JPH10504968A - 植物に導入された遺伝子の発現のためのアセトヒドロキシ酸シンターゼプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、異種遺伝子発現性植物のためのプロモーターとして有用な単離された非コーディングヌクレオチド配列に関する。本発明は更に、その単離されたヌクレオチド配列を含むベクターおよび植物細胞にも関する。トウモロコシからのＡＨＡＳプロモーターを用いて、高レベルかつ様々な植物組織内で、組込み遺伝子が発現される。トウモロコシのａｌｓ１およびａｌｓ２の遺伝子からのプロモーターのクローン化および配列決定を行い、その後にそれらの遺伝子からのプロモーター領域を、あるプラスミドの５’端に組込ませ、その後にはレポーター遺伝子であるベーターグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が続くようにさせる。両プロモーター断片共ＸＩ１２トウモロコシ株からのものである。ａｌｓ１プロモーター断片は約１４００塩基対の長さである一方で、ａｌｓ２プロモーター断片は８１９塩基対を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 植物に導入された遺伝子の発現のためのアセドヒドロキシ酸シンターゼプロモー ター 発明の分野 本発明は、植物における異種遺伝子発現のためのプロモーターとして有用な単 離された非コーディングヌクレオチド配列に関する。本発明は更に、その単離さ れたヌクレオチド配列を含むベクターおよび植物細胞にも関する。 発明の背景 植物界は２つの門、すなわちコケ植物（Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ）および維管束植 物（Ｔｒａｃｈｅｏｐｈｙｔａ）に分類される。維管束植物門には２６６，００ ０を越える種が含まれており、それらは４つの亜門に大別される。亜門シダ類に は被子植物（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ）綱が含まれる。この綱は２つの亜綱、 すなわち双子葉類（ｄｉｃｏｔｓ）および単子葉類（ｍｏｎｏｃｏｔｓ）に分類 される。 単子葉類には多くの重要な穀類および飼料作物が含まれるため、植物遺伝学者 はトランスジェニック単子葉類を産生することを可能にすることに興味の的を集 中させている。約５０，０００種の単子葉類が知られている。これらには、ユリ 、ヤシ、ラン、アヤメ、チューリップ、スゲ、および牧草類が含まれる。牧草類 には、トウモロコシ、小麦、イネ、および他の全ての穀物食品作物が含まれる。 不幸なことに単子葉類を遺伝子工学的に作製することには極度な困難が伴い、そ の結果、植物を用い る大半の研究は双子葉類について実施されている。 双子葉類は前記２群の内では大きいほうのものであり、約２００，０００種が 知られている。キンポウゲ、キンギョソウ、カーネーション、モクレン、ケシ、 キャベツ、バラ、エンドウ、ポインセチア、ワタ、サボテン、ニンジン、コケモ モ、ハッカ、トマト、ヒマワリ、ニレ、オーク、およびカエデは２５０科の双子 葉類の内の代表的な１９科である。 ＤＮＡ分子内に含まれる遺伝子情報が多数の短めのＲＮＡ分子の合成のための 鋳型として通常は作用し、それらＲＮＡ分子の内の大半のものが次には特定のポ リペプチド鎖の合成のための鋳型として作用する。特定のヌクレオチドセグメン ト（プロモーターと称されることが良くある）はＲＮＡポリメラーゼ分子により 認識され、このＲＮＡポリメラーゼ分子がＲＮＡ合成を開始させる。機能的ＲＮ Ａ鎖の転写が終了した後には第２種類目のシグナルによりＲＮＡ合成の停止、な らびに各ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡポリメラーゼ分子の脱離がもたらされる。 多数の共通プロモーターが存在し、それらは最近は単子葉類植物における異種 遺伝子発現を誘導させるのに用いられている。 Ｄａｖｉｄ ＭｃＥｌｒｏｙら（１９９０）は、イネアクチン１遺伝子（Ａｃ ｔ１）からのプロモーターが細菌性β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）に融 合させてある構築物の形質転換イネ原形質体内での一過性発現アッセイにより、 そのアクチンプロモーターが高レベルの遺伝子発現を誘導させることが示された ことを記載した。この発現はトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝 子（Ａｄｈ１）プロモーターに関して観察されるものの約６倍大きいものであっ た上に、完全なＡｃｔ１ ５’イントロンの存在に依存する。 Ｄａｖｉｄ ＭｃＥｌｒｏｙら（１９９１）は、単子葉類の形質転換のために 至適化させたベクターを、カリフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗ ｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターかＡｃｔ１ プロモーターかのいずれかを用いて構築したことを記述した。一過性発現アッセ イは、形質転換させたイネとトウモロコシの原形質体の両方について実施された 。Ａｃｔ１イントロンおよび至適化させたＧＵＳ翻訳開始部位をいずれかのプロ モーター配列に添加することにより遺伝子発現が有意に増大した。アクチンプロ モーターは、小麦、カラス麦、大麦、およびモロコシの原型質体の一過性アッセ イにおいてＧＵＳ発現を誘導させることが示されたことが非公開結果として記載 されてもいる。 Ｗａｎｇｇｅｎ Ｚｈａｎｇら（１９９１）は、Ａｃｔ１−ＧＵＳ遺伝子融合 体を保持するトランスジェニックイネ植物のインサイチュウーハイブリダイゼー ション調査により、Ａｃｔ１プロモーターが無性栄養性かつ再生性の両方を兼ね 備えた組織では構成性発現パターンを有することが示されたことを記載した。 Ｊｕｎ Ｃａｏら（１９９２）は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターもしくはイ ネのＡｃｔ１プロモーターのいずれかの制御下で発現されるｂａｒ遺伝子での形 質転換の後にトランスジェニックイネ植物をバイアロフォス（ｂｉａｌｏｐｈｏ ｓ）上で選択した。 Ａｌｅｎ Ｈ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９２）は、トウモロコシのＵ ｂｉ−１−ＣＡＴ遺伝子融合物で形質転換させたトウモロコシ原形質体は、一過 性発現アッセイではＣａＭＶ−３５Ｓ−ＧＵＳ遺伝子融合物で形質転換させたト ウモロコシ細胞より約１０倍高いレベルのＣ ＡＴ活性を示すことを記載した。トウモロコシ苗木の熱ショックの後のＵｂｉ− １およびＵｂｉ−２の転写レベルのノザンブロット分析により、両遺伝子共２５ ℃では構造的に発現されたが、熱ショック後には誘導を受けることが示された。 Ｓｅｉｉｃｈｉ Ｔｏｋｉら（１９９２）は、安定に形質転換されたトランス ジェニックイネ植物が、トウモロコシＵｂｉ−１プロモーターの制御下で発現さ れるｂａｒ遺伝子の電気穿孔法媒介性形質転換、およびバイアロフォス（ｂｉａ ｌｏｐｈｏｓ）上での選択の後に取得されたことを記載した。この結果により、 Ｕｂｉ−１プロモーターを用いてイネにおける効率的な高レベル遺伝子発現を誘 導させて、結実能力のあるトランスジェニックイネ植物の選択および再生を可能 にすることができることが示される。 Ｊ．Ｔｒｏｙら（１９９３）は、安定に形質転換された小麦植物が、未成熟胚 芽に由来するカルスの、ｂａｒ遺伝子およびＧＵＳ（これら各々はトウモロコシ Ｕｂｉ−１プロモーターの制御下で発現される）の両方での衝撃法、ならびにそ れに続くバイアロフォス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）上での選択の後に取得されたこ とを記載した。この結果により、Ｕｂｉ−１プロモーターを用いて小麦における 効率的な高レベル遺伝子発現を誘導させて、結実能力のあるトランスジェニック 植物の選択および再生を可能にすることができることが示される。 Ｙｕｅｃｈｅｎ ＷａｎおよびＰｅｇｇｙ Ｇ．Ｌｅｍａｕｘ（１９９４）は 、胚芽性大麦組織の、ｂａｒ遺伝子およびＧＵＳ（これら各々はトウモロコシＵ ｂｉ−１プロモーターの制御下で発現される）の両方での微小砲弾衝撃法、なら びにそれに続くバイアロフォス（ｂｉａｌｏ ｐｈｏｓ）上での選択の後には、安定に形質転換された結実能力のある大麦植物 が取得されたことを記載した。この結果により、Ｕｂｉ−１プロモーターを用い て大麦における効率的な高レベル遺伝子発現を誘導させて、結実能力のあるトラ ンスジェニック植物の選択および再生を可能にすることができることが示される 。Ｕｂｉ−ｂａｒもしくはＣａＭＶ ３５Ｓ−ｂａｒのいずれかを用いる少数植 物の衝撃法に関わる実験によっては、取得される形質転換体の数に有意な差異は 全く示されなかった。 Ｊｕｎｋｏ Ｋｙｏｚｕｋａら（１９９１）は、トウモロコシＡｄｈ１プロモ ーター−ＧＵＳ融合物をイネ原型質体に組込ませてトランスジェニックイネ植物 を取得したことを記載した。このトランスジェニック植物内でのＧＵＳ活性を調 査してＧＵＳ発現パターンを決定した。トウモロコシＡｄｈ１プロモーターは調 査した植物の全部位において構成的発現を亢進することが見いだされている。ト ウモロコシにおけるＡｄｈ１発現について既に示されているように、Ａｄｈ１に より誘導されるＧＵＳ発現は根においては嫌気条件により誘導された。 Ｄ．Ｉ．Ｌａｓｔら（１９９１）は、トウモロコシＡｄｈ１プロモーターを、 トウモロコシＡＤＨ１遺伝子の嫌気応答性因子（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｒｅｓｐ ｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）およびアグロバクテリウム ツメファキエンス （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のオクトピンシンタ ーゼ遺伝子からのｏｃｓ因子の多重コピー（ｐＥｍｕ）の添加により改変させた ことを記述した。ｐＥｍｕ−ＧＵＳで形質転換させた様々な単子葉種の原形質体 の一過性発現アッセイでは、最善の構築物により、小麦、トウモロコシ、イネ、 アイルコ ルン、およびロリウム ムルティフロルム（Ｌｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒ ｕｍ ）においてはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターと比較すると１０〜５０倍高い レベルの発現が得られた。 Ｒｏｂｅｒｔ ＢｏｗｅｒおよびＲｏｂｅｒｔ Ｇ．Ｂｉｒｃｈ（１９９２） は、安定な形質転換体が、サトウキビの胚芽性カルスの、Ｅｍｕプロモーターの 制御下にあるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子での形質転換後に取 得されたことを記載した。 Ｄ．Ａ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら（１９９４）は、Ｅｍｕプロモーターを用 いて、小麦とイネとの両方に形質転換された４つの異なる選択用マーカー遺伝子 （ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフ ェラーゼ、ホスフィノトリシン Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、および除草 剤耐性を付与する突然変異体アセトラクタートシンターゼ）の発現を誘導させた ことを記載した。小麦カルスおよび形質転換させたイネ植物は形質転換体の選択 の後に取得され、このことによりこのプロモーターを用いて選択用マーカー遺伝 子の発現を誘導させて形質転換穀物食品を取得することができることが示される 。 トランスジェニック穀物食品において外来性遺伝子発現を制御するのに用いら れるプロモーター因子の総説が最近発行されており、そしてこれは引用により本 明細書に取り込まれる（ＭｃＥｌｒｏｙ ａｎｄ Ｂｒｅｔｔｅｌ、１９９４） 。 多数のプロモーターが現在では双子葉類植物の形質転換のために用いられてい る。これらのプロモーターは様々な異なる源から取得される。共通に用いられる 、ある種のプロモーターがアグロバクテリウム ツメファキエンス（Ａｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ） から単離されており、このアグロバクテリウムではそれらのプロモーターは、感 染中にその植物ゲノム内に組み込まれるＴ−ＤＮＡセグメント上に保持されるオ ピンシンターゼ遺伝子の発現を誘導するように機能する。これらのプロモーター には、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）プロモーター（Ｌ．Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｃ．Ｗａｌｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８５）、マンノピ ンシンターゼ（ｍａｓ）プロモーター（Ｌ．Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．、１９８ ５；Ｋ．Ｅ．ＭｃＢｒｉｄｅ ａｎｄ Ｋ．Ｒ．Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、１９９ ０）、ならびにノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーター（Ｍ．Ｗ．Ｂｅｖａ ｎ ｅｔ ａｌ．、１９８３；Ｌ．Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．、１９８３、Ｒ．Ｔ．Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、１９８３、Ｍ．Ｄｅ Ｂｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、１９８４、Ｒ．Ｈａｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９８ ５）が含まれる。これらのプロモーターは多種多様な植物組織中で活性を示す。 幾つかのウイルス性プロモーターを用いても双子葉類における異種遺伝子発現 は誘導される（Ｊ．Ｃ．Ｋｒｉｄｌ ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ、１９８ ６）。カリフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ） ３５Ｓプロモーターは双子葉類の形質転換のために最も頻繁に 用いられるプロモーターの内の一つであり、それはそのプロモーターがほぼ全て の組織において高レベルの遺伝子発現を付与するためである（Ｊ．Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、１９８５；Ｄ．Ｗ．Ｏｗ ｅｔ ａｌ．、１９８６；Ｄ．Ｍ．Ｓ ｈａｈ ｅｔ ａｌ．、１９８６）。２つの並列３５Ｓ プロモーター（Ｒ．Ｋ ａｙ ｅｔ ａｌ．、１９８７）、およびｍａｓ−３５Ｓ プロモータ ー（Ｌ．Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ、１９９０）（これは、その３５Ｓプロモータ ーと並列になっているマノピンシンターゼプロモーターからできている）を含む 配置を初めとするこれらのプロモーターの改変物も用いられている。これらの両 プロモーターは単一コピーの３５Ｓ プロモーターよりも一層高いレベルの遺伝 子発現を誘導させる。既に用いられている他のウイルス性プロモーターには、カ リフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒ ｕｓ）１９Ｓプロモーター（Ｊ．Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、１９８ ４；Ｅ．Ｂａｌａｚｓ ｅｔ ａｌ．）およびゴマノハグサモザイクウイルスか らの３４Ｓ プロモーター（Ｍ．Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９０）が含 まれる。 多数の植物におけるＡＨＡＳ発現の調査により、ＡＨＡＳは全ての植物組織内 で発現されることが示されている。Ｇａｉｌ ＳｃｈｍｉｔｔおよびＢｉｊａｙ Ｋ．Ｓｉｎｇｈ（１９９０）は、ライママメの様々な組織において実施された 酵素アッセイによりＡＨＡＳ活性が、葉、茎、根、花、莢、および分裂組織を初 めとする検査した全組織に存在することが示されたことを記載した。ＡＨＡＳ活 性は茎内でははぼ一定であるが、葉、根、および分裂組織では加齢と共に減少す ることが見いだされた。 Ｓｈａｒｏｎ Ｊ．Ｋｈｅｅｌｅｒら（１９９３）は、タバコがアセトヒドロ キシ酸シンターゼをコードする２本の遺伝子、ＳｕｒＡおよびＳｕｒＢを含むこ とを記載した。両遺伝子共全種の組織において発現されるらしく、ただし違う組 織における発現レベルには約４倍の差が見られた。発達中の器官が最高レベルの 発現を示すようである。インサイチュ ーハイブリダイゼーション調査では、最高レベルの発現は代謝的に活性な細胞も しくは迅速に分裂している細胞に一貫して観察されたことが示された。ＳｕｒＢ は調査を行った全組織中でＳｕｒＡよりも高いレベルで発現された。 Ｔｈｅｒｅｓｅ Ｏｕｅｌｌｅｔら（１９９２）は、アブラナ（ブラシカ（Ｂ ｒａｓｓｉｃａ ））種はアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする多重遺伝子 族を含むことを記載した。５本のＡＨＡＳ遺伝子の内の４本がブラシカ ナプス （Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）において既に同定されている。遺伝子特異的 プローブを用いるリボヌクレアーゼプロテクション法（ＲＮＡｓｅ ｐｒｏｔｅ ｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を実施して様々なブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種に おける遺伝子族の内の異なるメンバーの発現パターンを決定した。それらの遺伝 子の内の２本、ＡＨＡＳ１よびＡＨＡＳ３が、調査した全組織において構成的に 発現されることが見いだされた。ＡＨＡＳ２転写物は再生性組織および種子の胚 体外組織内にのみ検出された。４番目の遺伝子ＡＨＡＳ４によりコードされる転 写物は検出されず、そしてそのためこの遺伝子は偽遺伝子であると考えられる。 Ｄａｌａ Ｌ．ＳｈａｎｅｒおよびＮ．Ｍｏｏｒｔｈｙ Ｍａｌｌｉｐｕｄｉ （１９９１）は、トウモロコシの若葉と、懸濁培養物として成長させたＢＭＳ細 胞との比較により、新鮮グラム重量当たりのＢＭＳ細胞の活性はその若葉試料に おけるものよりも約５．８倍高かったことが示されたと記載した。ＢＭＳ細胞は 活発に分裂しているため、この結果は、より若く、活発に分裂している組織の方 が、年長組織よりも高いＡＨＡＳ活性を示すという、タバコおよびライママメに 関する以前の研究 の結果と一致する。 発明の要約 トウモロコシからのＡＨＡＳプロモーターを用いて高レベルかつ様々な植物組 織内で組込み遺伝子を発現させた。トウモロコシのａｌｓ１およびａｌｓ２遺伝 子からのプロモーターのクローン化および配列決定を行い（図１、図２、図３） 、そしてこれらの遺伝子からのプロモーター領域を、その後にプラスミドの５’ 端に組込ませ、その後にはレポーター遺伝子であるベーターグルクロニダーゼ（ ＧＵＳ）が続くようにさせた。両方のプロモーター断片はＸＩ１２トウモロコシ 株からのものである。ａｌｓ１プロモーター断片は約１４００塩基対の長さであ る一方で、ａｌｓ２プロモーター断片は８１９塩基対を含む。ＡＨＡＳプロモー ターの活性を決定するためには、その後にキメラプラスミドを、トウモロコシ ブラックメキシカンスイード（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ Ｓｗｅｅｔ）の原 形質体およびイネの原形質体内に、一過性発現レベルの分析の目的で組込ませた 。比較の目的では原型質体を更に、そのＧＵＳレポーター遺伝子を誘導させるＣ ａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含むプラスミドでも形質転換させた。トウモロコ シ細胞中でのキメラプラスミドの発現は、ＧＵＳ酵素活性を分析することにより 決定する。トウモロコシのａｌｓ２プロモーターの活性は、両種の細胞において 、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの活性に等しいか、もしくはそれを上回ってい た（図４）。図５は、ｐＣＤ２２１Ｂ（ａｌｓ２−ＧＵＳ−ｏｃｓターミネータ ープラスミド）もしくはｐＡＣ４００（ＣａＭＶ ３５Ｓ−ＧＵＳ−ｏｃｓター ミネータープラスミド）のいずれかで安定に形質転換させたトウモロコシＢＭＳ 細胞株において実施したベーターグルクロニダ ーゼアッセイの結果を示す。植物組織に対する放射ラベル化ＲＮＡプローブのイ ンサイチューハイブリダイゼーションによるＡＨＡＳ ｍＲＮＡ分布の分析によ り、トウモロコシＡＨＡＳプロモーターは大半の植物部位において活性を示すこ とが示される（図６、図７、図８）。 アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＡＨＡＳプロモーターの活性は 、アグロバクテリウム ツメファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ ｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）を用いて安定に形質転換させたアラビドプシス（Ａｒａｂ ｉｄｏｐｓｉｓ ）植物内で分析される。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ ｓ ）のＡＨＡＳ遺伝子の上流プロモーター領域をＧＵＳレポーター遺伝子に融合 させ、二重ベクターｐＢＩＮ１９内に組み込ませ、そしてアラビドプシス（Ａｒ ａｂｉｄｏｐｓｉｓ ）を形質転換させるのに用いる。形質転換させた植物の分析 により大半の植物部位においてＧＵＳ発現（プロモーター活性を指示するもの） が示される。 図面の簡単な説明 図１は、トウモロコシＸＡ１７からのＡＨＡＳプロモーター配列ＡＬＳ１を表 す。 図２は、トウモロコシＸＡ１７からのＡＨＡＳプロモータ配列ＡＬＳ２を表す 。 図３は、トウモロコシＸＩ１２からのＡＨＡＳプロモーター配列ＡＬＳ２を表 す。 図４は、ｐＣＤ２２１Ｂ（ａｌｓ２−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＧＵＳ−ｏｃｓター ミネータープラスミド）もしくはｐＡＣ４００（ＣａＭＶ ３５Ｓ−ＧＵＳ−ｏ ｃｓ ターミネータープラスミド）での形質転換後のブ ラックメキシカンスイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ Ｓｗｅｅｔ）トウモ ロコシ細胞もしくはイネ懸濁細胞の原形質体の一過性アッセイからのベーターグ ルクロニダーゼ活性を表す棒グラフである。ＧＵＳ活性はピコモル／分／ｍｇ蛋 白質として算出される。結果は３回の独立した実験からのものである。 図５は、ｐＣＤ２２１Ｂ（ａｌｓ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＧＵＳ−ｏｃｓター ミネーター）もしくはｐＡＣ４００（ＣａＭＶ ３５Ｓ−ＧＵＳ−ｏｃｓターミ ネーター）のいずれかでの形質転換後の安定に形質転換されたブラックメキシカ ンスイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ Ｓｗｅｅｔ）細胞におけるベーター グルクロニダーゼ活性を表す棒グラフである。ＣＫは形質転換させていない対照 組織を表す。ＧＵＳ活性はピコモル／分／ｍｇ蛋白質として算出される。 図６ − 放射性ラベル化ＲＮＡプローブを用いる２週令のトウモロコシの苗 木からの葉輪生のインサイチューハイブリダイゼーション調査。組織切片を調製 し、そしてＡＨＡＳセンス鎖（ＡＨＡＳ−）もしくはＡＨＡＳアンチセンス鎖（ ＡＨＡＳ＋）のいずれかをコードするＲＮＡプローブにハイブリダイズさせた。 比較の目的で、ＳＳＵ（ＲＵＢＩＳＣＯ小サブユニット）のセンス鎖（ＳＳＵ− ）もしくはＳＳＵのアンチセンス鎖（ＳＳＵ＋）プローブも用いた。各場合共、 アンチセンス鎖（＋）のみが組織内に存在するｍＲＮＡにハイブリダイズするこ とが予期される。ａ）ＳＳＵ＋プローブ；ｂ）ＳＳＵ−プローブ；ｃ）ＡＨＡＳ ＋プローブ；ｄ）ＡＨＡＳ−プローブ。 図７ − 図６について記載される要領で調製された授粉後１２日目のトウモ ロコシ殻粒のインサイチューハイブリダイゼーション調査；ａ） 胚芽および胚柄、ＡＨＡＳ＋プローブ；ｂ）胚芽および胚柄、ＡＨＡＳ−プロー ブ；ｃ）果皮、アリューロン、および内胚乳、ＡＨＡＳ−プローブ；ｄ）果皮、 アリューロン、および内胚乳、ＡＨＡＳ＋プローブ。 図８ − 図６に記載される要領で調製された若いトウモロコシ植物の頂端分 裂組織のインサイチューハイブリダイゼーション調査。ａ）およびｂ）ＡＨＡＳ ＋プローブ；ｃ）およびｄ）ＡＨＡＳ−プローブ。 発明の詳細な記述 科学者たちは植物に所望される特徴を付与するための遺伝子的改変を用いるた めの方法を探索している。例えば、味、基本的構造、サイズ、害虫耐性および除 草剤耐性、色、酸性度、もしくは食品用穀類の甘さなどの特徴を改善するのに用 いられる遺伝子工学技術が、雑種形成という通常の方法と比較して一層迅速な手 法として探索されている。 本発明はトウモロコシおよびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｉｐｓｉｓ）から のＡＨＡＳプロモーター、ならびにそれらのプロモーターを含むベクターおよび 植物細胞に関する。（本出願の目的のためには、プロモーターはＲＮＡポリメラ ーゼの結合のためのシグナルとして作用する遺伝子の上流に見いだされるヌクレ オチド配列として特定される）。トウモロコシのａｌｓ１およびａｌｓ２遺伝子 のクローン化および配列決定を行い、そしてその後にそれらの遺伝子からのプロ モーター領域をプラスミドの５’端に組込ませ、その後にはＧＵＳレポーター遺 伝子が連続するようにさせた。この出願の目的では、レポーター遺伝子は目的の プロモーターの下流で融合されるヌクレオチド配列として特定され、その結果そ のプロモーターで開始する転写はそのレポーター遺伝子を通過して進行する。レ ポーター遺伝子は幾つかの容易に測定できる酵素活性 をコードしており；例えば本発明では、トウモロコシ細胞内のキメラプラスミド の発現はベーターグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）酵素活性を分析することにより決 定される。 当業者は、ＡＨＡＳプロモーターは多くの異なる植物組織内でかなり高い活性 を示し、かつ様々な植物内で新規遺伝子を発現するのに用いることができるとい うことを認識すべきである。新規遺伝子には、除草剤耐性、解毒作用、および植 物の病原体に対する耐性のための遺伝子が含まれるが、これらには限定されない 。 特許請求されるプロモータを単子葉類における異種遺伝子発現用に用いること ができ、それらの単子葉類とは、トウモロコシ、イネ、小麦、大麦、モロコシ、 カラス麦、ライ麦、およびキビを初めとするものであるが、これらには限定され ない。当業者は、特許請求されるプロモーターは更に双子葉類における発現をも 誘導させるであろう一方で、双子葉類における単子葉類プロモーターの発現は単 子葉類におけるものと比較すると低めのレベルになるであることが予測されるこ とも認識すべきである。 当業者はトウモロコシａｌｓ２プロモーターを用いて他の単子葉種内での遺伝 子発現を誘導させることができることを認識すべきである。例えば、イネＡｃｔ １プロモーターはトウモロコシの原形質体における遺伝子発現を誘導させ、トウ モロコシＥｍｕプロモーターはトランスジェニック小麦、大麦、およびイネを選 択するのに既に用いられており、そして双子葉類のプロモーターであるアラビド プシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡＨＡＳプロモーターはトランスジェニック タバコおよびトランスジェニックイモにおけるＡＨＡＳ遺伝子発現を誘導させの に既に用 いられている。特許請求されるトウモロコシａｌｓ２はトウモロコシ内で至適状 態で作用するが、他の単子葉類における遺伝子発現も誘導させる。トウモロコシ および他の種において実施された調査に基づくと、このプロモーターは、ある植 物全体に存在する、ある遺伝子の構成的発現を誘導させるはずである。最高レベ ルの発現は、活発に分裂しているか、もしくは代謝的に活発な組織のいずれかに おいて観察される。 当業者に知られる様々な異なる技術は、微小砲弾衝撃法、ＰＥＧ−媒介性形質 転換、電気穿孔法、およびシリコン線維を初めとするが、これらには限定されず 、これらの技術は既に単子葉類穀物を形質転換させるのに用いられている。これ らの技術全ては、形質転換予定のヌクレオチド配列の輸送のためのＤＮＡベクタ ーの使用を必要とする。本発明の使用に適するベクターには、トランスジェニッ ク物質の選択のために用いられるマーカー遺伝子を保持するベクターが含まれる が、これには限定されず、またそのマーカー遺伝子は、ハイグロマイシン、カナ マイシン、バイアロフォス、ならびにイミダゾリノンおよびスルホニル尿素除草 剤に対する耐性を付与する遺伝子を初めとする。 以下に示す実施例は本発明を詳細に説明する目的でのみ用いられ、かついずれ かの方法においても本発明を制約するものとして見なされるものではない。 実施例 ａｌｓ１およびａｌｓ２プロモーターの効率は、トウモロコシおよびイネの原 形質体、もしくはそれらのプロモーター配列がＧＵＳ遺伝子に融合させてある構 築物を保持するトウモロコシ細胞株におけるＧＵＳ活性を測定することにより評 価される。ベクター調製および形質転換のプ ロトコールが以下に記載される。 キメラＣａＭＶ ３５Ｓ−ＧＵＳ、ａｌｓ１−ＧＵＳ、およびａｌｓ２−ＧＵ Ｓ遺伝子を含む構築物 プラスミドｐＡＣ４００は、１．７ｋｂのＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片（ＧＵＳ遺 伝子を含む）および７００ｂｐのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（オクトピンシンタ ーゼターミネーターを含む）の上流にクローン化されたＣａＭＶ ３５Ｓプロモ ーターの４１８塩基対（ｂｐ）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片の融合物を含むｐＵ Ｃ１９を基にするプラスミドである。ａｌｓ１およびａｌｓ２遺伝子はトウモロ コシ株ＸＩ１２から調製されるゲノムライブラリーをスクリーニングすることに より取得される。ａｌｓ１遺伝子のＡＴＧ開始コドンから上流の１．４キロベー ス（ｋｂ）の配列を含むＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片をＣａＭＶ ３５Ｓプロモー ターの代わりにｐＡＣ４００内にサブクローン化してｐＣＤ２２３Ｂを作製する 。ａｌｓ２のＡＴＧから上流の８１９ｂｐのＰｓｔＩ−ＮｃｏＩ断片をＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔ（商標） ＫＳ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内の同一のＧＵＳ− ｏｃｓターミネーター融合物の前にサブクローン化してｐＣＤ２２１Ｂを作製し た。トウモロコシＸＩ１２からのａｌｓ２プロモーターの配列が図３に示される 。 イネおよびトウモロコシの原形質体の形質転換およびアッセイ 原型質体をイネ（ノルタイ（Ｎｏｒｔａｉ））もしくはトウモロコシ（ブラッ クメキシカンスイート（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ Ｓｗｅｅｔ；ＢＭＳ）） 懸濁細胞から単離し、そしてＬ．Ａ．Ｌｙｚｎｉｋら（１９８９）およびＪ．Ｙ ．Ｐｅｎｇら（１９９０）のＰＥＧ−媒介性形質転換プロトコールに従ってｐＡ Ｃ２２１ＢもしくはｐＡＣ４００で 形質転換させる。一過性アッセイのためには形質転換させたイネの原形質体をフ ィーダー細胞を含む培地の上に置かれたミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィル ター上にのせ、そして形質転換されたＢＭＳ原形質体を３ｍｌの液体培地中で培 養する。形質転換後２日目に原形質体培養物を回収し、そしてＧＵＳ抽出用緩衝 液で抽出する。ＧＵＳ活性は、Ｒ．Ａ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７）のプロ トコールに従って蛍光分析法により測定する。 トウモロコシＢＭＳ培養物からの安定な形質転換体を回収するためには原型質 体をｐＦＦ１９Ｋ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする選択用 遺伝子マーカーを含む）およびｐＣＤ２２１ＢもしくはｐＡＣ４００と同時に形 質転換させる。形質転換後には原型質体を、フィーダー細胞を含む培地の上に置 かれたミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルター上で培養する。１週間後に原 形質体培養物を、フィーダー細胞および１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む培 地に移す。原形質体培養物は耐性カルスが可視されるようになるまで１００ｍｇ ／ｌのカナマイシンを含む新鮮なＭＳ培地に移す。個々のカナマイシン耐性カル スを拾い上げ、そしてカナマイシンの存在下で更に２〜３週間増殖させる。カナ マイシン−耐性カルスをＲ．Ａ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７）のプロトコー ルに従ってＸ−Ｇｌｕｃで染色させるかもしくはＭＵＧと共にアッセイしてＧＵ Ｓ−陽性カルスのためのスクリーニングを行う。ＧＵＳを発現するとして同定さ れたカルスを抽出用緩衝液で粉砕し、そしてアッセイし；ＧＵＳ活性を蛍光分光 法により測定する。 これらの実験からのデータが図４および５に示される。 イミダゾリノン除草剤に対する耐性を付与し、かつトウモロコシａｌ ｓ２ プロモーターにより誘導される突然変異体トウモロコシＡＨＡＳ遺伝子が、 ＢＭＳとＡ１８８×Ｂ７３細胞およびイネ細胞との両方の形質転換後にトランス ジェニックカルスを取得するための選択用マーカーとして用いられる。この結果 により、ａｌｓ２プロモーターがマーカー遺伝子発現を誘導させるのに十分な高 レベル発現を誘導させるという概念が支持される。 インサイチューハイブリダイゼーション スライドは本質的にはＪ．Ａ．Ｌａｎｇｄａｌｅら（１９８８）により記載さ れる要領により調製する。組織を４％ホルムアルデヒド内で固定し、エタノール 中で脱水し、キシレンで洗浄し、そしてパラフィン中に包埋する。組織を８〜１ ０μｍの切片にスライスし、そしてポリ−Ｌ−リシンでコートしたスライド上に のせる。パラフィンをキシレンで除去し、そしてエタノール中で洗浄し、そして 水中ですすぐことにより組織を再水和させる。ＲＮＡプローブを、ａｌｓ２をコ ードする領域からの１７２ヌクレオチド（ｎｔ）断片およびＳＳＵコーディング 領域からの３９２ｎｔ断片の両鎖（＋および−）からＡｍｂｉｏｎ Ｍａｘｉｓ ｃｒｉｐｔ（商標）キットを用いて調製する。スライドをＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚ ら（１９８８）のプロトコールに従い、５０℃で一晩、ＳＰＢ［１００μｌの１ ０×塩（３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ６．８、５０ｍＭのＤＴＡ ）；４００μｌのホルムアミド；２００μｌの５０％硫酸デキストラン；４０μ ｌの１０ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ；１０μｌの １ ＭＤＴＴ；５０μｌの１０ｍ ｇ／ｍｌ ポリＡ］の１：４希釈物中、５０％ホルムアルデヒドおよび１０ｍＭ のＤＴＴ中、８０℃で３０秒間変性させたプローブを用いてハイブリダイズさせ る。スラ イドを２×１５分間洗浄用緩衝液（Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）（１×塩、５０％ ホルムアミド、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１０ｍ Ｍ ＤＴＴ）中、５０℃下で洗浄し、ＲＮａｓｅ Ａ（ＮＴＥ中の２０μｇ／ｍ ｌ）で３０分間、３７℃下で処理し、総計１時間、３７℃下でＮＴＥ緩衝液中で ５回洗浄し、５０℃下、洗浄用緩衝液（Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）中で２×３０ 分間洗浄し、エタノール中で脱水させ、そして空気乾燥させる。スライドは、予 め３７℃に暖めておいた乳液中に浸し（暗室内での作業）、３０分〜１時間乾燥 させ、そして現像するまで４℃下、暗所に保存する。スライドは２分間の現像に かけ、水中で洗浄し、少なくとも５分間固定させ、そして再度水中ですすぐ。組 織をアルシエンブルー（Ａｌｃｉｅｎ Ｂｌｕｅ）で染色し、そしてエタノール およびキシレン中で脱染色させる。ペルマウント（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ）での封入 後、暗視野顕微鏡を用いて組織を観察する。 図６〜８のインサイチュウハイブリダイゼーション実験からのデータにより、 その遺伝子はトウモロコシ胚芽全体を通しても発現されることが示される。 ＡＨＡＳプロモーターの発現を以下の事項により評定することが可能である： １． ａｌｓ２−ＧＵＳ融合遺伝子を構築し、そしてトランスジェニックトウ モロコシおよびイネ植物内でのＧＵＳ活性のパターンを決定する。トウモロコシ プロモーターを用いる以前の調査により、イネにおけるトウモロコシプロモータ ー発現を評定することの実行可能性が既に示されている（Ｊｕｎｋｏ Ｋｙｏｚ ｕｋａら、１９９１）。トランスジェニック植物の選択後には組織化学的分析を 、様々な発生段階の植物組織で実 施して、組織特異性および細胞タイプ特異性の両方を決定する。この技術は、単 子葉類および双子葉類の両方でのプロモーター活性を評定するのに一般的に用い られる。 ２． 一過性発現アッセイは、ａｌｓ２−ＧＵＳ構築物の形質転換後に様々な 植物種から調製された原形質体について実施される。このアプローチを用いて異 種である種において機能する様々なプロモーターの能力を評定する。原形質体を 目的の構築物で形質転換させ、そしてそれをインキュベートして組込み遺伝子が 発現されかつ蛋白質が蓄積するようにさせる。インキュベーション後には細胞を そのトランスジーンによりコードされる蛋白質の存在についてアッセイしてトラ ンスジーン発現を誘導させるプロモーターの効率を決定する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年９月３日 【補正内容】 請求の範囲 １． 植物における遺伝子発現のためのＡＨＡＳプロモーターおよび、ある異 種遺伝子をコードする配列を含む、単離されたヌクレオチド配列。 ２． 植物における遺伝子発現のためのＡＨＡＳプロモーターおよび、ある異 種遺伝子をコードする配列を含み；ＡＨＡＳプロモーターがトウモロコシのａｌ ｓ１ およびａ１ｓ２の遺伝子のためのプロモーターから選択される、単離された ヌクレオチド配列。 ３． 植物における遺伝子発現のためのＡＨＡＳプロモーターおよび、ある異 種遺伝子をコードする配列を含み；ＡＨＡＳプロモーターが： （ａ）図１、配列番号１の配列を含む請求の範囲１のヌクレオチド配列； （ｂ）図２、配列番号２の配列を含む請求の範囲１のヌクレオチド配列；もし くは （ｃ）図３、配列番号３の配列を含む請求の範囲１のヌクレオチド配列、 から選択される、単離されたヌクレオチド配列。 ４． 植物における遺伝子の発現のためのＡＨＡＳプロモーターおよび、ある 異種遺伝子をコードする配列を含み；ＡＨＡＳプロモーターがトウモロコシにお けるａｌｓ２のためのプロモーターである、単離されたヌクレオチド配列。 ５． プロモーター配列が単子葉類から取得される、請求の範囲１の配列。 ６． プロモーター配列がトウモロコシから取得される、請求の範囲 １の配列。 ７． 請求の範囲１、２、３、４、５、もしくは６のヌクレオチド配列を含む 、形質転換用ベクター。 ８． 請求の範囲７のベクターを含む植物細胞。 ９． 請求の範囲１、２、３、４、５、もしくは６のヌクレオチド配列を含む 成熟した植物。 １０． ある植物において高レベルで、かつ前記植物の様々な組織内に、ある異 種遺伝子を発現させる、前記植物中で請求の範囲１、２、３、４、５、もしくは ６のヌクレオチド配列を発現させることを含む方法。 １１． 請求の範囲１、２、３、４、５、もしくは６の配列を含む核酸構築物。 １２． ヌクレオチド配列の異種遺伝子が選択用のトランスジェニック物質に対 する耐性を付与することが可能な突然変異体遺伝子である、請求の範囲１１の核 酸構築物。 １３． ヌクレオチド配列の異種遺伝子がＡＨＡＳ遺伝子である、請求の範囲１ ２の核酸構築物。 １４． 選択用マーカーとして核酸構築物を使用し、その核酸構築物が、請求の 範囲１２の構築物であり： （ａ）核酸構築物を挿入することにより、ある植物物質を組換え的に形質転換 させる段階； （ｂ）ある化合物を含む増殖培地にその植物物質を入れる段階； （ｃ）その化合物の存在下での増殖が可能な植物物質を同定する段階、 を含む方法。 １５． 突然変異体遺伝子がＡＨＡＳ遺伝子である、請求の範囲１４の 方法。 １５． 化合物がイミダゾリノンもしくはスルホニル尿素化合物である、請求の 範囲１４の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ペング， ジアニイング アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08648 ローレンスビル・イーストンコート19

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 植物における遺伝子の発現のためのＡＨＡＳプロモーターを含む、単離 されたヌクレオチド配列。 ２． 図１、配列番号１の配列を含む、請求の範囲１のヌクレオチド配列。 ３． 図２、配列番号２の配列を含む、請求の範囲１のヌクレオチド配列。 ４． 図３、配列番号３の配列を含む、請求の範囲１のヌクレオチド配列。 ５． 植物が単子葉類である、請求の範囲１、２、３、もしくは４のヌクレオ チド配列。 ６． 単子葉類がトウモロコシである、請求の範囲５の配列。 ７． 請求の範囲１、２、３、４、もしくは５のヌクレオチド配列を含む、形 質転換用ベクター。 ８． 請求の範囲７のベクターを含む植物細胞。 ９． 請求の範囲１、２、３、４、もしくは５のヌクレオチド配列を含む成熟 した植物。 １０． ある植物において高レベルで、かつ前記植物の様々な組織内に、ある異 種遺伝子を発現させる、前記植物中で異種遺伝子を請求の範囲１、２、３、もし くは４のヌクレオチド配列の制御下で発現させることを含む方法。 １１． ある異種遺伝子に連結された請求の範囲１、２、３、もしくは４の配列 を含む核酸構築物。 １２． 遺伝子がＡＨＡＳ遺伝子である、請求の範囲１１の核酸構築物。 １３． 選択用マーカーとして核酸構築物を使用し、その構築物が、ある突然変 異体遺伝子に連結された請求の範囲１、２、３、もしくは４のＡＨＡＳプロモー ター配列を含み、その遺伝子が選択的トランスジェニック物質に対する耐性を付 与し： （ａ）核酸構築物を挿入することにより、ある植物物質を組換え的に形質転換 させる段階； （ｂ）ある化合物を含む増殖培地にその植物物質を入れる段階； （ｃ）その化合物の存在下での増殖が可能な植物物質を同定する段階、 を含む方法。 １４． 突然変異体遺伝子がＡＨＡＳ遺伝子である、請求の範囲１３の方法。 １５． 化合物がイミダゾリノンもしくはスルホニル尿素化合物である、請求の 範囲１３の方法。