JPH07123990A - ２，５−ジヒドロキシピリジンの製造方法および２，５−ジヒドロキシピリジンの合成酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 農薬の原料などとして利用される２，５−ジ
ヒドロキシピリジンを、工業的に利用可能な高純度で、
かつ多量に製造する方法と、この２，５−ジヒドロキシ
ピリジンを合成するための酵素とを提案する。 【構成】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物を
用いて、６−ヒドロキシニコチン酸を２，５−ジヒドロ
キシピリジンに変換する。この微生物は、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓであり、工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されたＰｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＣＳＭ−７７５
（ＦＥＲＭＰ−１３９２４）である。また、２，５−ジ
ヒドロキシピリジンの合成酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＣＳＭ−７７５（ＦＥＲ
ＭＰ−１３９２４）により生産する酵素である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、農薬の原料などとして
利用される２，５−ジヒドロキシピリジンの製造方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】２，
５−ジヒドロキシピリジンは、２−ヒドロキシピリジン
あるいは３−ヒドロキシピリジンを原料として有機合成
される。しかし、この合成方法では、位置選択的に水酸
化することが難しく、多様な副生物を生成するため、そ
の収量は、２−ヒドロキシピリジンを原料とした場合で
約３４重量％、３−ヒドロキシピリジンを原料とした場
合では約１１重量％〔Ｅ．Ｊ．Ｂｅｈｒｍａｎ ａｎｄ
Ｂ．Ｍ．Ｐｉｔｔ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔ
ｙ，８０，ｐ．３７１７−３７１８，１９５８．参照〕
と極めて低い。このようなことから、従来、工業的に利
用可能な高純度の２，５−ジヒドロキシピリジンを製造
する方法は確立されていない。

【０００３】一方、２，５−ジヒドロキシピリジンは、
ピコリン酸、ニコチン酸、ヒドロキシピリジンの微生物
による代謝における中間体として知られている〔（１）
Ｏ．Ｐ．ＳＨＵＫＬＡ ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｄｉａｎ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １０，ｐ．１７６−１７８１９
７３．（２）Ｒ．Ｃ．ＧＵＰＴＡ ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｄ
ｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｒ
ｔｙ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １５，ｐ．４６２−
４６４，１９７８．（３）Ｃ．ＨＯＵＧＨＴＯＮ ｅ
ｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３０，ｐ．８７９−
８９３，１９７２．参照〕。中間体である２，５−ジヒ
ドロキシピリジンは、微生物によりさらに代謝、分解さ
れるため、今日まで、著量の蓄積は認められていない。

【０００４】本発明は、２，５−ジヒドロキシピリジン
を、工業的に利用可能な高純度で、かつ多量に製造する
ことのできる方法と、この２，５−ジヒドロキシピリジ
ンを合成するための酵素とを提案することを目的とす
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために検討した結果、工業的生産を目的と
した有効な２，５−ジヒドロキシピリジンの製造方法と
して、２，５−ジヒドロキシピリジンの生成に優れた微
生物、またはそれに関与する酵素を用いれば、２，５−
ジヒドロキシピリジンを高効率に製造することができる
ことを見出し、本発明を完成させるに至った。

【０００６】具体的には、本発明者らは、先ず、数多く
の微生物の中から、６−ヒドロキシニコチン酸を原料と
して２，５−ジヒドロキシピリジンを生成する能力を有
するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
を、土壌より分離することにより見出した。次いで、こ
の微生物が有している６−ヒドロキシニコチン酸のカル
ボキシル基の脱炭酸と水酸化とを触媒して２，５−ジヒ
ドロキシピリジンを生成することのできる酵素を、この
２，５−ジヒドロキシピリジンの生成反応に経済的に供
し得る程度に高純度で、かつ高効率で調製することに成
功した。

【０００７】本発明の２，５−ジヒドロキシピリジンの
製造方法は、これらの検討結果を踏まえてなされたもの
であって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｓを用いて、６−ヒドロキシニコチン酸を２，５−
ジヒドロキシピリジンに変換することを特徴とする。

【０００８】この場合において、上記の微生物は、工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託されたＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＣＳＭ−７７
５（ＦＥＲＭＰ−１３９２４）であることをも特徴とす
る。

【０００９】また、本発明の２，５−ジヒドロキシピリ
ジンの合成酵素は、上記のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＣＳＭ−７７５（ＦＥＲＭＰ−
１３９２４）により生産される酵素、すなわち６−ヒド
ロキシニコチン酸モノオキシゲナーゼであることを特徴
とする。

【００１０】本発明に用いる微生物は、６−ヒドロキシ
ニコチン酸に作用して２，５−ジヒドロキシピリジンを
生成する微生物であれば特に制限はないが、その一例と
して、土壌より分離され、工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ ＣＳＭ−７７５株（ＦＥＲＭＰ−１３
９２４）を挙げることができる。

【００１１】２，５−ジヒドロキシピリジンを生成する
微生物の検索には、集積培養法などの常法を用いること
ができる。具体的には、土壌あるいは被験菌株を、６−
ヒドロキシニコチン酸を含む培地を用いて集積培養を行
う。

【００１２】２，５−ジヒドロキシピリジンを生産する
微生物は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）や
ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）などにより、培養液
中の２，５−ジヒドロキシピリジン蓄積量を測定し、蓄
積量を指標とすることにより選抜することができる。こ
の選抜された微生物（すなわち、２，５−ジヒドロキシ
ピリジン生産菌）について、必要に応じて、さらに寒天
培地などを用いて、純菌化を行うこともできる。

【００１３】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｓ ＣＳＭ−７７５株（ＦＥＲＭＰ−１３９２
４）は、６−ヒドロキシニコチン酸を含む培地にて培養
することにより、その培養液中に２，５−ジヒドロキシ
ピリジンを蓄積する微生物として、土壌より集積培養法
にて分離された菌株である。この菌株は、以下に示すよ
うな性質を有する。

【００１４】（ａ）形態的性質： ・細胞の形および大きさ；桿菌，１．０〜３．０μｍ×
０．５〜０．８μｍ ・細胞の多形性の有無； 無し ・運動性の有無； 有り ・鞭毛の着生状態； 有り（極鞭毛） ・胞子の有無； 無し

【００１５】（ｂ）培養的性質： ・肉汁寒天平板培養； 良好な生育，円形、光沢のあ
る淡黄茶色 ・肉汁寒天斜面培養； 良好な生育，光沢があり、円
滑で明るい褐色 ・肉汁液体培養； 良好な生育，液面に膜状に生
育する ・肉汁ゼラチン穿刺培養；ゼラチンを液化する ・リトマス・ミルク； アルカリ性，ペプトン化しな
い

【００１６】（ｃ）生理学的性質： ・グラム染色性； 陰性 ・硝酸塩の還元； ＋ ・脱窒反応； ＋ ・ＭＲテスト； − ・ＶＰテスト； − ・インドールの生成； − ・硫化水素の生成； − ・デンプンの加水分解； − ・クエン酸の利用； Ｋｏｓｅｒの培地； ＋ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地；＋ ・無機窒素源の利用； 硝酸塩； ＋ アンモニウム塩； ＋ ・蛍光性色素の生成； ＋ ・ウレアーゼ； − ・オキシダーゼ； ＋ ・カタラーゼ； ＋ ・生育の範囲； ｐＨ； ５．０〜９．０ 温度； ４〜３７℃ ・酸素に対する態度； 好気的 ・Ｏ−Ｆテスト； 酸化的 ・アルギニンの分解； ＋ ・抗酸性； 無し ・各種炭素源の利用； Ｌ−アラビノース； − Ｄ−グルコース； ＋ Ｄ−マンノース； ＋ Ｄ−フラクトース； ＋ Ｄ−ガラクトース； ＋ ショ糖； ＋ 乳糖； − トレハロース； ＋ Ｄ−マンニット； ＋ プロトカテキュ酸； ＋ カテコール； ＋ グルコン酸； ＋

【００１７】以上の菌学的性質について、バージェイズ
マニュアル オブ システマティック バクテリオロ
ジー（Ｂａｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）に基づき
検索を行ったところ、本菌株は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓと同定された。

【００１８】これらの微生物を培養する培地としては、
通常、これらの微生物が生育し得る培地であれば良く、
炭素源としては、グルコース、シュークロースなどの糖
類や、酢酸、琥珀酸などの有機酸類、エタノール、グリ
セロールなどのアルコール類などが用いられる。窒素源
としては、硝酸ナトリウム、硫化アンモニウムなどの無
機塩類や、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、尿素など
の有機化合物を用いることができる。これらの他に、必
要に応じて、無機塩類、金属塩、ビタミンなどを添加す
ることもできる。

【００１９】また、２，５−ジヒドロキシピリジンの合
成酵素（すなわち、６−ヒドロキシニコチン酸モノオキ
シゲナザーゼ）を多量に生産させるためには、６−ヒド
ロキシニコチン酸やニコチン酸などを添加すると良い。
６−ヒドロキシニコチン酸やニコチン酸などの添加量
は、培地に対して０．０１〜１０重量％、より好ましく
は０．１〜５重量％の濃度（２種以上を添加する際に
は、合計量の濃度）となるように添加することができ
る。

【００２０】培養温度２０〜４０℃、より好ましくは２
５〜３７℃で、ｐＨ５〜９、より好ましくは６〜８で、
好気的に培養することが望ましい。ただし、培養条件
は、用いる微生物や培地組成などに応じて、２，５−ジ
ヒドロキシピリジンの生産量が最大になるように設定す
ることが重要であることは当然である。

【００２１】本発明の２，５−ジヒドロキシピリジンの
合成酵素は、以下のようにして精製する。先ず、上記培
地を用いて２，５−ジヒドロキシピリジン生産菌を培養
し、菌体が生育した後、超音波破砕、フレンチプレス、
ダイナミルによる菌体破砕を行うか、あるいはリゾチウ
ムなどの細胞壁溶解酵素により細胞壁を溶解するかし
て、粗酵素液を得る。この粗酵素液から、遠心分離、硫
安分画、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾
過などを組み合わせて、２，５−ジヒドロキシピリジン
の合成酵素を、分離、精製することができる。

【００２２】この酵素は、６−ヒドロキシニコチン酸に
作用し、カルボキシル基を脱炭酸すると同時に、水酸化
する際の触媒として作用する。したがって、この酵素
は、２，５−ジヒドロキシピリジンを合成する酵素であ
り、具体的には、６−ヒドロキシニコチン酸モノオキシ
ゲナーゼであり、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド）や分子状酵素を必要とする。

【００２３】この酵素の分子量は、４２ＫＤａである。
この酵素は、６−ヒドロキシニコチン酸のほか、相対活
性は低いが、表１に示す通り２−ヒドロキシニコチン
酸、ヒドロキシ安息香酸などにも作用する。ただし、２
−ヒドロキシニコチン酸やヒドロキシ安息香酸などに作
用しても、２，５−ジヒドロキシピリジンが生成される
わけではない。

【００２４】

【表１】

【００２５】なお，この相対活性は、２５℃、ｐＨ７．
０の緩衝液中で６−ヒドロキシピリジンとＮＡＤＨを加
えて反応させた際に、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを
消費する酵素活性を１単位として測定、算出したもので
ある。なお、上記の２，５−ジヒドロキシピリジン合成
酵素の酵素活性は、蛋白質１ｍｇ当たり１２．１μｍｏ
ｌ／ｍｉｎ（２５℃）であった。

【００２６】このようにして得られる２，５−ジヒドロ
キシピリジン合成酵素を、６−ヒドロキシニコチン酸と
反応させることにより、高純度の２，５−ジヒドロキシ
ピリジンを得ることができる。

【００２７】このときの反応は、２，５−ジヒドロキシ
ピリジン合成酵素を、ｐＨ６．０〜９．０、好ましくは
ｐＨ７．０〜８．０の緩衝液中に懸濁し、これに６−ヒ
ドロキシニコチン酸を１〜３０ｍＭ添加して、温度１０
〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃にて、１０分〜
２４時間行う。また、この反応には、補酵素としてＮＡ
ＤＨ、ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）を添
加することもできる。

【００２８】反応中、ＨＰＬＣ分析などの常法により原
料である６−ヒドロキシニコチン酸の残量、２，５−ジ
ヒドロキシピリジンの生成量を分析し、反応時間などを
決定することができるが、６−ヒドロキシニコチン酸の
残量が低下した場合、さらに６−ヒドロキシニコチン酸
を添加して反応を継続することもできる。

【００２９】反応液からの２，５−ジヒドロキシピリジ
ンの回収は、常法によることができる。例えば、遠心分
離、限外濾過などにより２，５−ジヒドロキシピリジン
合成酵素を除去し、反応液を濃縮し、再結晶あるいは酢
酸エチルなどの有機溶媒による溶媒抽出の後、蒸発乾固
させることにより、２，５−ジヒドロキシピリジンを得
ることができる。

【００３０】

【実施例】

実施例１ 表２に示す培地に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ ＣＳＭ−７７５株を接種して、３０℃
にて２４時間、好気的条件下で、培養した。培養後、遠
心分離により菌体を集菌し、これをｐＨ７．０、０．１
Ｍのリン酸緩衝液に懸濁して洗浄後、同緩衝液に再懸濁
して菌体濃縮液を得た。この菌体濃縮液０．３５ミリリ
ットル（以下、「ｍＬ」と記し、リットルを「Ｌ」と記
す）と、上記の緩衝液１．４５ｍＬと、２５０ｍＭ６−
ヒドロキシニコチン酸水溶液０．２ｍＬとを混合して、
２５℃にて６０分間の反応を行った。反応終了後、ＨＰ
ＬＣ分析により２，５−ジヒドロキシピリジンの生成量
を分析したところ、２０ｍＭの２，５−ジヒドロキシピ
リジンが検出された。

【００３１】

【表２】

【００３２】実施例２ 〔Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
ＣＳＭ−７７５株（ＦＥＲＭＰ−１３９２４）を用いた
２，５−ジヒドロキシピリジン合成酵素の精製〕表３に
示す６−ヒドロキシニコチン酸を含む培地にて、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＣＳＭ−
７７５株を、３０℃にて２４時間、好気的条件下で、培
養し、遠心分離にて菌体を集菌した。

【００３３】

【表３】

【００３４】集菌した上記菌株について、超音波破砕機
を用い、１５０ワットにて１０分間の細胞破砕を行った
後、１０万ｇにて３０分間遠心分離を行った。その上清
について、硫安分画を行い、硫安濃度３０〜７０重量％
の分画を集めて、イオンクラマトグラフィー（ファルマ
シア社製商品名“ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ
−６Ｂ”を使用）を行った。さらに、疎水カラムクロマ
トグラフィー（ファルマシア社製商品名“Ｐｈｅｎｙ１
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ”）、吸着クロマト
グラフィー（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）による精
製を行った。

【００３５】その結果、２，５−ジヒドロキシピリジン
生産活性を有する画分を集めて、ＳＤＳ電気泳動により
酵素の純度を検定したところ、一本のバンドのみが認め
られ、単一に精製されたことが確認された。

【００３６】実施例３ 実施例２で精製した酵素（２，５−ジヒドロキシピリジ
ン合成酵素）を、６−ヒドロキシニコチン酸と反応させ
たところ、生成した２，５−ジヒドロキシピリジンは１
８．５ｍＭであった。なお、このときの２，５−ジヒド
ロキシピリジン合成酵素、６−ヒドロキシニコチン酸の
使用量、および使用した補酵素の種類や使用量は、表４
に示す通りとし、反応は、ｐＨ７．０、０．１Ｍのリン
酸緩衝液にて全容を３ｍＬとして、２５℃にて６０分間
行った。

【００３７】

【表４】

【００３８】

【発明の効果】本発明の製造方法によれば、高純度の
２，５−ジヒドロキシピリジンを生成することができ、
しかもこの２，５−ジヒドロキシピリジンは、さらに代
謝されることがないため、高濃度で蓄積することがで
き、２，５−ジヒドロキシピリジンを高効率で得ること
ができる。

【００３９】また、本発明の酵素によれば、２，５−ジ
ヒドロキシピリジンを高純度で、かつ高効率で合成する
ことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:39）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅ
   ｓｃｅｎｓを用いて、６−ヒドロキシニコチン酸を２，
   ５−ジヒドロキシピリジンに変換することを特徴とする
   ２，５−ジヒドロキシピリジンの製造方法。
2. 【請求項２】 微生物が、工業技術院生命工学工業技術
   研究所に寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏ
   ｒｅｓｃｅｎｓ ＣＳＭ−７７５（ＦＥＲＭＰ−１３９
   ２４）であることを特徴とする請求項１記載の２，５−
   ジヒドロキシピリジンの製造方法。
3. 【請求項３】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅ
   ｓｃｅｎｓ ＣＳＭ−７７５（ＦＥＲＭＰ−１３９２
   ４）により生産されることを特徴とする２，５−ジヒド
   ロキシピリジンの合成酵素。