JPH0740030B2

JPH0740030B2 - 凝集反応用乾燥試薬

Info

Publication number: JPH0740030B2
Application number: JP62235012A
Authority: JP
Inventors: 喬前原; 勝男三谷
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1987-09-21
Filing date: 1987-09-21
Publication date: 1995-05-01
Anticipated expiration: 2010-05-01
Also published as: JPS6478161A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、凝集反応用乾燥試薬に関するものである。更
に詳しくは、水不溶性無機粒子を用いることにより該試
薬の用事の粒子分散性が改善された凝集反応用乾燥試薬
を提供するものである。

尚、本発明において、平均粒子径（）とは粒子を透過
型電子顕微鏡で観察し、粒子の長手方向の直径を測定し
その平均の直径を算出したものを言う。又、本発明にお
いて、粒子分散性とは粒子が個々に分散している程度を
示す性質で、粒子容積がの範囲に含まれる粒子の全粒子に対する含有割合、即ち
粒子分散値（％）で表示したものを言う。該粒子分散値
は後述するように担体としての水不溶性無機粒子、及び
この無機粒子を用いて調製された凝集反応用乾燥試薬の
いずれにも使用される。

〔従来技術及び発明が解決しようとする問題点〕

近年、疾病の診断及び予後判定の為に、体液及び尿中に
分泌される生体成分を測定することが広く行なわれて来
ている。例えば、肝炎ウイルス、後天性免疫不全症候群
（エイズ）、成人Ｔ細胞白血病及び風疹等のウイルス感
染症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス及び
橋本病等の自己免疫病、カンジダ、マイコプラズマ、溶
連菌及び梅毒等の細菌感染症、インスリン、ヒト絨毛性
ゴナドトロピン及びエストロジエン等のホルモン検査、
その他腫瘍マーカーの検査などがあげられる。

これら疾病の診断は、検査対象の生体成分が微量である
為に従来の化学分析による検査では困難を極め、一般に
は抗原抗体反応を利用した免疫血清学的検査が利用され
て来た。この検査法の最大の特徴は、極めて高い感度と
特異性をもって体液中及び尿中に分泌される生体成分を
測定できる点にある。

この免疫血清学的検査の一つに凝集反応法がある。この
凝集反応法とは、動物の赤血球、ポリスチレンラテック
ス、クレー等より成る粒子を担体に用い、これらに抗原
又は抗体を固定化（以下感作という）させたものと、検
体（生体成分を含む体液や尿のことをいう）とを混合
し、抗原抗体複合体形成で生じる担体の凝集反応物の大
きさ又は凝集反応像の強さの程度を測定することによっ
て、対象となる生体成分を測定する方法である。

この凝集反応方法は、放射性免疫測定法（以下RIAと略
す）及び酵素免疫測定法（以下EIAと略す）等の免疫血
清学的検査上の標識法と異なり、特別で高価な設備が要
らず、操作が簡単で、しかも迅速な診断が可能という優
れた特徴があり有用性が高い。しかも最近、抗原及び抗
体の精製法の改善、感作法の改良及び判定法の工夫等に
より、凝集反応法の感度は著しく向上し、RIA及びEIAの
感度と匹敵する様になった。

ところで、担体に抗原又は抗体を感作させた凝集反応用
試薬は、分散液の状態では抗原又は抗体が著しく失活す
る傾向にあり、短期間のうちに試薬性能が低下する欠点
がある。これを解放する目的で一般に、凝集反応用試薬
を、例えば加熱又は常温下に乾燥し、長期間保存後に再
度、精製水、生理食塩水又は種々の緩衝液等に分散させ
て使用する方法が考えられたが、乾燥処理を施すことに
よって、担体に感作された生体物質の活性が低下した
り、また再分散後短時間で失活する傾向が生ずるなどの
問題があった。そこで、乾燥手段が種々検討され、凍結
乾燥が提案され、更に長期間性能が低下しない工夫も施
されるようになった。そして検査時に、この凍結乾燥し
た凝集反応用試薬に精製水、生理食塩水又は種々の緩衝
液を加え、完全に粒子が分散した状態の凝集反応用試薬
にして測定を行なう。この方法においても用事の試薬分
散性の良悪が試薬性能を左右する。すなわち用事の分散
性が悪く完全に粒子が分散されていない状態で検査を行
なえば、大きな凝集塊の存在が凝集反応像の外観を著し
く損うばかりでなく誤まった判定を下す原因ともなる。
更に、分散性が悪い試薬の場合は均一な分散までに時間
を要する為、迅速な診断という凝集反応法の特長を著し
く損なう欠点がある。

従来の担体である赤血球やポリスチレンラテックスは上
記の用事の分散性が乏しいので次の様な凍結乾燥法の工
夫が試みられている。

例えば、赤血球について云えば、特開昭48−26913、特
開昭54−23119には、赤血球の前処理を工夫することに
よる改良、特開昭50−13523、特開昭58−131566には凍
結乾燥時の浮遊液組成を工夫することによる改良、そし
て特開昭59−169504には凍結方法の改善によって試薬の
分散性を高める方法が記載されている。また、ポリスチ
レンラテックスを担体として使用する場合にも、凍結乾
燥時の浮遊液組成を多成分とする事による改良が報告さ
れている（特開昭59−109862）。

上記の様に、従来の担体である赤血球及びポリスチレン
ラテックスでは、得られる試薬の性能を良好に維持する
為に非常に煩雑で精密な凍結乾燥法が要求されている。
従ってその凍結乾燥条件の調整を誤れば、試薬性能が極
めて悪くなる。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、かかる技術的背景のもとに鋭意研究を重
ねた結果、水に対する特定の接触角をもつ水不溶性無機
粒子を凝集反応性粒子に用いることにより、用事の試薬
の分散性に優れた凝集反応用乾燥試薬が得られることを
見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、水に対する接触角80度以下である水不溶性無
機化合物であって、平均粒子径が0.1〜10.0μｍで、粒
子分散値が80％以上の粒子の表面に生体物質を感作した
凝集反応性粒子の浮遊液を凍結乾燥して得た凝縮反応用
乾燥試薬である。

上記凝集反応性粒子は、水に対する接触角が80度以下で
ある水不溶性無機粒子の表面に生体物質を感作した後、
適当な緩衝液に浮遊させる。ここで水とは、化学便覧
（基礎編Ｉ、日本化学会編、丸善）に記載されている化
学式H₂O,分子量18.02の無味無臭、無色透明の液体であ
る。

本発明の水不溶性無機粒子とは、特に生理食塩水又は緩
衝液に対して不溶性を示すことが好ましい。例えば、本
発明の水不溶性粒子を生理食塩水中に一定濃度分散さ
せ、24時間放置後の生理食塩水中に溶出した無機化合物
の濃度が1000ppm以下、特に100ppm以下が好ましい。

本発明の接触角とは、固体面上においた液の液滴の表面
と固体面との交点において、液滴に引いた接線と固体面
とがなす角で液を含む方の角をいう。この接触角は、一
般にぬれ性を表わすときに用いられる。ぬれ性は、例え
ば固体表面に液体をおいた前後のエネルギー差（Δγ）
として把えることができるので下記のyoungの式で表記
される。ここで液体の表面張力γｌと接触角は実験的に
求め Δγ＝γｓ−γsl＝γlcosθ ……（１） γs:固体の表面張力 γl:液体の表面張力 γsl:界面張力 θ：接触角ることができるのでぬれ性は上記（１）式により定量化
できる。接触角が０度に近づけば、完全に固体と液体は
ぬれた状態になり、180度に近づく程ぬれなくなる。

本発明の接触角は、通常使用されている接触角測定装置
（例えばゴニオメーター、エルマ社製）で測定されう
る。

本発明の水不溶性無機粒子は、水に対する接触角が80度
以下であれば特に限定されず用いうる。具体的に例示す
れば、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、酸化
第二鉄、四三酸化鉄、酸化コバルト、酸化ニッケル等の
周期律表第III族、第IV族または第VIII族の金属又は半
金属の酸化物；水酸化アルニミウム、水酸化第二鉄、水
酸化クロム等の水酸化物；臭化銀塩化銀等のハロゲン化
物；硫化カドミウム等の硫化物；炭酸カルシウム、炭酸
マグネシウム等の炭酸塩；硫酸バリウム、硫酸ストロン
チウム等の硫酸等が挙げられる。また上記水不溶性無機
粒子としては複合酸化物も好適に使用され、例えば英国
特許第2115799号公報に示されるシリカと周期律表第Ｉ
族、第II族、第III族及び第IV族からなる群より選ばれ
た少なくとも１種の金属酸化物が挙げられ、該シリカが
80モル％以上含まれるものが好ましい。

更にまた、本発明の水不溶性無機粒子は接触角が80度以
下の条件を満足すれば、その外部もしくは内部に有機化
合物を含有してもよい。例えば、該水不溶性無機粒子の
生理食塩水または緩衝液に対する難溶性をより一層高
め、かつ感作の効率を向上させるため該粒子を表面処理
することもしばしば好適な手段である。この表面処理方
法は特に限定的でなく、シランカップリング剤あるいは
チタンカップリング剤などを用いた乾式法及び湿式法に
よる公知の表面処理方法が採用される。あるいはまた、
染料を用いて水不溶性無機粒子を着色することもしばし
ば好適な手段である。この着色化は、最終的に着色され
た凝集反応用乾燥試薬を用いた凝集反応のエンドポイン
トを肉眼で精度良く診断する必要のある場合には最適で
ある。この染料としては特に限定されず公知の染料から
必要に応じて選択して用いればよい。一般的にはカチオ
ン染料が最も効果的であり、次いで含金属染料、更に次
いで反応染料及び螢光増白染料が好適である。また用途
によっては上記各種染料より多少劣るケースもあるが分
散染料、直接染料、酸性染料、酸性媒染染料その他の染
料も十分に使用できる。

本発明に使用される水不溶性無機粒子の平均粒子径
（）は、特に限定的ではないが0.05〜200μｍ、好ま
しくは0.1〜10.0μｍの範囲から選択される。平均粒子
径が0.1μｍより小さいときは凝集反応用乾燥試薬の担
体として該粒子を使用する場合、沈降速度が小さいため
判定時間に長時間を必要とする傾向にある。また逆に平
均粒子径が10.0μｍより大きくなると凝集像が不鮮明と
なり易く、鋭敏性が低下する傾向がある。

本発明で使用する水不溶性無機粒子の形状は特に限定さ
れず、多面体、柱形体、円錐体、球状体等の形で存在す
る粒子が採用される。特に球状体、就中真球状体のもの
は分散性がすぐれているので好適である。

本発明で使用される水不溶性無機粒子の粒子分散値は80
％以上であることが好ましい。90％以上であれば更に好
ましい。粒子分散値が80％より小さくなると、該水不溶
性無機粒子を用いて製造された凝集反応用乾燥試薬を後
述する凝集反応に利用したとき凝集像と非凝集像の判定
が難かしくなる傾向にある。又、該水不溶性無機粒子の
粒度分布、即ち、各粒子の粒子径の標準偏差を平均粒径
で除して100をかけた値である粒子径の分布値（％）は3
0％以下、更には20％以下であることが好ましい。この
粒度分布は生体物質を感作させる場合高い固定化率を得
るため小さいほど良い。

上記本発明で使用される水不溶性無機粒子の諸要件を勘
案すれば該粒子として接触角が80度以下でしかも平均粒
子径が0.1〜10.0μｍ且つ粒子分散値が80％以上で、核
部と該核部の表面にある着色層との２層構造よりなる粒
子であり、該核部は無機化合物で形成され且つ着色層は
染料又は染料と無機化合物との混合物で形成されてなる
水不溶性無機複合粒子が好適に採用される。或いは、平
均粒子径が0.1〜10.0μｍ且つ粒子分散値が80％以上
で、核部、該核部の表面にある着色層及び該着色層を被
覆した固定被覆層の少なくとも３層構造よりなる粒子で
あり、該核部は無機化合物で形成され、該着色層は染料
又は染料と無機化合物との混合物で形成され、該固定被
覆層は着色層より染料の含有量が少ない染料と無機化合
物との混合物又は染料を含まない無機化合物で形成され
てなる水不溶性無機複合粒子も好ましい。このような特
定の構造を有する水不溶性無機複合粒子は従来知られて
いない複合粒子であるが、その製造方法は特に限定され
ず、代表的なものを例示すれば次の通りである。

染料及び加水分解に供し、加水分解されて無機化合物と
なる原料被加水分解化合物（以下単に被加水分解化合物
ともいう）の少なくとも一部は溶解するが反応生成物は
溶解しない、中性又はアルカリ性の含水溶媒中に、該溶
媒に溶解しない核部となる微粒子の無機化合物を存在さ
せ、該溶媒に被加水分解化合物と染料を滴下し加水分解
を行うことにより製造する。

上記複合粒子の製法にあっては、原料となる染料及び被
加水分解化合物は溶解するが加水分解物は溶解しない溶
媒が使用される。該溶媒は染料或いは被加水分解化合物
の種類に応じて上記性状のものを予め決定して使用すれ
ばよい。但しこれらの原料は完全に溶解する必要はな
く、その一部を溶解するものであれば使用出来る。通常
好適に採用される溶媒について具体的に示せば、例え
ば、後述する反応性、操作性、入手が容易なこと等の理
由で、一般にはメタノール，エタノール，イソプロパノ
ール，ブタノール，イソアミルアルコール，エチレング
リコール，プロピレングリコール等のアルコール溶媒が
好適に用いられる。またジオキサン，ジエチルエーテル
等のエーテル溶媒，酢酸エチルなどのエステル溶媒等の
有機溶媒を上記アルコール溶媒に一部混合して用いるこ
ともできる。

前記溶媒中には後述する如く被加水分解化合物が加水分
解される必要があるので水が含有されている必要があ
る。該水の含有量は被加水分解化合物の種類又は溶媒の
アルカリ性度等によっても異なり一概に限定することが
出来ないが、一般には0.05〜５重量％の範囲から選べば
好適である。前記具体的に例示した溶媒にあっては例え
ばアルコールの如く、一般に上記範囲の水は含まれるも
のがあり、このような溶媒にあっては特に含水量を制御
する必要がない。

また上記溶媒は、通常中性又はアルカリ性の状態で使用
するのが一般的である。溶媒が酸性である場合は加水分
解によって得られる特定複合体粒子の粒子分散性が著し
く小さく、ほとんどのケースに於いてゲル状の粉状物と
なり目的とする粒子を得ることが出来ないので好ましく
ない。また該溶媒をアルカリ性とする手段は如何なる方
法でもよいが一般にはアンモニア水または水酸化ナトリ
ウム，水酸化カリウム，水酸化リチウム等の水酸化アル
カリを添加するか、或いはこれらの化合物を併用する方
法が好適である。これらの化合物の添加量も特に限定せ
ず適宜決定して用いればよいが、一般にはアンモニア水
を用いるときはアンモニア濃度が５〜30重量％、好まし
くは10〜25重量％の範囲となるように選べば好適であ
る。またアンモニア水と水酸化アルカリとを併用すると
きは水酸化アルカリの添加量によって得られる粒子の大
きさを制御出来るのでしばしば好適な態様として使用さ
れる。例えば上記アンモニア水に水酸化アルカリ濃度が
0.05〜0.15重量％の範囲で使用され、該水酸化アルカリ
濃度が増加するに従って得られる粒子径が大きくなる傾
向を示す。

特定複合粒子の製法にあっては、前記含水溶媒中に、該
溶媒に溶解しない核部となる無機化合物を存在させてお
き、該溶媒に被加水分解化合物と染料を滴下し加水分解
反応を行うのが好ましい。

該核部となる無機化合物は前記したものが使用出来る
が、一般には後述する被加水分解化合物を溶媒中で予め
加水分解し、該溶媒に溶解しない化合物を析出させ、該
析出物を上記核部とする方法も好適に採用される。該溶
媒中に存在する核部の濃度は特に限定されず、必要に応
じて予め決定して使用すればよいが一般には0.1〜10重
量％の範囲から選ぶのが好適である。

染料及び被加水分解化合物は上記核部が存在する溶媒に
滴下される。従って該染料は予め溶媒に溶解させて用い
るか被加水分解化合物で溶液状のものに溶解させて用い
るのがよい。また被加水分解化合物も同様に溶液状にし
て使用するのが好ましい。勿論染料と被加水分解化合物
を同一の溶媒に溶解して、前記含水溶媒に同時に滴下す
ることも、別々の滴下装置から該含水溶媒に別々に滴下
することも必要に応じて選択できる。

また前記原料を溶解した溶液の濃度は一般に低い法が好
ましいが、低くすぎると溶媒の使用量が著しく増大する
し、濃度が高すぎると反応の制御が難しくなったり取扱
いが不便になるので、これらを勘案して適宜決定すれば
よい。一般には原料濃度が50重量％以下、好ましくは５
〜50重量％の範囲の濃度として使用するのが最も好まし
い。

更にまた上記染料及び被加水分解化合物の滴下速度は得
られる複合粒子の粒子径及び粒子分散性に影響を与える
ので、他の条件に応じて予め決定して使用するのが好ま
しい。一般には含水溶媒の量の0.5〜10重量％好ましく
は0.5〜２重量％の量を１時間かけて滴下させることを
目やすにすればよい。例えば含水溶媒を２使用すれ
ば、原料は10〜200ml/時間の速度を目やすとすればよ
い。

前記原料として使用する被加水分解化合物はその一部例
えば10％以上が溶媒に溶解し、加水分解可能であるもの
であれば特に限定されず用いうる。一般に好適に使用さ
れる被加水分解化合物は金属のアルコキサイドである。
即ち一般式Mx（OR）ｘ（但し、Ｍは金属又は半金属を示
し、ｘはＭの原子価を示す）で示されるアルコサイド化
合物が好ましい。該一般式中、Ｒはアルキル基で、一般
にはメチル基，エチル基，イソプロピル基，ブチル基等
の低級アルキル基が好適に使用される。好適に使用され
るものを例示すれば次の通りである。即ち、一般には一
般式M³（OR¹）₃,M⁴（OR¹）₄,M⁸（OR¹）₃,（ただし、R¹
はアルキル基）で表示される金属のアルコキサイドまた
は上記一般式中の一つまたは二つのアルコキシル基（OR
¹）がカルボキシル基で置換された化合物が好ましい。
ここでM³は第III族の金属、M⁴は第IV族の金属、M⁸は第V
III族の金属で、具体的には、例えばアルミニウム，チ
タニウム，ケイ素，ジルコニウム，ゲルマニウム，ハフ
ニウム，錫，鉛，鉄，コバルト，ニッケル等が好適に使
用される。一般に好適に使用される上記化合物を具体的
に例示すると、Al（OC₂H₅）₃,Al（OC₃H₇）₃,Al（OC
₄H₉）_３等のアルミニウムアルコキサイド及び上記Alに
代って、Ｂなどで代替した第III族金属のアルコキサイ
ド;Ti（Ｏ−isoC₃H₇）₄,Ti（Ｏ−nC₄H₉）₄,Ti（Ｏ−CH₂
CH（C₂H₅）C₄H₉）₄,Ti（Ｏ−C₁₇H₃₅）₄,Ti（Ｏ−isoC₃H
₇）_２〔OCH（CH₃）CHCOCH₃〕₂,Ti（Ｏ−nC₄H₉）_２〔OC₂
H₄N（C₂H₄OH）_２〕₂,Ti（OH）_２〔OCH（CH₃）COOH〕₂,T
i（OCH₂CH（C₂H₅）CH（OH）C₃H₇）₄,Ti（Ｏ−nC₄H₉）_２
（OCOC₁₇H₃₅）_２等のチタンアルコキサイド及び上記Ti
に代って、Si,Zr,Ge,Hf,Sn,Pb等で代替した第IV族金属
のアルコキサイド;Fe（OC₂H₅）₃,Fe（Ｏ−nC₃H₇）₃,Fe
（Ｏ−nC₄H₉）₃,Fe（Ｏ−secC₄H₉）₃,Fe（Ｏ−tertC
₄H₉）_３等の鉄アルコキサイド及び上記Feに代って、Co,
Ni等で代替した第VIII族金属のアルコキサイド等であ
る。またCaCl₂,Ca〔HCO₆H₄COO〕_２・2H₂Oなどの化合物
も上記の金属のアルコキサイドに混合して使用できる。

被加水分解化合物は１種だけを使用する必要はなく、同
時に２種以上を使用することもしばしば好ましい態様と
なる場合がある。また例えば英国特許第2,115,799号公
報実施例に記載されている如くアルコキキシランの低縮
合物と他の金属のアルコキシドを予め混合し混合溶液を
調製し、この調製した混合溶液を原料として使用するこ
とも出来る。

特定複合粒子の他の原料となる染料は一部例えば溶媒10
0重量部に対して１重量部以上好ましくは５重量部以
上、更に好ましくは10重量部以上を溶解するものであれ
ば特に限定されず用いうる。一般的には前記した各種染
料が好適に使用出来る。また該染料は一般に0.001〜１
重量％の濃度で使用するのが好ましい。更には溶媒中に
常に0.05〜0.5重量％好ましくは0.05〜0.2重量％の染料
が存在するように選んでもよい。

前記原料は溶媒中で直ちに加水分解反応を起し粒子状で
不溶性の析出物となる。該加水分解の条件は特に限定さ
れず、如何なる条件をも選び得るが一般には撹拌又は非
撹拌下に５〜50℃好ましくは10〜30℃の範囲の温度で実
施すると好適である。

前記方法で加水分解して得られる染料と無機化合物との
複合粒子は平均粒子径（）が0.1〜10.0μｍのもので
非凝集性のもので、その粒子分散値も80％以上ほとんど
のケースで90％以上となる。このように溶媒中に核部が
存在していれば一見成長反応を阻害すると考えられる染
料の存在下でも加水分解反応が該核部に着色層を生成さ
せる形で進行することは全く驚ろくべき現象である。し
かも該染料は着色層に強固に固定され、該染料に応じた
着色性の複合粒子となる。このようにして得られた複合
粒子は染料を含まない無機化合物よりなる核部に染料と
無機化合物との混合物で構成された着色層が存在する複
合粒子となる。

また別の製法を例示すると次のような方法も好適であ
る。特定複合粒子の核部となる金属酸化物粒子として粒
子分散値が良好な例えば80％以上の且つ多孔性粒子を選
び染料を溶解した溶液と該多孔性粒子を接触させること
により、該多孔性粒子に染料を含浸させた特定複合粒子
が得られる。上記特定複合粒子の製法にあっては多孔性
粒子の選択が重要な要件となる。勿論該多孔性粒子の製
法は限定されるものではない。しかし一般には次のよう
な方法で得られた多孔性粒子が特に好適である。例えば
周期律表第III族，第IV族又は第VIII族の金属とカリウ
ム，ナトリウム，リチウム等のアルカリ金属とよりなる
複合酸化物を前記金属アルコキサイドの加水分解法によ
って製造する。次いで得られた複合酸化物を硫酸，硝
酸，塩酸等の鉱酸溶液と接触させることによって含有ア
ルカリ金属成分を溶出させると、得られる粒子は多孔性
でしかも粒子分析値が80％以上のすぐれたものとなる。
このような粒子を使用することにより、前記染料を含浸
させた即ち核部の表面に染料が存在した特定複合粒子と
なる。該特定複合粒子は必要に応じて乾燥して使用に供
するか後処理に供すればよい。

場合によっては前記染料又は染料と無機化合物との混合
物で構成された着色層から該染料が溶出することもあ
る。このような場合には該着色層に更に染料含有量が少
ない無機化合物又は染料を全く含まない無機化合物の固
定被覆層を被覆させた３層構造或いは該３層構造に更に
前記積層をくりかえし４種以上の構造とした特定複合粒
子とすることが出来る。該３層以上の多層構造とする手
段は特に限定されず如何なる手段を利用してもよい。一
般に好適に採用される方法を例示すれば、前記核部とな
る無機化合物が存在する含水溶媒中に染料及び被加水分
解化合物を滴下し、該原料を加水分解させ２層構造の粒
子を生成させた後、或いは染料を含浸した多孔性粒子を
製造した後同一の反応容器中に該被加水分解化合物のみ
を更に滴下し加水分解を行う方法或いは前記２層構造の
粒子又は染料含浸の多孔性粒子の製造系から未反応又は
未含浸の染料を分離し、次いで被加水分解化合物を更に
滴下し加水分解させて特定複合粒子を得る方法である。
前者即ち反応を同一系で行う場合は３層構造の複合粒子
が得られるが、３層目の固定被覆層は核部への着色層が
形成されるとき消化された残りの染料が溶媒中に溶解さ
れているにもかかわらず、滴下する被加水分解化合物溶
液中に染料が含まれていないときは著しく染料の含有量
が少ない組成のものとなる。この場合は通常核部に直接
形成される着色層に含まれる染料の約1/5程度又はそれ
以下、好ましくは1/10以下となる。かかる現象も一般的
反応からすると驚異的な現象であるがその作用は現在の
とこら明らかではない。従って前記の特定複合粒子の製
法は特別の反応形式をとる必要はなく唯一の反応器で３
層以上の層を積層することによって得ることも出来る。
そしてこのようにして得られた複合粒子にあっては３層
目に少量の染料が含まれていても染料が溶出することは
ほとんどないすぐれた球状の粒子となる。

以上のことから、無機化合物の核と着色層の製造を一連
の操作で行う場合の染料の添加時期は、得られる特定複
合粒子の粒子径を特定の範囲に調製するため及び特定複
合粒子からの染料の溶出を防止するために、核と着色層
の形成に要する全合成時間を１としたときに、0.1〜0.
9、特に好ましくは0.2〜0.8で示される時間内に染料の
添加を開始し、また完了することによって目的の特定複
合粒子とすることが出来る。

前記３層構造以上の多層構造の特定複合粒子を得ると
き、核部の表面にある着色層を被覆した２層構造の粒子
から未反応又は未含浸の染料を分離後例えば該粒子製造
に使用したと同一溶媒で数回洗浄後、該粒子を含む溶媒
中に染料を含まない被加水分解化合物を液滴下し該被加
水分解化合物を加水分解すれば、３層構造目の固定被覆
層は染料をほとんど含まない層となる。

前記２層構造又は３層構造を有する特定複合粒子に更に
前記のような処理を行うことにより３層構造以上の多層
の構造を有する複合粒子とすることが出来る。多層構造
の該複合粒子にあっては着色層の着色度合をより鮮明に
表示するため前記固定被覆層を透光性の材料から選ぶの
が好ましい。この意味では固定被覆層は周期律表第III
族又は第IV族の金属或いは該金属と周期律表第I,第II族
又は第Ｖ族の金属との複合酸化物であるのが好ましい。

以上説明した水不溶性無機粒子に感作させる生体物質と
しては特に限定的でなく公知のものが使用されるが、好
ましくは抗原、ハプテン及びこれらの免疫によって得ら
れる抗体などの免疫活性物質が用いられる。例えば、免
疫グロブリン、アルブミン、フィブリノーゲン（フィブ
リン及びそれらの分解産物）、α−フェトプロテイン、
Ｃ反応性蛋白、β_２−ミクログロブリン、ミオグロビ
ン、癌胎児性抗原、肝炎ウィルス抗原、ヒト絨毛性ゴナ
ドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、インスリン、ジ
ゴキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、DNA、RNA等の
蛋白、ホルモン、薬剤など、またそれらの抗体などが挙
げられる。

上記生体物質で本発明の水不溶性無機粒子を感作する方
法は公知の感作方法を採用することができる。例えば、
上記蛋白と水不溶性無機粒子とを水性媒体（例えば、
水、生理食塩水、各種緩衝液など）中で接触させるのが
良く、一般に混合後静置することにより行なわれるが、
接触効率を上げる為撹拌もしくは振とうしても良い。感
作後は、遠心分離及び必要に応じて上記水性媒体で洗浄
して上清中の生体物質を取り除く。

本発明において凍結乾燥方法は限定的でなく通常の方法
を行なえば良い。例えば、感作赤血球の凍結乾燥方法に
採用される方法及び条件が用いられる。好ましくは急速
予備凍結し次いで真空凍結乾燥する方法が採用される。
該急速予備凍結は液体窒素、ドライアイス−メタノー
ル、ドライアイス−アセトン、あるいはフルオロカーボ
ン等に、上記生体物質を感作させた凝集反応性粒子を分
散させた浮遊液の入ったバイアル又はアンプルなどの容
器を浸漬することによって達成される。

該浮遊液の液組成は限定的でなく、従来の凝集反応粒子
製造分野で急速予備凍結に用いられる液組成が採用さ
れ、例えば、種々の緩衝液にグルコース等の糖類、血清
アルブミン、アミノ酸あるいはこれらの混合物を加えた
ものが挙げられる。該浮遊液中の凝集反応性粒子の濃度
は0.05〜50重量％、好ましくは0.1〜10.0重量％になる
様に調整される。

真空凍結乾燥方法は限定的でなく、例えば上記凝集反応
性粒子の浮遊液の入ったバイアルを急速予備凍結したの
ち、あらかじめ−40℃〜−60℃に冷却した凍結乾燥機の
チャンバー内の棚上に置き24〜72時間かけて真空凍結乾
燥する。この時のチャンバー内の圧力は50〜200μHg、
最終乾燥温度は20〜50℃で行なう。次いで真空状態、又
は不活性ガスを充填して封栓保存する。

このようにして得られる本発明の凝集反応用乾燥試薬を
用いる凝集反応としては何ら制限なく、通常診断に利用
される凝集反応法が適用される。例えば、定性診断の平
板法、半定量法のマイクロタイター法、及び定量法の比
濁法、粒子数計測法等である。好ましくは、操作が簡単
で力価測定が可能であるマイクロタイター法を採用すれ
ば本発明の効果を著しく発揮できる。

〔作用及び効果〕

かくして得られる本発明の凝集反応用乾燥試薬は、用事
の分散性が極めて良好である。

水に対する接触角が80度より大きい水不溶性無機粒子を
用いた凝集反応用乾燥試薬は、使用に際して分散性が非
常に悪く凝集塊が存在し判定の誤りの原因となる。又、
良好な分散性を持つ状態になるまで長い放置時間を要し
凝集反応の特徴である迅速診断上好ましくない。これに
対し、水に対する接触角が80度以下の水不溶性無機粒子
を用いた本発明の凝集反応用乾燥試薬は用事の分散性が
極めて良好で、瞬時に試薬を構成する粒子が分散するの
で迅速な診断が可能なばかりでなく、分散していない凝
集粒子の存在を著しく抑えることができるので判定の誤
りを防ぐことができる。

この理由は必らずしも明確ではないが、水に対する接触
角が80度近傍で乾燥した水不溶性無機粒子の粒子表面の
結合水の量及びコンホメーションが急激に変化する為に
この様な分散性を差異を生じるものと推測される。即
ち、水に対する接触角が80度以下の水不溶性無機粒子を
用いた凝集反応用乾燥試薬は、水に接触させた際に構成
している粒子の表面がより親水的である為に結合水の量
が多くそのコンホメーションも好適に働きすみやかに水
となじむ。この結果、凝集状の粒子群の界面間隙への水
の浸透がすみやかに起こり粒子を一個体ずつ分離して最
終的に完全に１個の粒子群が水に懸濁した分散化が非常
に効率よく行なわれる。

又、本発明においては上記の如く、感作担体として無機
粒子を選択するものであるから赤血球、ポリマー粒子を
使用する場合にくらべて高比重、大粒子径の担体を提供
でき判定が容易かつ迅速になる。更に、表面に抗原性を
有さないので異好性抗体の抗原抗体反応に基づく非特異
的凝集反応を防止できる。更に又、表面特性の制御が容
易で巾広い蛋白を固定できるので診断試薬としての利用
範囲が拡がる。

本発明は、従来の免疫血清学的検査の凝集反応用乾燥試
薬に比べて著しく用事の分散性が向上した凝集反応用乾
燥試薬を提供するものであり、臨床検査分野へ及ぼす貢
献は極めて大きい。

以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。なお、以下の実施例における水不溶性無機粒子
の性状、溶出量及び接触角並びに凝集反応用乾燥試薬の
粒子分散性は以下の方法により測定した。

（１）平均粒子径（）平均粒子径（）は100個以上の粒子の長手方向の直径
を透過型電子顕微鏡で観察して求めた。

（２）粒度分布〔粒子径の分布値〕（SD）粒子径の分布値（SD）は各粒子の粒子径の標準偏差を平
均粒子径で除して、100をかけた値である（３）粒子分散値（PD）粒子分散値（PD）はπ/6（±0.5）^３の範囲の体積
を有する粒子数を全粒子数で除し、100をかけた値
（％）で表示した。尚、粒子体積の測定と粒子数のカウ
ントはコールターカウンター社製モデルZD−１を用いて
行った。この値は粒子が個々に分散している程度を示す
値である。

（４）凝集反応用乾燥試薬粒子分散値（RPD）乾燥試薬粒子分散値（RPD）は、1mgの凝集反応用乾燥試
薬を生理食塩水5mlに入れ、用手撹拌後１分静置して上
記（３）の粒子分散値と同様にして測定した。

（５）核部の平均粒子径（）核部を構成する無機化合物粒子について、該無機化合物
粒子を製造した後、前記（１）のの測定と同様にして
測定した。

（６）無機粒子の溶出量各水不溶性無機粒子を蒸留水に10重量％となるように分
散させ、この分散液1mlを取り24時間放置後上澄液中の
溶出した無機化合物に起因するイオン原子吸光法により
定量した。

（７）染料の溶出量（SC）メタノールに溶解した染料濃度と該濃度に於ける吸光度
を分光分析し、該染料の吸光係数（ε）を求める。別
に、無機化合物／染料複合粒子をメタノール5mlに５重
量％濃度となるように分散させ、１週間放置後上清4ml
を取り、分光分析し該上清の吸光度（Ａ）を求める。染
料の溶出量（Ｃ）を下式より算出した。

Ｃ＝A/ε （８）無機化合物／染料複合粒子中の染料含量（DC）先ず上記（５）と同様な方法で染料の吸光係数（ε）を
求める。別に、メタノールに無機化合物／染料複合粒子
を0.5重量％濃度で分散し、この分散液の4mlをとり、こ
の重量と吸光度（Ａ′）を分光分析する。更に別に、無
機化合物／染料複合粒子の核部を構成する無機化合物
で、該複合粒子と同じ平均粒子径を有する無機化合物粒
子をメタノールに0.5重量％濃度で分散し、この分散液
の吸光度（Ａ″）を分光分析する。

上記測定結果より下記式で該複合粒子中に含まれる染料
の重量（DW）を算出する。

DW＝（Ａ′−Ａ″）／ε 次いで、前記複合粒子のメタノール分散液4mlの重量か
らアルコール液重量を差引いて、該4ml中の複合粒子重
量（PW）を算出する。

最後に該複合粒子中の染料含量（DC）を下記式で算出す
る。

（９）着色層に含まれる染料の割合（CDC）無機化合物／染料複合粒子をエポキシ樹脂埋設法で超薄
切片に切出し、該超薄切片を透過型電子顕微鏡で観察す
る。該観察の結果、中心部の濃く見える部分（核部）、
その外側のうすく見える部分（着色層）及び３層以上で
複合粒子が構成されている場合は、３層目以上の外層部
を分析顕微鏡で分析する。該分析で得られる炭素の特定
Ｘ線（289eV）の強度より炭素原子数を求め下記式によ
り核部に接する着色層に含まれる染料の割合（CDC）を
算出した。

（10）接触角水不溶性無機粒子を100kg/cm²の圧力でプレス加工して
平板状の測定試料を作成したのち、接触角測定装置（ゴ
ニオメーター、エルマ社製）を用い所定の方法により蒸
留水に対する接触角を測定した。

実施例１〜５（１）水不溶性無機粒子の合成撹拌機付きガラス製フラスコ中にメタノール2800cc、ア
ンモニア水（25重量％）616cc、水酸化ナトリウム水溶
液（５モル／）21ccを加え10℃に保った後、テトラエ
チルシリケートのメタノール溶液（22重量％）256mlを2
5.5ml/hrの速度で滴々添加し、シリカ粒子を作成した。
このシリカ粒子を含む反応液中に更にテトラエチルシリ
ケートのメタノール溶液（44重量％）624mlと表１に示
す各種の染料のメタノール溶液（1.25重量％）400mlを
同時に25.5ml/hrの速度で滴々添加し、染料で着色して
着色シリカ粒子を合成した。得られた着色シリカ粒子を
大量のメタノールでデカンテーションによる精製と洗浄
を繰り返した。この染料を含有するシリカ粒子は、いず
れもメタノール中で分散させても、染料の溶出は全くみ
られなかった。

同様に、染料を含有していない非着色シリカ粒子を合成
した。これは、上記の合成法の中で染料のメタノール溶
液を同時添加しない以外は同じ条件である。

このようにして得られたシリカ粒子を最終的に10重量％
濃度となる様にメタノール中に分散し、その分散液100m
lに表１に示した表面処理剤をそれぞれ0.5重量％濃度に
なる様に添加し、10℃、16時間反応させて表面処理を行
ない表面処理をしたシリカ粒子（着色および非着色）を
得た。これらシリカ粒子の特性を表１に示す。

（２）熱変性ヒトIgGを感作した水不溶性無機粒子の
合成ヒトChon F II画分（シグマ社製）を1/150Mリン酸−生
理食塩水緩衝液pH＝7.4（以下PBSと略す）に10mg/mlに
なる様溶解し、60℃で10分間加熱することにより熱変性
ヒトIgGを得た。得られた熱変性ヒトIgGをPBSで50倍希
釈した溶液1mlと、前項で得られたシリカ粒子をPBSで１
重量％に希釈した溶液1mlを室温で撹拌しながら、２時
間感作した。

次いで遠心分離して、上清中の熱変性ヒトIgGを除き、
沈渣を少量のショ糖、牛血清アルブミン、グリシンを含
むPBS2mlで再分散した。かくしてシリカ粒子を使用した
凝集反応性粒子の浮遊液を得た。表面処理したシリカ粒
子の場合も同様の操作で行なった。

（３）凍結乾燥法（２）で得られた凝集反応性粒子の浮遊液1mlを3ml容バ
イアルに移し、液体窒素でバイアルを急速凍結した後、
あらかじめ−50℃に冷却しておいた凍結乾燥機のチャン
バー内の棚の上に置いた。次いで、100μHgの減圧下で4
0℃の到達温度まで５℃/hrの昇温速度で30時間凍結乾燥
を行なった。

かくして、リウマチ患者血清中のリウマトイド因子を半
定量するための凝集反応用乾燥試薬が得られた。

（４）凝集反応用乾燥試薬の分散と抗原、抗体反応（３）で得られた凝集反応用乾燥試薬の入ったバイアル
に、正常ウサギ血清を少量含有しPBSを2ml加え分散させ
る。

一方、リウマチ患者血清のプール血清をPBSで20倍希釈
したものを原液としてリウマチ患者血清希釈液を調整す
る。抗原抗体反応を行なう為にＶ型マイクロタイタープ
レートを用意し、リウマチ患者血清希釈液を各ウエルに
25μ加える。次いで上記の正常ウサギ血清を少量含有
したPBSに分散させた凝集反応用乾燥試薬を各ウエルに2
5μ加え、次いで５分間マイクロタイタープレートを
振とうした後室温に静置した。凝集反応用乾燥試薬は分
散５分後にウエルに滴下した。

次いで抗原・抗体反応に基ずく凝集管底像を肉眼で観察
し、熱変性ヒトIgGを感作した凝集反応用乾燥試薬の性
能を評価した。その結果を表１に示す。

比較例1,2 表１に示す如く染料及び表面処理剤を変えた以外は実施
例１と同様にして凝集反応用乾燥試薬を作成し性能評価
を行った。その結果を表１に示す。

比較例3,4 水不溶性無機粒子のかわりに表１に示すポリスチレンラ
テックスタルクを使用した以外は実施例１と同様に行な
った。その結果を表１に示す。

実施例6,7,8、比較例5,6 ウサギの産生したヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下、HC
Gと略す）の抗体をアフィニティークロマトグラフィー
により精製して得た精製HCG抗体を2mg/ml濃度に含有す
るPBSを調整した後、倍数希釈法により希釈してHCG抗体
希釈液を調整した。

次いで、実施例１と同様にして表２に記載した表面処理
剤を使って調製した水不溶性無機粒子の１重量％濃度の
PBSによる希釈液1mlと、上記抗体希釈液1mlを加え、撹
拌しながら室温で１時間感作した。

その後、遠心分離して上清中のHCG抗体を除き、沈渣を
少量のショ糖、牛血清アルブミン、グリシンを含むPBS2
mlに再分散した。このHCG抗体を感作した凝集反応性粒
子の浮遊液の凍結乾燥方法は実施例１の方法に準じた。

このようにして得られた凝集反応用乾燥試薬に、正常ウ
サギ血清を少量含有したPBSを2ml加え分散させた。

抗原・抗体反応は、HCGを10IU/ml濃度で含むプール妊婦
尿を用いて行なった。まず、プール妊婦尿をPBSで10倍
希釈したものを原液として妊婦尿希釈液を作成する。抗
原抗体反応を行なう為に、マイクロタイタープレートを
用意し妊婦尿希釈液を各ウエルに25μ加える。次い
で、上記凝集反応用乾燥試薬の分散液を各ウエルに25μ
加えた後、５分間マイクロプレートを振とうした後、
室温に静置した。この際凝集反応用乾燥試薬は分散５分
後にウエルに滴下した。次いで、抗原抗体反応に基ずく
凝集管底像を肉眼で観察し、HCG抗体を感作した凝集反
応用乾燥試薬の性能を評価した。その結果を表２に示
す。

実施例９〜13、比較例７〜11 表１の実施例２の水不溶性無機粒子に、実施例１の方法
に準じて熱変性ヒトIgGを感作した凝集反応性粒子を調
製した。

この凝集反応性粒子を表３に示した組成の添加剤を含む
浮遊液に浮遊させた以外は実施例１の方法と同様にして
凝集反応用乾燥試薬を得た。

かくして得られた熱変性ヒトIgGを感作した凝集反応用
乾燥試薬の抗原抗体反応の性能を表３に示した。

比較のため、ポリスチレンを同様に処理して得られた凝
集反応用試薬の性能もあわせて表３に示した。

実施例14、比較例12 表１の実施例３の水不溶性無機粒子に実施例１の方法に
準じて熱変性ヒトIgGを感作した凝集反応性粒子を調製
後、凍結乾燥して凝集反応用乾燥試薬を得た。

この熱変性ヒトIgGを感作した凝集反応用乾燥試薬の抗
原抗体反応の性能を実施例１の方法に準じ、以下の方法
で調べた。即ち、凝集反応用乾燥試薬の入ったバイアル
に正常ウサギ血清を少量含有したPBSを2ml加え分散さ
せ、この分散液をあらかじめリウマチ患者血清希釈液の
入れてある各ウエルに加えるまでの放置時間を変化させ
試薬性能に及ぼす影響を調べた。

その結果を表４に示す。比較のために表１の比較例２の
水不溶性無機粒子を用いて製造した凝集反応用乾燥試薬
も同様にして調べ、その結果をあわせて表４に示す。

実施例15 表１の実施例２の水不溶性無機粒子を用いてＢ型肝炎ウ
イルス抗原（以下、HBsと略す）を検出する平板法用の
凝集反応用乾燥試薬を以下のように調製した。

ヤギの産生したHBsの抗体をアフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製して得た精製HBs抗体を2mg/ml濃度
に含有するPBSを調製したのち、倍数希釈法により希釈
してHBs抗体希釈液を作成した。次いで、実施例１に準
じて感作、凍結乾燥を行ない凝集反応用乾燥試薬を得た
のちPBS4mlに分散させた。

抗原抗体反応は種々の濃度のHBsを含むヒト血清をPBSに
20倍に希釈後、この希釈液25μと上記凝集反応用乾燥
試薬の分散液25μを、ガラス平板上で撹拌混合し３分
後の凝集像の強さを測定した。凝集反応用乾燥試薬は分
散５分後にガラス平板上に滴下した。ガラス平板法によ
る凝集結果を表５に示した。

比較例として、表２の比較例６の無機粒子を用いて作成
した凝集反応用乾燥試薬を同様の方法で評価した結果、
分散性が不良で非特異凝集を生じた。

実施例16,17,18 撹拌機付きガラス製フラスコにイソプロピルアルコール
（IPA）2800ccと水28ccを加え10℃に保ったのち、表６
に示す各被加水分解化合物の30重量％IPA溶液1020mlを2
2.5ml/時の速度で滴々添加し各無機化合物粒子を得た。
これらの粒子を実施例１と同様に洗浄、精製後γ−グリ
シドプロピルトリメトキシシランを用いて表面処理し
た。これらの水不溶性無機粒子に実施例１と同様にして
熱変性ヒトIgGを感作、凍結乾燥して凝集反応用乾燥試
薬を得、マイクロタイター法によって性能を評価した。
その結果をあわせて表６に示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】水に対する接触角が80度以下である水不溶
性無機化合物であって、平均粒子径が0.1〜10.0μｍ
で、粒子分散値が80％以上の粒子の表面に生体物質を感
作した凝集反応性粒子の浮遊液を凍結乾燥して得た凝縮
反応用乾燥試薬