JPH0822222B2

JPH0822222B2 - ２―ケト酪酸の製造法

Info

Publication number: JPH0822222B2
Application number: JP32329189A
Authority: JP
Inventors: 節夫古吉; 慶東名和; 成彬川端
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1989-12-12
Filing date: 1989-12-12
Publication date: 1996-03-06
Anticipated expiration: 2011-03-06
Also published as: JPH03183476A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は新規な微生物と該微生物による２−ケト酪酸
の製造法に関する。２−ケト酪酸は例えばイソロイシン
発酵の原料あるいは光学活性なヒドロキシ酪酸、光学活
性なアミノ酪酸、抗生物質であるパウロマイシンＡなど
の原料となる。

（従来の技術）従来、２−ケト酪酸を工業的に合成する方法として
は、シュウ酸ジエチルとプロピオン酸ジエチルを脱水縮
合させた後、濃硫酸で加水分解する方法が知られてい
る。このほか、アセトアルデヒドとシアノメチルクロラ
イドを出発物質として多段階で得る方法や、２−メタン
スルホニルオキシクロトン酸を加水分解する方法、エト
キサリルプロピオン酸エチルエステルを加水分解する方
法等が公知である。

また、上記の化合合成法とは別に、微生物を用いる方
法については、アエロバクター・アエロゲネス（Aeroba
cte aerogenes）、ミクロコッカス・リソデイクトリカ
ス（Micrococus lysodeiktricus）、トルロプシス・ユ
ーティリス（Torulopsis utilis）、エッシェリシア・
コリ（Eschelichia coli）、サッカロマイセス・セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）などが産出するジヒ
ドロキシ酸デヒドラターゼ（Dihydroxyacid dehydratas
e（4.2.1.9））が、2,3−ジヒドロキシ酪酸を基質と
し、これを２−ケト酪酸に変換する能力を持つことなど
が知られている（Wixom,R.L.et al.,Biochim.Biophys.A
cta.53,433（1961））。

（発明が解決しようとする問題点）これら従来の方法は、化学合成法では、多段階の合成
を必要としたり、出発原料が高価であったりするため工
業的に有利な方法ではなく、また、微生物を用いる方法
では、生成収率が低いためにやはり工業生産には適さな
い。そこで、安価な合成法の確立が求められていた。本
発明は、従来法よりも安価に２−ケト酪酸の製造を可能
ならしめるものである。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、２−ケト酪酸製造の原料として、安価
なクロトン酸から容易にトレオ体またはエリスロ体とし
て有機合成される2,3−ジヒドロキシ酪酸に着目した。
そして、2,3−ジヒドロキシ酪酸を効率よく２−ケト酪
酸に変換する酵素系をもつ微生物を得るために、基質と
してトレオ体を用いて広く天然界から検索した結果、シ
ュードモナス・プチダに属する微生物が、トレオ−2,3
−ジヒドロキシ酪酸を効率よく２−ケト酪酸に変換する
酵素系をもつことを見いだし、発明を完成した。

すなわち、本発明は2,3−ジヒドロキシ酪酸を２−ケ
ト酪酸に変換する能力を有するシュードモナス・ブチダ
5D3A株（微工研菌寄第11126号）およびシュードモナス
属に属し、2,3−ジヒドロキシ酪酸を２−ケト酪酸に変
換する能力を有する微生物あるいはその処理物の存在下
に、2,3−ジヒドロキシ酪酸を２−ケト酪酸に変換して
２−ケト酪酸を蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする２−ケト酪酸の製造法である。

従来、2,3−ジヒドロキシ酪酸を２−ケト酪酸に変換
する酵素系をシュードモナス属細菌が産生することは公
知ではなかった。したがって、2,3−ジヒドロキシ酪酸
を２−ケト酪酸に変換する酵素系をもつ本願の微生物
は、新規なものである。

本発明に使用される酵素系は、シュードモナス属に属
する細菌が有する2,3−ジヒドロキシ酪酸を２−ケト酪
酸に変換する作用を利用するものである。

本発明者らは、トレオ−2,3−ジヒドロキシ酪酸を効
率よく２−ケト酪酸に変換する酵素系をもつ微生物を天
然界から検索した結果、5D3A株（微工研菌寄第11126
号）を単離した。5D3A株は、トレオ−2,3−ジヒドロキ
シ酪酸を２−ケト酪酸に変換する活性を有するが、資化
することが出来ない。この性質は、変換した２−ケト酪
酸を効率よく蓄積するためには有利であり、5D3A株（微
工研菌寄第11126号）は、本発明に用いる微生物として
好ましいものである。5D3A株（微工研菌寄第11126号）
の菌学的性質を以下に示す。

以上の菌学的諸性質を基準として、Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology第８版（1974）の分類
基準により検索すると、5D3A株（微工研菌寄第11126
号）は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putid
a）であると同定された。

本発明は、シュードモナス属に属する微生物を使用し
て、２−ケト酪酸を製造する方法に関するものである。

本発明において使用するシュードモナス属に属し、2,
3−ジヒドロキシ酪酸を２−ケト酪酸に変換する能力を
有する微生物としては、上記シュードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida）5D3A株（シュードモナス・プチ
ダTE3467とも呼ぶ）（微工研菌寄第11126号）が例示さ
れるが、該菌株に限定されない。該微生物の処理物と
は、該微生物の培養物から精製された酵素ならびに該酵
素の固定化物などを意味する。

本発明において原料となるトレオ（またはエリスロ）
−2,3−ジヒドロキシ酪酸は、一般にクロトン酸から合
成される。合成法については、４酸化オスミウム触媒の
存在下に、クロトン酸をＮ−メチルモルホリン−Ｎ−オ
キサイドによって酸化する方法（Frank B.Armstrong,et
al.,J.Chem.Soc.Perkin Trans.I,1985,691（1985））
また、４酸化オスミウムと過酸化水素の存在下にクロト
ン酸から合成する方法（F.W.Bachelorand G.A.Miana,ca
nadian J.Chem.,47,4089（1969））などが公知である。

本発明の微生物を培養するための培地組成としては、
炭素源・窒素源・無機物及び必要に応じて少量の微量栄
養素を含むものであれば、合成培地または天然培地のい
ずれも使用可能である。培地に使用する炭素源として
は、グリセリン、グルコース、可溶性でんぷん等、資化
されるものならばいずれも可能である。トレオ（または
エリスロ）−2,3−ジヒドロキシ酪酸は、それ自身は炭
素源にならないが、この反応系に関与する酵素系を誘導
する効果があり、培地中に添加することが好ましい。ま
た、窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩等が用い
られる。たとえば、硝酸アンモニウムまたは硫酸アンモ
ニウムである。無機イオンとしては、リン酸イオン、マ
グネシウムイオン、カリウムイオン、その他が適宜用い
られる。さらに、有機栄養素として、酵母エキス、ペプ
トン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが適宜用
いられる。

上記培地にて、本発明の微生物をpH6〜８（好ましく
は7.2）、温度17〜28℃（好ましくは25℃）において12
〜24時間培養する。調製された微生物の培養物は、トレ
オ（またはエリスロ）−2,3−ジヒドロキシ酪酸を２−
ケト酪酸に変換する酵素系をもつものである。このよう
な培養物はそのまま酵素源として反応に使用してもよ
く、また、培養物を遠心分離などで分離して得られる生
菌株、その乾燥菌体、あるいは、分離した菌体を超音波
処理・自己消化・磨砕などの方法により処理して得られ
る菌体処理物、さらにはこれらの菌体よりの抽出物なら
びに該抽出物より得られる酵素の粗製物または精製物と
して使用してもよい。もちろん、これらの固定化菌体ま
たは固定化酵素としても使用できる。

本発明方法ではこのようにして調製した菌体、菌体処
理物、固定化菌体などを触媒として用い、トレオ（また
はエリスロ）−2,3−ジヒドロキシ酪酸を反応液中で変
換せしめて、２−ケト酪酸を生成蓄積せしめる。

反応液には、２−ケト酪酸の生成率を高めるために、
基質であるトレオ（またはエリスロ）−2,3−ジヒドロ
キシ酪酸の他に、２価カチオンの添加が好ましく、例え
ば反応液中に1mMの塩化コバルトを共存させることによ
り、著しく生成効率を高めることができる。基質の使用
量には制限が無いが、好ましくは100mMである。酵素反
応は、通常pH8〜10（好ましくは9.0）、温度は10〜40℃
（好ましくは25℃）において行う。

反応時間は、目的に応じ適宜設定されるものである
が、通常１〜20時間である。

得られた反応液からの２−ケト酪酸の採取方法は、例
えば、反応液を遠心分離した上清をクロマトグラフィー
により分画する等の方法に従って行うことができる。

（実施例）以下、実施例を挙げて説明するが、これらは例示であ
って本発明を限定するものではない。

なお、トレオ−2,3−ジヒドロキシ酪酸の定量は高速
液体クロマトグラフ法で、２−ケト酪酸の定量は、2,4
−ジニトロフェニルヒドラジンを用いて分光光度法によ
り行った。

実施例１グリセリン0.5％、トレオ−2,3−ジヒドロキシ酪酸0.
3％、酵母エキス0.15％、硫酸アンモニウム0.1％、リン
酸一カリウム0.15％、リン酸二カリウム0.15％、食塩0.
1％、硫酸マグネシウム七水塩0.02％ほか微量要素を含
む培地（pH7.2）を肩付きフラスコに50ml入れ、120℃で
20分間殺菌した。これにシュードモナス、プチダ5D3A株
（微工研菌寄第11126号）を接種し、25℃で12時間、振
とう培養した。この培養液より菌体を遠心分離により採
取した後、100mMトレオ−2,3−ジヒドロキシ酪酸を含む
100mMトリス−塩酸緩衝液（pH9.0）で、菌体濃度が40mg
/mlになるように懸濁した。また、懸濁の際には同時に
塩化コバルトを濃度1mMになるよう加えた（全量10m
l）。この反応液を、振とうしながら25℃、０〜24時間
保持し、２−ケト酪酸生成量を測定した。結果を第１表
に示す。

また、菌体濃度が10、20、80mg/mlの場合でも同様の
操作を行った。その結果を、菌体濃度40mg/mlの場合を
含めて、第１図に示す。

第１図は、遠心分離により採取した菌体を、100mMト
レオ−2,3−ジヒドロキシ酪酸を含む100mMトリス−塩酸
緩衝液（pH9.0）で、菌体濃度がそれぞれ10、20、40、8
0mg/mlにまなるように懸濁し、また、懸濁の際に同時に
塩化コバルトを濃度1mMになるよう加えた反応液（全量1
0ml）を、振とうしながら25℃、０〜24時間保持した場
合の２−ケト酪酸生成量を示したものである。

図中の記号○−○は菌体濃度10mg/mlの場合を、以下
△−△は20mg/ml、□−□は40mg/ml、●−●は80mg/ml
の場合をそれぞれ表す。

実施例２グリセリン0.5％、酵母エキス0.15％、硫酸アンモニ
ウム0.1％、りん酸一カリウム0.15％、りん酸二カリウ
ム0.15％、食塩0.1％、硫酸マグネシウム七水塩0.02％
ほか微量要素を含む培地（pH7.2）に、さらに０〜2.0mM
の範囲でトレオ−2,3−ジヒドロキシ酪酸を添加して、
肩つきフラスコに50ml入れ、120℃で20分間殺菌した。
それぞれにシュードモナス・プチダ5D3A株（微工研菌寄
第11126号）を接種し、25℃で12時間振とう培養のの
ち、菌体を遠心分離により集めた。

集めた菌体を、100mMトレオ−2,3−ジヒドロキシ酪酸
を含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH9.0）で、菌体濃度
が20mg/mlになるようにそれぞれ懸濁した。また、懸濁
の際には同時に塩化コバルトを濃度1mMになるよう加え
た（全量10ml）。これらの反応液を、振とうしながら25
℃、24時間保持し、２−ケト酪酸生成量を測定した。結
果を第２表に示す。

（発明の効果）本発明は、新規な微生物ならびに該微生物による２−
ケト酪酸の製造法を提供するものであり、実施例におい
て示されたごとく、効率よく２−ケト酪酸の生成が可能
であることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、２−ケト酪酸生成量を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:38）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】2,3−ジヒドロキシ酪酸を２−ケト酪酸に
変換する能力を有するシュードモナス・プチダ5D3A株
（微工研菌寄第11126号）。
【請求項２】シュードモナス属に属し、2,3−ジヒドロ
キシ酪酸を２−ケト酪酸に変換する能力を有する微生物
あるいはその処理物の存在下に、2,3−ジヒドロキシ酪
酸を２−ケト酪酸に変換して、２−ケト酪酸を蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする２−ケト酪酸の製
造法。