JPH07117537B2 - 免疫診断用試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な免疫診断用試薬を提供する。

尚本発明に於いて、平均粒子径（）とは無機化合物／
染料複合体粒子（以下単に特定複合体粒子とも呼ぶ）を
透過型電子顕微鏡で観察し、粒子の長手方向の直径を測
定し、その平均の直径を算出したものを云う。また本発
明に於いて、粒子分散性とは粒子容積が の範囲に含まれる粒子の全粒子に対する含有割合（％）
で表示したものを云う。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕

従来無機化合物の微粒子は種々のものが知られているが
その大部分は凝集性のゲル状物であり免疫診断用試薬に
用いる担体に使用出来るものは提案されるに至っていな
い。免疫診断用試薬に用いる担体としてはゲル状物が使
用出来す、非凝集性のしかも分散性が良好な粒子の開発
が未だ実現していない。特に免疫診断用試薬のうち、マ
イクロタイター法に使用するものは免疫反応における凝
集反応の終点を精度よく診断する必要があるため種々の
制約が加わる。例えば非凝集性であること、比重が大き
いこと、着色が均一であること等の制約を要求される。
しかし、従来はこのような性状を有する無機化合物の微
粒子は提供されるに至っていない。従って本発明の目的
は分散性が良好な無機化合物に免疫活性物質を感作した
優れた免疫診断用試薬を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は均一な着色を有し且つ粒子の分散性の良好
な微粒子の製法について鋭意研究を行って来た。その結
果、染料及び加水分解に供し、加水分解されて無機化合
物となる原料被加水分解化合物（以下単に被加水分解化
合物とも云う）の少くとも一部は溶解するが反応生成物
は溶解しない、中性又はアルカリ性の含水溶媒中に、該
溶媒に溶解しない核部となる微粒子の無機化合物を存在
させ、該溶媒に被加水分解化合物と染料を滴下し加水分
解を行うことにより、平均粒子径が0.1〜10.0μｍ且つ
粒子分散性が80％以上で、核部と該核部の表面にある着
色層との２層構造よりなる粒子であり、該核部は無機化
合物で形成され且つ該着色層は染料と無機化合物との混
合物で形成されてなる無機化合物／染料複合体粒子が製
造出来ることを見出した。

この知見に基づき更に研究を続けた結果、免疫学的凝集
反応を鋭敏性及び迅速性に優れ且つ鮮明な凝集反応像を
示す免疫診断用試薬の担体として著しくすぐれている複
合体粒子を開発し、該複合体粒子に免疫活性物質を感作
させた免疫診断用試薬を完成しここに提案するに至った
のである。以下本発明を詳細に説明する。

即ち、本発明者らは、平均粒子径が0.1〜10.0μｍ且つ
粒子分散性が80％以上で、核部と該核部の表面にある着
色層との２層構造よりなる粒子であり、該核部は無機化
合物で形成され且つ該着色層は染料又は染料と無機化合
物との混合物で形成されてなる無機化合物／染料複合体
粒子に免疫活性物質を感作した免疫診断用試薬を発明し
た。更に本発明者らは、改良を加え、一層染色安定性や
分散性の高い免疫診断用試薬を完成した。即ち本発明は
上記無機化合物／染料複合体粒子が染料を含まない無機
化合物よりなる核部、染料又は染料と無機化合物との混
合物で形成される該核部の表面にある着色層、更に該着
色層を保護するため該着色層より染料の含有量が少ない
染料と無機化合物との混合物か染料を含まない無機化合
物で形成される該着色層を被覆した固定被覆層の少くと
も３層構造よりなることを特徴とする無機化合物／染料
複合体粒子に免疫活性物質を感作した免疫診断用試薬を
も提供するものである。

本発明で使用する特定複合体粒子はその平均粒子径
（）が0.1〜10.0μｍ好ましくは0.8〜5.0μｍの範囲
にあることが必要である。上平均粒子径（）は既に定
義した如く、特定複合体粒子を透過型電子顕微鏡で観察
し、粒子の長手方向の直径を測定しその平均の直径を算
出したものをいう。後述する実施例に於いては特定複合
体粒子の200個をアトランダムに取り出し該透過型電子
顕微鏡で観察し、粒子の長手方向の直径を測定し、平均
を算出して平均粒子径（）として表示した。

本発明で使用する特定複合体粒子の平均粒子径（）が
前記範囲より小さいとき即ち0.1μｍより小さいときは
免疫診断用試薬の担体として該粒子を使用する場合、沈
降速度が小さいため判定時間に長時間を必要とするので
好ましくない。また逆に該平均粒子径（）が10.0μｍ
より大きくなると免疫診断用試薬の担体として該粒子を
使用する場合、凝集像が不鮮明となり易く、鋭敏性が大
きく低下する傾向があるので好ましくない。

また本発明で使用する特定複合体粒子はその粒子分散性
が80％以上好ましくは90％以上であることが必要であ
る。該粒子分散性は既に定義した如く、粒子容積が の範囲に含まれる粒子の全粒子に対する含有割合（％）
である。該粒子分散性の要因は特定複合体粒子を免疫診
断用試薬の担体として使用するとき最も重要な要件とな
る。該粒子分散性が80％より小さくなると免疫診断用試
薬の担体として該特定複合体粒子を使用したとき凝集像
と被凝集像の判定が困難になるので好ましくない。該粒
子分散性は免疫診断用試薬の担体として使用するうえで
は良好な程好ましく、90％以上となれば更に好ましい。
また前記粒子分散性を表示する粒子容積の式が の範囲に含まれる粒子が全粒子に対する含有割合（％）
で80％以上好ましくは90％以上となる特定複合体粒子で
あればなお良好である。本発明の粒子分散性は如何なる
方法で測定してもよいが、一般には同一容積を測定する
装置例えばコールタールカウンター社製モデルZD−１を
利用すれば簡単に測定することが出来る。

本発明で使用する特定複合体粒子は前記形状の特徴を有
するものであれば他の形状は特に限定されず、多面体、
柱形体、円錐体、球状体等の形で存在する粒状体であれ
ばよい。特に球状体、就中真珠状体のものは前記粒子分
散性がすぐれているので好適である。

また本発明で使用する特定複合体粒子を免疫診断用試薬
の担体として使用するときは該試薬の使用形態に応じて
該複合体粒子の比重を選択することがしばしば有効な場
合がある。本発明で使用する特定複合体粒子の比重は特
に限定されるものではないが、一般には1.5〜4.0好まし
くは1.8〜2.5の範囲で制御したものが最も広く利用され
うる。特にマイクロタイター用試薬の担体として用いる
場合、抗原−抗体反応による凝集像と非凝集像の形成可
能な範囲内で沈降速度が速く、短時間に凝集像または非
凝集像の判定をする目的のために前記比重を選ぶのが好
ましい。

本発明で使用する特定複合体粒子は前記形状の特徴の他
に下記のような構造上の特徴を有しているものが好まし
い。即ち核部と該核部の表面にある着色層更に必要に応
じて該着色層を更に被覆した固定被覆層とよりなる２層
或いは３層以上の多層構造よりなる粒子であり、該核部
は無機化合物で形成され且つ該着色層は染料又は染料と
無機化合物との混合物で形成され更に固定被覆層の着色
層より染料の含有量が少ない染料と無機化合物との混合
物又は染料を含まない無機化合物で形成されている。

上記核部は本発明で使用する特定複合体粒子の平均粒子
径が0.1〜10.0μｍである制約がある関係上、該粒子径
より小さい粒子であることは明白で、一般に0.01〜8.0
μｍ好ましくは0.07〜4.0μｍの粒子径からなってい
る。そして該核部自身、分散性が良好である方が好適で
ある。また本発明で使用する特定複合体粒子の核部の素
材は特に限定されず、公知の無機化合物が使用出来る。
特に好適に使用される無機化合物を具体的に例示すれ
ば、アルミニウム、チタニウム、ジルコニウム、ハフニ
ウム、錫、鉛、鉄、コバルト、ニッケル等の周期律表第
III族、第IV族または第VIII族の金属の酸化物又はホウ
素、ケイ素、ゲルマニウム等の周期律表第III又は第IV
族の半金属の酸化物等である。また上記無機化合物とし
ては次ぎのような複合酸化物も好適に使用される。即ち
上記周期律表第III族、第IV族又は第VIII族の相互金属
間の複合酸化物或いは上記金属と周期律表第Ｉ族、第II
族又は第Ｖ族の金属との複合酸化物である。上記周期律
表第Ｉ族、第II族及び第Ｖ族の金属に特に限定されない
が一般にはリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシ
ウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、リン、
アンチモン、ビスマスバナジウム、ニオブ、タンタル等
が好適である。また、一般に上記複合酸化物にあっては
その主な成分は前記周期律表第III族、第IV族または第V
III族の金属成分であるのが好ましく、これらの金属を8
0モル％以上含むものが特に好ましい。

また更に該核部を構成する無機化合物としては炭酸カル
シウム、炭酸マグネシウム等の炭酸塩や硫酸バリウム、
硫酸ストロンチウム等の硫酸塩も使用出来る。該特定複
合粒子に於いて上記核部を形成する無機化合物として最
も好適に使用されるものはシリカ、アルミナ、チタニ
ア、ジルコニア或いはこれらを主な構成成分とする複合
酸化物である。これらの金属酸化物、半金属酸化物又は
複合酸化物は公知の化合物であり、その製法も特に限定
されるものではない。代表的なこれらの化合物の製法は
例えばジャーナル オブ コロイド アンド インタフ
ェース サイアンス（Journal of colloid and interfa
ce science）26、62〜69（1968）、特開昭52−138094号
公報、英国特許第2,115,799号公報等に記載された手段
またはこの手段に準じて実施すればよい。また上記複合
酸化物の代表的なものは上記英国特許第2,115,799号公
報に示される、シリカと周期律表第Ｉ族、第II族、第II
I族及び第IV族からなる群より選ばれた少くとも１種の
複合金属酸化物であり、一般には該シリカが80モル％以
上含まれるものである。

本発明で使用する特定複合体粒子を構成する上記核部の
表面にある着色層は染料又は染料と無機化合物との混合
物で形成されている。該着色層が染料を含む必要性は、
先ず第一に免疫診断用試薬の担体として使用するときに
均一な着色性を付与するためである。染料以外にも例え
ば金属酸化物にあってもコバルト酸化物の如く着色性の
ものがあるが、湿度、イオン濃度、酸化条件等の影響を
受けて均一な着色性を期待することは出来ず、上記染料
に代る化合物とはなり得ない。また第二の理由は染料が
種々の機能性材料であり、電気伝導性、光電池性、フォ
トクロミック性等必要に応じた機能性を特定複合体粒子
に付与出来るからである。その他染料を使用することに
より色調及び着色度が多様に選択出来る利点があり、し
かも低含有量でこれらの性状を付与出来る利点がある。
従って前記着色層の構成成分として染料が混合されてい
ることは極めて重要な要因となる。上記染料は単独で使
用出来るが２種以上を混合して使用することも可能であ
る。該染料を混合して使用することは色調をさらに幅広
く調製出来るのでしばしば好適な態様となりうる。

前記着色層の構成成分としての染料は特に限定されず公
知の染料から必要に応じて選択して用いればよい。一般
的にはカチオン染料が最も効果的であり、次いで含金属
染料、更に次いで反応染料及び蛍光増白染料が好適であ
る。また用途によっては上記各種染料より多少劣るケー
スもあるが分散染料、直接染料、酸性染料、酸性媒染染
料その他の染料も十分に使用出来る。特に好適に使用さ
れるこれらの各染料についてその代表的なものをより具
体的に例示すれば下記の通りである。

カチオン染料としてはマラカイトグリーン、ローダミン
Ｂ、メチレンブルー、オーラミン、マジェンタ、ビスマ
ルクブラウン、メチルバイオレット、クリスタルバイオ
レット、ダイアクリル（三菱化成（株）の登録商標）、
スムアクリル（住友化学（株）の登録商標）、アイゼン
カチオン（保土谷化学（株）の登録商法）等が揚げら
れ、分散染料としてはダイアニックス（三菱化成（株）
の登録商標）、ディスパゾール（アイ・シー・アイ社の
登録商標）、ミケトンポリエステル（三井東圧化学
（株）の登録商標）、リゾライン（バイエル社の登録商
標）、スミカロン（住友化学（株）の登録商標）、テラ
ジル（チバ・ガイギー社の登録商標）等が挙げられる。
また、直接染料としてはコンゴーレッド、ダイレクトデ
ィープブラックEW、クリソフェニンＧ、ベンザミン（バ
イエル社の登録商標）、キュプロフェニール（チバ・ガ
イギー社の登録商標）、ジャパノール、スミライト（住
友化学（株）の登録商標）、ダイアコットン（三菱化成
（株）の登録商標）、リゾフィックス（サンド社の登録
商標）等が挙げられ、酸性染料としては、アリザリンサ
フィロールＢ、アリザリンダイレクトブルーＡ、アリザ
リンシアニングリーンＧ、カルボラングリーンＧ、ダイ
アシッド（三菱化成（株）の登録商標）、カルボラン
（アイ・シー・アイ社の登録商標）、アミド、アント
ラ、アントラン（ヘキスト社の登録商標）、スミノール
（住友化成（株）の登録商標）等げ挙げられる。さら
に、酸性媒染染料としては、ダイヤモンドブラックＦ、
クロムファストネビーブルーＢ、パラチンファストブル
ーBN、アントラセン（サンド社の登録商標）、ミツイ
（三井東圧化学（株）の登録商標）、ソロクロム（アイ
・シー・アイ社の登録商標）、サンクロミン（住友化成
（株）の登録商標）等が挙げられ、含金属染料として
は、アシドール（BASF社の登録商標）、アイゼンオパル
（保土谷化学（株）の登録商標）、オレオソール（田岡
化学の登録商標）、ラナファスト（三井東圧化学（株）
の登録商標）、ラニール、スミラン（住友化学（株）の
登録商標、イソラン（バイエル社の登録商標）等が挙げ
られ、反応染料としては、セルマゾール（三井東圧化学
（株）の登録商標）、ダイアミラ、ミカシロン（三菱化
成（株）の登録商標）、スミフィックス（住友化学
（株）の登録商標）、レバフィックス（バイエル社の登
録商標）、レマゾール（ヘキスト社の登録商標）等、蛍
光増白染料としてはミカホワイト（三菱化成（株）の登
録商標）、ホワイトテックス（住友化学（株）の登録商
標）等が挙げられる。

本発明で使用する特定複合体粒子の着色層の構成は染料
のみで形成してもよく、また染料と無機化合物との混合
物で形成してもよい。該無機化合物は前記核部の成分と
同様の化合物が特に限定されず使用出来る。該無機化合
物を染料との混合物として使用する態様はしばしば好ま
しい。その理由は例えば燃料の発色性が紫外線によって
劣化するのを防ぎ保存性能を良くすること、染料を高濃
度に保ち取扱い易くすること等である。従って、染料と
該無機化合物との混合物として該着色層を形成するとき
は両成分は化学的又は物理的な手段で容易に分離しない
ものが好ましく、出来れば化学的に結合しているものが
好ましい。このような性状の混合物は特定複合体粒子の
製造方法、該製造に使用する原料の種類等によって異な
るので予め決定するのが好ましい。本発明の着色層に於
ける染料と無機化合物との組成比はその使用目的によっ
て異なり一概に限定することは出来ないが、一般には染
料が特定複合体粒子中に0.01〜30重量％、好ましくは0.
1〜５重量％の範囲で含まれるように選択するのが好適
である。これらの場合、一般に染色は80％以上、実質的
には特定複合粒子中の染料層に止まる。

本発明の特定複合体粒子は前記の如く、核部という着色
層及び固定被覆層の少なくとも３層構造よりなる粒子で
あるが、該核部と着色層との厚みは特に限定されず使用
目的に応じた性状に基づいて決定すればよい。一般には
該核部が該特定複合体粒子の直径の1/5〜4/5、好ましく
は1/5〜2/5の範囲となるように選ぶのが好適である。

本発明で使用する特定複合体粒子は前記の如く核部とそ
の表面にある着色層更にその上面に固定被覆層を有する
３層構造を有していればよく、必要に応じて、更に着色
層、固定被覆層、その他の層を重ね４層以上の多層構造
とすることも好適な場合がある。固定被覆層又は第４層
以上の多層構造とする場合は前記染料の発色性の安定保
存性、取扱いの容易性等の目的から最外部層は出来るだ
け染料を含有しない無機化合物で構成させるのが好まし
い。しかし該最外部層には染料が含有されている層を排
除すると云う意味ではなく、一般には核部の表面にある
着色層に含まれる染料に較べて例えば20重量％程度まで
の染料の含有量であれば不利になる要素は少ない。

また固定被覆層、即ち３層目、又はその上に形成させる
４層目以上の多層構造とする場合の層の厚みは特に限定
されるものではなく使用目的に応じて適宜決定すればよ
いが、一般には特定複合体粒子の直径の2/5〜1/10好ま
しくは2/5〜1/5の範囲が好適である。

本発明で使用する特定複合体粒子は前記説明した如く新
規な粒子である。特に有機化合物である染料又は染料と
無機化合物との混合物が無機化合物の核部に厚く成長
し、粒子分散性が80％以上の粒子状として存在すること
は驚ろくべき現象である。

上記複合体粒子の製造方法は特に限定されるものではな
いが、代表的なものを例示すれば次ぎの通りである。

上記複合体粒子の製法にあっては、原料となる染料及び
被加水分解化合物は溶解するが加水分解物は溶解しない
溶媒が使用される。該溶媒は染料或いは被加水分解化合
物の種類に応じて上記性状のものを予め決定して使用す
ればよい。但しこれらの原料は完全に溶解する必要はな
く、その一部を溶解するものであれば使用出来る。通常
好適に採用される溶媒について具体的に示せば例えば、
後述する反応性、操作性、入手が容易なこと等の理由
で、一般にはメタノール、エタノール、イソプロパノー
ル、ブタノール、イソアミルアルコール、エチレングリ
コール、フロピレングリコール等のアルコール溶媒が好
適に用いられる。またジオキサン、ジエチルエーテル等
のエーテル溶媒、酢酸エチルなどのエステル溶媒等の有
機溶媒を上記アルコール溶媒に一部混合して用いること
もできる。

前記溶媒中には後述する如く被加水分解化合物が加水分
解される必要があるので水が含有されている必要があ
る。該水の含有量は被加水分解化合物の種類又は溶媒の
アルカリ性度等によっても異なり一概に限定することが
出来ない。一般には0.05〜５重量％の範囲から選べば好
適である。前記具体的に例示した溶媒にあっては例えば
アルコールの如く、一般に上記範囲の水は含まれるもの
があり、このような溶媒にあっては特に含水量を制御す
る必要がない。

また上記溶媒は、通常中性又はアルカリ性の状態で使用
するが一般的である。溶媒が酸性である場合は加水分解
によって得られる特定複合体粒子の粒子分散性が著しく
小さく、ほとんどのケースに於いてゲル状の粉状物とな
り目的とする粒子を得ることが出来ないので好ましくな
い。また該溶媒をアルカリ性とする手段は如何なる方法
でもよいが一般にはアンモニア水または水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等の水酸化アルカ
リを添加するか、或いはこれらの化合物を併用する方法
が好適である。これらの化合物の添加量も特に限定せず
適宜決定して用いればよいが、一般にはアンモニマ水を
用いるときはアンモニア濃度が５〜30重量％、好ましく
は10〜25重量％の範囲となるように選べば好適である。
またアンモニア水と水酸化アルカリとを併用するときは
水酸化アルカリの添加量によって得られる粒子の大きさ
を制御出来るのでしばしば好適な態様として使用され
る。例えば上記アンモニア水に水酸化アルカリ濃度が0.
05〜0.15重量％の範囲で使用され、該水酸化アルカリ濃
度が増加するに従って得られる粒子径が大きくなる傾向
を示す。

特定複合体粒子の製法にあっては、前記含水溶媒中に、
該溶媒に溶解しない核部となる無機化合物を存在させて
おき、該溶媒に被加水分解化合物と染料を滴下し加水分
解反応を行うのが好ましい。

該核部となる無機化合物は前記したものが使用出来る
が、一般には後述する被加水分解化合物を溶媒中で予め
加水分解し、該溶媒に溶解しない化合物を析出させ、該
析出物を上記核部とする方法も好適に採用される。該溶
媒中に存在する核部の濃度は特に限定されず、必要に応
じて予め決定して使用すればよいが一般には0.1〜10重
量％の範囲から選ぶのが好適である。

染料及び被加水分解化合物は上記核部が存在する溶媒に
滴下される。従って該染料は予め溶媒に溶解させて用い
るか被加水分解化合物で溶液状のものに溶解させて用い
るのがよい。また被加水分解化合物も同様に溶液状にし
て使用するのが好ましい。勿論染料と被加水分解化合物
を同一の溶媒に溶解して、前記含水溶媒に同時に滴下す
ることも、別々の滴下装置から該含水溶媒に別々に滴下
することも必要に応じて選択できる。

また前記原料を溶解した溶液の濃度は一般に低い方が好
ましいが、低くすぎると溶媒の使用量が著しく増大する
し、濃度が高すぎると反応の制御が難しくなったり取扱
いが不便になるので、これらを勘案して適宜決定すれば
らい。一般には原料濃度が60重量％以下、好ましくは５
〜50重量％の範囲の濃度として使用するのが最も好まし
い。

更にまた上記染料及び被加水分解化合物の滴下速度は得
られる複合体粒子の粒子径及び粒子分散性に影響を与え
るので、他の条件に応じて予め決定して使用するのが好
ましい。一般には含水溶媒の量の0.5〜10重量％好まし
くは0.5〜２重量％の量を１時間かけて滴下させること
を目やすにすればよい。例えば含水溶媒２使用すれ
ば、原料は10〜200ml/時間の速度を目やすとすればよ
い。

前記原料として使用する被加水分解化合物はその一部例
えば10％以上が溶媒に溶解し、加水分解可能であるもの
であれば特に限定されず用いうる。一般に好適に使用さ
れる被加水分解化合物は前記核部を構成する成分として
説明した金属のアルコキサイドである。即ち一般式M
_x（OR）_ｘ（但し、Ｍは金属又は半金属を示し、ｘはＭ
の原子価を示す）で示されるアルコサイド化合物が好ま
しい。該一般式中、Ｒはアルキル基で、一般にはメチル
基、エチル基、イソプロピル基、ブチル基等の低級アル
キル基が好適に使用される。また上記金属のアルコキサ
イドは加水分解によって単独で金属酸化物の着色層を形
成しうるものもあるが、他の金属成分と複合酸化物を形
成しなければ該着色層を形成し得ないものもある。これ
らの区別は予め加水分解することで簡単に決定出来るの
で、実施に際し、予め決定するとよい。一般には前記核
部を構成する無機化合物について説明したと同様の傾向
がある。即ち一般には周期律表第III族、第IV族又は第V
III族の金属の酸化物は単独で上記着色層を形成しうる
が、周期律表第Ｉ族、第II族又は第Ｖ族の金属は上記周
期律表第III族、第IV族又は第VIII族の金属との間で複
合酸化物として使用するのが好適である。更にまた上記
一般式中、Ｍは前記性状を示すものであれば特に限定さ
れず使用することが出来るが一般に好適に使用されうる
ものを例示すれば次の通りである。即ち、一般には一般
式M¹（OR¹）、M²（OR¹）_２、M³（OR¹）_３、M⁴（O
R¹）_４、M⁵（OR¹）_５、M⁸（OR¹）_３、 （ただし、R¹はアルキル基）で表示される金属のアルコ
キサイドまたは上記一般式中の一つまたは二つのアルコ
キシル基（OR¹）がカルボキシル基で置換された化合物
が好ましい。ここでM¹は第Ｉ族の金属、M²は第II族の金
属、M³は第III族の金属、M⁴は第IV族の金属、M⁵は第Ｖ
族の金属、M⁸は第VIII族の金属で、具体的には、例えば
リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カル
シウム、ストロンチウム、バリウム、アルミニウム、チ
タニウム、ケイ素、ジルコニウム、ゲルマニウム、ハフ
ニウム、錫、鉛、リン、バナジウム、ニオブ、タンタ
ル、鉄、コバルト、ニッケル等が好適に使用される。一
般に好適に使用される上記化合物を具体的に例示する
と、NaOCH₃、NaOC₂H₅、NaOC₃H₇等のナトリウムアルコキ
サイド及び上記Naに代って、Li、Ｋ等で代替した第Ｉ族
金属のアリコキサイド;Mg（OCH₃）_２、Mg（OC₂H₅）_２、
Mg（OC₃H₇）_２、Mg（OC₄H₉）_２、Mg（OC₅H₁₁）_２等のマ
グネシウムアルコキサイド及び上記Mgに代って、Ca、S
r、Ba等で代替した第II族きアルコキサイド;Al（OC
₂H₅）_３、Al（OC₃H₇）_３、Al（OC₄H₉）_３等のアルミニ
ウムアルコキサイド及び上記Alに代って、Ｂなどで代替
した第III族金属のアルコキサイド； Ti（Ｏ−isoC₃H₇）_４、Ti（Ｏ−nC4H9）_４、 Ti（Ｏ−CH₂CH（C₂H₅）C₄H₉）_４、Ti（Ｏ−C
₁₇H₃₅）_４、 Ti（Ｏ−isoC₃H₇）_２、〔OCH（CH₃）CHCOCH₃〕_２、 Ti（Ｏ−nC₄H₉）_２〔OC₂H₄N（C₂H₄OH）_２〕_２、 Ti（OH）_２〔OCH（CH₃）COOH〕_２、 Ti（OCH₂CH（C₂H₅）CH（OH）C₃H₇）_４、 Ti（Ｏ−nC₄H₉）_２（OCOC₁₇H₃₅）_２等のチタンアルコキ
サイド及び上記Tiに代ってSi、Zr、Ge、Hf、Sn、Pb等で
代替した第IV族金属のアルコキサイド； Ｖ（OC₂H₅）_４、Ｖ（Ｏ−isoC₃H₇）_４、Ｖ（Ｏ−nC
₄H₉）_４、 Ｖ（Ｏ−tertC₄H₉）_４等のバナジウムアルコキサイド及
び上記Ｖに代ってNb、Ta、Ｐ、Sb、Bi等で代替した第Ｖ
族金属のアルコキサイド;Fe（OC₂H₅）_３、Fe（Ｏ−nC₃H
₇）_３、Fe（Ｏ−nC₄H₉）_３、Fe（Ｏ−secC₄H₉）_３、Fe
（Ｏ−tertC₄H₉）_３等の鉄アルコキサイド及び上記Feに
代って、Co、Ni等で代替した第VIII族金属のアルコキサ
イド等である。また、CaCl₂、Ca〔HOC₆H₄COO〕_２・2H₂O
などの化合物も上記の金属のアルコキサイドに混合して
使用できる。

被加水分解化合物は前記説明した如く１種だけを使用す
る必要はなく、同時に２種以上を使用することもしばし
ば好ましい態様となる場合がある。また例えば英国特許
第2,115,799号公報実施例に記載されている如くアルコ
キシシランの低縮合物と他の金属のアルコキシドを予め
混合し混合溶液を調製し、この調製した混合溶液を原料
として使用することも出来る。

特定複合体粒子の他の原料となる染料は一部例えば溶媒
100重量部に対して１重量部以上好ましくは５重量部以
上、更に好ましくは10重量部以上を溶解するものであれ
ば特に限定されず用いうる。一般的には前記着色層の構
成成分として説明した各種染料が好適に使用出来る。ま
た該染料は一般に0.001〜１重量％の濃度で使用するの
が好ましい。更には溶媒中に常に0.05〜0.5重量％好ま
しくは0.05〜0.2重量％の染料が存在するように選んで
もよい。

前記原料は溶媒中で直ちに加水分解反応を起し粒子状で
不溶性の析出物となる。該加水分解の条件は特に限定さ
れず、如何なる条件をも選び得るが一般には撹拌又は非
撹拌下に５〜50℃好ましくは10〜30℃の範囲の温度で実
施すると好適である。

前記方法て加水分解して得られる析出と無機化合物との
複合体粒子は平均粒子径（）が0.1〜10.0μｍのもの
で非凝集性のもので、その粒子分散性も80％以上ほとん
どのケースで90％以上となる。このように溶媒中に核部
が存在していれば一見成長反応を阻害すると考えられる
染料の存在下でも加水分解反応が該核部に着色層を生成
させる形で進行することは全く驚ろくべき現象である。
しかも該染料は着色層に強固に固定され、該染料に応じ
た着色性の複合体粒子となる。このようにして得られた
複合体粒子は染料を含まない無機化合物よりなる核部に
染料と無機化合物との混合物で構成された着色層が存在
する複合体粒子となる。

また別の製法を例示すると次のような方法も好適であ
る。特定複合体粒子の核部となる金属酸化物粒子として
粒子分散性が良好な例えば80％以上の且つ多孔性粒子を
選び染料を溶解した溶液と該多孔性粒子の表層を接触さ
せることにより、該多孔性粒子に染料を含浸させた特定
複合体粒子が得られる。上記特定複合体粒子の製法にあ
っては多孔性粒子の選択が重要な要件となる。勿論該多
孔性粒子の製法は限定されるものではない。しかし一般
には次ぎのような方法で得られた多孔性粒子が特に好適
である。例えば周期律表第III族、第IV族又は第VIII族
の金属とカリウム、ナトリウム、リチウム等のアルカリ
金属とよりなる複合酸化物を前記金属アルコキサイドの
加水分解法によって製造する。次いで得られた複合酸化
物を硫酸、硝酸、塩酸等の鉱酸溶液と接触させることに
よって含有アルカリ金属成分を溶出させると、得られる
粒子は多孔性でしかも粒子分散性が80％以上のすぐれた
ものとなる。このような粒子を使用することにより、前
記染料を含浸させた即ち核部の表面に染料が存在した特
定複合体粒子となる。該特定複合体粒子は必要に応じて
乾燥して使用に供するか後処理に供すればよい。

場合によっては前記染料又は染料と無機化合物との混合
物で構成された着色層から該染料が溶出することもあ
る。従って、本発明にあっては、該着色層に更に染料含
有量が少ない無機化合物又は染料を全く含まない無機化
合物の固定被覆層を被覆させた３層構造或いは該３層構
造に更に前記積層をくりかえし４層以上の構造とした特
定複合体粒子とする。該３層以上の多層構造とする手段
は特に限定されず如何なる手段を利用してもよい。一般
に好適に採用される方法を例示すれば、前記核部となる
無機化合物が存在する含水溶媒中に染料及び被加水分解
化合物を滴下し、該原料を加水分解させ２層構造の粒子
を生成させた後、或いは染料を含浸した多孔性粒子を製
造した後同一の反応容器中に該被加水分解化合物のみを
更に滴下し加水分解を行う方法或いは前記２層構造の粒
子又は染料含浸の多孔性粒子の製造系から未反応又は未
含浸の染料を分離し、次いで被加水分解化合物を更に滴
下し加水分解させて特定複合体粒子を得る方法である。
前者即ち反応を同一系で行う場合は３層構造の複合体粒
子が得られるが、３層目の固定被覆層は核部への着色層
が形成されるとき消化された残りの染料が溶媒中に溶解
されているにもかかわらず、滴下する被加水分解化合物
溶液中に染料が含まれていないときは著しく染料の含有
量が少ない組成のものとなる。この場合は通常核部に直
接形成されている着色層に含まれる染料の約1/5程度又
はそれ以下、好ましくは1/10以下となる。かかる現象も
一般的反応からすると驚異的な現象であるがその作用は
現在のとこら明らかではない。従って、前記の特定複合
体粒子の製法は特別の反応形式をとる必要はなく唯一の
反応器で３層以上の層を積層することによって得ること
も出来る。そしてこのようにして得られた複合体粒子に
あっては３層目に少量の染料が含まれても染料が溶出す
ることはほとんどないすぐれた球状の粒子となる。

以上のことから、無機化合物の核と着色層の製法を一連
の操作で行う場合の染料の添加時期は、得られる特定複
合体粒子の粒子径を特定の範囲に調製するため及び特定
複合体粒子からの染料の溶出を防止するために、核と着
色層の形成に要する全合成時間を１としたときに、0.1
〜0.9、特に好ましくは0.2〜0.8で示される時間内に染
料の添加を開始し、また完了することによって目的の特
定複合体粒子とすることが出来る。

前記３層構造以上の多層構造の特定複合体粒子を得ると
き、核部の表面にある着色層を被覆した２層構造の粒子
から未反応又は未含浸の染料を分離後例えば該粒子製造
に使用したと同一溶媒で数回洗浄後、該粒子を含む溶媒
中に染料を含まない被加水分解化合物を液滴下し該被加
水分解化合物を加水分解すれば、３層構造目の固定被覆
層は染料をほとんど含まない層となる。

４層構造以上の多層構造の該複合体粒子にあっては着色
層の着色度合をより詳細に表示するため前記固定被覆層
を透光性の材料から選ぶのが好ましい。この意味では固
体被覆層は周期律表第III族又は第IV族の金属或いは該
金属と周期律表第Ｉ、第II族又は第Ｖ族の金属との複合
酸化物であるのが好ましい。

本発明で使用する特定複合体粒子は、免疫診断用試薬の
担体に用いるとき生理食塩水または緩衝液に対して難溶
性を示すものであることが好ましい。該複合体粒子の生
理食塩水または緩衝液に対する難溶性をより一層高め、
かつ蛋白質等の免疫活性物質の感作の効率を向上させる
ため該複合体粒子を表面処理することもしばしば好適な
手段である。この表面処理方法は、特に限定的でなく、
公知の方法が好適に採用される。例えばシランカップリ
ング剤あるいはチタンカップリング剤などにより表面処
理できる。シランカップリング剤としては、ビニルトリ
クロロシラン、ビニル−トリス（β−メトキシエトキ
シ）シラン、γ−メタクリロキシプロピルトリメトキシ
シラン、γ−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシ
シラン、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシラ
ン、γ−クロロプロピルトリメトキシシラン、β−（3,
4−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラ
ン、トリメチルクロロシラン、ジメチルジクロロシラ
ン、ヘキサメチルジシラザン、メチルトリエトキシシラ
ン、フェニルトリエトキシシラン等が挙げられる。チタ
ンカップリング剤としては、イソプロピルトリイソステ
アロイルチタネート、イソプロピルトリデシルベンゼン
スルホニルチタチート、イソプロピルトリスジオクチル
パイロホスフェートチタネート、テトライソプロピルビ
スジオクチルホスファイトチタネート、テトラオクチル
ビスジトリデシルホスファイトチタネート、ビスジオク
チルパイロホスフェートエチレンチタネート、イソプロ
ピルトリオクタノイルチタネート、ジイソステアロイエ
チレンチタネート等が挙げられる。上記以外にも表面処
理剤として有機ジルコアルミネート化合物等既知のもの
が使用できる。また、表面処理法は既知の方法すなわち
乾式法及び湿式法のいずれも使用できるが、分散状態の
まま処理する湿式法が好ましく採用される。表面処理に
おいては、表面処理剤濃度、処理温度、処理時間等の処
理条件によって、複合体粒子の疏水性が大きく変化する
ので目的に応じて処理条件を選択すればよい。

以上のようにして得られた複合体粒子は、染料の種類に
よって任意の色に着色でき、また、特定の粒子径を有し
ており免疫診断用試薬の担体として好適に使用し得る。

以下に、前記の複合体粒子を免疫診断用試薬の担体とし
て用いるケースについて詳述する。

前記の複合体粒子に感作させる免疫活性物質は、特に限
定的でなく、例えば特開昭54−28816号公報、癌（Gan
n）75、845〜848（1984）等に記載された公知のものが
使用できる。代表的なものを例示すれば、例えば、変性
ガンマグロブリン、抗核因子、ヒトアルブミン、抗ヒト
アルブミン抗体、イムノグロブリンＣ（IgG）、抗ヒトI
gG抗体、イムノグロブリンＡ（IgA）、抗ヒトIgA抗体、
イムノグロブリンＭ（IgM）、抗ヒトIgM抗体、抗ヒトIU
gE抗体、ストレプトリジンＯ、ストレプトキナーゼ、ヒ
アルロニダーゼ、Ｃ−反応性蛋白（CRP）、抗ヒトCRP抗
体、アルファーフェトプロテイン（AFP）、抗AFP抗体、
癌胎児性抗原（CEA）、抗ヒトCEA抗体、ヒト繊毛性ゴナ
ドトロピン（HCG）、抗HCG抗体、抗エストロゲン抗体、
抗インシュリン抗体、Ｂ型肝炎表面抗体（HBs）、抗HBs
抗体、梅毒トレポネマ抗原、風疹抗原、インフルエンザ
抗原、補体CIq、抗CIq抗体、抗C₃抗体、抗C₄抗体、抗ト
ランスフェリン抗体等の公知の免疫活性物質をあげるこ
とができる。

またこれらの免疫活性物質、とくに抗原に関しては例え
ばサイエンス（Science）、232、1135〜1137（1986）等
に記載された化学合成や遺伝子工学により人工的に免疫
活性物質も同様である。

さらに、上記以外に感作する生理活性物質も特に限定的
でなく、公知のものが使用できる。例えば、酵素として
西洋ワサビパーオキシダーゼ、グルコース酸化酵素、ス
ーパーオキサイドディスムターゼ、チトクロームａ、
ｂ、b₁、ｃ、p450等；ホルモンとして下垂ホルモン（Pi
tuitary horrnones）、インシュリン、グルカゴン、サ
イロイドホルモン等；ハプテンとしてオヒアムカロイド
（モルフィネ）、アンチピリン、バルビツール酸等があ
げられる。

前記複合体粒子への免疫活性物質の感作方法は、疏水結
合に基づく吸着によって可能である。吸着は既知の方法
で可能であるが、具体的に例示すると、該複合体粒子を
既知の緩衝液または生理食塩水中に分散させ、この分散
液中に免疫活性物質を添加し、免疫活性物質が失活しな
いような温和な条件で撹拌し、複合体粒子表面に感作さ
せる。この際、残存する未感作の担体表面をアルブミ
ン、ゼラチン等生理活性物質で不活性化もしくはブロッ
クさせることもできる。

さらに、該複合体粒子は、前記の表面処理過程において
種々の官能基を導入することが可能である。例えばγ−
アミノプロピルトリエトキシシランを用いると複合体粒
子表面にアミノ基の導入が可能となる。このようにして
カルボキシル基、エポキシ基、アルデヒド基、ヒドロキ
シル基等の導入が可能となり、これ等の官能基と公知の
方法を利用して免疫活性物質を共有結合を用いて感作さ
せることができる。

例えば、（１）グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて
免疫活性物質のアミノ基と共有結合する方法、（２）１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミドハイドロクロライド等の架橋剤を用いて免疫活
性物質のカルボキシル基と共有結合する方法、（３）ジ
フェニルホスホリルアジド等の架橋剤を用いて免疫活性
物質のカルボキシル基と共有結合する方法、等が例示さ
れる。

特定複合体粒子に感作させる免疫活性物質の量は、各検
査項目に適している割合で固定化させればよく、一概に
限定されない。一般には免疫活性物質の量が多い程、免
疫診断用試薬の鋭敏性及び迅速性が上るため、鋭敏性及
び迅速性を要求する場合には、前記の無機化合物粒子に
飽和するまで、免疫活性物質を吸着させることが好まし
い。

例えば、本発明に用いる測定複合体粒子に感作させる免
疫活性物質の量は、無機化合物粒子の単位表面積当り0.
1〜7.0mg/m²の範囲、さらに好ましくは0.3〜5.0mg/m²の
範囲から選ぶことが好適である。

上記のようにして得られる免疫診断用試薬は粒子分散性
が80％以上、さらには90％以上であることが好ましい。

〔効果〕

特定複合体粒子を用いた免疫診断用試薬は、特にマイク
ロタイター検査法において、免疫学的凝集反応の鋭敏性
が大きいだけでなく、判定時間が短く、凝集像が鮮明で
あるという特徴がある。これは、前記により得られる免
疫診断用試薬が特定の粒子径の複合体粒子に免疫活性物
質を固定化していることと粒子分散性が80％以上である
ことに起因する。さらに、該特定複合体粒子は、染料に
より着色されているので、水中においても凝集反応の判
定を極めて容易に行うことができる。しかも、この染料
は、溶媒中に溶出することがほとんどないため、該特定
複合体粒子を溶媒中に長期保存しても、染料がおちるこ
とはない。従って、該複合体粒子を担体として得られる
免疫診断用試薬は従来のマイクロタイターテストを極め
て迅速に行えるだけでなく、公知の抗原抗体反応に基づ
く凝集反応を免疫診断試薬、例えば特開昭55−158540
号、同56−1143号等に記載された粒子カウント法やブロ
ード（Blood）、66［４］873〜881（1985）等に記載さ
れた混合受身凝集法に用いられる免疫診断試薬として好
適に使用され、更に標識化合物を固定化した酵素免疫測
定あるいは放射線免疫測定等にも広く応用される。

以下に実施例及び比較例を挙げて、本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明にこれらの実施例に限定されるも
のではない。

なお、以下の実施例における特定複合体粒子の性状は、
以下の方法により測定した。

（１） 平均粒子径（） 平均粒子径（）は透過型電子顕微鏡の観察でアットラ
ンダムに取り出した200個の粒子の長手方向の直径を測
定し、その平均の直径を算出したものである。

（２） 粒子径の分散値（SD） 粒子径の分散値（SD）は各粒子の粒子径の標準偏差を平
均粒子径で除して、100をかけた値である。

（３） 粒子分散値（PD） 粒子分散値（PD）はπ/6（±0.5）^３の範囲の体積
を有する粒子数を全粒子数で除し、100をかけた値
（％）で表示した。尚粒子体積の測定と粒子数のカウン
トはコールターカウンター社製モデルZD−１を用いて行
った。

（４） 核部の平均流紙型（） 核部を構成する無機化合物粒子について、該無機化合物
粒子を製造した後、前記（１）のの測定と同様にして
測定した。

（５） 染料の溶出量（SC） メタノールに溶解した染料濃度と該濃度に於ける吸光度
を分光分析し、該染料の吸光係数（ε）を求める。別
に、無機化合物／染料複合体粒子をメタノール5mlに５
重量％濃度となるように分散させ、１週間放置後上清4m
lを取り、分光分析し該上清の吸光度（Ａ）を求める。
染料の溶出量（Ｃ）を下式により算出した。

Ｃ＝A/ε （６） 無機化合物／染料複合体粒子中の染料含量（D
C） 先ず上記（５）と同様な方法で染料の吸光係数（ε）を
求める。別に、メタノールに無機化合物／染料複合体粒
子を0.5重量％濃度で分散し、この分散液の4mlをとり、
この重量と吸光度（Ａ′）を分光分析する。更に別に、
無機化合物／染料複合体粒子の核部を構成する無機化合
物で、該複合体粒子と同じ平均粒子径を有する無機化合
物粒子をメタノールに0.5重量％濃度で分散し、この分
散液の吸光度（Ａ″）を分光分析する。

上記測定結果より下記式で該複合体粒子中に含まれる染
料の重量（DW）を算出する。

DW＝（Ａ′−Ａ″）／ε 次いで、前記複合体粒子のメタノール分散液4mlの重量
からアルコール液重量を差引いて、該4mlの複合体粒子
重量（PW）を算出する。

最後に該複合体粒子中の染料含量（DC）を下記式で算出
する。

（７） 核部に接する着色層に含まれる染料の割合（CD
C） 無機化合物／染料複合体粒子をエポキシ樹脂埋設法で超
薄切片に切出し、該超薄切片を透過型電子顕微鏡で観察
する。該観察の結果、中心部の濃く見える部分（核
部）、その外側のうすく見える部分（着色層）及び３層
以上で複合体粒子が構成されている場合は、３層目以上
の外層部を分析顕微鏡で分析する。該分析で得られる炭
素の特定Ｘ線（289eV）の強度より炭素原子数を求め下
記式により核部に接する着色層に含まれる染料の割合
（CDC）を算出した。

実施例（１） 撹拌機付きガラス製フラスコ中にメタノール2800ml、ア
ンモニア水（25重量％）616ml、水酸化ナトリウム水溶
液（５モル／）21mlを加え10℃に保った後に、テトラ
エチルシリケートのメタノール溶液（22重量％）256ml
を22.5ml/hrの速度で滴々添加し、シリカ粒子（平均粒
子径0.91μｍ）をつくった。このシリカ粒子を含む反応
液中にさらにテトラエチルシリケートのメタノール溶液
（44重量％）624mlと表３に示す各種の染料のメタノー
ル溶液（1.25重量％）400mlを同時に25.5ml/hrの速度で
滴々添加し、先に該染料のメタノール溶液の滴下が終了
する様にし染料で着色したシリカ粒子を合成した。得ら
れたシリカ粒子をメタノールでデカンテーションによる
精製と洗浄を繰り返した。この染料を含有するシリカ粒
子は、いずれも球状であり、メタノール中で分散させて
も、染料の溶出は全くみられなかった。

また、表（１）No.1のシリカ粒子をエポキシ樹脂埋設法
で超薄切片に切出し該超薄切片を透過型電子顕微鏡で観
察した。その粒子構造を示す電子顕微鏡写真（40,000
倍）を第１図に示した。第１図から１つの核部、着色層
及び固定被覆層からなる３重構造であることが認められ
る。

また表（１）No.1の染料を含有するシリカ粒子について
その粒子分散値を第２図（ａ）に示した。

（１） 染料を含有するシリカ粒子の表面処理染料で着
色したシリカ粒子は、10重量％濃度になるようにメタノ
ール中に分散し、その分散液100mlに表１に示した表面
処理剤をそれぞれ0.5重量％濃度になるように添加し、1
0℃、16時間反応させて表面処理を行い、表面処理した
特定複合体粒子を得た。表1No.1の染料で着色したシリ
カ粒子の表面処理後の粒子分散性を第２図（ｂ）に示し
た。

（２） 熱変性ヒトIgGを固定化した特定複合体粒子の
調製 ヒトコーンＦII画分（シグマ社製）を1/150Mリン酸緩衝
液（pH7.4）に10mg/mlになるよう溶解し、60℃で60分間
加熱することにより熱変性ヒトIgGを得た。得られた熱
変性ヒトIgGをリン酸緩衝液で40倍に希釈したものを原
液とし、倍数希釈法により希釈した。この熱変性ヒトIg
Gの希釈液1mlと（１）で得られたそれぞれの表面処理し
た特定複合体粒子をリン酸緩衝液で１重量％に希釈した
溶液1mlを撹拌しながら室温で１時間混合した。次い
で、遠心分離して、固型分を少量の乳糖、ノニオン界面
活性剤及び牛血清アルブミン（BSA）を含むリン酸緩衝
剤2mlに再分散した。かくして得られたそれぞれの熱変
性ヒトIgGを感作した免疫診断用試薬のっ粒子分散値は
表１に併記した。

（３） 抗原・抗体反応 リウマチ患者血清のプール血清をリン酸緩衝液で20倍に
希釈したものを原液とし、倍数希釈法によりリウマチ患
者血清をリン酸緩衝液で希釈して、リウマチ患者血清希
釈液を調製する。抗原・抗体反応を行うためにマイクロ
タイタープレートを用意し、リウマチ患者血清希釈液を
各ホールに25μ加える。次いで熱変性ヒトIgGを感作
した免疫診断用試薬の分散液を各ホールに25μ加えた
後、５分間撹拌し静置した。次いで抗原・抗体反応によ
る凝集状態を観察し、上記免疫診断用試薬の性能を評価
した。反応開始後の凝集状態を第３図に示す。粒子がス
ポット状に集まり外周縁が均等でなめらかな円形を示す
場合（−）、粒子が小さなリングを形成し、外周縁が均
等でなめらかなもの（±）、粒子リングが明らかに大き
く、リング内に凝集粒子が膜状に広がっているもの
（＋）、凝集が均一に起こり凝集粒子が底全体に膜状に
広がっているもの（）と判定した。明らかに（＋）像
が認められたホールにおけるリウマチ患者血清希釈液の
最高希釈倍数をもって、鋭敏性を評価した。迅速性は明
らかな陰極（−）像が現われ、変化しなくなる時間を尺
度とした。また非特異凝集反応は、Ｃ部分に（±）、
（＋）、（）のいずれかの凝集状態が認められたホー
ルの個数を示した。これらの結果は表１に示した。

表1No.1の染料で着色したシリカ粒子の感作後の粒子分
散性は第２図（ｃ）に示す通りであった。表1No.1〜No.
9の特定複合体粒子について抗原・抗体反応の結果を表
１に示した。

実施例２ 実施例１における水酸化ナトリウムの添加量及び染料の
添加時間を表２に示すように変化させた以外は実施例１
と同様にして特定複合体粒子を合成後、精製し、実施例
１と同様に表面処理を行った。その後に、実施例１の
（２）、（３）と同様に抗原・抗体反応を調べた。得ら
れたそれぞれの特定複合体粒子特性及び抗原・抗体の反
応結果を表２に示す。

実施例３ 撹拌機付きガラス製フラスコにイソプロピルアルコール
（IPA）2800ml及び蒸留水28mlを加え、10℃に保った
後、表３に示す原料のIPA溶液（20重量％）280mlを22.5
ml/時の速度で滴々添加、加水分解した。その後さらに
原料のIPA溶液（40重量％）670mlと表３に示す染料のメ
タノール溶液（1.25重量％）、450mlを22.5/時の速度で
同時に滴々添加し、染料を添加終了後も原料の添加を続
けて特定複合体粒子を得た。この特定複合体粒子は３層
構造よりなっているものであった。これらの特定複合体
粒子の実施例１と同様に精製洗浄した。おのおのの特定
複合体粒子は、球状であり、メタノール中で分散させて
も染料の溶出は全く見られなかった。得られた特定複合
体粒子を表３に示す表面処理剤で実施例１（１）と同様
に表面処理した。それぞれの粒子の特性を表３に示す。

さらに実施例１（２）、（３）と同様の操作でおのおの
の表面処理した特定複合体粒子に熱変性IgGを固定化
し、リウマチ患者血清との抗原・抗体反応を調べた結果
を併せて表３に示す。

実施例４ 0.1％塩酸4.0gとテトラエチルシリケート158g（Si（OC₂
H₅）_４、日本コルコート化学社製、製品名；エチルシリ
ケート28）とをメタノール1200mlに溶かし、この溶液を
室温で約２時間撹拌しながら加水分解した。その後、こ
れをテトラブチルチタネート（Ti（Ｏ−nC₄H₉）_４、日
本曹達製）40.9gをイソプロパノール500mlに溶かした溶
液に撹拌しながら添加し、テトラエチルシリケートの加
水分解とテトラブチルネタネートとの混合溶液を調製し
た。次に撹拌機付きの内容積10のガラス製反応容器に
メタノール2.5を導入し、これに500gのアニモニア水
溶液（濃度25wt％）を加えてアニモニア性アルコール溶
液を調製し、これにシリカの種子を作るためのテトラエ
チルシリケート4.0gをメタノール100mlに溶かした溶液
を約５分間かけて添加し、添加終了５分後反応液がわず
か乳白色のところで、さらに続けて上記の混合溶液を反
応容器の温度を20℃に保ちながら約２時間かけて添加し
反応性成物を析出させた。その後さらに続けて、テトラ
エチルシリケートのメタノール溶液（44重量％）378ml
と、メチレンブルー（カチオン染料）のメタノール溶液
（1.25重量％）250mlを夫々25ml/時の速度で同時に添加
開始し該染料溶液の滴々添加が該テトラエチルシリケー
ト溶液の滴々添加より先に終了する条件で加水分解を行
なった。さらに実施例１と同様に精製、洗浄し染料を有
するシリカ−チタニア粒子（核部は表４に示す無機化合
物で着色層と固定被覆層の無機化合物はシリカよりなる
３層構造粒子）を得た。

さらに上記操作において、テトラブチルチタネート40.9
gを表４に示す原料及び染料に変えた以外は上記と同様
にして種々の組成の染料複合体粒子を得た。得られたお
のおのの染料複合体粒子を実施例１と同様に表面処理剤
を用いて表面処理した。

なお、各粒子は球状であり、メタノール中への染料の溶
出は全く見られなかった。

さらに実施例１と同様の操作で各染料複合体粒子に熱変
性IgGを固定化した。その時のおのおのの粒子は粒子分
散値は、表４のとおりであった。これらの熱変性IgG感
作粒子とリウマチ患者血清との抗原・抗体反応を調べ
た。その結果も表４に併記した。

実施例５ 撹拌機付きガラス製フラスコ中に、表５に示す予め調製
しておいた無機化合物の核を２重量％で分散させたメタ
ノール分散液28000ml及びアンモニア水（25重量％）616
mlを加え、10℃に保った後にテトラエチルシリケートの
メタノール溶液（44重量％）624mlとダイヤクリルレッ
ドMS−Ｎ（三菱化成（株）製）のメタノール溶液（1.25
重量％）400mlを同時に25.5ml/hrの速度で滴々添加し、
該染料溶液の滴々添加が該テトラエチルシリケート溶液
の滴々添加より先に終了する条件で加水分解を行なっ
た。得られた複合体粒子の特性は表５に示した。

さらに、各々の複合体粒子について、実施例１（２）と
同様にトリフェニルクロロシランを用い表面処理を行っ
た後、実施例１（３）と同様に抗原・抗体反応を行い、
その結果も表５に併記した。

実施例６ 撹拌機付きガラス製フラスコ中に表６に示す予め調製し
ておいた核部となる無機化合物56gを1000mlの表８に示
す染料のメタノール溶液（10重量％）に分散させ、室温
で16時間撹拌する。撹拌後、静置し上清をデカンテーシ
ョンにより取りのぞき1000mlのメタノールを添加し、10
分間撹拌した。撹拌後、静置し上清をのぞき、2800mlの
メタノール及びアンモニア水（25重量％）616mlを加
え、10℃に保った後、テトラエチルシリケートのメタノ
ール溶液（22重量％）1024mlを25.5ml/hrの速度で滴々
添加し、加水分解を行い特定複合体粒子を得た。得られ
た該複合体粒子の特性は表６に示した。さらに各々の上
記複合体粒子について実施例１の（１）と同様に表面処
理し、実施例１の（２）、（３）と同様に抗原・抗体反
応を行なった。その結果は表６に示す通りであった。

実施例７ 撹拌機付きガラス製フラスコ中にメタノール2800ml、ア
ンモニア水（25重量％）616ml、水酸化ナトリウム水溶
液（５モル／）21mlを加え10℃に保った後に、テトラ
エチルシリケートのメタノール溶液（22重量％）792ml
とナトリウムメチラートのメタノール溶液（22重量％）
88mlを混合した混合液を25.5ml/hrの速度で滴々添加
し、シリカ・ナトリウム複合粒子を得た。該複合粒子を
実施例１、（１）と同様に精製し、10重量％濃度になる
ようにメタノール中に分散した。次いで撹拌機付きガラ
ス製フラスコに５重量％の硫酸水溶液2000mlを用意し、
室温で撹拌下、該複合粒子分散液を5ml/minの速度で滴
々添加し酸処理を行なった。酸処理後、実施例１、
（１）と同様に洗浄、精製を行なった。得られた多孔性
粒子の性状を表７−1No.1に示した。別に撹拌機付きガ
ラス製フラスコにイソプロピルアルコール（IPA）2800c
cを加え、10℃に保った後、表７−１（No.2、３及び
４）に示す原料のIPA溶液（20重量％）855mlとナトリウ
ムメチラートのIPA溶液（20重量％）95mlとを混合した
混合液を上記と同様に添加し、酸処理後精製を行なっ
た。それぞれ得られた多孔性粒子の性状は表７−1No.2
〜No.4に示した。

得られた多孔性粒子を沈殿させ、上清のメタノールを除
去した後、10重量％に溶解したメチレンブルーのエタノ
ール溶液1000mlを添加し、撹拌下、室温で16時間含浸染
色した。含浸染色後、実施例１と同様に洗浄・精製し
た。得られたそれぞれの特定複合体粒子の特性は表７−
１に示した。

表７−１、No.1〜No.4の染色多孔性粒子を2.5重量％濃
度になる様にメタノール・アンモニア（4:1）混合液100
0mlに分散した。

この分散液を撹拌機付きガラス製フラスコに取り10℃に
保った後テトラエチルシリケートのメタノール溶液（20
重量％）160mlと、メタノール・アンモニア（4:1）混合
液160mlを同時に22.5ml/hrの速度で滴々添加し特定複合
体粒子を得た。得られた特定複合体粒子の特性は表９に
示した。さらに実施例１（１）と同様にトリメチルクロ
ロシランで表面処理を行なった。次いで実施例１
（２）、（３）と同様に抗原・抗体反応を調べた。その
結果を表７−２に示した。

実施例８ 表８に示した前記各実施例で得られた特定複合体粒子を
2.5重量％濃度となる様にメタノール・アンモニア混合
液1000mlに分散した。この分散液を撹拌機付きガラス製
フラスコに取り10℃に保った。この液に表８に示した染
料のメタノール溶液（1.25重量％）250ml、メタノール
・アンモニア（4:1）混合液450ml及びテトラエチルシリ
ケートのメタノール溶液（40重量％）450mlを同時に22.
5ml/hrの速度で滴々添加した。すなわち該染料溶液の滴
々添加が最初に終了し、次いで該テトラエチルシリケー
ト溶液と該メタノール・アンモニア混合液が同時に滴々
添加を終了する条件で加水分解反応を行なった。その結
果５層構造よりなる特定複合体粒子を得た。得られた特
定複合体粒子の特性は表10に示した。

次いで実施例１（１）、（２）、（３）と同様に表面処
理を行ない抗原・抗体反応を調べた。その結果も表８に
示した。

実施例９ ヤギの産生したアルファーフェトプロテイン（以下、AF
Pと略す）の抗体をアフィニティクロマトにより精製し
て得た精製AFP抗体を1mg/ml濃度に含有するリン酸緩衝
液を調製した後倍数希釈法により希釈してAFP抗体希釈
液を調製した。同様の操作で、抗癌胎児性抗原（抗CE
A）、抗Ｃ−反応性蛋白（抗CRP）の希釈液を調製した。
次いで実施例1No.2のダイアクリルレッドMS−Ｎ（カチ
オン染料）で着色しトリフェニルクロロシランを用いて
表面処理した特定複合体粒子及び実施例4No.1のメチレ
ンブルー（カチオン染料）で着色し、トリフェニルクロ
ロシランを用いて表面処理した特定複合体粒子の１重量
％濃度のリン酸緩衝液による分散液１容にこれらの抗体
希釈液１容を加え、撹拌しながら室温で１時間混合し
た。次に遠心分離し、固型分を少量の乳糖、ノニオン界
面活性剤、及び牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液2m
lに再分散した。かくして得られた各抗体を感作して得
た免疫診断用試薬粒子の粒子分散値を表９に示した。次
いで、これらの抗体感作粒子とおのおのの患者血清のプ
ール血清との抗原・抗体反応を実施例１と同様の方法で
調べた結果を表９に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られた染料を含有したシリカ粒
子の粒子構造を示す電子顕微鏡写真である。第２図は、
実施例１で得られた染料を含有したシリカ粒子（ａ）、
その表面処理後（ｂ）、熱変性IgG固定化後（ｃ）の単
粒子性を示し、第３図は、実施例１で得られた診断用試
薬の凝集像を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】平均粒子径が0.1〜10.0μｍ且つ粒子分散
   性が80％以上で、核部、該核部の表面にある着色層及び
   該着色層を被覆した固定被覆層と少なくとも３層構造よ
   りなる粒子であり、該核部は無機化合物で形成され、該
   着色層は染料又は染料と無機化合物との混合物で形成さ
   れ、該固定被覆層は着色層より染料の含有量が少ない染
   料と無機化合物との混合物が染料を含まない無機化合物
   で形成されてなる無機化合物／染料複合体粒子に免疫活
   性物質を感作した免疫診断用試薬