JPH0714343B2

JPH0714343B2 - 新規マルトテトラオ−ス生成酵素およびその製造方法

Info

Publication number: JPH0714343B2
Application number: JP4356885A
Authority: JP
Inventors: 昭一小林; 尚桶本; 芳郎根本; 仁橋本; 耕三原
Original assignee: Ensuiko Sugar Refining Co Ltd
Current assignee: Ensuiko Sugar Refining Co Ltd
Priority date: 1985-03-07
Filing date: 1985-03-07
Publication date: 1995-02-22
Anticipated expiration: 2010-02-22
Also published as: JPS61202687A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規なマルトテトラオース生成酵素およびその
製造方法に関する。

〔従来の技術〕

近年、マルトオリゴ糖に関する研究が活発にすすめられ
ているが、現在工業的に大量生産されているものはマル
トースのみである。マルトース以外にはマルトトリオー
スが試薬用として、またマルトペンタオースがアミラー
ゼ活性測定用としてそれぞれ少量生産されているにすぎ
ない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、最近マルトトリオース〜マルトヘキサオースの
マルトオリゴ糖が次々に発見され、澱粉から各種オリゴ
糖の生産が容易に行なえるようになつてきた。たとえば
マルトテトラオースに関してはAgric-Biol,Chem.,46
（３）,639〜646（1982）J.F.Robyt and R.J.Ackerman:
Arch.Biochem.Biophys.,145,105〜114（1971）に記載の
酵素が知られている。この酵素はシユードモナス・スツ
ツチエリ（Pseudomonas Stutzeri）から生産されるもの
であるが、生産性が低い（２〜5IU/ml。この他の微生物
については未だ知られていない。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで本発明者らは、マルトテトラオースを効率よく生
成し得る高活性酵素を探索すべく研究を重ねた。その過
程で各種保存菌株を検索した結果、シュードモナス・サ
ツカロフイラ（Pseudomonas Saccharophila）を培養す
ることにより目的とするマルトテトラオース合成酵素が
得られることを見出し、本発明を完成するに至つた。

本発明は、第１に以下に示す性質を有する新規なマルト
テトラオース生成酵素に関する。

（１）本酵素はアミロース，可溶性澱粉、馬鈴薯澱
粉，甘藷澱粉，米澱粉，タピオカ澱粉，トウモロコシ澱
粉，モチトウモロコシ澱粉，サゴ澱粉などに作用してマ
ルトテトラオースを生成する。

（２）本酵素は30℃にてpH6.7が至適であり、pH5.5〜
10.5で安定である。

（３）本酵素はpH7.0において至適温度は50〜55℃で
あり、60℃以上の温度で30分間放置すると失活する。

（４）本酵素は1mMパラクロロ安息香酸第二水銀溶液
中で阻害を受けるが、阻害率は60〜70％、Fe³⁺,Co²⁺で
は94〜99％であるが、Mg²⁺では全く阻害を受けない。

（５）本酵素の分子量は62000（デイスクゲル電気永
動法による）である。

（６）本酵素の等電点はpH4.7（アンフオライン電気
永動法による）である。

第２に本発明は、シユードモナス・サツカロフイラを培
養し、培養物中に新規なマルトテトラオース生成酵素を
蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする新規なマ
ルトテトラオース生成酵素の製造方法である。

本発明の新規なマルトテトラオース生成酵素は微生物を
用いて生産され、その生産菌としては、上記性質を有す
る酵素を生産する能力を有するものであればよく、たと
えばシユードモナス・サツカロフイラIAM1504などがあ
る。本発明に用いる微生物としては本菌株とその変種，
変異株に制限されるものではなく、上記酵素の生産能を
有するものであればよい。ここで変異手段としては、常
法のものでよく、たとえばラジオアイソトープ（RI），
紫外線（UV），ニトロソグアニジンなどを用いて行なえ
ばよい。

次に、本発明の新規なマルトテトラオース生成酵素を生
産するための微生物の培養条件について検討した。ま
ず、基本培地として炭素源１％，窒素源１％，リン酸１
カリウム0.1％，リン酸２カリウム0.28％（pH7.0）を用
い、窒素源をポリペプトンに固定して、炭素源について
第１表に示した各種物質を１％添加して検討した。この
培地にシユードモナス・サツカロフイラIAM1504を植菌
し、30℃で２日間浸とう培養を行なつた。このときの活
性比率（可溶性澱粉を100としたときの値）を第１表に
示す。表から明らかなように、炭素源としては可溶性澱
粉が最良であり、粉アメ，各種澱粉，マルトースを用い
たときにかなり高い活性が得られた。

第１表炭素源 IU/ml 活性比率無添加 0.3 2.1 グルコース 0 ０シユクロース 0 ０マルトース 6.5 45.5 ラクトース 0.3 2.1 市販粉アメ（DE22） 10.5 73.4 可溶性澱粉 14.3 100 馬鈴薯澱粉 9.5 66.4 トウモロコシ澱粉 7.5 52.4 モチトウモロコシ澱粉 7.6 53.1 次に、窒素源について検討するため、炭素源を可溶性澱
粉に固定し、第２表の各種物質１％および水２％を添加
し、30℃で２日間振とう培養を行なつた。このときの活
性比率（ポリペプトンを100としたときの値）を第２表
に示す。表から明らかなように、ポリペプトンを用いた
ときに著しく高い活性が得られた。

第２表窒素源 IU/ml 活性比率無添加 0.1 0.7 ペプトン 9.3 65.0 ポリペプトン 14.3 100 オートミール^＊ 0.3 2.1 フスマ^＊ 0.6 4.2 コーンスチープリカー^＊ 1.1 7.7 酢酸アンモニウム 0.3 2.1 硫酸アンモニウム 0.1 0.7 硝酸ナトリウム 2.5 17.5 ＊２％に添加上記検討結果から、最適の培地組成は、可溶性澱粉１
％，ポリペプトン１％，リン酸１カリウム0.1％，リン
酸２カリウム0.28％を含むものであることが判明した。
したがつて、培養に用いる培地としては、上記知見を参
考にして、供試菌株が良好な活性にて目的とする酵素を
生産し得る組成のものを選定すべきである。

培養条件については目的とする酵素の生産量が最大とな
るように選定すべきであり、本酵素の生産には通常30
℃,2日間の培養をすべきである。また、培養液から酵素
を採取，精製するには、既知の方法を適当に組合せて行
なえばよい。なお、培養液中の不溶分等を遠沈除去によ
り得た上澄を粗酵素として用いることができる。酵素の
精製は各種の方法により行なうことが出来るが、その１
例を示すと次の通りである。

４℃の低温で粗酵素液に硫酸アンモニウムを加え、0.3
〜0.5飽和で沈殿する画分を集め、10mMリン酸緩衝液（p
H7.0）に溶解する。この酵素液を同緩衝液に対して一晩
透析したものについて以後の操作を行なう。なお、この
硫安塩析での回収率は約95％である。次に、DEAE-トヨ
パール650Mカラムクロマトグラフイー，ゲル過クロマ
トグラフイーなどにより精製してデイスクゲル電気泳動
的に単一バンドを示す標品を得ることができる（第１
図）。

このようにして得た精製酵素を用いて本酵素の性質を検
討した。結果を以下に示す。

（１）作用本酵素を可溶性澱粉に作用させたときの反応経過は第２
図に示したとおりである。図から明らかなように、本酵
素は反応初期からマルトテトラオースを特異的に生成す
る。

したがつて、マルトテトラオースを効率的に生産するに
は、本酵素をたとえばメンブランリアクターのような容
器中で液化澱粉に作用させ、生成糖を限外過膜を用い
て反応系外に取り出す方法，カラムクロマトグラフイー
による方法などを採用することができ、また固定化酵素
との組み合わせもできる。

本酵素の作用形式は、マルトオクタオース以下のオリゴ
糖を基質にした場合、次の通りである。なお、略号は
G₁:グルコース,G₂:マルトース,G₃:マルトトリオース,
G₅:マルトペンタオース,G₈:マルトオクタオースを示
す。

このように、重合度が小さい基質を用いた場合、本酵素
はいわゆるExo型のアミラーゼとしての作用を示すが、
重合度の大きいデキストリンにはEndo型のアミラーゼと
して作用する。したがつて、澱粉は本酵素の作用によつ
て切り残しはなく大部分がG₄に変換する。この際、プル
ラナーゼ等の枝切り酵素を共存させれば、G₄の収率を向
上させることができる。

（２）作用至適pHおよびpH安定性反応液組成をとし、30℃で15分間反応させて還元力を測定し、最高値
を100として表わしたときの結果を第３図に示す。図か
ら明らかなような、本酵素の至適pHは6.7である。

また、pH安定性については、本酵素液1mlに各種pHの10m
M緩衝液（pH4〜6:酢酸緩衝液,pH6〜8:リン酸緩衝液,pH8
〜9:トリス‐塩酸緩衝液,pH9〜10:炭酸ソーダ緩衝液）
0.1mlを加え、30℃で60分間静置した後、各0.1mlずつを
採り、100mMリン酸緩衝液（pH7.0）0.4mlおよび２％基
質液0.5mlを加えて30℃にて30分間反応させ、残存酵素
活性を測定した。結果を第４図に示す。第４図に示した
ように、本酵素はpH5.5〜10.5の範囲で安定である。

（３）酵素力価の測定法酵素の活性は、可溶性澱粉（メルク社製，分析用）を還
元して基質として用い、ソモジー・ネルソン法により還
元力を測定し、30℃で１分間に１マイクロモル等量のグ
ルコシド結合を切断する酵素量を1 IU（国際単位）とし
た。

（４）作用至適温度と温度安定性反応液組成をとし、各種の温度で15分間反応させて還元力を測定し、
最高値を100として表わしたときの結果を第５図に示
す。図から明らかなように、本酵素の作用至適温度50〜
55℃である。

また、pH7.0で各種温度に15分静置した後、30℃で反応
を行ない残存活性を測定した。結果を第６図に示す。第
６図から明らかなように、55℃以上では急激に失活す
る。

（５）阻害，活性化および安定化本酵素は0.4mMパラクロロ安息香酸第二水銀溶液中では
阻害を受け、阻害率は60〜70％である。

次に、各種金属イオン（1mM濃度）の影響は水銀，銀，
コバルト，銅および鉄による阻害率が90％以上という高
い値を示し、アルミニウム，亜鉛，マンガンでは各々2
0,30,60％である。また、ストロンチウムでは活性が115
に高められ、カルシウムイオンは本酵素の耐熱性を５℃
高める。

（６）分子量デイスクゲル電気泳動法によつて得られた本酵素の分子
量は62000である。

（７）等電点アンフオライン電気泳動法によつて求められた等電点は
pH4.7である。

（８）結晶構造および元素分析本酵素については未だ結晶標品が得られていないが、電
気泳動で単一バンドを示す精製標品を得ている。

以上に示したように、本酵素は作用の面では従来のマル
トテトラオース生成酵素と類似しているものの分子量，
等電点，阻害の形式等の性質については従来のものと異
なり、マルトテトラオースを大量に生成する新規な酵素
である。

〔実施例〕次に、実施例により本発明を説明する。

実施例１シユードモナス・サツカロフイラIAM1504を可溶性澱粉
１％，ポリペプトン１％，リン酸１カリウム0.1％，リ
ン酸２カリウム0.28％のの斜面寒天培地に接種し、30℃
で２日間培養した後、その１白金耳をとり、同じ組成の
液体培地（100ml培地/500ml三角フラスコ）に移し、30
℃で２日間通気振とう培養を行なつた。

培養終了後、低温で培養物中の菌体および不溶物を遠沈
除去して上澄を得、これを粗酵素とした。この粗酵素液
の活性は14.0IU/mlであつた。

実施例２シユードモナス・サツカロフイラIMA1504の培養液を少
量とり、常法によりRI,UV,ニトロソグアニジンで処理し
た後、平板培養を行ないアミラーゼ活性の高いコロニー
をとつた。これを可溶性澱粉１％，ポリペプトン１％，
リン酸１カリウム0.1％，リン酸２カリウム0.28％の培
地で30℃にて２日間培養した。その後の操作は実施例１
と同様にした。得られた粗酵素液の活性は18.0IU/mlで
あつた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、新規なマルトテトラオース生成酵素を
効率よく大量、かつ安価に生産できるため、本酵素の用
途は食品をはじめ各種の分野に拡がることが期待され
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は精製酵素のデイスクゲル電気泳動写真、第２図
はマルトテトラオース生成酵素の反応経過（5IU/g基
質）を示すクロマトグラム、第３図は本酵素の至適pHを
示すグラフ、第４図は本酵素のpH安定性を示すグラフ、
第５図は本酵素の至適温度を示すグラフ、第６図は本酵
素の温度安定性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者橋本仁神奈川県鎌倉市今泉台４−31―10 (72)発明者原耕三神奈川県横浜市金沢区並木２−６―３― 104 (56)参考文献Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，47 （８）（1983）Ｐ．1761−1768

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の性質を有する新規なマルトテトラオ
ース生成酵素。（１）本酵素は30℃にてpH6.7が至適であり、pH5.5〜
10.5で安定である。（２）本酵素はpH7.0において至適温度は50〜55℃で
あり、60℃以上の温度で30分間放置すると失活する。（３）本酵素は1mMパラクロロ安息香酸第二水銀溶液
中で阻害を受け、阻害率は60〜70％、Fe³⁺,Co²⁺では94
〜99％であるが、Mg²⁺では全く阻害を受けない。（４）本酵素の分子量は62000（デイスクゲル電気永
動法による）である。（５）本酵素の等電点はpH4.7（アンフオライン電気
永動法による）である。
【請求項２】シュードモナス・サツカロフイラを培養
し、培養物中に下記の性質を有する酵素を蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする新規なマルトテトラオ
ース生成酵素の製造方法。（１）本酵素は30℃にてpH6.7が至適であり、pH5.5〜
10.5で安定である。（２）本酵素はpH7.0において至適温度は50〜55℃で
あり、60℃以上の温度で30分間放置すると失活する。（３）本酵素は1mMパラクロロ安息香酸第二水銀溶液
中で阻害を受け、阻害率は60〜70％、Fe³⁺,Co²⁺では94
〜99％であるが、Mg²⁺では全く阻害を受けない。（４）本酵素の分子量は62000（デイスクゲル電気永
動法による）である。（５）本酵素の等電点はpH4.7（アンフオライン電気
永動法による）である。
【請求項３】シユードモナス・サツカロフイラがシユー
ドモナス・サツカロフイラIAM1504である特許請求の範
囲第２項記載の方法。