択の後には、安定に形質転換された結実能力のある大麦植物が取得されたことを記載した。この結果により、Ｕｂｉ−１プロモーターを用いて大麦における効率的な高レベル遺伝子発現を誘導させて、結実能力のあるトランスジェニック植物の選択および再生を可能にすることができることが示される。Ｕｂｉ−ｂａｒもしくはＣａＭＶ３５Ｓ−ｂａｒのいずれかを用いる少数植物の衝撃法に関わる実験によっては、取得される形質転換体の数に有意な差異は全く示されなかった。ＪｕｎｋｏＫｙｏｚｕｋａら（１９９１）は、トウモロコシＡｄｈ１プロモーター−ＧＵＳ融合物をイネ原型質体に組込ませてトランスジェニックイネ植物を取得したことを記載した。このトランスジェニック植物内でのＧＵＳ活性を調査してＧＵＳ発現パターンを決定した。トウモロコシＡｄｈ１プロモーターは調査した植物の全部位において構成的発現を亢進することが見いだされている。トウモロコシにおけるＡｄｈ１発現について既に示されているように、Ａｄｈ１により誘導されるＧＵＳ発現は根においては嫌気条件により誘導された。Ｄ．Ｉ．Ｌａｓｔら（１９９１）は、トウモロコシＡｄｈ１プロモーターを、トウモロコシＡＤＨ１遺伝子の嫌気応答性因子（ＡｎａｅｒｏｂｉｃＲｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ）およびアグロバクテリウムツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のオクトピンシンターゼ遺伝子からのｏｃｓ因子の多重コピー（ｐＥｍｕ）の添加により改変させたことを記述した。ｐＥｍｕ−ＧＵＳで形質転換させた様々な単子葉種の原形質体の一過性発現アッセイでは、最善の構築物により、小麦、トウモロコシ、イネ、アイルコルン、およびロリウムムルティフロルム（Ｌｏｌｉｕｍｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）においてはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと比較すると１０〜５０倍高いレベルの発現が得られた。ＲｏｂｅｒｔＢｏｗｅｒおよびＲｏｂｅｒｔＧ．Ｂｉｒｃｈ（１９９２）は、安定な形質転換体が、サトウキビの胚芽性カルスの、Ｅｍｕプロモーターの制御下にあるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子での形質転換後に取得されたことを記載した。Ｄ．Ａ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら（１９９４）は、Ｅｍｕプロモーターを用いて、小麦とイネとの両方に形質転換された４つの異なる選択用マーカー遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ、および除草剤耐性を付与する突然変異体アセトラクタートシンターゼ）の発現を誘導させたことを記載した。小麦カルスおよび形質転換させたイネ植物は形質転換体の選択の後に取得され、このことによりこのプロモーターを用いて選択用マーカー遺伝子の発現を誘導させて形質転換穀物食品を取得することができることが示される。トランスジェニック穀物食品において外来性遺伝子発現を制御するのに用いられるプロモーター因子の総説が最近発行されており、そしてこれは引用により本明細書に取り込まれる（ＭｃＥｌｒｏｙａｎｄＢｒｅｔｔｅｌ、１９９４）。多数のプロモーターが現在では双子葉類植物の形質転換のために用いられている。これらのプロモーターは様々な異なる源から取得される。共通に用いられる、ある種のプロモーターがアグロバクテリウムツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から単離されており、このアグロバクテリウムではそれらのプロモーターは、感染中にその植物ゲノム内に組み込まれるＴ−ＤＮＡセグメント上に保持されるオピンシンターゼ遺伝子の発現を誘導するように機能する。これらのプロモーターには、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）プロモーター（Ｌ．Ｃｏｍａｉｅｔａｌ．、１９８５；Ｃ．Ｗａｌｄｒｏｎｅｔａｌ．、１９８５）、マンノピンシンターゼ（ｍａｓ）プロモーター（Ｌ．Ｃｏｍａｉｅｔａｌ．、１９８５；Ｋ．Ｅ．ＭｃＢｒｉｄｅａｎｄＫ．Ｒ．Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、１９９０）、ならびにノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーター（Ｍ．Ｗ．Ｂｅｖａｎｅｔａｌ．、１９８３；Ｌ．Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａｅｔａｌ．、１９８３、Ｒ．Ｔ．Ｆｒａｌｅｙｅｔａｌ．、１９８３、Ｍ．ＤｅＢｌｏｃｋｅｔａｌ．、１９８４、Ｒ．Ｈａｉｎｅｔａｌ．、１９８５）が含まれる。これらのプロモーターは多種多様な植物組織中で活性を示す。幾つかのウイルス性プロモーターを用いても双子葉類における異種遺伝子発現は誘導される（Ｊ．Ｃ．ＫｒｉｄｌａｎｄＲ．Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ、１９８６）。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ）３５Ｓプロモーターは双子葉類の形質転換のために最も頻繁に用いられるプロモーターの内の一つであり、それはそのプロモーターがほぼ全ての組織において高レベルの遺伝子発現を付与するためである（Ｊ．Ｏｄｅｌｌｅｔａｌ．、１９８５；Ｄ．Ｗ．Ｏｗｅｔａｌ．、１９８６；Ｄ．Ｍ．Ｓｈａｈｅｔａｌ．、１９８６）。２つの並列３５Ｓプロモーター（Ｒ．Ｋａｙｅｔａｌ．、１９８７）、およびｍａｓ−３５Ｓプロモーター（Ｌ．Ｃｏｍａｉｅｔａｌ、１９９０）（これは、その３５Ｓプロモーターと並列になっているマノピンシンターゼプロモーターからできている）を含む配置を初めとするこれらのプロモーターの改変物も用いられている。これらの両プロモーターは単一コピーの３５Ｓプロモーターよりも一層高いレベルの遺伝子発現を誘導させる。既に用いられている他のウイルス性プロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ）１９Ｓプロモーター（Ｊ．Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉｅｔａｌ．、１９８４；Ｅ．Ｂａｌａｚｓｅｔａｌ．）およびゴマノハグサモザイクウイルスからの３４Ｓプロモーター（Ｍ．Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ．、１９９０）が含まれる。多数の植物におけるＡＨＡＳ発現の調査により、ＡＨＡＳは全ての植物組織内で発現されることが示されている。ＧａｉｌＳｃｈｍｉｔｔおよびＢｉｊａｙＫ．Ｓｉｎｇｈ（１９９０）は、ライママメの様々な組織において実施された酵素アッセイによりＡＨＡＳ活性が、葉、茎、根、花、莢、および分裂組織を初めとする検査した全組織に存在することが示されたことを記載した。ＡＨＡＳ活性は茎内でははぼ一定であるが、葉、根、および分裂組織では加齢と共に減少することが見いだされた。ＳｈａｒｏｎＪ．Ｋｈｅｅｌｅｒら（１９９３）は、タバコがアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする２本の遺伝子、ＳｕｒＡおよびＳｕｒＢを含むことを記載した。両遺伝子共全種の組織において発現されるらしく、ただし違う組織における発現レベルには約４倍の差が見られた。発達中の器官が最高レベルの発現を示すようである。インサイチューハイブリダイゼーション調査では、最高レベルの発現は代謝的に活性な細胞もしくは迅速に分裂している細胞に一貫して観察されたことが示された。ＳｕｒＢは調査を行った全組織中でＳｕｒＡよりも高いレベルで発現された。ＴｈｅｒｅｓｅＯｕｅｌｌｅｔら（１９９２）は、アブラナ（ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ））種はアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする多重遺伝子族を含むことを記載した。５本のＡＨＡＳ遺伝子の内の４本がブラシカナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）において既に同定されている。遺伝子特異的プローブを用いるリボヌクレアーゼプロテクション法（ＲＮＡｓｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｓｓａｙ）を実施して様々なブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種における遺伝子族の内の異なるメンバーの発現パターンを決定した。それらの遺伝子の内の２本、ＡＨＡＳ１よびＡＨＡＳ３が、調査した全組織において構成的に発現されることが見いだされた。ＡＨＡＳ２転写物は再生性組織および種子の胚体外組織内にのみ検出された。４番目の遺伝子ＡＨＡＳ４によりコードされる転写物は検出されず、そしてそのためこの遺伝子は偽遺伝子であると考えられる。ＤａｌａＬ．ＳｈａｎｅｒおよびＮ．ＭｏｏｒｔｈｙＭａｌｌｉｐｕｄｉ（１９９１）は、トウモロコシの若葉と、懸濁培養物として成長させたＢＭＳ細胞との比較により、新鮮グラム重量当たりのＢＭＳ細胞の活性はその若葉試料におけるものよりも約５．８倍高かったことが示されたと記載した。ＢＭＳ細胞は活発に分裂しているため、この結果は、より若く、活発に分裂している組織の方が、年長組織よりも高いＡＨＡＳ活性を示すという、タバコおよびライママメに関する以前の研究の結果と一致する。発明の要約トウモロコシからのＡＨＡＳプロモーターを用いて高レベルかつ様々な植物組織内で組込み遺伝子を発現させた。トウモロコシのａｌｓ１およびａｌｓ２遺伝子からのプロモーターのクローン化および配列決定を行い（図１、図２、図３）、そしてこれらの遺伝子からのプロモーター領域を、その後にプラスミドの５’ 端に組込ませ、その後にはレポーター遺伝子であるベーターグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が続くようにさせた。両方のプロモーター断片はＸＩ１２トウモロコシ株からのものである。ａｌｓ１プロモーター断片は約１４００塩基対の長さである一方で、ａｌｓ２プロモーター断片は８１９塩基対を含む。ＡＨＡＳプロモーターの活性を決定するためには、その後にキメラプラスミドを、トウモロコシブラックメキシカンスイード（ＢｌａｃｋＭｅｘｉｃａｎＳｗｅｅｔ）の原形質体およびイネの原形質体内に、一過性発現レベルの分析の目的で組込ませた。比較の目的では原型質体を更に、そのＧＵＳレポーター遺伝子を誘導させるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含むプラスミドでも形質転換させた。トウモロコシ細胞中でのキメラプラスミドの発現は、ＧＵＳ酵素活性を分析することにより決定する。トウモロコシのａｌｓ２プロモーターの活性は、両種の細胞において、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの活性に等しいか、もしくはそれを上回っていた（図４）。図５は、ｐＣＤ２２１Ｂ（ａｌｓ２−ＧＵＳ−ｏｃｓターミネータープラスミド）もしくはｐＡＣ４００（ＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＵＳ−ｏｃｓターミネータープラスミド）のいずれかで安定に形質転換させたトウモロコシＢＭＳ細胞株において実施したベーターグルクロニダーゼアッセイの結果を示す。植物組織に対する放射ラベル化ＲＮＡプローブのインサイチューハイブリダイゼーションによるＡＨＡＳｍＲＮＡ分布の分析により、トウモロコシＡＨＡＳプロモーターは大半の植物部位において活性を示すことが示される（図６、図７、図８）。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＡＨＡＳプロモーターの活性は、アグロバクテリウムツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて安定に形質転換させたアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物内で分析される。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＡＨＡＳ遺伝子の上流プロモーター領域をＧＵＳレポーター遺伝子に融合させ、二重ベクターｐＢＩＮ１９内に組み込ませ、そしてアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）を形質転換させるのに用いる。形質転換させた植物の分析により大半の植物部位においてＧＵＳ発現（プロモーター活性を指示するもの）が示される。図面の簡単な説明図１は、トウモロコシＸＡ１７からのＡＨＡＳプロモーター配列ＡＬＳ１を表す。図２は、トウモロコシＸＡ１７からのＡＨＡＳプロモータ配列ＡＬＳ２を表す。図３は、トウモロコシＸＩ１２からのＡＨＡＳプロモーター配列ＡＬＳ２を表す。図４は、ｐＣＤ２２１Ｂ（ａｌｓ２−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＧＵＳ−ｏｃｓターミネータープラスミド）もしくはｐＡＣ４００（ＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＵＳ−ｏｃｓターミネータープラスミド）での形質転換後のブラックメキシカンスイート（ＢｌａｃｋＭｅｘｉｃａｎＳｗｅｅｔ）トウモロコシ細胞もしくはイネ懸濁細胞の原形質体の一過性アッセイからのベーターグルクロニダーゼ活性を表す棒グラフである。ＧＵＳ活性はピコモル／分／ｍｇ蛋白質として算出される。結果は３回の独立した実験からのものである。図５は、ｐＣＤ２２１Ｂ（ａｌｓ２ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＧＵＳ−ｏｃｓターミネーター）もしくはｐＡＣ４００（ＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＵＳ−ｏｃｓターミネーター）のいずれかでの形質転換後の安定に形質転換されたブラックメキシカンスイート（ＢｌａｃｋＭｅｘｉｃａｎＳｗｅｅｔ）細胞におけるベーターグルクロニダーゼ活性を表す棒グラフである。ＣＫは形質転換させていない対照組織を表す。ＧＵＳ活性はピコモル／分／ｍｇ蛋白質として算出される。図６ − 放射性ラベル化ＲＮＡプローブを用いる２週令のトウモロコシの苗木からの葉輪生のインサイチューハイブリダイゼーション調査。組織切片を調製し、そしてＡＨＡＳセンス鎖（ＡＨＡＳ−）もしくはＡＨＡＳアンチセンス鎖（ＡＨＡＳ＋）のいずれかをコードするＲＮＡプローブにハイブリダイズさせた。比較の目的で、ＳＳＵ（ＲＵＢＩＳＣＯ小サブユニット）のセンス鎖（ＳＳＵ− ）もしくはＳＳＵのアンチセンス鎖（ＳＳＵ＋）プローブも用いた。各場合共、アンチセンス鎖（＋）のみが組織内に存在するｍＲＮＡにハイブリダイズすることが予期される。ａ）ＳＳＵ＋プローブ；ｂ）ＳＳＵ−プローブ；ｃ）ＡＨＡＳ＋プローブ；ｄ）ＡＨＡＳ−プローブ。図７ − 図６について記載される要領で調製された授粉後１２日目のトウモロコシ殻粒のインサイチューハイブリダイゼーション調査；ａ）胚芽および胚柄、ＡＨＡＳ＋プローブ；ｂ）胚芽および胚柄、ＡＨＡＳ−プローブ；ｃ）果皮、アリューロン、および内胚乳、ＡＨＡＳ−プローブ；ｄ）果皮、アリューロン、および内胚乳、ＡＨＡＳ＋プローブ。図８ − 図６に記載される要領で調製された若いトウモロコシ植物の頂端分裂組織のインサイチューハイブリダイゼーション調査。ａ）およびｂ）ＡＨＡＳ＋プローブ；ｃ）およびｄ）ＡＨＡＳ−プローブ。発明の詳細な記述科学者たちは植物に所望される特徴を付与するための遺伝子的改変を用いるための方法を探索している。例えば、味、基本的構造、サイズ、害虫耐性および除草剤耐性、色、酸性度、もしくは食品用穀類の甘さなどの特徴を改善するのに用いられる遺伝子工学技術が、雑種形成という通常の方法と比較して一層迅速な手法として探索されている。本発明はトウモロコシおよびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｉｐｓｉｓ）からのＡＨＡＳプロモーター、ならびにそれらのプロモーターを含むベクターおよび植物細胞に関する。（本出願の目的のためには、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼの結合のためのシグナルとして作用する遺伝子の上流に見いだされるヌクレオチド配列として特定される）。トウモロコシのａｌｓ１およびａｌｓ２遺伝子のクローン化および配列決定を行い、そしてその後にそれらの遺伝子からのプロモーター領域をプラスミドの５’端に組込ませ、その後にはＧＵＳレポーター遺伝子が連続するようにさせた。この出願の目的では、レポーター遺伝子は目的のプロモーターの下流で融合されるヌクレオチド配列として特定され、その結果そのプロモーターで開始する転写はそのレポーター遺伝子を通過して進行する。レポーター遺伝子は幾つかの容易に測定できる酵素活性をコードしており；例えば本発明では、トウモロコシ細胞内のキメラプラスミドの発現はベーターグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）酵素活性を分析することにより決定される。当業者は、ＡＨＡＳプロモーターは多くの異なる植物組織内でかなり高い活性を示し、かつ様々な植物内で新規遺伝子を発現するのに用いることができるということを認識すべきである。新規遺伝子には、除草剤耐性、解毒作用、および植物の病原体に対する耐性のための遺伝子が含まれるが、これらには限定されない。特許請求されるプロモータを単子葉類における異種遺伝子発現用に用いることができ、それらの単子葉類とは、トウモロコシ、イネ、小麦、大麦、モロコシ、カラス麦、ライ麦、およびキビを初めとするものであるが、これらには限定されない。当業者は、特許請求されるプロモーターは更に双子葉類における発現をも誘導させるであろう一方で、双子葉類における単子葉類プロモーターの発現は単子葉類におけるものと比較すると低めのレベルになるであることが予測されることも認識すべきである。当業者はトウモロコシａｌｓ２プロモーターを用いて他の単子葉種内での遺伝子発現を誘導させることができることを認識すべきである。例えば、イネＡｃｔ１プロモーターはトウモロコシの原形質体における遺伝子発現を誘導させ、トウモロコシＥｍｕプロモーターはトランスジェニック小麦、大麦、およびイネを選択するのに既に用いられており、そして双子葉類のプロモーターであるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡＨＡＳプロモーターはトランスジェニックタバコおよびトランスジェニックイモにおけるＡＨＡＳ遺伝子発現を誘導させのに既に用いられている。特許請求されるトウモロコシａｌｓ２はトウモロコシ内で至適状態で作用するが、他の単子葉類における遺伝子発現も誘導させる。トウモロコシおよび他の種において実施された調査に基づくと、このプロモーターは、ある植物全体に存在する、ある遺伝子の構成的発現を誘導させるはずである。最高レベルの発現は、活発に分裂しているか、もしくは代謝的に活発な組織のいずれかにおいて観察される。当業者に知られる様々な異なる技術は、微小砲弾衝撃法、ＰＥＧ−媒介性形質転換、電気穿孔法、およびシリコン線維を初めとするが、これらには限定されず、これらの技術は既に単子葉類穀物を形質転換させるのに用いられている。これらの技術全ては、形質転換予定のヌクレオチド配列の輸送のためのＤＮＡベクターの使用を必要とする。本発明の使用に適するベクターには、トランスジェニック物質の選択のために用いられるマーカー遺伝子を保持するベクターが含まれるが、これには限定されず、またそのマーカー遺伝子は、ハイグロマイシン、カナマイシン、バイアロフォス、ならびにイミダゾリノンおよびスルホニル尿素除草剤に対する耐性を付与する遺伝子を初めとする。以下に示す実施例は本発明を詳細に説明する目的でのみ用いられ、かついずれかの方法においても本発明を制約するものとして見なされるものではない。実施例ａｌｓ１およびａｌｓ２プロモーターの効率は、トウモロコシおよびイネの原形質体、もしくはそれらのプロモーター配列がＧＵＳ遺伝子に融合させてある構築物を保持するトウモロコシ細胞株におけるＧＵＳ活性を測定することにより評価される。ベクター調製および形質転換のプロトコールが以下に記載される。キメラＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＵＳ、ａｌｓ１−ＧＵＳ、およびａｌｓ２−ＧＵＳ遺伝子を含む構築物プラスミドｐＡＣ４００は、１．７ｋｂのＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片（ＧＵＳ遺伝子を含む）および７００ｂｐのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（オクトピンシンターゼターミネーターを含む）の上流にクローン化されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの４１８塩基対（ｂｐ）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片の融合物を含むｐＵＣ１９を基にするプラスミドである。ａｌｓ１およびａｌｓ２遺伝子はトウモロコシ株ＸＩ１２から調製されるゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより取得される。ａｌｓ１遺伝子のＡＴＧ開始コドンから上流の１．４キロベース（ｋｂ）の配列を含むＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片をＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの代わりにｐＡＣ４００内にサブクローン化してｐＣＤ２２３Ｂを作製する。ａｌｓ２のＡＴＧから上流の８１９ｂｐのＰｓｔＩ−ＮｃｏＩ断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＫＳ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内の同一のＧＵＳ− ｏｃｓターミネーター融合物の前にサブクローン化してｐＣＤ２２１Ｂを作製した。トウモロコシＸＩ１２からのａｌｓ２プロモーターの配列が図３に示される。イネおよびトウモロコシの原形質体の形質転換およびアッセイ原型質体をイネ（ノルタイ（Ｎｏｒｔａｉ））もしくはトウモロコシ（ブラックメキシカンスイート（ＢｌａｃｋＭｅｘｉｃａｎＳｗｅｅｔ；ＢＭＳ））懸濁細胞から単離し、そしてＬ．Ａ．Ｌｙｚｎｉｋら（１９８９）およびＪ．Ｙ．Ｐｅｎｇら（１９９０）のＰＥＧ−媒介性形質転換プロトコールに従ってｐＡＣ２２１ＢもしくはｐＡＣ４００で形質転換させる。一過性アッセイのためには形質転換させたイネの原形質体をフィーダー細胞を含む培地の上に置かれたミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルター上にのせ、そして形質転換されたＢＭＳ原形質体を３ｍｌの液体培地中で培養する。形質転換後２日目に原形質体培養物を回収し、そしてＧＵＳ抽出用緩衝液で抽出する。ＧＵＳ活性は、Ｒ．Ａ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７）のプロトコールに従って蛍光分析法により測定する。トウモロコシＢＭＳ培養物からの安定な形質転換体を回収するためには原型質体をｐＦＦ１９Ｋ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする選択用遺伝子マーカーを含む）およびｐＣＤ２２１ＢもしくはｐＡＣ４００と同時に形質転換させる。形質転換後には原型質体を、フィーダー細胞を含む培地の上に置かれたミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルター上で培養する。１週間後に原形質体培養物を、フィーダー細胞および１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む培地に移す。原形質体培養物は耐性カルスが可視されるようになるまで１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む新鮮なＭＳ培地に移す。個々のカナマイシン耐性カルスを拾い上げ、そしてカナマイシンの存在下で更に２〜３週間増殖させる。カナマイシン−耐性カルスをＲ．Ａ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７）のプロトコールに従ってＸ−Ｇｌｕｃで染色させるかもしくはＭＵＧと共にアッセイしてＧＵＳ−陽性カルスのためのスクリーニングを行う。ＧＵＳを発現するとして同定されたカルスを抽出用緩衝液で粉砕し、そしてアッセイし；ＧＵＳ活性を蛍光分光法により測定する。これらの実験からのデータが図４および５に示される。イミダゾリノン除草剤に対する耐性を付与し、かつトウモロコシａｌｓ２プロモーターにより誘導される突然変異体トウモロコシＡＨＡＳ遺伝子が、ＢＭＳとＡ１８８×Ｂ７３細胞およびイネ細胞との両方の形質転換後にトランスジェニックカルスを取得するための選択用マーカーとして用いられる。この結果により、ａｌｓ２プロモーターがマーカー遺伝子発現を誘導させるのに十分な高レベル発現を誘導させるという概念が支持される。インサイチューハイブリダイゼーションスライドは本質的にはＪ．Ａ．Ｌａｎｇｄａｌｅら（１９８８）により記載される要領により調製する。組織を４％ホルムアルデヒド内で固定し、エタノール中で脱水し、キシレンで洗浄し、そしてパラフィン中に包埋する。組織を８〜１０μｍの切片にスライスし、そしてポリ−Ｌ−リシンでコートしたスライド上にのせる。パラフィンをキシレンで除去し、そしてエタノール中で洗浄し、そして水中ですすぐことにより組織を再水和させる。ＲＮＡプローブを、ａｌｓ２をコードする領域からの１７２ヌクレオチド（ｎｔ）断片およびＳＳＵコーディング領域からの３９２ｎｔ断片の両鎖（＋および−）からＡｍｂｉｏｎＭａｘｉｓｃｒｉｐｔ（商標）キットを用いて調製する。スライドをＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚら（１９８８）のプロトコールに従い、５０℃で一晩、ＳＰＢ［１００μｌの１０×塩（３ＭＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ６．８、５０ｍＭのＤＴＡ）；４００μｌのホルムアミド；２００μｌの５０％硫酸デキストラン；４０μ ｌの１０ｍｇ／ｍｌｔＲＮＡ；１０μｌの１ＭＤＴＴ；５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌポリＡ］の１：４希釈物中、５０％ホルムアルデヒドおよび１０ｍＭのＤＴＴ中、８０℃で３０秒間変性させたプローブを用いてハイブリダイズさせる。スライドを２×１５分間洗浄用緩衝液（ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ）（１×塩、５０％ホルムアミド、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８、１ｍＭＥＤＴＡ、および１０ｍＭＤＴＴ）中、５０℃下で洗浄し、ＲＮａｓｅＡ（ＮＴＥ中の２０μｇ／ｍｌ）で３０分間、３７℃下で処理し、総計１時間、３７℃下でＮＴＥ緩衝液中で５回洗浄し、５０℃下、洗浄用緩衝液（ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ）中で２×３０分間洗浄し、エタノール中で脱水させ、そして空気乾燥させる。スライドは、予め３７℃に暖めておいた乳液中に浸し（暗室内での作業）、３０分〜１時間乾燥させ、そして現像するまで４℃下、暗所に保存する。スライドは２分間の現像にかけ、水中で洗浄し、少なくとも５分間固定させ、そして再度水中ですすぐ。組織をアルシエンブルー（ＡｌｃｉｅｎＢｌｕｅ）で染色し、そしてエタノールおよびキシレン中で脱染色させる。ペルマウント（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ）での封入後、暗視野顕微鏡を用いて組織を観察する。図６〜８のインサイチュウハイブリダイゼーション実験からのデータにより、その遺伝子はトウモロコシ胚芽全体を通しても発現されることが示される。ＡＨＡＳプロモーターの発現を以下の事項により評定することが可能である：１．ａｌｓ２−ＧＵＳ融合遺伝子を構築し、そしてトランスジェニックトウモロコシおよびイネ植物内でのＧＵＳ活性のパターンを決定する。トウモロコシプロモーターを用いる以前の調査により、イネにおけるトウモロコシプロモーター発現を評定することの実行可能性が既に示されている（ＪｕｎｋｏＫｙｏｚｕｋａら、１９９１）。トランスジェニック植物の選択後には組織化学的分析を、様々な発生段階の植物組織で実施して、組織特異性および細胞タイプ特異性の両方を決定する。この技術は、単子葉類および双子葉類の両方でのプロモーター活性を評定するのに一般的に用いられる。２．一過性発現アッセイは、ａｌｓ２−ＧＵＳ構築物の形質転換後に様々な植物種から調製された原形質体について実施される。このアプローチを用いて異種である種において機能する様々なプロモーターの能力を評定する。原形質体を目的の構築物で形質転換させ、そしてそれをインキュベートして組込み遺伝子が発現されかつ蛋白質が蓄積するようにさせる。インキュベーション後には細胞をそのトランスジーンによりコードされる蛋白質の存在についてアッセイしてトランスジーン発現を誘導させるプロモーターの効率を決定する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年９月３日【補正内容】請求の範囲１．植物における遺伝子発現のためのＡＨＡＳプロモーターおよび、ある異種遺伝子をコードする配列を含む、単離されたヌクレオチド配列。２．植物における遺伝子発現のためのＡＨＡＳプロモーターおよび、ある異種遺伝子をコードする配列を含み；ＡＨＡＳプロモーターがトウモロコシのａｌｓ１およびａ１ｓ２の遺伝子のためのプロモーターから選択される、単離されたヌクレオチド配列。３．植物における遺伝子発現のためのＡＨＡＳプロモーターおよび、ある異種遺伝子をコードする配列を含み；ＡＨＡＳプロモーターが：（ａ）図１、配列番号１の配列を含む請求の範囲１のヌクレオチド配列；（ｂ）図２、配列番号２の配列を含む請求の範囲１のヌクレオチド配列；もしくは（ｃ）図３、配列番号３の配列を含む請求の範囲１のヌクレオチド配列、から選択される、単離されたヌクレオチド配列。４．植物における遺伝子の発現のためのＡＨＡＳプロモーターおよび、ある異種遺伝子をコードする配列を含み；ＡＨＡＳプロモーターがトウモロコシにおけるａｌｓ２のためのプロモーターである、単離されたヌクレオチド配列。５．プロモーター配列が単子葉類から取得される、請求の範囲１の配列。６．プロモーター配列がトウモロコシから取得される、請求の範囲１の配列。７．請求の範囲１、２、３、４、５、もしくは６のヌクレオチド配列を含む、形質転換用ベクター。８．請求の範囲７のベクターを含む植物細胞。９．請求の範囲１、２、３、４、５、もしくは６のヌクレオチド配列を含む成熟した植物。１０．ある植物において高レベルで、かつ前記植物の様々な組織内に、ある異種遺伝子を発現させる、前記植物中で請求の範囲１、２、３、４、５、もしくは６のヌクレオチド配列を発現させることを含む方法。１１．請求の範囲１、２、３、４、５、もしくは６の配列を含む核酸構築物。１２．ヌクレオチド配列の異種遺伝子が選択用のトランスジェニック物質に対する耐性を付与することが可能な突然変異体遺伝子である、請求の範囲１１の核酸構築物。１３．ヌクレオチド配列の異種遺伝子がＡＨＡＳ遺伝子である、請求の範囲１２の核酸構築物。１４．選択用マーカーとして核酸構築物を使用し、その核酸構築物が、請求の範囲１２の構築物であり：（ａ）核酸構築物を挿入することにより、ある植物物質を組換え的に形質転換させる段階；（ｂ）ある化合物を含む増殖培地にその植物物質を入れる段階；（ｃ）その化合物の存在下での増殖が可能な植物物質を同定する段階、を含む方法。１５．突然変異体遺伝子がＡＨＡＳ遺伝子である、請求の範囲１４の方法。１５．化合物がイミダゾリノンもしくはスルホニル尿素化合物である、請求の範囲１４の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ペング，ジアニイングアメリカ合衆国ニユージヤージイ州08648 ローレンスビル・イーストンコート19

Claims

【特許請求の範囲】１．植物における遺伝子の発現のためのＡＨＡＳプロモーターを含む、単離されたヌクレオチド配列。２．図１、配列番号１の配列を含む、請求の範囲１のヌクレオチド配列。３．図２、配列番号２の配列を含む、請求の範囲１のヌクレオチド配列。４．図３、配列番号３の配列を含む、請求の範囲１のヌクレオチド配列。５．植物が単子葉類である、請求の範囲１、２、３、もしくは４のヌクレオチド配列。６．単子葉類がトウモロコシである、請求の範囲５の配列。７．請求の範囲１、２、３、４、もしくは５のヌクレオチド配列を含む、形質転換用ベクター。８．請求の範囲７のベクターを含む植物細胞。９．請求の範囲１、２、３、４、もしくは５のヌクレオチド配列を含む成熟した植物。１０．ある植物において高レベルで、かつ前記植物の様々な組織内に、ある異種遺伝子を発現させる、前記植物中で異種遺伝子を請求の範囲１、２、３、もしくは４のヌクレオチド配列の制御下で発現させることを含む方法。１１．ある異種遺伝子に連結された請求の範囲１、２、３、もしくは４の配列を含む核酸構築物。１２．遺伝子がＡＨＡＳ遺伝子である、請求の範囲１１の核酸構築物。１３．選択用マーカーとして核酸構築物を使用し、その構築物が、ある突然変異体遺伝子に連結された請求の範囲１、２、３、もしくは４のＡＨＡＳプロモーター配列を含み、その遺伝子が選択的トランスジェニック物質に対する耐性を付与し：（ａ）核酸構築物を挿入することにより、ある植物物質を組換え的に形質転換させる段階；（ｂ）ある化合物を含む増殖培地にその植物物質を入れる段階；（ｃ）その化合物の存在下での増殖が可能な植物物質を同定する段階、を含む方法。１４．突然変異体遺伝子がＡＨＡＳ遺伝子である、請求の範囲１３の方法。１５．化合物がイミダゾリノンもしくはスルホニル尿素化合物である、請求の範囲１３の方法。