JPH1014587A - 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産 - Google Patents

微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産

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JPH1014587A
JPH1014587A JP9082921A JP8292197A JPH1014587A JP H1014587 A JPH1014587 A JP H1014587A JP 9082921 A JP9082921 A JP 9082921A JP 8292197 A JP8292197 A JP 8292197A JP H1014587 A JPH1014587 A JP H1014587A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 無障害のヒト副甲状腺ホルモンを安定に生産
する微生物は報告されてきていないこと。更に、副甲状
腺ホルモンは酵母からも単離されてきていないこと。 【解決手段】 ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコード
するＤＮＡを持つ大腸菌挿入用の新しいプラスミドが作
成された。このプラスミドは大腸菌に挿入されると大腸
菌を形質転換させ、マルチコピーのプラスミド、つまり
ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンのcＤＮＡを複製させる
ものとして機能する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はプレプロヒト副甲状
腺ホルモンをコードするＤＮＡを持つ、遺伝子工学的操
作を加えた微生物に関するものである。哺乳類細胞によ
って正常に合成される数々の蛋白質やペプチドは、医
学、農業、工業上有用であることが証明されてきた。こ
れらの蛋白質やペプチドは異なる分子サイズでもあり、
例えば酵素や構造蛋白質、成長因子、ホルモンなどのよ
うにいくつかの異なる機能を有している。
【０００２】
【従来の技術】本質的に、蛋白質、ペプチド共に、アミ
ノ酸の一次配列により構成されており、２次構造、３次
構造を形成して生物学的活性を発現する。ヒト副甲状腺
ホルモンは比較的小分子量であり、アミノ酸を順次付加
することによって、化学的にこのペプチドを合成するこ
とが可能である。故に副甲状腺ホルモンは商業的に利用
可能ではあるが、ごく少量で高価である。結果的に多く
の潜在的、医学、農業、工業面の応用に供するのに適当
な利用可能なヒト副甲状腺ホルモンは存在しない。
【０００３】過去１０年間、組み換えＤＮＡを用いた微
生物学的技術は異種のペプチドの生産に微生物を利用す
る事を可能にしてきた。微生物は急速かつ、大量の成長
が可能であり、細菌のペプチドと同様の方法で、外来性
の産生物を合成できる。この分子生物学的アプローチの
有効性と可能性は既に医学或いは他の使用目的に今や多
用可能な数々のヒト蛋白質の微生物による生産によって
証明されてきた。副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は哺乳類
のカルシウム代謝の最も重要なレキュレーターの１つで
あり、ヒトや動物のミルク熱急性低カルシウム症の他
に、病理的血中カルシウムレベル変化といった、いくつ
かの病気にも関連している。それ故にこのホルモンは、
診断キットの一部としても重要であり、ヒトや家畜の医
療においても治療に潜在的可能性を有している。
【０００４】ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンＤＮＡの最
初の合成はヘンドリー（Ｈendry）Ｇ.Ｎ，Ｋroneberg.
Ｈ.Ｍ.，Ｐotts.Ｊr.Ｊ.Ｔ.Ｒich Ａらによって報告さ
れた。（７８ Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．7365−7369，
1981）。またヘンドリーらによってＰＴＨ．mＲＮＡ配
列の相補ＤＮＡが合成され、２本鎖に合成された（前
出）。このcＤＮＡは、pＢＲ３２２ＤＮＡにクローニン
グされ、大腸菌（Ｅ.coli）１７７６にトランスフェク
トされた。選択された抗生物質に耐性のコロニーのう
ち、２００コロニー中２３コロニーが、特異的ヒトＰＴ
ＨｃＤＮＡの挿入を持っていることが同定された。しか
しながら２３個のヒトＰＴＨコロニーのうち、全長にわ
たって挿入されているものはなかった（ヘンドリーら、
前出）。後にブレイエル（Ｂreyel）.Ｅ，Ｍorelle.Ｇ.
Ａuf'mtolk.Ｂ，Ｆrank.Ｒ. Ｂlocker Ｈ.Ｍayer.
Ｈ.らは、シャロン４Ａファージで構成された胎児肝、
ジェノミックＤＮＡライブラリーにヒトＰＴＨ遺伝子が
あることを報告した（第３回欧州バイオテクノロジー会
議、1984．９月１０−１４．vol.３．３６３−３６
９）。ＰＴＨ遺伝子の制限酵素断片が再クローン化さ
れ、大腸菌（Ｅ．coli）にトランスフェクトされた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、ブレイエルら
の研究により（前出）、Ｅ.coliはヒトＰＴＨを分解す
ることがわかった。故に、これまでのところ、無障害の
ヒト副甲状腺ホルモンを安定に生産する微生物は報告さ
れてきていない。更に、副甲状腺ホルモンは酵母からも
単離されてきていない。
【０００６】したがって、ヒトプレプロ副甲状腺ホルモ
ン（ＨＰＴＨ）をコードするＤＮＡを持つ大腸菌（Ｅ.c
oli）挿入用のプラスミドの開発が本発明の目的であ
る。また、ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコードする
ＤＮＡを持つ大腸菌を遺伝子工学的に作成する事が本発
明のもう一つの目的である。更に、本発明の目的は、酵
母挿入用の副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡを持つ
プラスミドの開発である。また、ヒト副甲状腺ホルモン
を含めて、副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡを持
つ、形質転換酵母を作成し、その形質転換酵母から、副
甲状腺ホルモンを得ることが、本発明の目的である。本
発明の他の目的や、利用法は、後述されるところによっ
て明らかとなるであろう。
【０００７】
【課題を解決するための手段】前述の目的を達成する為
に、本発明によってヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコ
ードするＤＮＡを持つ大腸菌挿入用の新しいプラスミド
が作成された。このプラスミドは大腸菌に挿入されると
大腸菌を形質転換させ、マルチコピーのプラスミド、つ
まりヒトプレプロ副甲状腺ホルモンのCＤＮＡを複製さ
せるものとして機能する。本発明による大腸菌挿入用の
プラスミドと形質転換大腸菌は、例えば、ヘンドリーら
によって報告されているように、本発明のプラスミド
は、プレプロ副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡの
５'末端に２重の開始コドンを含んでいる点で、今まで
の人工プラスミドや微生物と区別できる。この２重の開
始コドンの存在により、このCＤＮＡを持つプラスミド
で微生物を形質転換させた時、プレプロ副甲状腺ホルモ
ンを従来技術の形質転換微生物よりも高効率、高収量で
生産するような生産微生物が得られたのであろう。
【０００８】更に、本発明によって副甲状腺ホルモンを
コードするＤＮＡを持った酵母挿入用のプラスミドが作
成された。より具体的にはこのプラスミドは前述の、大
腸菌への挿入用のプラスミドをクローン化することによ
って開発された。最終的には、本発明により、前述の酵
母への挿入用プラスミドによって副甲状腺ホルモンを生
産分泌するような形質転換酵母が得られた。即ち、本発
明は、酵母培地から、副甲状腺ホルモンを単離できるよ
うな方法を開発したのである。
【０００９】より具体的には、この形質転換酵母は、サ
ッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓaccharomyces cerev
isiae）である。また、副甲状腺ホルモンは、ヒト副甲
状腺ホルモンである。ブタペスト条約の規定により、p
ＳＳＨＰＴＨ−１０とその形質転換大腸菌、pＳＳαＬ
Ｘ２−ＨＰＴＨ Ｉ とその形質転換サッカロマイセス・
セレビシアエ（Ｓaccharomyces cerevisiae）は、１９
８６年９月２９日、メリーランド州のアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａmerican Ｔype Ｃul
ture Ｃollection）に供託された。これらのサンプル
は、以下の寄託番号を付与されている。 pＳＳＨＰＴＨ−１０を持つ、形質転換大腸菌 ＡＴＣＣ ６７２２３ pＳＳＨＰＴＨ−１０ ＡＴＣＣ ４０２６７ pＳＳαＬＸＳ−ＨＰＴＨ １を持つ形質転換 サッカロマイセス・セレビシアエ ＡＴＣＣ ２０８２１ pＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ １ ＡＴＣＣ ４０２６６
【００１０】
【図面の説明】図１にヒトプレプロ副甲状腺ホルモンを
コードするＤＮＡ塩基配列の可能な全てのバリエーショ
ンを示してある。図２にクローンpＳＳＨＰＴＨ−１０
のヒトプレプロ副甲状腺ホルモンＤＮＡに特異的なコー
ド配列を示してある。図３に本発明のプラスミドに存在
すると考えられるヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコー
ドし、５'末端に２重のスタートコドンを持つ、可能な
全てのＤＮＡ配列をその近接領域と共に示している。図
４はクローンpＳＳＨＰＴＨ−１０の特異的ヒトプレプ
ロ副甲状腺ホルモンＤＮＡ配列をその近接配列と共に示
してある。図５はクローンpＳＳＨＰＴＨ−１０のＤＮ
Ａ配列にコードされる、ヒトプレプロ副甲状腺ホルモン
の実際のアミノ酸配列を示している。
【００１１】図６は組み換えプラスミドpＳＳＨＰＴＨ
−１０の構成を示している。図７はpＡＬＸ４の制限地
図を示している。図８はpＬ４とｐＭＦα１−１からのp
αＬＸ−５の構成を示している。図９はpＳＳαＬＸ５
−ＨＰＴＨ １の概略図を示している。図１０はＭＦα
１−ＨＰＴＨの融合遺伝子の配列と、ＨＰＴＨをコード
するＤＮＡの可能な全ての組み合わせを示している。図
１１はＭＦα１−ＨＰＴＨの融合遺伝子の配列を示して
いる。図１２は酵母が生産、分泌し、酵母培地から回収
されたヒト副甲状腺ホルモンの電気泳動プレートを示し
ている。
【００１２】以上に示したように本発明は、ヒトプレプ
ロ副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡを含んだ大腸菌
への挿入用プラスミドについてのものである。また本発
明は作成された形質転換大腸菌に関する。更に本発明
は、大腸菌への挿入用プラスミドに由来する、副甲状腺
ホルモンをコードするＤＮＡを持つ酵母への挿入用プラ
スミドについてのものである。最終的には本発明は、副
甲状腺ホルモンが回収されると考えられる酵母について
のものである。
【００１３】更に本発明によりこのプラスミドと形質転
換微生物の単離と作成の方法がもたらされる。外科的操
作後直ちに回収されたヒト副甲状腺腫からポリＡ選択の
ＲＮＡが単離された。ポリＡ ＲＮＡを庶糖濃度勾配超
遠心によって適正な大きさのｍＲＮＡに濃縮した。この
サイズに分画されたポリＡ ＲＮＡからインビトロで正
常な分子量の副甲状腺ホルモンを翻訳しこれを、抗副甲
状腺腫抗血清による免疫沈降後に、ＳＤＳ電気泳動によ
って判定した。ヒト、ＰＴＨ特異的mＲＮＡを鋳型とし
て用いオリゴｄ（Ｔ）１８マーをプライマーとして鳥筋
原細胞腫ウィルス逆転写酵素を用いて相補ＤＮＡを合成
した。ＲＮＡの鋳型をアルカリ加水分解によって除去し
た後に、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ Ｉのクレノウフラ
グメント存在下で精製した第１のＤＮＡ鎖をインキュベ
ートすることによって第２の相補鎖ＤＮＡを合成した。
二本鎖の相補ＤＮＡの末端をアスベルギルス・オリザエ
（Ａspergillus oryzae）の一本鎖特異的エンドヌクレ
アーゼＳ１の作用により平滑末端にし、５００bp以上の
長さの相補ＤＮＡをニュートラル庶糖濃度勾配遠心によ
って単離した。約２０塩基長のｄ（Ｃ）テイルをcＤＮ
Ａの３'末端に酵素によって付加した。この修飾された
相補ＤＮＡを制限酵素Ｐst Ｉで切断しオリゴｄ（Ｇ）
テイルを付加したベクターpＢＲ３２２に付加した。作
成された組み換えプラスミドＤＮＡを大腸菌Ｋ１２ Ｂ
Ｊ５１０３株に形質転換させた。ポジティブな形質転換
株は、それぞれ、ホルモンmＲＮＡ配列の３'末端の非コ
ード領域と、Ｎ本のコード領域をカバーする２種類の合
成デオキシオリゴヌクレオチドを用いたコロニーハイブ
リダイゼーションによって検索した。６６個のクローン
のうち６つが両方のプローブにポジティブであり、これ
らを制限酵素地図による詳細な解析に供したところ、ス
タートコドンと３'末端のストップコドンのＸba Ｉ部位
の近接領域において、サイズがいくつか異なることを除
いては、全て同一であった。そのうちの１つのクローン
であるpＳＳＨＰＴＨ−１０のＤＮＡ配列を解析したと
ころpＢＲ３２２のＰst Ｉ部位に４３２塩基長のヒト副
甲状腺ホルモンの相補ＤＮＡが挿入されている事が判明
した。この全cＤＮＡ配列は、スタートコドンの前に５b
pの欠失があった事を除いては、ヘンドリーら（前述）
によって報告された配列と同一であった。
【００１４】図２は、pＳＳＨＰＴＨ−１０のヒトプレ
プロ副甲状腺ホルモンのＤＮＡ配列を示したものであ
る。５'の二重スタートコドンを除いては、ヒト副甲状
腺ホルモンのＤＮＡ配列の可能な全てのバリエーション
を示す図１と一致するであろう。図３は本発明によって
得られたクローンのＤＮＡ配列をその近接領域の配列と
共に示してある。より具体的には、ヒト副甲状腺ホルモ
ンをコードする大腸菌への挿入用プラスミドはpＳＳＨ
ＰＴＨ−１０であり、そのＤＮＡ配列は近傍の配列と共
に図４に示してある。
【００１５】更に本発明により、酵母への挿入用の、副
甲状腺をコードするＤＮＡを持つプラスミドが得られ
る。この副甲状腺ホルモンはヒト及び動物、例えばブタ
やウシの副甲状腺ホルモンでもよい。本発明の酵母挿入
用プラスミドは、ヒト又は動物の副甲状腺ホルモンをコ
ードするＤＮＡを持つプラスミドから再クローン化され
得よう。具体的には、酵母への挿入用プラスミドに、ヒ
ト副甲状腺ホルモンをコードするＤＮＡが含まれてい
る。以下の例で示すように、pＳＳＨＰＴＨ−１０由来
のヒトＨＰＴＨ配列を再クローン化しサッカロマイセス
・セレビシアエ（Ｓaccharomyces cerevisiae）で発現
するように特別に設計されたベクターに挿入した。
【００１６】pＳＳＨＰＴＨ−１０は２８８bpのＢg１
II−Ｘba Ｉ断片にあるように切断した。この断片をpＵ
Ｃ１９中のＢamＨ ＩとＸba Ｉ部位間にサブクローニン
グした。このサブクローンを更にＤpn Ｉで切断し生じ
てきた最も大きな断片を単離した。この断片を次にＳal
Ｉで切断した。
【００１７】酵母ＭＡＴα細胞中でＰＴＨを発現、分泌
するこのプラスミドpＳＳαＬＸ−ＨＰＴＨ１は三段階
を経て作成された。
【００１８】１．酵母シャトルベクターpＬ４（大腸菌
中でもサッカロマイセス・セレビシアエ(Ｓaccharomyce
s cerevisiae)中でも複製する）の作成。 ２．酵母性フェロモンＭＦα１遺伝子を含んだＤＮＡ断
片のクローニングと、これの酵母シャトルベクターへの
挿入によるｐαＬＸ５ベクターの作成。 ３．pＳＳＨＰＴＨ−１０のＨＰＴＨ遺伝子のコード領
域のＤＮＡ断片をpαＬＸ５のコード領域にＭＦα１遺
伝子の前駆体部分と共に挿入することによるpＳＳαＬ
Ｘ５−ＨＰＴＨベクターの作成。 シャトルベクターpＬ４はpＡＤＨ０４０より単離したＡ
ＤＨＩプロモーターを含む、ＥcoＲ Ｉ−ＡvaII断片をp
ＪＤＢ２０７に挿入することによって作成した。Ｓph
Ｉ断片を次に欠失させ、プラスミドpＡＬＸ１を作成し
た。βラクタマーゼ遺伝子中のpst Ｉ部位を欠失させ、
このプラスミドをＰva ＩとＢg1 Ｉで部分分解し、pＵ
ＣのＰvu Ｉ、Ｂg1 Ｉ断片をライゲーションし、pＡＬ
Ｘ２を作成した。さらに、オリゴヌクレオチドの挿入後
このプラスミドとＨind IIIで分解し再び結合させてpＡ
ＬＸ４を作成した。
【００１９】Ｙ２８８c株より得た酵母の全ＤＮＡをＥc
oＲ Ｉで切断し１.６〜１.８kbの断片を単離した。これ
をＥcoＲ Ｉで切断したpＢＲ３２２に結合し、大腸菌を
形質転換させた。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼー
ションによりＭＦα−１の挿入クローンをスクリーニン
グした。この結果選択されたＤＮＡを大腸菌の形質転換
用に用いた。得られたプラスミドｐＭＦα１−１をＥco
Ｒ Ｉで切断しクレノウフラグメントで平滑末端にした
後にＢg1 IIで切断した。ＭＦα１断片を単離し、（Ｂa
mＨ Ｉで切断した後にクレノウフラグメントで平滑末端
にした）pＬ５に結合してpαＬＸ５を作成した。pαＬ
Ｘ５にヒトＰＴＨcＤＮＡ断片を挿入する為に、pαＬＸ
５をＨind IIIで切断し、生じた接着末端とこの部位を
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントとｄＮＴ
Ｐで平滑末端にした。次にpαＬＸ５をＳal Ｉで切断
し、Ｓal Ｉで切断した上記のヒトＰＴＨ断片と相補す
る接着末端を有するＤＮＡを作成した。
【００２０】Ｓal Ｉで切断したヒトＰＴＨ断片を、Ｓa
l Iで切断したpαＬＸ５に挿入した。作成したプラスミ
ドpＳＳαＬＸ５・ＰＴＨは図９に示してある。ｐＳＳ
αＬＸ５−ＰＴＨを酵母に挿入し、ヒト副甲状腺ホルモ
ンを生産、分泌するような形質転換酵母を得た。より具
体的には、この形質転換酵母はサッカロマイセス・セレ
ビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【００２１】図１２に酵母培地より得たヒト副甲状腺ホ
ルモンの電気泳動プレートを示してある。しかしなが
ら、pＳＳＨＰＴＨ−１０を再クローニングし酵母への
挿入用プラスミドを作成する方法は詳細に示してあり、
この方法は本発明を例証するものとして示してあるが、
本発明は以後これに制限されるものではない。この方法
は、ヒト、動物のＰＴＨをコードするＤＮＡを持つ様々
なプラスミドに応用されるだろうし、本発明の酵母への
挿入用プラスミドが作成出来る。
【００２２】本発明のプラスミド及び形質転換微生物は
以下の例にあるように作成された。 例 １ヒト副甲状腺ホルモンのmＲＮＡの単離と相補ＤＮＡの
合成 本発明の最初の材料として患者より外科的に得られた副
甲状腺腫が使われた。副甲状腺組織を摘出後、直ちにド
ライアイス中で冷却しＲＮＡ調製用に研究室に運んだ。
この凍結組織は、４Ｍグアニジニンイチオシアネート存
在下、超ツラックスホモゲナイザーでホモゲナイズし、
ガーグイン（Ｇhirgwin Ｊ.Ｍ.）、ヒジビラ（Ｐrzybyl
a Ａ.Ｅ.）、マクドナルド（ＭacＤonald Ｒ.Ｊ.）、ル
ター（Ｒutter Ｗ.Ｊ.）らの方法（Ｂiochemistry １８
5294−5299 1979）に従って段階別エタノール沈殿に
よってＲＮＡを回収した。調製したＲＮＡを、オリゴｄ
（Ｔ）セルロースアフィニティクロマトグラフィカラム
にかけ、ポリ（Ａ）を持つmＲＮＡを濃縮した。ポリ
（Ａ）を多く含むＲＮＡを更に１５〜３０％連続庶糖濃
度勾配超遠心にかけ、副甲状腺ホルモンmＲＮＡのサイ
ズのＲＮＡを濃縮した。得られたグラジエントを２５画
分に分画し、３画分毎にインビトロで翻訳させ、抗ＰＴ
Ｈ抗血清による免疫沈降しガウテビィク（Ｇautvik,Ｋ.
Ｍ.）Ｃautivik.Ｖ.Ｔ. Ｈalvorsen Ｊ.Ｆ. Ｓcand.
Ｊ.Ｃlin.Ｌab.Ｉnvest. ４３ ５５３−５６９ 198
4）とＳＤＳ，ポリアクリルアミド電気泳動レムリー
（Ｌaemmeli.Ｕ.Ｋ.）２２７ Ｎature ６８０ 1970）
によってＰＴＨmＲＮＡ含量を、検量した。翻訳可能な
ＰＴＨmＲＮＡを含む画分のＲＮＡはエタノール沈殿に
よって回収した。ＰＴＨmＲＮＡを多量に含むこのＲＮ
Ａを、cＤＮＡ合成の為の鋳型にして、プライマーとし
てオリゴｄ（Ｔ）１８マーを、反応触媒として鳥筋原細
胞腫ウィルス逆転写酵素を用いた。マニアティス（Ｍan
iatis.Ｔ.）Ｆritsch Ｅ.Ｆ.Ｓanbrook.Ｊ. Ｍolecula
r Ｃloning pp２３０−２４３ 1982）。第一のＤＮＡ
鎖の合成後に、ＲＮＡの鋳型をアルカリ加水分解によっ
て除去した。第２のｃＤＮＡ鎖は、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩのクレノウフラグメント存在下に、精製した第
一のｃＤＮＡ鎖をインキュベートして合成した（マニア
ティス前出）。このインビトロ合成二本鎖cＤＮＡは、
アスペルギルス・オリザエ（Ａspergillus oryzae）の
一本鎖特異的エンドヌクレアーゼＳ１の作用によって平
滑末端にした(マニアティス前出)。この平滑末端cＤＮ
Ａは、１５〜３０％のニュートラル庶糖勾配によってサ
イズ毎に分画した。各画分のサイズ分布は、アガロース
ゲル電気泳動で既知のＤＮＡ断片をマーカーにして検定
した。約５００bpより長いcＤＮＡを含む画分をストッ
クし、cＤＮＡをエタノール沈殿によって集めた。
【００２３】例 ２ＰＴＨcＤＮＡのプラスミドpＢＲ３２２へのクローニン
グと大腸菌Ｋ１２ＢＪ.５１８３の形質転換 約２０塩基長のｄ（Ｃ）テイルをcＤＮＡの３'末端にタ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに
よって付加した。（マニアティス前出）このｄ（Ｃ）テ
イルが付加されたcＤＮＡをＰst Ｉで切断し、ｄ（Ｇ）
テイルが付加されたベクターpＢＲ３２２にアニールさ
せ、作成された組み換えプラスミドＤＮＡをハナハン
（Ｈanahan.Ｄ）の方法（１６６．Ｊ.Ｍol.Ｂiol．５５
７−５８０1983）によって形質転換可能になった大腸菌
Ｋ１２．Ｂ.Ｊ.５１８３細胞に形質転換した。得られた
３３０００の形質転換株がＰＴＨcＤＮＡを含んでいる
ことは、コロニーハイブリダイゼーション（Ｈanahan.
Ｄ，Ｍeselson １０ Ｇene６３ 1980）によって検定
した。
【００２４】２〜３４個の形質転換株を、それぞれ８２
mm直径のニトロセルロースフィルターに直接にプレーデ
ィングによって接種し、テトラサイクリンを含む高栄養
寒天プレート上に置き、３７℃で約０.１mmのコロニー
が出現する迄インキュベートした。このフィルターに新
しい２枚のフィルターを順次押しつけることによってそ
れぞれのフィルターの２枚のレプリカを得た。このレプ
リカフィルターを新しいテトラサイクリンを含む寒天プ
レートの上に置き、約直径０.５mmのコロニーが出現す
るまで３７℃でインキュベートした。細菌のコロニーの
マスターフィルターは寒天プレート上に置き４℃で保存
し、２連のレプリカフィルターは寒天プレートから引き
はなして以下のコロニーハイブリダイゼーションの操作
に供した。
【００２５】例 ３組み換えＰＴＨcＤＮＡを含む菌コロニーと、pＳＳＨＰ
ＴＨ−１０クローンのＤＮＡ配列の性質 それぞれのコロニーの細胞はその場でアルカリおよび塩
化ナトリウム処理によりこわされ、各々の細菌のクロー
ンの有するＤＮＡが、露出された。フィルターをトリス
緩衝液で中和し８０℃で乾燥させることによってＤＮＡ
がフィルターに結合する。細胞の破片は６５℃で、界面
活性剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と塩化ナトリ
ウムで洗浄することにより、ほとんどが除去されたが、
ＤＮＡは細菌のコロニーがあった位置のフィルターに結
合したままである。これらのフィルターを６×ＳＳＣ液
（０.９Ｍ ＮaCl，０.０９Ｍ クエン酸ナトリウ
ム）、１×デンハルト液（０.１g／mlフィコル（Ｆicol
l）、０.１g／mlポリビニルピロリドン、０.１g／mlウ
シ血清アルブミン）、１００g／mlニシン精子ＤＮＡ、
０.５％ＳＤＳ、０.０５％ピロリン酸ナトリウムに３７
℃で２時間浸しておく。（ウッズ(Ｗoods.Ｄ.Ｅ.)６
Ｆocus Ｎo.３．1984）
【００２６】ハイブリダイゼーションは、32Ｐ標識のＤ
ＮＡプローブが入っているハイブリダイゼーション液
（６×ＳＳＣ、１×デンハルト液、２０g／ml tＲＮ
Ａ、０.０５％ピロリン酸ナトリウム）中で、４２℃で
１８時間かけて行った。（ウッズ前出）
【００２７】ハイブリダイゼーションのプローブとして
使ったＤＮＡは、ヘンドリーら（前出）らによって報告
されたヒトＰＴＨcＤＮＡの配列から推定された２種類
の異なる合成デオキシリボオリゴヌクレオチドのうちの
１つである。１番目のプローブは、２４マーのオリゴヌ
クレオチドでありヒトプレプロＰＴＨのコード配列のス
タートコドン付近の配列に由来するものでありその配列
はＴＡＣＴＡＴＧＧＡＣＧＴＴＴＴＣＴＧＴＡＣＣＧＡ
である。第２のオリゴヌクレオチドは２４マーであり、
終止コドンの３１ヌクレオチド下流に位置する制限酵素
Ｘｂa Ｉの切断部位をまたぐものであり、その配列はＣ
ＴＣＡＡＧＡＣＧＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＡＴＣＣであ
る。
【００２８】32Ｐ−γ−ＡＴＰの32Ｐをオリゴヌクレオ
チドの５'末端にポリヌクレオチドキナーゼの作用で結
合させ標識した。（マキサム(Ｍaxam Ａ.Ｍ.)Ｇilbert
Ｗ.６５．Ｍethods Ｅnzymol．４９９ 1980）ハイブリ
ダイズしたフィルターはオートラジオグラフィーの前に
４２℃で６×ＳＳＣ、０.０５％ピロリン酸ナトリウム
液中で洗浄した。二連のレプリカフィルターの両方の写
しにハイブリダイズしていることで判定してみたところ
６６個のクローンが両方のプローブにポジティブである
ことがわかった。cＤＮＡライブラリーがストックされ
ているもとのフィルターからそれらを全て回収して、−
７０℃で永久保存するために増殖させた。これらのうち
６つをプラスミド調製用とエンドヌクレアーゼによる制
限酵素地図の更に詳細な解析をするために選んで調べた
ところ、開始コドンとＸba Ｉ部位の近接領域でそれぞ
れサイズが異なってきていることを除いては全てが全く
同一のものであった。
【００２９】例 ４クローンpＳＳＨＰＴＨ−１０ pＳＳＨＰＴＨ−１０クローンをマサキム・ギルバート
法（前出）によるＤＮＡの配列解析に供した。図６にp
ＳＳＨＰＴＨ−１０の完全な構造が示してある。このク
ローンは４３２bp長のＰＴＨcＤＮＡの配列が、pＢＲ３
２２のＰst Ｉ部位に挿入されており５'末端に２７のＧ
／Ｃ塩基対か３’末端に１７のＧ／Ｃ塩基対がある。図
４にpＳＳＨＰＴＨ−１０のcＤＮＡ挿入部分の完全なＤ
ＮＡ配列が示してある。開始コドンのちょうど前１−５
塩基対の欠失があることを除いてはヘンドリー（前出）
らのシークエンスを同一であり、使用される開始コドン
に先立つ、報告されている（ヘンドリーら前出）。開始
−終止シグナル（ＡＴＧＴＧＡＡＧ）は、（下線部が欠
失）、２重の開始シグナル（ＡＴＧＡＴＧ）に変わって
いた。
【００３０】例 ５酵母シャトルベクターpＬ４の作成 ＨＰＴＨを酵母で発現させる計画が始まる以前に一般的
な酵母発現ベクターの一連のものが作成された。その１
つがpＬ４であり、以下に述べるように後に使用してpＳ
ＳαＬＸ５−ＨＰＴＨを作成した。
【００３１】ベッヂ（Ｂeggs Ｊ.Ｄ），Ｖon Ｗettstei
n Ｄ．Ｆriis Ｊ.Ｋielland−Ｂrandt Ｍ. Ｓtenderu
p.Ａ．らによって作成されたプラスミドpＪＤＢ２０７
“マルチコピー酵母プラスミドベクター”（Ｅds）Ｍol
ecular Ｇenetics in Ｙeast（1981）Ａlfred Ｂenzon
Ｓymposiun Ｖol.１６ ３８３−３９０）は、一般的な
発現ベクターのための基本に選んだ。これは、pＢＲ３
２２に由来するpＡＴ１５３に酵母の２ミクロンＤＮＡ
のＥcoＲ Ｉ断片が挿入されている。また、酵母のＬＥ
Ｕ２遺伝子を持っている。pＪＤ２０７の酵母cir+細胞
中でのコピー数は他のプラスミドに比較してはるかに多
く、cir+株での非選択培養後でもめずらしく安定であ
る。
【００３２】ペレント（Ｐarent Ｓ.Ａ.）Ｆenimore
Ｃ.Ｍ. Ｂostian Ｋ.Ａ.“発現用のベクターシステ
ム、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ.cerevisia
e）のＤＮＡシークエンスの分析とクローニング”１．
Ｙeast，８３−１３８（1985）；エルハート（Ｅrhart
Ｅ．）Ｈollenberg Ｃ.Ｐ.“サッカロマイセス・セレビ
シアエ（Ｓaccharomyces cerevisiae）の２ミクロンＤ
ＮＡ組み換えプラスミド上の欠損ＬＥＵ２の存在が高コ
ピー数とキュアリングの原因である。”１５６Ｊ.Ｂact
erial ６２５−６３５（1983）。
【００３３】これらの特徴は選択マーカー遺伝子ＬＥＵ
２（またはＬＥＵ２dと言う。ｄは欠陥の頭文字）のプ
ロモーターが部分的に弱くなっていることと関連があ
り、エルハート（前出）、以下のプラスミド作成におい
て変換されない。ＡＤＨＩプロモーターを含む１２６０
塩基対のＥcoＲＩ−Ａva II断片をプラスミドpＡＤＨ０
４０から単離した。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフ
ラグメントと全ての４つのdＮＴＰとの反応を完全に行
わせた後にＢamＨ Ｉリンカーを付加してこの断片をpＪ
ＤＢ２０７の中にある唯一のＢamＨ Ｉ部位にクローン
化した。逆方向のプロモーターになっているプラスミド
から１０５０塩基対のＳphＩ断片（pＪＤＢ２０７のＳp
h Ｉ部位からプロモーター断片中のＳph Ｉ部位に至
る）を欠失させ、１つのＢamＨ Ｉ部位のみを残した。
このプラスミドをpＡＬＸ １と称した。
【００３４】pＡＬＸ １中のβラクタマーゼ遺伝子中の
Ｐst Ｉ部位を次に遺伝子を不活性化させることなく欠
失させた。pＡＬＸ １をＰst Ｉで完全に分解し、ヌク
レアーゼＳ１でＰst Ｉ部位を分解し、次にＰvuＩとＢg
l Ｉによって部分的に分解した。同時にpＵＣ１８から
ビエイラ（Ｖieira Ｊ.）Ｍessing Ｊ.１９．Ｇene.２
５９．1982）Ｐst Ｉ部位を含まない対応するβラクタ
マーゼ遺伝子の断片になる。ＰvuＩ、Ｂgl Ｉの２５０
塩基対の断片を単離した。これを部分分解したpＡＬＸ
１に結合させた。単離されたアンピシリン耐性クローン
全てのうち、βラクタマーゼ遺伝子はpＵＣ８断片と結
合することによって、復帰していた。このプラスミドの
ことをpＡＬＸ２と称する。
【００３５】ベルゲン（Ｂergen）大学のクレッペ（Ｋ.
Ｋleppe）教授より以下のオリゴヌクレオチドを購入
し、pＡＬＸ２のＢamＨ Ｉ部位に挿入した。
【化１】
【００３６】適正な方向にプロモーターが入ったプラス
ミドを単離し、これをpＡＬＸ３と称する。最終的にpＡ
ＬＸ３はＨind IIIで切断し再結合させることによって
Ｈind IIIの４８０塩基対断片を欠失させた。このプラ
スミドをpＡＬＸ４と名づけた。図７にpＡＬＸ４の制限
地図を示してある。pＬ４はpＡＬＸ４由来のものでＡＤ
ＨＩのプロモーターが欠失している。pＬ４は他のプロ
モーターの挿入用のものとして使われた。pＡＬＸ４を
まずＢgl IIとＳal Ｉで切断した。生じてきた接着末端
をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントと４つ
のdＮＴＰによってうずめて、再結合させた。この処理
によってＡＤＨＩプロモーターが除去され、Ｂgl II部
位を再び持つベクターpＬ４が作成された。
【００３７】例 ６pαＬＸ５の作成 酵母の性フェロモンＭＦα１の遺伝子は初めてカージャ
ン（Ｋurjan.Ｊ.）とヘルスコウィツ（Ｈerskowitz.
Ｉ.）によってクローニングされた。“酵母フェロモン
遺伝子（ＭＦα）の構造；推定上のα因子前駆体には４
つのタンデムコピーの成熟因子が含まれる”３０ Ｃｅ
ｌｌ.９３３−９４３（1982）。この文献に報告されて
いる配列をもとにＭＦα１遺伝子を再クローニングし
た。全酵母ＤＮＡをＹ２８８Ｃ株より得、ＥcoＲ Ｉで
切断し、この切断産物のうち１.６〜１.８kdの範囲のサ
イズのものを調整用アガロースゲルから単離した。これ
は次に脱リン酸化され、ＥcoＲ Ｉで切断されたpＢＲ３
２２に結合させ、大腸菌ＢＪ５１８３を形質転換するの
に使われた。生じてきたクローンを下記の構成の標識オ
リゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションによってＭ
Ｆα１遺伝子の挿入を調べた。 ＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＴＡＡＡＧＣ
【００３８】ポジティブクローンより精製してきたＤＮ
Ａは、次に、プラスミドＤＮＡが調製されてきた大腸菌
ＪＡ２２１を形質転換するのに使われた。以下のプラス
ミドに使われたプラスミドすなわちpＭＦα１−１は図
８に示してある。ＰＭＦα−１はＥcoＲ Ｉで切断し、
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントと４つの
dＮＴＰと反応させ、フェノール抽出を行いＢgl IIで切
断した。１.７kdのＭＦα１遺伝子をアガロースゲルか
ら単離した。酵母シャトルベクターにこれを挿入する前
に、pＬ４のＨind III部位をＨind IIIによる分解によ
って除去し、クレノウフラグメントでのうめあわせ反応
と、再結合によってpＬ５シャトルベクターを作成し
た。pＬ５はＢamＨ Ｉが切断され、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノウフラグメントと４つのdＮＴＰによってう
めあわせ、フェノール抽出をし、Ｂgl IIで切断した。
ゲルで精製した後にこれをＭＦα１の断片と結合させ、
図８に示してあるような発現ベクターpαＬＸ５を作成
した。
【００３９】例 ７pＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ１の作成 pＳＳＨＰＴＨ−１０プラスミドからの２８８塩基対の
Ｂgl II、Ｘba Ｉ断片を単離しpＵＣ１９にそのベクタ
ーのＢamＨ ＩとＸba Ｉ部位を用いてサブクローニング
した。このpＵＣ−ＨＰＴＨと名づけられたサブクロー
ンをＤpn Ｉで切断し最大の断片を単離した。この断片
をＳal Ｉで切断し、Ｓal Ｉ切断の方は接着末端にＤpn
Ｉ切断の方は平滑末端になっている、２つの生成断片
のうち小さい方を単離した。
【００４０】pαＬＸ５をＨind IIIで切断し、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノウフラグメントと４つのdＮＴＰ
でのうめあわせ反応をし、フェノール抽出を行い、Ｓal
Ｉでの切断を行った。ゲルから精製後、これを上述の
ＨＰＴＨ断片に結合した。このクローンはリーディング
フレームが適正となるようにＨind III部位が再生され
ている。このプラスミドをpＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ１
と称し、図９に示してある。ＭＦα１−ＨＰＴＨ融合遺
伝子の配列は図５に示してある。
【００４１】例 ８酵母におけるＨＰＴＨの発現と分泌 酵母株ＦＬ２００（α，Ｕra３，Ｌeu２）を、プラスミ
ドpαＬＸ５とpＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ１で、スフェロ
プラスト法で形質転換させた。それぞれのうち１つの形
質転換株をＬeu−の培地で成育させ、細胞を含まない培
養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色で調べた。（図１２）p
ＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ１の形質転換株の培地には２つ
の大量のバンドがあったが、pαＬＸ５の形質転換株培
養液にはなかった。１つのバンドはだいたい9,000ダル
トンであり、ＨＰＴＨの予想される分子量に対応し、他
のバンドは約16,000ダルトンでありプロセッシングを受
けていないＭＦα１−ＨＰＴＨ融合産物に対応するもの
であろう。両ポリペプチド共に生来のホルモンと同一の
態様で抗ヒトＰＴＨ抗体と反応した。
【００４２】以上の例は、例証により示されているが、
本発明はこれに制限されるわけではない。以上の例はヒ
ト副甲状腺ホルモンを生産、分泌するサッカロマイセス
・セレビシアエ（Ｓ.cerevisiae)の開発を目的としたも
のだが、本発明の方法は、どの種の副甲状腺ホルモンを
コードするＤＮＡを含むプラスミドを作成するのにも応
用され得よう。更にこのプラスミドはどの種の酵母にも
挿入され得よう。故に本発明はサッカロマイセス・セレ
ビシアエ（Ｓ.cerevisiae)に制限されない。
【００４３】本発明の酵母が生産した、クローン化ヒト
副甲状腺ホルモンには既知の、又は潜在的可能性のあ
る、様々な使用法がある。例えば、最近の医学理論によ
ると、ヒト副甲状腺ホルモンは骨粗鬆症の治療に非常に
効果的であるらしい。遺伝子工学的に作成された副甲状
腺ホルモンはヒトや動物の副甲状腺ホルモンレベルを測
る分析キットについても利用価値があろう。ヒト副甲状
腺ホルモンやその断片は減少性又は病理的血中カルシウ
ムレベル異常を示すヒトや動物の治療にも使えるであろ
う。
【００４４】遺伝子工学的に作られた副甲状腺ホルモン
が例えば本発明の結果として大量に入手可能になると、
数多くの他の使用法の開発が期待される。本発明は特定
の好適具体例を参照しつつ記載したが、その応用は当業
者に明白なので、本発明は上記具体例に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコードする
ＤＮＡ塩基配列の可能な全てのバリエーションを示す図
である。
【図２】 クローンpＳＳＨＰＴＨ−１０のヒトプレプ
ロ副甲状腺ホルモンＤＮＡに特異なコード配列を示す図
である。
【図３】 ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンをコードし、
５'末端に２重のスタートコドンを持つ、ＤＮＡ配列を
近接領域と共に示す図である。
【図４】 クローンpＳＳＨＰＴＨ−１０の特異的ヒト
プレプロ副甲状腺ホルモンＤＮＡ配列を近接配列と共に
示す図である。
【図５】 クローンpＳＳＨＰＴＨ−１０のＤＮＡ配列
にコードされる、ヒトプレプロ副甲状腺ホルモンのアミ
ノ酸配列を示す図である。
【図６】 組み換えプラスミドpＳＳＨＰＴＨ−１０の
構成を示す図である。
【図７】 pＡＬＸ４の制限地図を示す図である。
【図８】 pＬ４とｐＭＦα１−１からのpαＬＸ−５の
構成を示す図である。
【図９】 pＳＳαＬＸ５−ＨＰＴＨ １の概略図であ
る。
【図１０】 ＭＦα１−ＨＰＴＨの融合遺伝子の配列
と、ＨＰＴＨをコードするＤＮＡの組み合わせを示す図
である。
【図１１】 ＭＦα１−ＨＰＴＨの融合遺伝子の配列を
示す図である。
【図１２】 ヒト副甲状腺ホルモンの電気泳動プレート
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ペーテル・アレストローム ノルウェー王国エンヌ−3505ソルリーホー ダ，サクセベイエン24 (72)発明者 カーレ・エンム・ガウトビク ノルウェー王国エンヌ−0257オスロ２，ス コーブン17 (72)発明者 トルディス・ベアテ・オイェン ノルウェー王国エンヌ−0671オスロ６，ス トルダムン33 (72)発明者 オード・ストーク・ガブリエルセン ノルウェー王国エンヌ−0280オスロ２，ウ ルレルン16

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）をコードす
    るＤＮＡとこれに作動可能に結合されたサッカロマイセ
    ス（Ｓaccharomyces）交配ファクターアルファ１をコー
    ドするＤＮＡを含む遺伝子を有することを特徴とする、
    微生物宿主を形質転換して副甲状腺ホルモンを発現し、
    分泌することができるベクター。
  2. 【請求項２】 ＰＴＨがヒト由来のものである、請求項
    １に記載のベクター。
  3. 【請求項３】 微生物宿主が酵母菌である、請求項１ま
    たは２に記載のベクター。
  4. 【請求項４】 微生物宿主が大腸菌である、請求項１ま
    たは２に記載のベクター。
  5. 【請求項５】 ＰＴＨをコードしているＤＮＡが次のヌ
    クレオチド配列を含むものである、請求項１〜４のいず
    れか１項に記載のベクター： 【表１】
  6. 【請求項６】 ＰＴＨをコードしているＤＮＡが次のヌ
    クレオチド配列を含むものである、請求項１〜４のいず
    れか１項に記載のベクター： 【表２】
  7. 【請求項７】 遺伝子が次のヌクレオチド配列を有する
    ＤＮＡを含むものである、請求項１〜４のいずれか１項
    に記載のベクター： 【表３】 Ｍ＝ＡまたはＣ Ｒ＝ＡまたはＧ Ｗ＝ＡまたはＴ Ｓ＝ＣまたはＧ Ｙ＝ＣまたはＴ Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ Ｎ＝ＡまたはＧまたはＣまたはＴ。
  8. 【請求項８】 遺伝子が次のヌクレオチド配列を有する
    ＤＮＡを含むものである、請求項１〜４のいずれか１項
    に記載のベクター： 【表４】
  9. 【請求項９】 酵母菌がサッカロミセス属から選択され
    る、請求項３に記載のベクター。
  10. 【請求項１０】 酵母菌がサッカロミセス・セレビシエ
    から選択される、請求項９に記載のベクター。
  11. 【請求項１１】 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）をコード
    するＤＮＡとこれに作動可能に結合されたサッカロマイ
    セス（Ｓaccharomyces）交配ファクターアルファ１をコ
    ードするＤＮＡを含む遺伝子を有するベクターによって
    形質転換されていることを特徴とする、副甲状腺ホルモ
    ンを発現し、分泌することができる微生物。
  12. 【請求項１２】 ＰＴＨがヒト由来のものである、請求
    項１１に記載の微生物。
  13. 【請求項１３】 酵母菌である、請求項１１または１２
    に記載の微生物。
  14. 【請求項１４】 大腸菌である、請求項１１または１２
    に記載の微生物。
  15. 【請求項１５】 ＰＴＨをコードしているＤＮＡが次の
    ヌクレオチド配列を含むものである、請求項１１〜１４
    のいずれか１項に記載の微生物： 【表５】 Ｍ＝ＡまたはＣ Ｒ＝ＡまたはＧ Ｗ＝ＡまたはＴ Ｓ＝ＣまたはＧ Ｙ＝ＣまたはＴ Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ Ｎ＝ＡまたはＧまたはＣまたはＴ。
  16. 【請求項１６】 ＰＴＨをコードしているＤＮＡが次の
    ヌクレオチド配列を含むものである、請求項１１〜１４
    のいずれか１項に記載の微生物： 【表６】
  17. 【請求項１７】 遺伝子が次のヌクレオチド配列を有す
    るＤＮＡを含むものである、請求項１１〜１４のいずれ
    か１項に記載の微生物： 【表７】 Ｍ＝ＡまたはＣ Ｒ＝ＡまたはＧ Ｗ＝ＡまたはＴ Ｓ＝ＣまたはＧ Ｙ＝ＣまたはＴ Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ Ｎ＝ＡまたはＧまたはＣまたはＴ。
  18. 【請求項１８】 遺伝子が次のヌクレオチド配列を有す
    るＤＮＡを含むものである、請求項１１〜１４のいずれ
    か１項に記載の微生物： 【表８】
  19. 【請求項１９】 酵母菌がサッカロミセス属から選択さ
    れる、請求項１３に記載の微生物。
  20. 【請求項２０】 酵母菌がサッカロミセス・セレビシエ
    から選択される、請求項１９に記載の微生物。
JP9082921A 1986-10-22 1997-04-01 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産 Expired - Lifetime JP2834111B2 (ja)

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