JPH0761265B2 - サ−マス属に属する新菌株、新規なβ−ガラクトシダ−ゼ及びその製造法 - Google Patents
サ−マス属に属する新菌株、新規なβ−ガラクトシダ−ゼ及びその製造法Info
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- JPH0761265B2 JPH0761265B2 JP62026216A JP2621687A JPH0761265B2 JP H0761265 B2 JPH0761265 B2 JP H0761265B2 JP 62026216 A JP62026216 A JP 62026216A JP 2621687 A JP2621687 A JP 2621687A JP H0761265 B2 JPH0761265 B2 JP H0761265B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なβ−ガラクトシダーゼ及びその製造方
法に関する。
法に関する。
β−ガラクトシダーゼは、ラクトース（乳糖）をグルコ
ースとガラクトースとに分解する酵素であり、乳糖分解
乳又は乳糖分解液などの食品の製造に利用されている。
このβ−ガラクトシダーゼは動植物をはじめとして、か
び、酵母、細菌などの微生物に至るまで広く存在する
が、現在、食品工業で使用されている酵素は主としてか
びあるいは酵母に由来する比較的耐熱性の低いβ−ガラ
クトシダーゼである。これらのβ−ガラクトシダーゼに
ついては特公昭53-24094号公報（先例１）、特開昭52-4
4287号公報（先例２）に開示されている。
ースとガラクトースとに分解する酵素であり、乳糖分解
乳又は乳糖分解液などの食品の製造に利用されている。
このβ−ガラクトシダーゼは動植物をはじめとして、か
び、酵母、細菌などの微生物に至るまで広く存在する
が、現在、食品工業で使用されている酵素は主としてか
びあるいは酵母に由来する比較的耐熱性の低いβ−ガラ
クトシダーゼである。これらのβ−ガラクトシダーゼに
ついては特公昭53-24094号公報（先例１）、特開昭52-4
4287号公報（先例２）に開示されている。
一方、耐熱性を有するβ−ガラクトシダーゼについて
は、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリ
ング（Biotechnology and Bioengineering）,26巻,1141
頁,1984年（先例３）、ジャーナル・オブ・アプライド
・マイクロバイオロジー（Journal of Applied Microbi
ology）,2巻,390頁,1980年（先例４）、カナディアン・
ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー（Canadian J
ournal of Microbiology）,22巻,817頁,1976年（先例
５），特開昭56-154991号公報（先例６）及びジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriolog
y）,110巻,691頁,1972年（先例７）に開示されている。
しかしながら後述するように（第２表参照）、これら従
来のβ−ガラクトシダーゼはいずれもが、低い耐熱性、
至適pH域の狭小あるいは反応生成物による酵素作用の阻
害の１以上を有している。従って実用に供されていない
のが実情である。
は、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリ
ング（Biotechnology and Bioengineering）,26巻,1141
頁,1984年（先例３）、ジャーナル・オブ・アプライド
・マイクロバイオロジー（Journal of Applied Microbi
ology）,2巻,390頁,1980年（先例４）、カナディアン・
ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー（Canadian J
ournal of Microbiology）,22巻,817頁,1976年（先例
５），特開昭56-154991号公報（先例６）及びジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriolog
y）,110巻,691頁,1972年（先例７）に開示されている。
しかしながら後述するように（第２表参照）、これら従
来のβ−ガラクトシダーゼはいずれもが、低い耐熱性、
至適pH域の狭小あるいは反応生成物による酵素作用の阻
害の１以上を有している。従って実用に供されていない
のが実情である。
上述のように、現在工業的規模で食品の製造に使用され
ているβ−ガラクトシダーゼは比較的耐熱性が低い酵素
である。このため乳糖分解処理工程は一般に55℃以下で
行なわれており、また、原料である牛乳又は乳糖液が細
菌の栄養源として良好なものであるため、処理中の雑菌
汚染による腐敗及び固定化されたβ−ガラクトシダーゼ
にあっては、製造終了後充分な洗浄殺菌ができない等、
製造上の重大な問題となっている。こうした問題を解決
するため、耐熱性β−ガラクトシダーゼを用いて雑菌が
増殖し難い高温での目的物の処理、あるいは洗浄、殺菌
が望まれており、工業的に使用しうる耐熱性β−ガラク
トシダーゼの開発が強く要望されている。
ているβ−ガラクトシダーゼは比較的耐熱性が低い酵素
である。このため乳糖分解処理工程は一般に55℃以下で
行なわれており、また、原料である牛乳又は乳糖液が細
菌の栄養源として良好なものであるため、処理中の雑菌
汚染による腐敗及び固定化されたβ−ガラクトシダーゼ
にあっては、製造終了後充分な洗浄殺菌ができない等、
製造上の重大な問題となっている。こうした問題を解決
するため、耐熱性β−ガラクトシダーゼを用いて雑菌が
増殖し難い高温での目的物の処理、あるいは洗浄、殺菌
が望まれており、工業的に使用しうる耐熱性β−ガラク
トシダーゼの開発が強く要望されている。
このような要望に対処するため、前記のように耐熱性の
β−ガラクトシダーゼを検索する試みがなされ、種々の
耐熱性β−ガラクトシダーゼが発見された。しかしなが
ら、従来得られた耐熱性β−ガラクトシダーゼには工業
的に使用する上で必要と考えられる次の〜に記載す
る酵素学的性質をすべて備えたものは存在せず、未だ実
用化の域には達していない。
β−ガラクトシダーゼを検索する試みがなされ、種々の
耐熱性β−ガラクトシダーゼが発見された。しかしなが
ら、従来得られた耐熱性β−ガラクトシダーゼには工業
的に使用する上で必要と考えられる次の〜に記載す
る酵素学的性質をすべて備えたものは存在せず、未だ実
用化の域には達していない。
耐熱性が充分であること：牛乳および脱脂乳の熱凝
固は78〜80℃でおこるため、酵素処理はこの温度以下で
可及的に高温であることが望ましい。従って70〜75℃付
近での酵素の熱安定性が充分であることが要求される。
固は78〜80℃でおこるため、酵素処理はこの温度以下で
可及的に高温であることが望ましい。従って70〜75℃付
近での酵素の熱安定性が充分であることが要求される。
中性〜酸性に至適温度を有すること：β−ガラクト
シダーゼによる加工の対象となる原料としては、牛乳、
脱脂乳、チーズホエー、乳糖液等が想定される。これら
は中性（pH6.5）〜酸性（pH4.5）の原料であるから、そ
の範囲で充分な酵素活性を有することが要求される。
シダーゼによる加工の対象となる原料としては、牛乳、
脱脂乳、チーズホエー、乳糖液等が想定される。これら
は中性（pH6.5）〜酸性（pH4.5）の原料であるから、そ
の範囲で充分な酵素活性を有することが要求される。
反応生成物による酵素活性の阻害度が低いこと：β
−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させたときの反応生成
物であるガラクトースおよびグルコースによる酵素活性
の低下が少ないことが要求される。
−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させたときの反応生成
物であるガラクトースおよびグルコースによる酵素活性
の低下が少ないことが要求される。
本発明者等は上記の性質を有するβ−ガラクトシダーゼ
を創製することを企図し、そのようなβ−ガラクトシダ
ーゼを産生する微生物を自然界から純粋に単離すること
を試みた。その結果、多数のβ−ガラクトシダーゼを産
生する微生物の中から高度好熱菌の一種であるサーマス
属に属する微生物が上記の性質を有するβ−ガラクトシ
ダーゼを産生することを見出し、本発明を完成した。
を創製することを企図し、そのようなβ−ガラクトシダ
ーゼを産生する微生物を自然界から純粋に単離すること
を試みた。その結果、多数のβ−ガラクトシダーゼを産
生する微生物の中から高度好熱菌の一種であるサーマス
属に属する微生物が上記の性質を有するβ−ガラクトシ
ダーゼを産生することを見出し、本発明を完成した。
本発明の目的は、新規なβ−ガラクトシダーゼ及びその
製造方法を提供することである。
製造方法を提供することである。
本発明は75〜85℃の至適作用温度を有し、4.5〜6.5の至
適pHを有し、かつ50ミリモルのガラクトース及びグルコ
ースによって酵素活性が実質的に低下しない新規なβ−
ガラクトシダーゼを産生することを特徴とするサーマス
属に属する新菌株、75〜85℃の至適作用温度を有し、4.
5〜6.5の至適pHを有し、かつ50ミリモルのガラクトース
及びグルコースによって酵素活性が実質的に低下しない
ことを特徴とする新規なβ−ガラクトシダーゼ及び75〜
85℃の至適作用温度を有し、4.5〜6.5の至適pHを有し、
かつ50ミリモルのガラクトース及びグルコースによって
酵素活性が実質的に低下しない新規なβ−ガラクトシダ
ーゼを産生するサーマス属に属する菌株を培養し、β−
ガラクトシダーゼを採取することを特徴とする新規なβ
−ガラクトシダーゼの製造法である。
適pHを有し、かつ50ミリモルのガラクトース及びグルコ
ースによって酵素活性が実質的に低下しない新規なβ−
ガラクトシダーゼを産生することを特徴とするサーマス
属に属する新菌株、75〜85℃の至適作用温度を有し、4.
5〜6.5の至適pHを有し、かつ50ミリモルのガラクトース
及びグルコースによって酵素活性が実質的に低下しない
ことを特徴とする新規なβ−ガラクトシダーゼ及び75〜
85℃の至適作用温度を有し、4.5〜6.5の至適pHを有し、
かつ50ミリモルのガラクトース及びグルコースによって
酵素活性が実質的に低下しない新規なβ−ガラクトシダ
ーゼを産生するサーマス属に属する菌株を培養し、β−
ガラクトシダーゼを採取することを特徴とする新規なβ
−ガラクトシダーゼの製造法である。
（１）微生物の取得 本発明者等は、全国各地の土壌からバージェズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Be
rgeys Manual of Systematic Bateriology）第１巻（以
下マニュアルと記載する）に従ってβ−ガラクトシダー
ゼを産生することが知られている微生物を多数分離し
た。そして、それらの微生物を培養し、β−ガラクトシ
ダーゼを産生せしめ、培地からβ−ガラクトシダーゼを
単離し、その理化学的性質について検討した。その結
果、目的とするβ−ガラクトシダーゼを産生する３菌種
ZK-001,ZK-002及びZK-003を分離し、これらを前記マニ
ュアルに従って同定すると、いずれも好気性無胞子桿菌
で、運動性がなく、グラム染色陰性、カタラーゼ陽性で
あり、生育温度40〜80℃、生育適温65〜75℃、生育至適
pHが中性付近であることから、サーマス属に属する微生
物であることは明らかであり、また２％NaCl含有液体培
地での生育及び糖の資化性より公知のサーマス属に属す
る微生物とは異なる新規な微生物と判定された。本発明
者等はこれらの微生物を工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託し、サーマス・エスピー（Thermus sp.）ZK-00
1について微工研菌寄第9184号、サーマス・エスピー（T
hermus sp.）ZK-002について微工研菌寄第9185号及びサ
ーマス・エスピー（Thermus sp.）ZK-003について微工
研菌寄第9186号なる寄託番号が付された。これらの微生
物の菌学的性質は第１表に示すとおりである。
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Be
rgeys Manual of Systematic Bateriology）第１巻（以
下マニュアルと記載する）に従ってβ−ガラクトシダー
ゼを産生することが知られている微生物を多数分離し
た。そして、それらの微生物を培養し、β−ガラクトシ
ダーゼを産生せしめ、培地からβ−ガラクトシダーゼを
単離し、その理化学的性質について検討した。その結
果、目的とするβ−ガラクトシダーゼを産生する３菌種
ZK-001,ZK-002及びZK-003を分離し、これらを前記マニ
ュアルに従って同定すると、いずれも好気性無胞子桿菌
で、運動性がなく、グラム染色陰性、カタラーゼ陽性で
あり、生育温度40〜80℃、生育適温65〜75℃、生育至適
pHが中性付近であることから、サーマス属に属する微生
物であることは明らかであり、また２％NaCl含有液体培
地での生育及び糖の資化性より公知のサーマス属に属す
る微生物とは異なる新規な微生物と判定された。本発明
者等はこれらの微生物を工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託し、サーマス・エスピー（Thermus sp.）ZK-00
1について微工研菌寄第9184号、サーマス・エスピー（T
hermus sp.）ZK-002について微工研菌寄第9185号及びサ
ーマス・エスピー（Thermus sp.）ZK-003について微工
研菌寄第9186号なる寄託番号が付された。これらの微生
物の菌学的性質は第１表に示すとおりである。
＊リトマスミルクを除き、次の組成の培地（pH7.6）を
基礎培地として使用した。
基礎培地として使用した。
0.1％酵母エキス、0.1％トリプトン、10.0％の無機塩液
（溶液１中に1.0gニトリロ三酢酸、0.6gCaSO4・2H2O,
1.0gMgSO4・7H2O,0.08gNaCl,1.03gKNO3,6.89gNaNO3,1.1
1gNa2HPO4を含む）、1.0％の塩化第二鉄溶液（溶液１
中に0.28gFeCl3・6H2Oを含む）、1.0％の微量元素液
（溶液１中に0.5mlH2SO4,2.2gMnSO4・H2O,0.5gZnSO4
・7H2O,0.5gH3BO3,0.016gCuSO4・5H2O,0.025gNa2MoO4・
2H2O,0.046gCoCl2・6H2Oを含む）、0.001％チアミン塩
酸塩、0.001％ニコチン酸アミド、0.001％ビオチン、0.
001％パラアミノ安息香酸 （２）本酵素の取得 本酵素産生菌を後述する培地に接種し、50〜80℃より好
ましくは、65〜75℃にて12〜48時間好気的に培養する。
（溶液１中に1.0gニトリロ三酢酸、0.6gCaSO4・2H2O,
1.0gMgSO4・7H2O,0.08gNaCl,1.03gKNO3,6.89gNaNO3,1.1
1gNa2HPO4を含む）、1.0％の塩化第二鉄溶液（溶液１
中に0.28gFeCl3・6H2Oを含む）、1.0％の微量元素液
（溶液１中に0.5mlH2SO4,2.2gMnSO4・H2O,0.5gZnSO4
・7H2O,0.5gH3BO3,0.016gCuSO4・5H2O,0.025gNa2MoO4・
2H2O,0.046gCoCl2・6H2Oを含む）、0.001％チアミン塩
酸塩、0.001％ニコチン酸アミド、0.001％ビオチン、0.
001％パラアミノ安息香酸 （２）本酵素の取得 本酵素産生菌を後述する培地に接種し、50〜80℃より好
ましくは、65〜75℃にて12〜48時間好気的に培養する。
培地としては、炭素源、窒素源の他、必要に応じて、無
機塩、微量栄養素を含んでいる。炭素源としては、従来
公知の各種材料を使用することができ、例えば、グルコ
ース、マルトース、シュクロースあるいは可溶性澱粉な
どを典型例として例示できる。また窒素源としても特に
制限はなく、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
スティープリカー、アミノ酸液、大豆粕などの有機能窒
素、あるいは硫安、尿素、硝酸アンモニウム、塩化アン
モニウムなどの無機能窒素などが安価かつ入手容易なも
のとして例示できる。尚有機態窒素源は炭素源となるこ
とはいうまでもない。更にこのような炭素源、窒素源の
他、一般に使用されている各種の塩、例えば、マグネシ
ウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機塩、ビタ
ミンなどを添加することも可能である。好適な培地を例
示すれば0.2％のグルコース、0.2％の酵母エキス、0.2
％のトリプトン、10.0％の無機塩液（溶液１中に1.0g
ニトリロ三酢酸、0.6gCaSO4・2H2O,1.0gMgSO4・7H2O,0.
08gNaCl,1.03gKNO3,6.89gNaNO3,1.11gNa2HPO4を含
む）、1.0％の塩化第二鉄溶液（溶液１中に0.28gFeCl
3・6H2Oを含む）、1.0％の微量元素液（溶液１中に0.
5mlH2SO4,2.2gMnSO4・H2O,0.5gZnSO4・7H2O,0.5gH3BO3,
0.016gCuSO4・5H2O,0.025gNa2MoO4・2H2O,0.046gCoCl2
・6H2Oを含む）、0.001％のチアミン塩酸塩、0.001％の
ニコチン酸アミド、0.001％のビオチン、0.001％のパラ
アミノ安息香酸を含有し、そのpHをNaOHによりpH7.6に
調整した液体培地である。本酵素の分離精製は例えば次
のようにして実施することができる。まず培養液中の菌
体を遠心分離、濾過などで集菌し、得られた菌体を緩衝
液（例えば、10mMリン酸緩衝液pH7.0）中で常法により
破砕して抽出処理する。その抽出液の上清をとり、常法
のイオン交換，ゲル濾過等のクロマトグラフィーにかけ
れば、本酵素が得られる。
機塩、微量栄養素を含んでいる。炭素源としては、従来
公知の各種材料を使用することができ、例えば、グルコ
ース、マルトース、シュクロースあるいは可溶性澱粉な
どを典型例として例示できる。また窒素源としても特に
制限はなく、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
スティープリカー、アミノ酸液、大豆粕などの有機能窒
素、あるいは硫安、尿素、硝酸アンモニウム、塩化アン
モニウムなどの無機能窒素などが安価かつ入手容易なも
のとして例示できる。尚有機態窒素源は炭素源となるこ
とはいうまでもない。更にこのような炭素源、窒素源の
他、一般に使用されている各種の塩、例えば、マグネシ
ウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機塩、ビタ
ミンなどを添加することも可能である。好適な培地を例
示すれば0.2％のグルコース、0.2％の酵母エキス、0.2
％のトリプトン、10.0％の無機塩液（溶液１中に1.0g
ニトリロ三酢酸、0.6gCaSO4・2H2O,1.0gMgSO4・7H2O,0.
08gNaCl,1.03gKNO3,6.89gNaNO3,1.11gNa2HPO4を含
む）、1.0％の塩化第二鉄溶液（溶液１中に0.28gFeCl
3・6H2Oを含む）、1.0％の微量元素液（溶液１中に0.
5mlH2SO4,2.2gMnSO4・H2O,0.5gZnSO4・7H2O,0.5gH3BO3,
0.016gCuSO4・5H2O,0.025gNa2MoO4・2H2O,0.046gCoCl2
・6H2Oを含む）、0.001％のチアミン塩酸塩、0.001％の
ニコチン酸アミド、0.001％のビオチン、0.001％のパラ
アミノ安息香酸を含有し、そのpHをNaOHによりpH7.6に
調整した液体培地である。本酵素の分離精製は例えば次
のようにして実施することができる。まず培養液中の菌
体を遠心分離、濾過などで集菌し、得られた菌体を緩衝
液（例えば、10mMリン酸緩衝液pH7.0）中で常法により
破砕して抽出処理する。その抽出液の上清をとり、常法
のイオン交換，ゲル濾過等のクロマトグラフィーにかけ
れば、本酵素が得られる。
本酵素の好ましい取得法を例示すれば、次の通りであ
る。サーマス・エスピー（Thermus sp.）ZK-001を例え
ば上記のような培地5lに植菌し、70℃にて24時間好気的
に培養して得られる培養液を12,000g,20℃にて30分間遠
心分離し、菌体を集菌し、55gの菌体を得た。
る。サーマス・エスピー（Thermus sp.）ZK-001を例え
ば上記のような培地5lに植菌し、70℃にて24時間好気的
に培養して得られる培養液を12,000g,20℃にて30分間遠
心分離し、菌体を集菌し、55gの菌体を得た。
この菌体に約300mlの抽出用リン酸緩衝液（10mM pH7.
0）を加え、ミルにより磨砕し、酵素を抽出した。抽出
液を40,000g,60分間遠心し、上清を採取した。沈澱に更
に200mlの上記抽出用リン酸緩衝液を加え、再度抽出し
た後、同様に遠心し、上清を採取した。これを最初の上
清に合わせ、粗酵素抽出液480mlを得た。この粗酵素液
に硫酸アンモニウム187gを加え60％飽和とし、１晩静置
し、沈澱を生成せしめた。沈澱を30,000g,60分間の遠心
分離により集め、約200mlの10mMリン酸緩衝液（pH7.0）
に溶解したのち、同緩衝液で透析した。透析した酵素液
中の沈澱を40,000g,60分間の遠心により除去したのち、
この酵素液を10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したD
EAE-TOYOPEARLカラムに吸着させた。次いで０〜0.5MのN
aClを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）の濃度勾配法によ
って酵素を溶出した。溶出した活性画分を集め、限外濾
過膜を用いて濃縮した後、0.1MのNaClを含む10mMリン酸
緩衝液（pH7.0）を用いて一夜透析した。この酵素液を
0.1MのNaClを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化
したセファクリルS-300のゲル濾過カラムにかけ３つの
活性画分を分離した。集めた３つの活性画分をそれぞれ
10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて一夜透析したの
ち、同緩衝液で平衡化したパラアミノフェニルベーター
ディチオガラクトピラノシド（p-amino phenyl-β‐D-t
hiogalactopyranoside）を共有結合させたセファローズ
4Bカラムに吸着させた。このカラムを10mMリン酸緩衝液
（pH7.0）で充分に洗った後、0.1Mホウ酸緩衝液（pH10.
0）を流し酵素を溶出し、活性画分を分離した。かくし
て得られた３つの活性画分はポリアクリルアミドゲルデ
ィスク電気泳動（ゲル濃度7.5％,pH9.5）においてそれ
ぞれ単一であった。得られた酵素標品は３つの酵素合計
で3.4mgであり、活性収率は12％であった。尚他の２菌
株についても培養条件を種々変更して上記と同様にして
本酵素を取得することが可能である。
0）を加え、ミルにより磨砕し、酵素を抽出した。抽出
液を40,000g,60分間遠心し、上清を採取した。沈澱に更
に200mlの上記抽出用リン酸緩衝液を加え、再度抽出し
た後、同様に遠心し、上清を採取した。これを最初の上
清に合わせ、粗酵素抽出液480mlを得た。この粗酵素液
に硫酸アンモニウム187gを加え60％飽和とし、１晩静置
し、沈澱を生成せしめた。沈澱を30,000g,60分間の遠心
分離により集め、約200mlの10mMリン酸緩衝液（pH7.0）
に溶解したのち、同緩衝液で透析した。透析した酵素液
中の沈澱を40,000g,60分間の遠心により除去したのち、
この酵素液を10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したD
EAE-TOYOPEARLカラムに吸着させた。次いで０〜0.5MのN
aClを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）の濃度勾配法によ
って酵素を溶出した。溶出した活性画分を集め、限外濾
過膜を用いて濃縮した後、0.1MのNaClを含む10mMリン酸
緩衝液（pH7.0）を用いて一夜透析した。この酵素液を
0.1MのNaClを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化
したセファクリルS-300のゲル濾過カラムにかけ３つの
活性画分を分離した。集めた３つの活性画分をそれぞれ
10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて一夜透析したの
ち、同緩衝液で平衡化したパラアミノフェニルベーター
ディチオガラクトピラノシド（p-amino phenyl-β‐D-t
hiogalactopyranoside）を共有結合させたセファローズ
4Bカラムに吸着させた。このカラムを10mMリン酸緩衝液
（pH7.0）で充分に洗った後、0.1Mホウ酸緩衝液（pH10.
0）を流し酵素を溶出し、活性画分を分離した。かくし
て得られた３つの活性画分はポリアクリルアミドゲルデ
ィスク電気泳動（ゲル濃度7.5％,pH9.5）においてそれ
ぞれ単一であった。得られた酵素標品は３つの酵素合計
で3.4mgであり、活性収率は12％であった。尚他の２菌
株についても培養条件を種々変更して上記と同様にして
本酵素を取得することが可能である。
（３）本酵素の性質 本発明の方法により製造した本酵素の酵素化学的性質は
次のとおりである。
次のとおりである。
（ａ）作用：ラクトースをガラクトースとグルコースに
分解する。
分解する。
（ｂ）基質特異性：ラクトースを分解するが、シュクロ
ース、メリビオース、ラフィノース、マルトース及びゲ
ンチオビオースは分解しない。
ース、メリビオース、ラフィノース、マルトース及びゲ
ンチオビオースは分解しない。
（ｃ）至適pH及び安定pH範囲：至適pHは4.5〜6.5であ
り、55℃で24時間保持の条件ではpH4.0〜8.0の範囲内で
安定である（第１図の本酵素の作用pH曲線参照）。
り、55℃で24時間保持の条件ではpH4.0〜8.0の範囲内で
安定である（第１図の本酵素の作用pH曲線参照）。
（ｄ）温度に対する安定性:pH7.0において80℃で１時間
加熱後100％の活性が残存し、85℃で１時間加熱後、85
％の活性が残存する。
加熱後100％の活性が残存し、85℃で１時間加熱後、85
％の活性が残存する。
（ｅ）作用適温の範囲:75〜85℃に至適作用温度を有す
る（第２図の本酵素の作用温度曲線参照）。
る（第２図の本酵素の作用温度曲線参照）。
（ｆ）無機塩の作用:1ミリモルの塩化第二鉄、塩化マン
ガン、塩化カルシウム及び硫酸マグネシウムにより酵素
活性は変化しないが、１ミリモルの塩化亜鉛及び硫酸銅
によりそれぞれ10％及び30％の酵素活性が低下する。
ガン、塩化カルシウム及び硫酸マグネシウムにより酵素
活性は変化しないが、１ミリモルの塩化亜鉛及び硫酸銅
によりそれぞれ10％及び30％の酵素活性が低下する。
（ｇ）反応生成物による阻害:50ミリモルのガラクトー
ス及びグルコースによる酵素活性の低下はいずれも10％
以下である（第３図の本酵素の反応生成物による阻害に
関する図参照）。
ス及びグルコースによる酵素活性の低下はいずれも10％
以下である（第３図の本酵素の反応生成物による阻害に
関する図参照）。
（ｈ）分子量：本酵素についてセファクリルS-300カラ
ムクロマトグラフィー（1.6×100cm）を使用し、ゲル濾
過法により分子量を測定したところ、55,000±5,000ダ
ルトン、11,000±10,000ダルトン及び44,000±50,000ダ
ルトンに相当した。
ムクロマトグラフィー（1.6×100cm）を使用し、ゲル濾
過法により分子量を測定したところ、55,000±5,000ダ
ルトン、11,000±10,000ダルトン及び44,000±50,000ダ
ルトンに相当した。
本酵素及び従来公知の微生物由来のβ−ガラクトシダー
ゼ（前記先例１〜６の酵素）の理化学的性質並びに酵素
化学的性質を比較して第２表に示す。
ゼ（前記先例１〜６の酵素）の理化学的性質並びに酵素
化学的性質を比較して第２表に示す。
尚、β−ガラクトシダーゼの活性測定法並びに活性表示
法は次のとおりである。
法は次のとおりである。
すなわち、1.50％のＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド（以下ONPGと記載する）を含有する0.1M
リン酸緩衝液（pH6.5）2.4mlに本酵素液0.1mlを加え、7
0℃,10分間反応させた後、10％Na2CO3液2.5mlを加え反
応を停止する。生成したＯ−ニトロフェノールの量を42
0nmにおける吸光度より求め、１分間に１μmolのＯ−ニ
トロフェノールを遊離する酵素量を１単位とした。
クトピラノシド（以下ONPGと記載する）を含有する0.1M
リン酸緩衝液（pH6.5）2.4mlに本酵素液0.1mlを加え、7
0℃,10分間反応させた後、10％Na2CO3液2.5mlを加え反
応を停止する。生成したＯ−ニトロフェノールの量を42
0nmにおける吸光度より求め、１分間に１μmolのＯ−ニ
トロフェノールを遊離する酵素量を１単位とした。
第２表に示す如く、本酵素の酵素化学的及び理化学的性
質は、公知の何れのβ−ガラクトシダーゼとも異なって
おり、特に高い熱安定性、広範な至適pHの範囲及び低い
反応生成物による阻害度の特性を兼ね備えており、従来
の酵素にない優れた特性を有している。従って本酵素は
牛乳、脱脂乳、チーズホエーあるいは乳糖液等の多くの
乳糖含有食品を高温で処理することに適しており、工業
的に有用なβ−ガラクトシダーゼである。
質は、公知の何れのβ−ガラクトシダーゼとも異なって
おり、特に高い熱安定性、広範な至適pHの範囲及び低い
反応生成物による阻害度の特性を兼ね備えており、従来
の酵素にない優れた特性を有している。従って本酵素は
牛乳、脱脂乳、チーズホエーあるいは乳糖液等の多くの
乳糖含有食品を高温で処理することに適しており、工業
的に有用なβ−ガラクトシダーゼである。
次に実施例を示し、本発明につき更に具体的に説明する
が、本発明は以下の実施例によって何等制限されるもの
ではない。
が、本発明は以下の実施例によって何等制限されるもの
ではない。
実施例１ サーマス・エスピーZK-001（Thermus sp.ZK-001:微工研
菌寄第9184号）を、0.2％グルコース、0.2％酵母エキ
ス、0.2％トリプトン、10.0％の無機塩液（溶液１中
に1.0gニトリロ三酢酸、0.6gCaSO4・2H2O,1.0gMgSO4・7
H2O,0.08gNaCl,1.03gKNO3,6.89gNaNO3,1.11gNa2HPO4を
含む）、1.0％の塩化第二鉄溶液（溶液１中に0.28gFe
Cl3・6H2Oを含む）、1.0％の微量元素液（溶液１中に
0.5mlH2SO4,2.2gMnSO4・H2O,0.5gZnSO4・7H2O,0.5gH3BO
3,0.016gCuSO4・5H2O,0.025gNa2MoO4・2H2O,0.046gCoCl
2・6H2Oを含む）、0.001％のチアミン塩酸塩、0.001％
のニコチン酸アミド、0.001の％ビオチン、0.001％のパ
ラアミノ安息香酸を含有し、NaOHによりpH7.6に調整し
た液体培地10lに植菌し、20l容のジャーファーメンター
内で70℃で24時間通気培養した。培養液の酵素活性は、
培養液1ml当たり0.84単位であった。
菌寄第9184号）を、0.2％グルコース、0.2％酵母エキ
ス、0.2％トリプトン、10.0％の無機塩液（溶液１中
に1.0gニトリロ三酢酸、0.6gCaSO4・2H2O,1.0gMgSO4・7
H2O,0.08gNaCl,1.03gKNO3,6.89gNaNO3,1.11gNa2HPO4を
含む）、1.0％の塩化第二鉄溶液（溶液１中に0.28gFe
Cl3・6H2Oを含む）、1.0％の微量元素液（溶液１中に
0.5mlH2SO4,2.2gMnSO4・H2O,0.5gZnSO4・7H2O,0.5gH3BO
3,0.016gCuSO4・5H2O,0.025gNa2MoO4・2H2O,0.046gCoCl
2・6H2Oを含む）、0.001％のチアミン塩酸塩、0.001％
のニコチン酸アミド、0.001の％ビオチン、0.001％のパ
ラアミノ安息香酸を含有し、NaOHによりpH7.6に調整し
た液体培地10lに植菌し、20l容のジャーファーメンター
内で70℃で24時間通気培養した。培養液の酵素活性は、
培養液1ml当たり0.84単位であった。
この培養液を、20℃にて12,000g,30分間遠心分離し、菌
体を集菌し、107gの菌体を得た。この菌体に約600mlの
抽出用リン酸緩衝液（10mM,pH7.0）を加え、ミルにより
磨砕し酵素を抽出した。抽出液を40,000g,60分間遠心し
上清を採取した。沈澱に更に400mlの上記抽出用リン酸
緩衝液を加え再度抽出した後、同様に遠心し上清を採取
した。これを最初の上清に合わせ粗酵素抽出液975mlを
えた。この粗酵素液に硫酸アンモニウム380gを加え60％
飽和とし、一晩静置し沈澱を生成せしめた。次に沈澱を
30,000g,60分間の遠心分離により集め、約30mlの10mMリ
ン酸緩衝液（pH7.0）に溶解したのち、同緩衝液で透析
した。透析した酵素液中の沈澱を40,000g,60分間の遠心
により除去したのち、酵素液を10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）で平衡化したDEAE-TOYOPEARLカラム（５×45cm）に
吸着させた。次いで０〜0.5MのNaClを含む10mMリン酸緩
衝液（pH7.0）の濃度勾配法によって酵素を抽出した。
溶出した活性画分48.0mlを限外濾過膜（アミコン社製PM
-10）を用いて約10mlに濃縮した後、0.1MのNaClを含む1
0mMリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて一夜透析した。この
酵素液を0.1MのNaClを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）
で平衡化したセファクリルS-300のゲル濾過カラム（2.6
×95cm）に通液し、３つの活性画分を分離した。３つの
活性画分を合わせ、10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を用い
て一夜透析したのち、同緩衝液で平衡化したパラアミノ
フェニルベーダーディチオガラクトピラノシド（p-amin
o phenyl−β−D-thiogalactopyranoside）を共有結合
させたセファローズ4Bカラム（1.0×15.0cm）に吸着さ
せた。このカラムを10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で充分
に洗った後、0.1Mホウ酸緩衝液（pH10.0）を流し、酵素
を溶出し、活性画分を分離した。かくして本酵素約8.5m
gを得た。
体を集菌し、107gの菌体を得た。この菌体に約600mlの
抽出用リン酸緩衝液（10mM,pH7.0）を加え、ミルにより
磨砕し酵素を抽出した。抽出液を40,000g,60分間遠心し
上清を採取した。沈澱に更に400mlの上記抽出用リン酸
緩衝液を加え再度抽出した後、同様に遠心し上清を採取
した。これを最初の上清に合わせ粗酵素抽出液975mlを
えた。この粗酵素液に硫酸アンモニウム380gを加え60％
飽和とし、一晩静置し沈澱を生成せしめた。次に沈澱を
30,000g,60分間の遠心分離により集め、約30mlの10mMリ
ン酸緩衝液（pH7.0）に溶解したのち、同緩衝液で透析
した。透析した酵素液中の沈澱を40,000g,60分間の遠心
により除去したのち、酵素液を10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）で平衡化したDEAE-TOYOPEARLカラム（５×45cm）に
吸着させた。次いで０〜0.5MのNaClを含む10mMリン酸緩
衝液（pH7.0）の濃度勾配法によって酵素を抽出した。
溶出した活性画分48.0mlを限外濾過膜（アミコン社製PM
-10）を用いて約10mlに濃縮した後、0.1MのNaClを含む1
0mMリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて一夜透析した。この
酵素液を0.1MのNaClを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）
で平衡化したセファクリルS-300のゲル濾過カラム（2.6
×95cm）に通液し、３つの活性画分を分離した。３つの
活性画分を合わせ、10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を用い
て一夜透析したのち、同緩衝液で平衡化したパラアミノ
フェニルベーダーディチオガラクトピラノシド（p-amin
o phenyl−β−D-thiogalactopyranoside）を共有結合
させたセファローズ4Bカラム（1.0×15.0cm）に吸着さ
せた。このカラムを10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で充分
に洗った後、0.1Mホウ酸緩衝液（pH10.0）を流し、酵素
を溶出し、活性画分を分離した。かくして本酵素約8.5m
gを得た。
実施例２ サーマス・エスピーZK-002（Thermus sp.ZK-002:微工研
菌寄第9185号）を実施例１の培地のグルコースを0.2％
の可溶性デンプンに変えた培地に10lに植菌し、実施例
１と同一条件で培養し、0.64単位/mlの培養液を得た。
以下実施例１と同様の方法で精製し、本酵素約6.8mgを
得た。
菌寄第9185号）を実施例１の培地のグルコースを0.2％
の可溶性デンプンに変えた培地に10lに植菌し、実施例
１と同一条件で培養し、0.64単位/mlの培養液を得た。
以下実施例１と同様の方法で精製し、本酵素約6.8mgを
得た。
実施例３ サーマス・エスピーZK-003（Thermus sp.ZK-003:微工研
菌寄第9186号）を実施例１で述べた組成の培地10lに植
菌し、実施例１と同一条件で培養し、0.68単位の培養液
を得た。以下実施例１と同様の方法で精製し、本酵素約
7.3mgを得た。
菌寄第9186号）を実施例１で述べた組成の培地10lに植
菌し、実施例１と同一条件で培養し、0.68単位の培養液
を得た。以下実施例１と同様の方法で精製し、本酵素約
7.3mgを得た。
本発明によれば、耐熱性が高く、かつ作用pH域が広く、
さらに反応生成物による阻害度の低いβ−ガラクトシダ
ーゼを得ることができる。本酵素は牛乳、脱脂乳、チー
ズホエーおよび乳糖液などの乳糖含有食品を雑菌が腐敗
し難い高温で処理することを可能にする。このことは、
これらの食品の加工時における製造工程管理をより簡便
にせしめるものであり、食品工業において極めて有意義
なものである。
さらに反応生成物による阻害度の低いβ−ガラクトシダ
ーゼを得ることができる。本酵素は牛乳、脱脂乳、チー
ズホエーおよび乳糖液などの乳糖含有食品を雑菌が腐敗
し難い高温で処理することを可能にする。このことは、
これらの食品の加工時における製造工程管理をより簡便
にせしめるものであり、食品工業において極めて有意義
なものである。
第１図は本酵素の作用pH曲線、第２図は本酵素の作用温
度曲線、第３図は本酵素の反応生成物による阻害に関す
る図である。
度曲線、第３図は本酵素の反応生成物による阻害に関す
る図である。
Claims (7)
- 【請求項１】次の理化学的性質を有することを特徴とす
る新規なβ−ガラクトシダーゼ： （ａ）作用：ラクトースをガラクトースとグルコースに
加水分解する作用を有する。 （ｂ）基質特異性：ラクトースを分解するが、シュクロ
ース、メリビオース、ラフィノース、マルトース及びゲ
ンチオビオースは分解しない。 （ｃ）至適pH及び安定pH範囲：至適pHは4.5〜6.5であ
り、55℃,24時間保持の条件ではpH4.0〜8.0の範囲内で
安定である。 （ｄ）加熱に対する安定性:pH7.0において80℃,1時間加
熱後100％の酵素活性が残存し、85℃で１時間加熱後85
％の酵素活性が残存する。 （ｅ）作用適温の範囲:75〜85℃に至適作用温度を有す
る。 （ｆ）無機質の作用:1ミリモルの塩化第二鉄、塩化マン
ガン、塩化カルシウム及び硫酸マグネシウムにより酵素
活性は変化しないが、１ミリモルの塩化亜鉛及び硫酸銅
によりそれぞれ10％及び30％の酵素活性が低下する。 （ｇ）反応生成物による阻害:50ミリモルのガラクトー
ス及びグルコースによる酵素活性の低下はいずれも10％
以下である。 （ｈ）分子量：ゲル濾過法による測定で55,000ダルト
ン、110,000ダルトン及び440,000ダルトンにピークを示
す。 - 【請求項２】サーマス属に属する菌株により産生される
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の新規な
β−ガラクトシダーゼ。 - 【請求項３】前記サーマス属に属する菌株が微工研菌寄
第9184号菌株、微工研菌寄第9185号菌株、微工研菌寄第
9186号菌株、又はこれらの混合菌株から選ばれるいずれ
かのものであることを特徴とする特許請求の範囲第２項
に記載の新規なβ−ガラクトシダーゼ。 - 【請求項４】サーマス属に属する菌株を培養し、次の理
化学的性質を有するβ−ガラクトシダーゼを採取するこ
とを特徴とする新規なβ−ガラクトシダーゼの製造法： （ａ）作用：ラクトースをガラクトースとグルコースに
加水分解する作用を有する。 （ｂ）基質特異性：ラクトースを分解するが、シュクロ
ース、メリビオース、ラフィノース、マルトース及びゲ
ンチオビオースは分解しない。 （ｃ）至適pH及び安定pH範囲：至適pHは4.5〜6.5であ
り、55℃,24時間保持の条件ではpH4.0〜8.0の範囲内で
安定である。 （ｄ）加熱に対する安定性:pH7.0において80℃,1時間加
熱後100％の酵素活性が残存し、85℃で１時間加熱後85
％の酵素活性が残存する。 （ｅ）作用適温の範囲:75〜85℃に至適作用温度を有す
る。 （ｆ）無機質の作用:1ミリモルの塩化第二鉄、塩化マン
ガン、塩化カルシウム及び硫酸マグネシウムにより酵素
活性は変化しないが、１ミリモルの塩化亜鉛及び硫酸銅
によりそれぞれ10％及び30％の酵素活性が低下する。 （ｇ）反応生成物による阻害:50ミリモルのガラクトー
ス及びグルコースによる酵素活性の低下はいずれも10％
以下である。 （ｈ）分子量：ゲル濾過法による測定で55,000ダルト
ン、110,000ダルトン及び440,000ダルトンにピークを示
す。 - 【請求項５】培養が50〜80℃の温度で好気的に行われる
ことを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の新規な
β−ガラクトシダーゼの製造法。 - 【請求項６】培養が６〜8.5のpHで行われることを特徴
とする特許請求の範囲第４項又は第５項のいずれかに記
載の新規なβ−ガラクトシダーゼの製造法。 - 【請求項７】前記サーマス属に属する菌株が微工研菌寄
第9184号菌株、微工研菌寄第9185号菌株、微工研菌寄第
9186号菌株、又はこれらの混合菌株から選ばれるいずれ
かのものであることを特徴とする特許請求の範囲第４項
乃至６項のいずれかに記載の新規なβ−ガラクトシダー
ゼの製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62026216A JPH0761265B2 (ja) | 1987-02-09 | 1987-02-09 | サ−マス属に属する新菌株、新規なβ−ガラクトシダ−ゼ及びその製造法 |
| DK067188A DK167774B1 (da) | 1987-02-09 | 1988-02-09 | Stamme tilhoerende slaegten thermus, beta-galactosidase, fremgangsmaade til fremstilling af beta-galactosidasen ved hjaelp af stammen samt anvendelse af beta-galactosidasen til fremstilling af galactose og/eller glucose |
| EP88810076A EP0279778B1 (en) | 1987-02-09 | 1988-02-09 | New strain belonging to genus Thermus, new beta-galactosidase and process for producing same |
| DE3888989T DE3888989T2 (de) | 1987-02-09 | 1988-02-09 | Stamm des Genus Thermus, neue Beta-galaktosidase und Verfahren zu dessen Herstellung. |
| US07/744,110 US5283189A (en) | 1987-02-09 | 1991-08-09 | β-galactosidase from Thermus sp |
| US08/142,128 US5432078A (en) | 1987-02-09 | 1993-10-28 | Thermostable strains of the genus thermus capable of producing a β lactosidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62026216A JPH0761265B2 (ja) | 1987-02-09 | 1987-02-09 | サ−マス属に属する新菌株、新規なβ−ガラクトシダ−ゼ及びその製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31382394A Division JP2530998B2 (ja) | 1994-12-16 | 1994-12-16 | サ―マス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する新菌株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63196267A JPS63196267A (ja) | 1988-08-15 |
| JPH0761265B2 true JPH0761265B2 (ja) | 1995-07-05 |
Family
ID=12187212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62026216A Expired - Lifetime JPH0761265B2 (ja) | 1987-02-09 | 1987-02-09 | サ−マス属に属する新菌株、新規なβ−ガラクトシダ−ゼ及びその製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0279778B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0761265B2 (ja) |
| DE (1) | DE3888989T2 (ja) |
| DK (1) | DK167774B1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5234828A (en) * | 1990-03-16 | 1993-08-10 | Suntory Limited | Process for producing novel heat-resistant β-galactosyltransferase |
| EP0456986B1 (en) * | 1990-03-16 | 1995-12-20 | Suntory Limited | Heat resistant beta-galactosyltransferase, its production process and its use |
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